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KR0149997B1 - 입상 살균제 제품 및 그 제조방법 - Google Patents

입상 살균제 제품 및 그 제조방법

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KR0149997B1
KR0149997B1 KR1019900006703A KR900006703A KR0149997B1 KR 0149997 B1 KR0149997 B1 KR 0149997B1 KR 1019900006703 A KR1019900006703 A KR 1019900006703A KR 900006703 A KR900006703 A KR 900006703A KR 0149997 B1 KR0149997 B1 KR 0149997B1
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KR
South Korea
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granular
enzyme
nucleus
polysaccharide
layer
Prior art date
Application number
KR1019900006703A
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English (en)
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KR900017571A (ko
Inventor
다니엘 싸뎅
프레데릭 느규앙
미셀 데레
Original Assignee
미셀 데레
비오 세레 라모아뚜아르 에스 아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 미셀 데레, 비오 세레 라모아뚜아르 에스 아 filed Critical 미셀 데레
Publication of KR900017571A publication Critical patent/KR900017571A/ko
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Publication of KR0149997B1 publication Critical patent/KR0149997B1/ko

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Abstract

내용없음

Description

입상 살균제 제품 및 그 제조방법
본 발명은 락토퍼옥시다제 효소, 산소 공여체 및 필요한 경우 산화성 물질을 포함하는 살균제 시스템으로부터 입상 살균제 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 전술한 방법으로 제조된 입상 살균제 제품에도 관계된다.
락토퍼옥시다제 효소/산소공여체/산화성물질로 구성된 LP 시스템이라 부르는 살균효소 시스템은 살균성을 갖고 있는 것으로 알려졌다. 이러한 시스템은 포유류의 붐비물인 우유, 타액, 눈물등에서 발견되고 있는 점액 물질로서 전술한 분비물과 점막을 보호하는 것으로 확인되었다. 작은 분자의 형태로 존재하는 LP시스템은 물이나 습기와 같은 수성 매질에 대단히 잘 용해되어 옆으로 확산되므로 특정부위에 처리하였을 때 그 작용이 처리된 부위에만 한정되도록 집중시키는 것이 용이하지 않았다. 더구나, 전술한 살균 효소 시스템의 회수에는 고도의 정밀한 분리 기술이 요구된다.
본 발명은 전술한 LP 시스템으로부터단백질 성분이 수성 매질중에서 불용성이고, 이동도와 확산도를 용도에 따라 조절할 수 있는 입상 살균제 제품을제조하는 방법을 찾아내기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 LP 시스템이 변성되지 않고 그들의 효소가 화학적으로 변화하지 않는 전술한 입상 제품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명을 또 다른 목적은 특정 용도에 적합한 대상성 특성(예를들면, 전기적 전하등)을 입상 제품에 부여하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 입상제품의 제조방법은 산소 공여체가 과산화물인 전술한 LP 시스템을 이용하는바, 전술한 LP 시스템은 효소(글루코스 옥시다제, 크산단 옥시다제 등)나 미생물 (락토바실루스, 스트렙토록커스 등)중에서 선택한 활성물질을 포함할수 있다. 본 발명에 사용하는 LP 시스템은 용도에 따라 산화성 물질(티오시안산, 요오드 또느 브롬 등)을 함유할 수 있는데. 이러한 물질은 꼭 필요한 것은 아니다. 이러한 물질들은 매질중에 전술한 산화성 물질들이 이미 특정량 이상 함유되어 있는 경우에는 첨가할 필요가 없다.
본 발명의 방법은 LP 시스템의 락토퍼옥시다제 효소를 친수성 폴리사카라이드 중합체로 구성된 핵, 하이드록실 관능기나 그 유도체에 의하여 화학적으로 핵에 결합된 제1인지질층 및 제2인지질층을 포함하는 입자들로 구성된 입상 벡타나 캐리어에 결합시켜 효소 분자가 제2인지질층 및/ 또는 제1 지질층에 삽입되도록 하는 공정 및 전술한 입상 벡타를 비수성(非水性)매질속에 투입하여 LP 시스템의 분자들이 응결되지 않도록 하는 공정을 포함함을 특징으로 한다.
산소 공여체가 활성물질로서 옥시다제 효소를 포함하는 경우, 이 옥시다제 효소는 입상 벡타에 결합되게 된다.
따라서 본 발명에 의하면 하나 또는 그 이상의 효소가 비수성 매질에 불용성인 입상 벡타에 결합된 입상 살균 제품이 얻어지는바, 이 입상 살균 제품의 입도와 밀도는 폴리사카라이드 핵을 적절히 선택하므로서 조절할 수 있다.
본 발명에 의한 입상 살균 제품은 캐리어가 생화학적으로 허용되고 먹을 수 있는 성분(특히 잔류물이 없이 대사 작용할 수 있는 성분)으로 구성되는 경우에는 의약과 음식물로 사용할 수 있다.
지질층과 인지질 층에 대한 효소의 결합은 정상적인 조건하에서 안정하여 효소가 지질층이나 인지질층으로부터 유리되지 않는 다는 것이 실험적으로 증명되었다.
전술한 바와 같이 벡타의 표면에 위치하지만 변성되지 아니한 효소들은 LP 시스템의 공지된 살균작용을 유도하는 산소 공여체에 의한 산화작용을 촉진하는 효소활성을 유지하고 있다. 이러한 활성은 거의 모두 유지되지만, 대부분의 경우 성분의 이동도가 낮으면 반응속도는 저하된다.
그러나, 예상외로 폴리사카라이드 핵 표면에 이온성 관능기가 결합되는 경우에는 제 1지질층을 형성할 때 생체외적 운동 에네르기가 작용하지 않는 것으로 보인다. 또한 제1지질층에 가하여지는 내부 이온 특성은 감소된 반응속도를 보상하는 락토퍼옥시다제 효소의 활성에 좋은 영향을 미치는 것으로 보인다. 설명하기 곤란한 이러한 효과는 산소 공여체로 과산화물을 사용하는 오르도페닐렌디아민(산화성 물질의 성분)을 이용한 비색법으로 측정된다.
본 발명에서는 락토페린 LF 로 보강한 LP 시스템을 사용할 수 있는바, 이 경우 락토페린 LF 는 입상 벡타에 결합된다. 이와 마찬가지로 다른 첨가제들도 LP 시스템에 첨가될 수 있다. 예를들면, 매질 내에서 보호 작용을 하는 슈퍼옥시디스무타제(SOD) 효과가 LP 시스템에 첨가될 수 있는바, 이 효소는 입상 벡타에 결합된다.
특히 바람직 한 것은 단일 효소가 하나의 입자에 결합되도록 각개 효소가 입상벡타에 독립적으로 첨가되도록 하고, 제조된 입자들을 서로 혼합하거나 다른 LP 시스템의 제품과 혼합하는 것이다.
용도에 따라서는 활성이 용도에 맞는 적정수준 이하로 상실되는 것을 방지하기 위하여 활성화도를 지연시킬 필요가 있다. 전술한 바와 같이 활성화를 지연시키기 위하여, 본 발명의 한 예에서는 효소를 결합시킨후 입상 벡타의 입자들을 폴리사카라이드나 콜로이드 물질의 표면층으로 피복한다. 이러한 표면층은 제품을 사용하기 전 비수성 매질중에서 보관할때는 제품중에 함유된 활성 물질을 다른 반응성 물질로부터 격리시키고, 제품을 수성매질과 혼합하여 사용할 때는 표면층을 구성하는 폴리사카라이드의 수화 또는 용해에 의하여 활성물질의 할성이 개시되도록 하는 역할을 한다. 이러한 표면층의 형성은 통상적인 침지 또는 분무 방법에 의하여 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 예에서는 입자가 전하를 띠도록 하기 위하여 입상 벡타의 제2인지질층에 전기적인 양성 전하를 갖는 분자를 결합시킨다. 이러한 처리에 의하면 하전에 따라 입자들이 상호간 또는 다른 입자 및 혁탁액중에 용해된 분자와 쉽게 결합되게 할 수도 있고 결합되지 않게 할 수도 있다.
입상 벡타에 하나 또는 그 이상의 효소 입자를 결합시키는 방법은 프랑스 특허 제 88,071,10호에 설명되어 있다. 이 방법은 아실화된 핵을 형성하기 위하여 폴리사카라이드를 함유하는 비수성 용매로 구성된 바양자성 매질중에서 폴리사카라이드 핵 주위에 지질층을 결합 시키는 공정과 아실화된 핵이 함유된 매질에 제2인지질 층을 형성하는 인지질과 인지질 성분에 고정시킬 효소를 투입하고 인지질의 전이온도에 가까운 온도로 가열하여 수화 시키는 공정을 포함한다.
폴리사카라이드의 핵에 내부 이온 특성을 갖는 지질층을 결합시키는 방법은 폴리사카라이드 핵을 지방산 염화물과 미량의 디카복실산 앤하이드라이드, 특히 석신산 앤하이드라이드의 혼합물과 반응시키는 공정을 포함한다.
실제로, 디카복실산 앤하이드라이드는 제2인지질층이 고정되었을 때 충분한 지질 특성을 유지하도록 하기 위하여 지방산 염화물(예를들면 스테아린산 염화물 등)에 대하여 40% 이하의 몰비로 되게 혼합한다.
폴리사카라이드 핵은 용도에 따라 선택한다. 이 폴리사카라이드 핵은 화학적으로 불용성인 자연물(셀룰로우스, 아밀로팩틴과 같은 전분의 변성체)이거나 또는 망상구조의 합성물질(덱스트란, 베타-아밀로스 등)일수 있다. 이러한 물질들의 불용성은 화학적 특성에 의하여 결정된다. 폴리사카라이드 핵의 크기는 폴리사카라이드를 분쇄하고 선별하여 요구하는 크기를 얻을 수 있다. 망상 구조로된 핵의 경우, 그 밀도는 중합반응시 망상 구조의 정도를 변화시키므로서 조절할 수 있다. 전술한 폴리사카라이드 핵의 크기는 10-8m와 10-5M범위에서 변화될 수 있는 바, 작은 것은 확산작용을 이용하는 의약품(예를들면 피부를 투과하는 의약품)에 확산작용을 나타내도록 하는데 사용하고, 큰 것은 활성을 집중시키고 물리적 방법(예를들면 여과, 원심분리, 경사시켜 제거하는 방법 등)에 의하여 효소를 회수할 수 있도록 하기 위하여 확산을 방지하는데 이용된다. 젖은 핵은 제1지질층을 결합시키기 전에 건조시키는바 이러한 건조는 중합후 입자들이 뭉치는 것을 방지하기 위하여 분무화하거나 분쇄하는 공정을 포함한다.
제1지질층은 폴리사카라이드 핵에 대한 비용매, 특히 디클로로매탄 중에서 결합된다. 제1지질층을 결합시키기 위하여는 핵을 구성하는 화합물, 산염화물이나 무수물(특히 스테아린산의 염화물이나 무수물) 및 촉매인 3급 아민(예를들면 트리에틸아민)을 매질중에 분산시켜 각개 핵주위에서 아실화 반응이 일어나도록 한다. 전술한 지질층의 두께는 화학량론적 사용량과 반응시간을 조절하여 조정할 수 있다. 전술한 조건을 적절히 조절하면 제2층과 효소가 결합되기 쉬운 단분자층 상태로 되는 대단히 얇은 층이 얻어진다. 또한 탄소수 14내지 22의 장쇄 지방산을 결하시키면 결합의 질과 효소활성이 유리하게 나타난다. 그러나 전술한 22개 이상의 탄소수를 갖는 지방산을 사용하면 전술한 제1지질층이 굳어진다. 탄소수 18의 지방산(스테아린산)을 사용한 경우에 특히 우수한 결과가 얻어 졌다. 전술한 바와 같이 제조 과정 중 매질에 미량의 석신산 앤하이드라이드를 첨가하면 제 1지질층에 내부 이온 특성이 나타난다.
제2 인지질층은 콩 레시틴, 계란 레시틴 또는 우유 레시틴같은 동물 또는 식물 유래의 인지질로부터 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 제2 인지질층은 아실화된 핵, 인지질 및 결합시킬 효소를 인지질의 전이온도로 유지된 물속에서 혼합하여 제조할 수 있다. 전술한 제2 인지질층의 생성시간은 30 내지 60분이다. 화학량론적 사용량은 인지질의 단일층(분자층)을 얻기 위한 아실화된 핵의 입도에 대한 함수로서 응용된다. 이러한 제2 인지질층은 입자들이 수용액중에서 균일하게 분산되게 하는 역할(완전한 소수성 단일 제1 지질층에는 해당하지 않음)과 효소 또는 기타 물질의 결합을 향상시키는 역할을 한다.
본 발명은 전술한 방법에 의하여 얻어지는 살균제 제품에도 관계된다. 본 발명에의한 제품은 락토퍼옥시다제효소, 산소공여체 및 필요한 경우 산화성 물지을 포함하고, 시스템 중의 락토퍼옥시다제 효소가 친수성 폴리사카라이드 중합체로 형성된 핵, 전술한 핵에 하이드록시 관능기나 그 유도체에 의하여 화학적으로 결합된 제1 지질층 및 제2 인지질층을 포함하는 입자들로 구성도니 압싱 캐리어나 벡타에 결합되어, 효소 분자가 전술한 제1 지질층 및 또느 제2 인지질층에 삽입되었음을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전술한 제품을 함유하는 치료용 조성물에도 관계된다.
본 발명의 조성물에는 피부, 점막 및 소화기관의 치료용 조성물, 미생물의 감염 방지를 위한 조성물 및 치아 소독제등이 포함된다.
본 발명에 의한 입상 제품은 전술한 용도에 맞는 효과적인 살균 활성, 생물학적 허용성과 생물학적 의태특성(세포막과 상호작용하고 조직의 표면에 효소활성을 유지하는 제2 층에 유사한 특성) 및 한정된 확산과 우수한 안정성을 갖고 있다.
이하 실시예를 기재한다.
[실시예 1]
이 실시예는 느린 확산속도를 나타내도록 하기 위하여 입도가 비교적 큰(10-6 내지 3.10-6m) 살균제 입자제품을 제조하기 위한 것이다.
[폴리사카라이드 핵의 조제]
1ℓ짜리 둥근 플라스크에 베타-아밀라제 형태의 전분 150g과 1M 가성소오다 용액 150㎖을 투입하여 혼합하고 10㎖이 소듐 하이포클로로히드린을 첨가하여 5분간 교반한다. 80℃로 가열 하면서 10시간동안 중합시키고 생성된 망상구조의 생성물을 분리하여 세척하고 2 ℓ의 물에 현탁시켜 기계적으로 분쇄하고(익편 분쇄기 이용) 원심분리하여 10-6내지 3.10-6m 의 입도를 갖는 아실화된 핵 입자를 얻는다. 제조된 미립자를 분무건조하면 비교적 유연한 구형 입자가 얻어진다.
제 1 지질층의 결합
앞에서 제조한 입자 100g을 1ℓ의 디클로메탄에 분산시킨 다음, 트리에틸아민 25g과 스테아린산 염화물 60g을 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 교반하여 혼합한다. 입자를 분리하고 에탄올로 세척한다.
라우워리법에 의한 분석에 의하면 스테아린산 (C 18)은 핵의 하이드록시관능기로부터 유도된 에스테르기를 통하여 핵무게의 2%정도의 비율로 되게 핵에 결합되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 비율은 단분자층의 특성을 나타낸다. 얻어진 입자들은 강한 소수성을 나타내고 총 아실화반응의 특성을 나타내었다.
락토퍼옥시다제 효소의 결합과 제2 인지질층의 형성
락토퍼옥시다제 효소는 소의 항유혈청으로부터 이온 교환 크로마토그래피법에 의하여 추출한 것을 사용한다. 95% 이상의 순도로 정제한 락토퍼옥시다제를 안정하게 완전 건조하기 위하여 동결건조한다.
이 실시예에서 LP시스템은 전술한 락토퍼옥시다제 효소, 산화성 물질인 티오시안산칼륨 LAC 산소공여체인 글루코스옥시다제를 포함하고 있으나, 락토퍼옥시다제 효소 만이 입상 벡타에 결합되었다.
1ℓ의 둥근 플라스크에 아실화된 폴리사카라이드 핵 2g, 냉동 건조한 락토퍼옥시다제 효소 0.2g 및 계란을 수소화시켜 제조한 동물 유래의 수소화 레시틴 0.2g을 투입한다. 건조상태로 교반하면서 증류수 400mℓ을 소량씩 가하고 현탁액을 37℃(레시틴이 전이온도)로 30분동안 유지한다.
현탄액의 일부를 원심분리하여 입자를 분리하고 오르도페닐렌디아민법에 의하여 결합된 락토퍼옥시다제 효소의 활성을 측정한다. 벡타 입자에 결합되지 아니한 효소는 약 0.5%(대단히 적음)이고 효소의 활성은 유리 상태의 락토퍼옥시다제 효소의 활성에 비하여 60% 정도로 나타났다. 이러한 결과는 대단히 만족스러운 것으로서 락토퍼옥시다제 효소가 변성되지 않고 벡타 입자에 결합되었음을 나타낸다. (원칙적으로 활성의 저하는 이동도의 저하를 가져와 속도의 감소를 초래한다.)
현탄액의 또 다른 일부를 냉동건조하고 LP 시스템의 다른 성분인 티오시안산 칼륨(시판 건조분말) 및 글루코스-옥시다제 효소 시스템(시판용 분말)과 다음의 중량비로 배합한다.
락토퍼옥시다제 효소를 함유하는 핵 입자 44.20%
티오시안산 칼슘 11.06%
글루코스 44.20%
옥시다제 효소 0.44%
생성된 입상 제품은 리스테리아 속의 박테리아에 대한 살균작용을 시험하기 위하여 수화제로 만들어서 사용한다. 대조용 배양물과 비교한 계수는 살균활성이 대단히 유효함을나타내었다. 본 발명에 의하면 37℃에서 4시간 배양후 리스테리아가 전부 사멸되었으나, 대조용 배양물은 개체군이 처음과 동일하게 유지되었다.
[실시예 2]
실시예 1의 방법으로 폴리사카라이드 핵을 제조한다. 실시예 1과 동일한 방법으로 아실화반응을 실시하되, 제1 지질층이 내부 이온성 산 특성을 나타내도록 하기 위하여 스테아린산 염화물을 실시예 1에서 보다 적은 48g 사용하는대신, 무수 석신산 4g을 첨가하였다. 생성된 제품에 포함된 지방산의 비율은 약 1.6%였다. 지방산으로 구성된 단막층의 일부 부위가 석신산의 모노에스테르에 의하여 점유되었다.
제2 인지질층과 락토퍼옥시다제 효소의 결합은 실시예 1의 방법에 따라 실시한다. 분석결과 매개물 입자에 결합되지 아니한 효소의 백분율은 실시예1의 경우보다 조금 낮은 0.35%이고, 효소의 활성은 동일한 량의 유리상태의 효소 활성의 100%에 해당하였다. 이 실험결과는 제1 지질층의 부분적인 이온화에 의하여 락토퍼옥시다제 효소의 활성이 향상되었음을 보여준다.
입상 살균제 제품은 앞에서 제조한 입자들과 기타의 LP 시스템의 성분들을 사용하여 제조한다.
[실시예 3]
실시예 1에서 제조한 락토퍼옥시다제 효소를 함유하는 생화학적 핵의 현탁액을 낸동 건조하기전에 수거한다. 이 실시예에서는 핵 무게의 2배에 해당하는 량의 만니톨을 첨가하고 교반하여 만니톨을 용해시키고, 현탁액을 저온(35℃)에서 미립화시킨다.
제2 인지질층이 만니톨의 얇은 피막층으로 피복된 입자들이 얻어 지는바, 전술한 피막층은 비수성 매질중에서 핵이 용해되지 않도록 함과 동시에 효소의 활성을 차단한다.
입상 살균제 제품은 실시예 1에서와 같이 기타의 성분들과 배합하여 제조한다.
본 발명의 제품은 비수성 용매중에서 대단히 안정하여 장기간 보존중에 활성이 손실되지 않았다.

Claims (9)

  1. LP 시스템의 생리화학적 특성을 개선시키고 수성 매질에 불용성인 입자 형태의 LP 시스템을 얻기 위하여, 산소공여체가 과산화물, 반응성 물질 및 미생물중의 하나를 포함하는 락토퍼옥시다제효소/산소공여체/산화성 물질로 구성되는 살균성 LP 시스템을 이용하여 입상 살균성 제품을 제조하는 방법에서, LP 시스템 중의 락토퍼옥시다제 효소를 친수성 폴리사카라이드의 중합체로 구성된 핵, 전술한 핵에 하이드록시 관능기나 그 유도체를 통하여 화학적으로 결합된 제1 지질층 과 제2 인지질층을 포함하는 입자들로 구성된 입상 벡타에 결합시켜 효소 분자가 제1 지질층과 제2 인지질층중의 한 층이나 두 층 속으로 삽입되게 하는 공정 및 전술한 입상 벡타를 비수성 매질속으로 투입하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 입상 살균성 제품의 제조방법.
  2. 청구범위 1항에서, 산소 공여체가 활성물질로서 옥시다제 효소를 포함하고 이 방법은 전술한 옥시다제 효소 분자를 입상 벡타에 결합시키는 공정을 포함함을 특징으로 하는 방법
  3. 청구범위 1항에서 이 방법이 락토페린 LF를 입상 벡타에 결합시키는 공정을 포함하고, 생성된 입상 살균제품은 락토페린 LF에 의하여 보강됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구범위 1항에서, 폴리사카라이드 핵에 제1 지질층을 형성하여 아실화된 핵을 형성하는 공정이 폴리사카라이드를 용해시키지 않는 비양자성 매질중에서 폴리사카라이드 핵을 인지질층을 그래프트 결합시키는 공정을 포함하고, 이 방법이 아실화된 핵에 제2 인지층과 LP 시스템의 다른 성분들을 결합시키는 공정 및 인지질의 전이온도에서 수화시키는 공정을 포함함을 특징으로 방법.
  5. 청구범위 1항에서, 이 방법이 입상 벡타의 입자들을 폴리사카라이드나 콜로이드 물질로 피복하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 방법
  6. 청구범위 1항에서, 핵이 전분, 덱스트란 및 셀룰로우스 중에서 선택한 폴리사카라이드 중합체로 제조된 것음을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구범위 1항에서, 제2 인지질층이 콩 레시틴, 계란 레시틴 및 우유 레시틴 중에서 선택한 동물과 식물로부터 유도된 인지질로 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 반응 물질인 효소와 필요와 따라 산화성 물질을 포함하고 락토퍼옥시다제 효소와 산호 공여체를 포함하는 입상 살균성 제품에 있어서, 락토퍼옥시다제 효소가 친수성 폴리사카라이드로 구성된 핵, 전술한 폴리사카라이드 핵에 하이드록시 관능기 또는 그 유도체에 의하여 화학적으로 결합된 제1 지질층 및 제2 인지질층을 포함하는 입자들로 구성된 입상 벡타에 결합되고, 전술한 효소 분자가 제2 인지질층과 제1 지질층에 삽입되었음을 특징으로 하는 입상 살균제 제품.
  9. 청구범위 8항에서 입상 벡타가 추가로 락토레린 LF와 슈퍼옥시디스무타제(SOD)를 포함함을 특징으로 하는 입상 살균제 제품.
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