JPWO2007099764A1

JPWO2007099764A1 - 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法

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Publication number: JPWO2007099764A1
Application number: JP2008502691A
Authority: JP
Inventors: 正大船木; 憲之木崎; 八十原　良彦; 良彦八十原
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2027-02-14
Also published as: JP5005672B2; WO2007099764A1

Abstract

新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチド等を利用した光学活性アルコールの製造方法である。

Description

本発明は、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。

光学活性アルコール類、例えばβ−ヒドロキシエステル類は、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。還元酵素を用いてβ−ケトエステル類を不斉還元し、光学活性なβ−ヒドロキシエステル類を製造する方法が知られている(特許文献１、２、非特許文献１、２)。
特開平８−１０３２６９号公報国際公開第２００３−０９３４７７号公報Ｋａｔａｏｋａ，Ｍ．ら，Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｔｈｙｌ４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｃｅｌｌｓｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅａｌｄｅｈｙｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｓ. Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５１，４８６−４９０（１９９９）．Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ａ．ら，Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆｃｈｉｒａｌａｌｃｏｈｏｌｓｓｕｃｈａｓ（Ｒ）−１，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｂｙｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．ＡｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣａｔａｌｙｓｉｓｏｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｃａｌｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ），２１７−２３１（２００４）．

本発明は、上記背景技術の各文献に記載の還元酵素とは異なる、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。

（１）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

（２）本発明の一つの特徴は、（１）に記載のＤＮＡであり、かつ、β−ケトエステル類を不斉的に還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。

（３）本発明の一つの特徴は、（１）又は（２）のいずれかに記載のＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

（４）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである。
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド。

（５）本発明の一つの特徴は、（４）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡである。

（６）本発明の一つの特徴は、（１）、（２）又は（５）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターである。

（７）本発明の一つの特徴は、（６）に記載のベクターであり、かつ、該ベクターが、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡと、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）を、それぞれＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、互いにライゲーションして構築した、組換えプラスミドｐＮＴＢＡであるベクターである。

（８）本発明の一つの特徴は、還元型補酵素再生活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、（６）に記載のベクターである。

（９）本発明の一つの特徴は、（６）〜（８）のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。

（１０）本発明の一つの特徴は、前記宿主細胞が大腸菌である（９）記載の形質転換体である。

（１１）本発明の一つの特徴は、（３）又は（４）に記載のポリペプチド、又は、（９）または（１０）に記載の形質転換体を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法である。

（１２）本発明の一つの特徴は、（３）又は（４）に記載のポリペプチド、又は、（９）または（１０）に記載の形質転換体を、β−ケトエステル類と反応させることを特徴とする光学活性β−ヒドロキシエステル類の製造方法である。

本発明のその他の特徴及びその効果は、以下に説明する実施形態および実施例によって明らかにされる。

本発明により、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した有用な光学活性アルコールの製造方法が提供される。

以下、本発明を実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。

以下、実施形態に基づいて本発明を詳述する。

１．ポリペプチド
本発明の実施形態の「ポリペプチド」は、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドである。また、本発明の実施形態の「ポリペプチド」は、β−ケトエステル類を不斉的に還元し、β−ヒドロキシエステル類を生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物などの生物から単離することができる。本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。また、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性（同一性）を有し、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するか、またはβ−ケトエステル類を不斉的に還元し、β−ヒドロキシエステル類を生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等であり、本発明に含まれる。

ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８））を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性を有するポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるポリペプチドを挙げることができる。

このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。

また、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（１９８９））等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。置換、挿入、欠失または付加を生じさせるアミノ酸の数は、その置換等した後のポリペプチドが上記活性を失わない限り制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。

本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとしてはパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手することができる。

本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。

本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。

まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。

２．ＤＮＡ
本発明の「ＤＮＡ」は、上述の実施形態のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で本発明のＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明のＤＮＡを取得できる。

まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。

このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒらの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４１５（２０００））により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ＡＢＩ３７３Ａ型ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。

該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６，８１８６（１９８８））によりその全体の配列を決定することができる。

このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するか、またはβ−ケトエステル類を不斉的に還元し、β−ヒドロキシエステル類を生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。

配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。

ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。本明細書において記述されている、上記ＤＮＡの単離、および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９））等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。

本発明のＤＮＡの例としては、上記の各ＤＮＡのほか、配列番号１に示す塩基配列において、塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性、またはβ−ケトエステル類を不斉的に還元し、β−ヒドロキシエステル類を生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。上記の置換、挿入、欠失および／又は付加される塩基の数は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが上記活性を失わない限り制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。

３．ベクター
本発明の「ベクター」は、適当な宿主細胞内で前記ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。

このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の記載に基づいて当業者が容易に取得及び調製可能なプラスミドｐＵＣＮＴが好適に使用できる。

前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。

上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明のベクターの例としては、ｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡを導入した、後述するプラスミドｐＮＴＢＡを挙げることができる。

４．宿主細胞
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」（東洋紡績株式会社、1993年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。

５．形質転換体
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味し、本発明のポリペプチドの酵素活性が残存する限りはこれに含まれる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。本発明の形質転換体の例としては、後述するＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）が挙げられる。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、上記エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１と同様の菌学的性質を有する。

６．還元反応
還元反応の基質としては、本発明の「ポリペプチド」が還元し得るカルボニル基を含む化合物であればいずれでもよい。好ましくはβ−ケトエステル類である。具体的には、たとえばアセト酢酸メチル、アセト酢酸エチル、アセト酢酸ｔ−ブチル、４−クロロアセト酢酸メチル、４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸オクチル、４−アセトキシアセト酢酸エチル、４−ベンゾイルオキシアセト酢酸エチル、２−オキソシクロペンタンカルボン酸メチル、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチル、アセトアセトアニリド、ｏ−アセトアセトアニシジド、ｐ−アセトアセトアニシジドなどである。

還元反応の際には、基質を反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。

還元反応を促進させるために、一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと省略する）、還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸（以降ＮＡＤＰＨと省略する）等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。

また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺をそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元するための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元するための基質としてグルコースを共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元するための基質としてギ酸を共存させる。

本発明のＤＮＡと補酵素再生能を有する酵素をコードするＤＮＡの両方を導入された形質転換体を用いると、別途、補酵素再生酵素を調製する必要がない。該形質転換体を得るには、２つのＤＮＡを別々に導入してもよいし、両方のＤＮＡを含むベクターで形質転換を行ってもよい。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。

（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、上述のパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３より、アセトアセトアニリドを不斉的に還元する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。

アセトアセトアニリドに対する還元活性は、１.３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、４０ｍＭの基質アセトアセトアニリド、０．２５ｍＭの補酵素ＮＡＤＰＨ、および粗酵素を添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。

（微生物の培養）
５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）３Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３株の培養液を５０ｍｌ接種し、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量０．９ＮＬ／ｍｉｎ、３０℃で４０時間培養を行った。

（無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．８％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。

（核酸の除去）
上記で得た無細胞抽出液に、３．５％硫酸プロタミン水溶液を添加し、３０分攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。

（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
核酸除去処理を行った無細胞抽出液を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。

（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１.２Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し、１.２Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（９０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１.２Ｍから０.２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。

（ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、のβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（４０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。

（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１.２Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し、１.２Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（1０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１.２Ｍから０.２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。

（２'，５'−ＡＤＰＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含むを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した２'，５'−ＡＤＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（３５ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。

（実施例２）遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作製）
実施例１で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５'−CARGAYCTNACNAAYAARAC−３'（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５'−ARNGCYTCNGTCATNCCCAT−３'（配列表の配列番号４）を合成した。

（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３の菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４１５（２０００））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩＰＲＩＳＭＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ３７３ＡＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。

（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６，８１８６（１９８８））により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１に示した。ｉ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａＬＡＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。

（実施例３）発現ベクターの構築
プライマー３：５'−ATTAAACATATGAAATTGCAAGATCTTACG−３'（配列表の配列番号６）と、プライマー４：５'−AAAGAATTCTTACTGTGGATTGGTTGTCC−３'（配列表の配列番号７）を用い、実施例２で得たパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位との間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＢＡを構築した。

（実施例４）形質転換体の作製
実施例３で構築した組換えベクターｐＮＴＢＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）を得た。これを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。また、比較例として、プラスミドベクターｐＵＣＮＴを含むＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）も同様に培養した。これらを遠心分離によって菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これらを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のアセトアセトアニリド還元活性を測定したところ、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）では３１．７Ｕ／ｍｇ、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）では活性が検出できなかった。なお、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。

（実施例５）（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの製造
実施例４と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）菌体の無細胞抽出液１ｍｌに、４−クロロアセト酢酸エチル（β−ケトエステル類に含まれる）１０ｍｇ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤＰ０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ２"」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを添加し、３０℃で１６時間振とうした。反応終了後に反応液を酢酸エチルで抽出し、フェニルイソシアネートで誘導体化を行った。これを薄層クロマトグラフィーによって精製した。この誘導体化された４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを用いて光学純度を測定したところ、９９％ｅｅ以上であった。４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（β―ヒドロキシエステル類に含まれる）の光学純度の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＣＥＬＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を装着したＨＰＬＣを用いて行った。

（実施例６）ポリペプチドの基質特異性
０．２％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例１で調製した精製ポリペプチドを適当量添加し、３０℃で３分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これをアセトアセトアニリドに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表１に示した。表１から明らかなように本発明の実施形態のポリペプチドは、広範なカルボニル基を有する化合物に対して還元活性を示した。

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項１に記載のＤＮＡであり、かつ、β−ケトエステル類を不斉的に還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項１又は２のいずれかに記載のＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド。
請求項４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項１、２又は５のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
請求項６に記載のベクターであり、かつ、該ベクターが、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡと、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）を、それぞれＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、互いにライゲーションして構築した、組換えプラスミドｐＮＴＢＡであるベクター。
還元型補酵素再生活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項６に記載のベクター。
請求項６〜８のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
前記宿主細胞が大腸菌である請求項９記載の形質転換体。
請求項３又は４に記載のポリペプチド、又は、請求項９または１０に記載の形質転換体を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
請求項３又は４に記載のポリペプチド、又は、請求項９または１０に記載の形質転換体を、β−ケトエステル類と反応させることを特徴とする光学活性β−ヒドロキシエステル類の製造方法。