JPWO2004006956A1 - 脳損傷の予後改善薬とそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

脳血管障害、脳変性疾患、脱髄疾患等の疾患による脳損傷を治療または予防する化合物と、そのスクリーニング方法を提供する。
脳血管障害、脳変性疾患、脱髄疾患等の疾患による脳損傷の局所のミクログリア細胞やマクロファージにおいて誘導される造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素を阻害したり、損傷部位の周辺のアストログリア細胞で発現するプロスタグランジンＤ受容体の活性化を阻害することにより、プロスタグランジンＤ_２が関与する脳損傷を治療または予防する。さらに、ヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスを用いて、これらの薬効物質を試験する方法も提供する。

Description

この発明は、脳損傷を治療または予防する化合物及びそのスクリーニング方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、脳血管障害、脳変性疾患、脱髄疾患等の疾患による脳損傷部位のミクログリア細胞やマクロファージにおいて誘導される造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、「Ｈ−ＰＧＤＳ」ということがある）を阻害したり、損傷部位の周辺のアストログリア細胞で発現するプロスタグランジンＤ受容体（以下、「ＤＰ受容体」ということがある）の活性化を阻害することにより、プロスタグランジンＤ_２が関与する脳損傷を治療または予防する化合物と、これらの物質の薬効を、ヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスを用いて試験する方法に関するものである。

医療技術の発達により、頭部に大規模な損傷を負っても一命を取り留める人が増えている。交通事故や、労働中の災害、スポーツなどにより頭部外傷を負う人は多く、実に交通事故で死亡する人の半数は頭部外傷が原因である。これらは頭蓋骨に外力がかかった際、直下に生じる脳挫傷、あるいは脳浮腫に起因している。脳浮腫とは、脳血管に存在する脳血液関門の破綻が原因であり、血漿成分が血管外に漏出して脳が腫れてくることである。近年この治療法として、低体温法が注目されているが、これは脳代謝を抑えることで脳浮腫の増悪や頭蓋内圧の上昇を抑制し、二次的な脳損傷を防ごうとする治療方法である。重要な治療方針ではあるが、しかし、低体温による心肺機能や免疫機構の低下による問題が生じる場合もある（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００１；３４４：５５６−５６３）。

本発明は脳の局所的な炎症の遷延による組織損傷を抑止し、予後の改善をはかることのできる化合物を提供することを目的とする。
本発明はまたそのような化合物をスクリーングする方法を提供することも目的とする
上記目的を達成するため本発明者は鋭意研究を行ない、次のような知見を得たことに基いて本発明を完成させた。
１）遺伝性であるか外傷性であるかを問わず脳損傷が生じた場合、Ｈ−ＰＧＤＳ及びＤＰ受容体の発現が増加する。
２）Ｈ−ＰＧＤＳは脳損傷の局所のミクログリア細胞やマクロファージにおいて、ＤＰ受容体は損傷部位の周辺のアストログリア細胞で発現が誘導される。
３）損傷部位ではマクロファージの集積、アストログリア細胞の活性化が顕著である。
４）Ｈ−ＰＧＤＳの阻害剤又はＤＰ受容体の拮抗剤を投与するとＤＰ受容体の発現が減少し、アストログリア細胞の活性化が抑制される。
５）Ｈ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスでは野性型マウスに比べ脳損傷が増悪される。
６）Ｈ−ＰＧＤＳ遺伝子欠損マウスとＤＰ受容体欠損マウスでは野性型マウスに比べ損傷部位での出血やアストログリア細胞の活性化が軽微である。
即ち、本発明は、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤を活性成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物を要旨とする。
「脳損傷」には交通事故等による外傷性のものに止まらず、脳梗塞や脳出血等の脳血管障害によるもの、アルツハイマー病、多発性硬化症等を含む脳変性疾患、脱髄疾患等も含む。「脳損傷の治療または予防」とは、脳挫傷、脳浮腫、脳梗塞、脳出血、虚血性脳症、アルツハイマー病、多発性硬化症、脱髄疾患の治療または予防を包含する
本発明は、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を有効成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物をも要旨とする。
本発明は、有効量の造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤を投与するすることを含む脳損傷の治療方法をも要旨とする。
本発明は、脳損傷の治療用薬剤を製造するための、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤の使用をも要旨とする。
本発明は、有効量のプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を投与するすることを含む脳損傷の治療方法をも要旨とする。
本発明は、脳損傷の治療用薬剤を製造するための、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の使用をも要旨とする
本発明は、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤およびプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を活性成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物をも要旨とする。
本発明は、１）ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの脳に外傷を与え、
２）外傷を与える前又は後に候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
３）該マウスにおける外傷の状態を、候補化合物を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む脳損傷の治療または予防に用いる化合物のスクリーニング方法をも要旨とする。

図１は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの大脳と小脳におけるＨ−ＰＧＤＳおよびＤＰ受容体ｍＲＮＡの発現レベルの変化を示すグラフである。
図２は、免疫組織染色法によるＴｗｉｔｃｈｅｒマウスのミクログリア細胞やマクロファージ細胞に局在しているＨ−ＰＧＤＳを示す模写図である。
図３は、活性化アストログリア細胞に発現したＤＰ受容体を示す模写図である。
図４は、実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスにおけるＨ−ＰＧＤＳおよびＤＰ受容体ｍＲＮＡの発現レベルの変化を示すグラフである。
図５は、実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスでのＨ−ＰＧＤＳ発現レベルの変化を示す模写図である。
図６は、外傷性脳損傷モデルでのＨ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡ発現量の経時変化を示すグラフである。
図７は、外傷性脳損傷モデルでのＤＰ受容体のｍＲＮＡ発現量の経時変化示すグラフである。
図８は、外傷性脳損傷モデルでの炎症の経時変化を示す模写図である。
図９は、外傷性脳損傷モデルにおけるＨ−ＰＧＤＳ発現の経時変化を示す模写図である。
図１０は、外傷性脳損傷モデルにおけるアストログリア細胞の活性化の経時変化を示す模写図である。
図１１は、外傷性脳損傷周辺の活性化アストログリア細胞でのＤＰ受容体の発現を示す模写図である。
図１２は、外傷性脳損傷から４日後の野生型マウスとヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの脳損傷の比較を示す模写図である。
図１３は、ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスでのＨＱＬ−７９によるアストログリア細胞の活性化とＤＰ受容体発現の抑制を示す模写図である。
図１４は、外傷性脳損傷後のＤＰ受容体発現に対するＨＱＬ−７９の抑制効果を示すグラフである。
図１５は、外傷性脳損傷に対するＨＱＬ−７９の回復促進効果を示す模写図である。
図１６は、外傷性脳損傷に対するＤＰ受容体拮抗薬の回復促進効果を示す模写図である。
図１７は、外傷性脳損傷から４日後の野生型マウスとＨ−ＰＧＤＳ遺伝子欠損マウスの脳損傷の比較を示す模写図である。
図１８は、トランスジェニックマウスの作製に用いた導入ベクターの構造を示す図である。
図１９は、マウスＨ−ＰＧＤＳ遺伝子の構造（上段）、ターゲティングベクターにおける変異配列の構造（中段）および相同組換え後のマウスゲノムＤＮＡ（下段）を示す図である。
図２０は、外傷性脳損傷モデルでの炎症の経時変化を組織へのエバンスブルー色素漏出反応を指標に調べた結果を示すグラフである。
図２１は、外傷性脳損傷後の組織傷害（色素漏出）に対するＨＱＬ−７９の抑制効果を示すグラフである（傷害を与える１時間前からＨＱＬ−７９の投与を開始した）。
図２２は外傷性脳損傷後の組織傷害（色素漏出）に対するＨＱＬ−７９の抑制効果を示す模写図である（傷害を与えた１日後からＨＱＬ−７９の投与を開始した）。
図２３は外傷性脳損傷後の組織傷害（色素漏出）に対するＨＱＬ−７９の抑制効果を示すグラフである（傷害を与えた１日後からＨＱＬ−７９の投与を開始した）。
図２４は外傷性脳損傷に伴うエバンスブルー色素の漏出に対するピナグランジンの抑制効果を示すグラフである。
図２５は、外傷性脳損傷に対するピナグランジンの進展抑制効果を示す模写図である。
図２６は外傷性脳損傷から２日後の野生型マウスとＨＰＧＤＳ ＫＯあるいはＤＰＲ ＫＯマウスの脳損傷を傷害部位への色素漏出を指標に比較したグラフである。
図２７は外傷性脳損傷後の組織傷害（色素漏出）に対するＢＷＡ ８６８Ｃおよびラマトロバンの抑制効果を示すグラフである。
発明の詳細な記述
Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤の例は、４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン（ＨＱＬ−７９）、１−アミノ−４−｛４−［４−クロロ−６−（２−スルホ−フェニルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルメチル］−３−スルホ−フェニルアミノ｝−９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−アントラセン−２−スルホン酸（チバクローンブルー）、１−アミノ−４−（４−スルファモイルアニリノ）−アントラキノン−２−スルホン酸（ＰＧＤ−０４２）もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物、２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジディル）テトラゾリウム塩化物（ＰＧＤ−０１６）またはそれらの水和物を含む。
本明細書中、「製薬上許容される塩」とは、塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
本発明はまた、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を活性成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物をも要旨とする。
プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の例は、（±）−３−ベンジル−５−（６−カルボキシヘキシル）−１−（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ヒダントイン（ＢＷ Ａ８６８Ｃ）、（＋）−（３Ｒ）−３−（４−フルオロベンゼンスルホンアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−プロピオン酸（ラマトロバン）、（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（５−ヒドロキシベンンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸、（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸（ピナグラジン）もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である。
更なるプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の例は、式（Ｉ）：

（式中、

Ｒは水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アシルオキシまたは置換されていてもよいアリールスルホニルオキシを表わし、Ｘは水素またはアルキルを表わし、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を含む。
好ましい態様では、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬は、式（ＩＡ）：

（式中、ＲおよびＸは前記と同意義であり、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である。
更に、好ましくはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬は、式（ＩＡ−ａ）：

（式中、ＲおよびＸは前記と同意義であり、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である
一般式（Ｉ）で表わされる化合物は公知であり以下のようにして製造できる。

（式中、Ｙ環、ＸおよびＲは前記と同意義であり、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
一般式（Ｉ）で示される化合物は、上記反応式で示されるごとく、一般式（ＩＩ）で示されるアミノ化合物に一般式（ＩＩＩ）で示されるカルボン酸またはその反応性誘導体を反応させることにより製造することができる。
本反応法における原料化合物（ＩＩ）中、

特公平６−２３１７０号明細書に記載されている。また、

特開昭６１−４９号明細書および特開平２−１８０８６２号明細書に記載されている。
一般式（ＩＩＩ）で示されるカルボン酸とは、４−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、６−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、７−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−フルオロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、６−フルオロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、４−ヒドロキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−ヒドロキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、６−ヒドロキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、７−ヒドロキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−アセトキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−ベンゾスルホニルオキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、６−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、５−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸、６−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸である。これらのカルボン酸は、それぞれ前記定義の置換基を有することができる。
これらのカルボン酸は、日本化学雑誌８８巻、７号、７５８−７６３（１９６７）、日本化学雑誌８６巻、１０号、１０６７−１０７２（１９６５）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（ｃ）１８９９−１９０５（１９６７）、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ．Ｃｈｅｍ．１０巻、６７９−６８１（１９７３）、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９巻、１１３１−１１３６（１９８２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９巻、１６３７−１６４３（１９８６）記載の方法に準じて合成できるものである。
一般式（ＩＩＩ）で示されるカルボン酸の反応性誘導体とは、対応する酸ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、沃化物）、酸無水物（例えば、ぎ酸もしくは酢酸との混合酸無水物）、活性エステル（例えば、スクシンイミドエステル）などを意味し、通常アミノ基のアシル化に使用するアシル化剤を包含する。例えば、酸ハロゲン化物とするときは、ハロゲン化チオニル（例えば、塩化チオニル）、ハロゲン化リン（例えば、三塩化リン、五塩化リン）、ハロゲン化オギザリル（例えば、塩化オギザリル）等と公知の方法（例えば、新実験化学講座１４巻１７８７頁（１９７８）；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ８５２−８５４（１９８６）；新実験化学講座２２巻１１５頁（１９９２））に従って反応させればよい。
反応は通常のアミノ基のアシル化反応の条件に従って行えばよく、例えば、酸ハロゲン化物による縮合反応の場合、溶媒としてエーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン）、ベンゼン系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）、その他、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルなどを使用し、要すれば塩基（例えば、トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの有機塩基、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどの無機塩基）の存在下、冷却下ないし室温あるいは加熱下、好ましくは−２０℃ないし氷冷下あるいは室温ないし反応系の加熱還流温度で、数分ないし数１０時間、好ましくは０．５時間ないし２４時間、より好ましくは１時間ないし１２時間実施すればよい。また、カルボン酸を反応性誘導体とはせずに、遊離のまま使用する場合には、アミンとカルボン酸の縮合反応に使用する縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール）の存在下に反応させる。
本発明の医薬組成物は造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤およびプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の両方を活性成分として用いてもよい。
本発明で使用する脳損傷の治療または予防に用いる化合物は上記のようにＨ−ＰＧＤＳ阻害剤又はプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬から選択することもできるが、次のようにしてスクリーニングすることもできる。
すなわち。
１）ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの脳に外傷を与え、
２）外傷を与える前又は後に候補化合物を該トランスジェニックマウスに投与し、
３）該マウスにおける外傷の状態を、候補化合物を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する。
ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの製造方法は２０００年１０月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０６９６３（ＷＯ ０１／２４６２７）に開示されている。その全体が本明細書の一部を構成する。

製造例１
造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスの作 製
ＷＯ ０１／２４６２７号に開示されている方法に従って造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスを作製した。
ヒト細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、ラットＨ−ＰＧＤＳ遺伝子のｃＤＮＡ（Ｃｅｌｌ ９０：１０８５−１０９７５，１９９７；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ８２０７１）をプローブしてヒトＨ−ＰＧＤＳのｃＤＮＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３３１５−３３２２，２０００；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ−０１４４８５）をクローニングした。次にベクターｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−１９９（１９９１））のクローニング部位（Ｓａｌ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）にヒトＨ−ＰＧＤＳのｃＤＮＡを挿入結合し、導入ベクターを構築した。図１８はこの導入ベクターにおける導入遺伝子の構成である。この導入遺伝子はＣＭＶエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターをＨ−ＰＧＤＳｃＤＮＡの上流に有しており、マウスの染色体に導入されると、これらのエンハンサーおよびプロモーターの作用によりＨ−ＰＧＤＳｍＲＮＡを大量に発現される。この導入ベクターをマイクロインジェクション法によりＦＶＢマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅより入手）の受精卵に注入した。遺伝子導入受精卵は定法に従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させ出生させた。得られたマウスの尾部からＤＮＡを抽出し、導入遺伝子の配列に基き合成されたプローブを用いて、サザンブロット法によりトランスジェニックマウスを選別した。
製造例２
造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素遺伝子欠損 （Ｈ−ＰＧＤＳ ＫＯ） マウスの作製
２００２年１月２８日に出願された特願２００２−１８６６６号に教示されている方法に従って造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素遺伝子欠損マウスを作製した。
公知のマウスＨ−ＰＧＤＳ遺伝子のエクソンＩＩ（Ｈ−ＰＧＤＳの蛋白質翻訳開始領域）を含む領域をＮｅｏ^ｒ遺伝子に置換し、さらにＨ−ＰＧＤＳ遺伝子の約７Ｋｂ上流にヘルペスウイルスのサイミジンカイネース遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）を組み込んで変異配列を調製し、この変異配列をベクターに組み込んでターゲティング・ベクターを作製した（図１９参照）。
電気穿孔法により、未分化の培養ＥＳ細胞（１．２×１０^７個）にターゲティング・ベクターを４８μｇ／ｍｌの割合で導入して遺伝子導入ＥＳ細胞を得た。これらの細胞をプレートに播き、２日後にＧ４１８およびガンシクロビルを培地に添加して更に７日間培養し、Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示すコロニーを得た。これらのコロニーを個別に分離し、さらに培養したのち、ＤＮＡを抽出してサザンブロッティングにより相同組換えＥＳ細胞を選別した。
次いで、この相同組換えＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの胚盤胞へ常法により注入し、仮親マウスへ移植して個体へと発生させた。
その結果、１０匹のキメラマウスを得た。得られたキメラマウスのうち、雄の個体と雌の野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスとを交配させて初代（Ｆ_１）マウスを得た。これらのＦ_１マウスから、サザンブロット分析により２倍体染色体の一方に変異配列が確認された個体（♂、♀）を選別し、これらを交配させて第２世代（Ｆ_２）マウスを得た。
最終的に、これらＦ_２マウスから、サザンブロット分析により２倍体染色体の両方に変異配列が確認された個体（ホモ接合体）および片方に変異配列が確認された個体（ヘテロ接合体）を選別しＨ−ＰＧＤＳ遺伝子欠損マウスを作製した。

遺伝性脱髄疾患における造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素とＤＰ受容体の 誘導
Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄａｓｅ欠損症であるヒトＫｒａｂｂｅ病のモデルマウスＴｗｉｔｃｈｅｒ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２０２：４７９−４８３，１９８０；Ｄｕｃｈｅｎ ＬＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１０３：６９５−７１０，１９８０；Ｓａｋａｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６６：１１１８−１１２４，１９９６；Ｔａｎｉｉｋｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５８：６４４−６５３，１９９９）を用いて、遺伝性の脱髄による脳損傷に伴うＨ−ＰＧＤＳとＤＰ受容体のｍＲＮＡの変化を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により定量した（図１参照）。Ｈ−ＰＧＤＳとＤＰ受容体のｍＲＮＡの発現量は、共に、脱髄による脳損傷に伴い増加する。
免疫組織染色法により、Ｈ−ＰＧＤＳはミクログリア細胞と脱髄の進んだ組織局所に集積するＡｍｅｂｏｉｄ細胞やマクロファージ細胞に発現することを同定した（図２参照）。一方、ＤＰ受容体は、脱髄の進んだ組織の周辺に分布する活性化されたアストログリア細胞に発現することを同定した（図３参照）。

自己免疫性脱髄疾患における造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素とＤＰ受容 体の誘導
ヒト多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎マウス（Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９１：９７−１０４，１９９９；Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｈｅｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３：２９１−３０１，２００２）においても、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定したＨ−ＰＧＤＳとＤＰ受容体のｍＲＮＡの発現量は、共に、脱髄による脳損傷と相関した増加を示す（図４参照）。
免疫組織染色法による観察では、Ｈ−ＰＧＤＳはミクログリア細胞と脱髄の進んだ組織局所に集積するＡｍｅｂｏｉｄ細胞やマクロファージ細胞に発現する（図５参照）。

外傷性脳損傷における造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素とＤＰ受容体の誘 導
外傷性大脳皮質傷害（Ｓｔａｂ ｗｏｕｎｄ）モデル（Ｓａｌｈｉａ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８８８：８７−９７，２０００；Ａｓａｈｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２１：７７２４−７７３２，２００１；Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｙｅｂｅｎｅｓ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７３：８１２−８２０，１９９９）を用いて、脳損傷におけるＨ−ＰＧＤＳとＤＰ受容体のｍＲＮＡの発現を調べた結果、Ｈ−ＰＧＤＳは損傷後２日目に最大値をとり（図６参照）、ＤＰ受容体は２日目から８日目にかけて持続的に増加した（図７参照）。
損傷の２４時間後から傷害部位周囲に集積するミクログリア細胞とマクロファージでＨ−ＰＧＤＳの誘導が起こり（図８と図９参照）、傷害部位周辺のアストログリア細胞ではＧＦＡＰとＤＰ受容体の発現が増強し、これらの現象は損傷の８日後まで持統した（図１０と図１１参照）。
傷害の程度を損傷部位への色素（エバンスブルー）の漏出反応（Ｋａｋｉｍｕｒａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１０７８−１０８０，１９９８）によって定量化した。損傷後２日目に最大値をとりその後治癒に伴って低下した（図２０参照）。

造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素阻害剤投与による遺伝性脱髄疾患におけ るアストログリア細胞の活性化の抑制
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤であるＨＱＬ−７９（４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン）を３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、１４日間、皮下投与すると、アストログリア細胞の活性化が抑制され、同時に、アストログリア細胞でのＤＰ受容体の発現が低下した（図１３参照）。

造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素阻害剤投与による外傷性脳損傷における ＤＰ受容体の誘導の抑制と脳損傷の回復促進
Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤であるＨＱＬ−７９を３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、傷害を与える１時間前から４日間、マウスに経口投与すると、Ｓｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルにおける組織損傷領域でのＤＰ受容体ｍＲＮＡ量は低下し（図１４参照）、脳損傷の回復促進が認められた（図１５参照）。この治療効果は傷害部位への色素漏出反応を指標とした実験によっても確認された（図２１参照）。
さらに、傷害を与えた後からＨ−ＰＧＤＳ阻害剤の投与を開始しても損傷の拡大を抑制することが確認された（図２２、２３参照）。

プロスタグランジンＤ受容体拮抗薬投与による外傷性脳損傷の軽減
Ｓｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルマウスに、ＤＰ受容体拮抗薬であるＢＷ Ａ８６８Ｃ（（±）−３−ベンジル−５−（６−カルボキシヘキシル）−１−（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエチルアミノ）ヒダントインを損傷の当日から１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で４日間、静脈内投与すると脳損傷の回復促進が認められ、組織損傷部位周辺のアストログリアの活性化が抑制された（図１６参照）。
Ｓｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルマウスに対するプロスタグランジンＤ受容体拮抗薬であるＢＷ Ａ８６８Ｃあるいはラマトロバン（（＋）−（３Ｒ）−３−（４−フルオロベンゼンスルホンアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−プロピオン酸）の効果を損傷部位への色素漏出量を指標に評価した。すなわち、脳損傷惹起２日後にエバンスブルー色素を静脈内投与し、その後２時間の組織への色素漏出量を測定した。ＢＷ Ａ８６８Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ）を脳損傷惹起３時間後および１日後に静脈内投与すると傷害部位への色素漏出を抑制した（図２７参照）。
ラマトロバン（３０ｍｇ／ｋｇ）を惹起３時間後および１日後に経口投与すると傷害部位への色素漏出を抑制した（図２７参照）。

Ｓｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルに対するＤＰ受容体拮抗薬であるピナグラジンの効果を損傷部位への色素漏出量で評価した。すなわち、脳損傷惹起２日後にエバンスブルー色素を静注し、その後２時間における色素の組織中漏出量を測定した。その結果、ピナグラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を脳損傷惹起１時間前および１日後に経口投与すると、脳損傷に伴って認められるエバンスブルー色素漏出量の増加が抑制された。またピナグラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）は惹起３時間および１日後の後処置によっても色素の漏出を抑制した（図２４参照）。さらに病理組織学的検討においてピナグラジンはいずれの投与方法によってもＳｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルにおける脳損傷の進展を抑制した（図２５参照）。

ヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現による外傷性脳損傷の増悪
製造例１で作成したヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスを用いたＳｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルでは、損傷部位でのマクロファージの集積、および、抗ＧＦＡＰ抗体を用いて免疫組織化学的に調べたアストログリア細胞の活性化が、野生型マウスに比べて顕著であり治癒は遅延した（図１２参照）。

造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素遺伝子欠損による外傷性脳損傷の軽減
製造例２で作製した造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素遺伝子欠損（ＨＰＧＤＳ ＫＯ）マウス（ホモ接合体）を用いたＳｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルでは、損傷部位での出血、抗ＧＦＡＰ抗体を用いて免疫組織化学的に調べたアストログリアの活性化が、さらに傷害部位での色素漏出が野生型マウスに比べて軽微であった（図１７および図２６参照）。
一方、ＤＰ受容体遺伝子欠損（ＤＰＲ ＫＯ）マウス（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７；２８７（５４６０）：２０１３−２０１７，２０００）を用いたＳｔａｂ ｗｏｕｎｄモデルでは傷害部位での色素漏出が野生型マウスに比べて軽微であった（図２６参照）。
本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を治療に用いるには、通常の経口又は非経口投与用の製剤として製剤化する。本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を含有する医薬組成物は、経口及び非経口投与のための剤形をとることができる。即ち、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与製剤、あるいは、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などの注射用溶液又は懸濁液、吸入薬、点眼薬、点鼻薬、坐剤、もしくは軟膏剤、貼布剤、パップ剤などの経皮投与用製剤、経皮吸収剤などの非経口製剤とすることもできる。好ましくは、経口剤または注射用薬剤として用いる。
これらの製剤は当業者既知の適当な担体、賦形剤、溶媒、基剤等を用いて製造することができる。例えば、錠剤の場合、活性成分と補助成分を一緒に圧縮又は成型する。補助成分としては、製剤的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例、トウモロコシでん粉）、充填剤（例、ラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例、でん粉グリコール酸ナトリウム）又は滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム）などが用いられる。錠剤は、適宜、コーティングしてもよい。シロップ剤、液剤、懸濁剤などの液体製剤の場合、例えば、懸濁化剤（例、メチルセルロース）、乳化剤（例、レシチン）、保存剤などを用いる。注射用製剤の場合、溶液、懸濁液又は油性もしくは水性乳濁液の形態のいずれでもよく、これらは懸濁安定剤又は分散剤などを含有していてもよい。軟膏剤、貼布剤、パップ剤などの経皮投与用製剤、経皮吸収剤の場合は、水性基剤（水、低級アルコール、ポリオール）または油性基剤（高級脂肪酸エステル類（イソプロピルミリステート）、親油性アルコール）を用いて製剤化する。
本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬は、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、経口投与の場合、体重１ｋｇあたり、１日０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜３０ｍｇ、非経口投与の場合、体重１ｋｇあたり、１日０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜５ｍｇ、より好ましくは０．００１〜３ｍｇを投与する。これを１〜４回に分割して投与すればよい。
製剤例
製剤例１
以下の成分を含有する錠剤を製造する：
式（Ｉ）で表わされる化合物 １０ｍｇ
乳糖 ９０ｍｇ
微結晶セルロース ３０ｍｇ
ＣＭＣ−Ｎａ １５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ５ｍｇ
１５０ｍｇ
式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖、微結晶セルロース、ＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩）を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウム混合し、製錠用混合末を得る。本混合末を直打し、１５０ｍｇの錠剤を得る。
製剤例２
活性成分５０ｍｇを含む懸濁剤は次のように製造する：
式（Ｉ）で表わされる化合物 ５０ｍｇ
ナトリウムカルボキシメチルセルロース ５０ｍｇ
シロップ １．２５ｍｌ
安息香酸溶液 ０．１０ｍｌ
香料 ｑ．ｖ．
色素 ｑ．ｖ．
精製水を加え合計 ５ｍｌ
活性成分をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけ、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびシロップと混合して滑らかなペーストにする。安息香酸溶液および香料を水の一部で希釈して加え、攪拌する。ついで水を十分量加えて必要な体積にする。
製剤例３
静脈用製剤は次のように製造する：
式（Ｉ）で表わされる化合物 １００ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリド １０００ｍｌ
上記成分の溶液は通常、１分間に１ｍｌの速度で患者に静脈内投与される。
製剤例４
常法により次の組成のゼラチン硬カプセル剤を調製した。
ＨＱＬ−７９ １０ｍｇ
デンプン ５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
製剤例５
常法により次の組成の錠剤を調製した。
ＨＱＬ−７９ １０ｍｇ
セルロース、微晶質 ５００ｍｇ
二酸化ケイ素 １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
以上詳述したように、本発明の組成物は脳血管障害、脳変性疾患、脱髄疾患等の疾患の処置に使用できる。
脳損傷局所のミクログリア細胞やマクロファージで誘導されるＨ−ＰＧＤＳを阻害したり、損傷部位の周辺のアストログリア細胞で発現するＤＰ受容体の活性化を阻害することにより、プロスタグランジンＤ_２が関与する脳損傷を治療または予防することが可能となる。
プロスタグランジンＤ_２は多発性硬化症患者で生合成が活発であり（Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４：１７３１−１１７３５，２００１）、そのモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスの発症過程で増悪因子として働いている可能性が高いので、Ｈ−ＰＧＤＳの特異的な阻害剤や受容体拮抗薬を用いると、現在行われているステロイド療法や免疫抑制剤に代わる、多発性硬化症の治療や予防にの有益な療法になりうる。さらにこれらの薬剤は、自己免疫性の細胞障害や神経細胞死に伴う局所炎症反応を抑止することで、アルツハイマー病を含む神経原繊維変化を伴う難治疾患の治療にも応用できる。

Claims (13)

1. 造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤を活性成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物。
2. Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤が４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン、１−アミノ−４−｛４−［４−クロロ−６−（２−スルホ−フェニルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルメチル］−３−スルホ−フェニルアミノ｝−９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−アントラセン−２−スルホン酸、１−アミノ−４−（４−スルファモイルアニリノ）−アントラキノン−２−スルホン酸、もしくはそれらの製薬上許容される塩またはそれらの水和物、または２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジディル）テトラゾリウム塩化物またはその水和物である請求項１に記載の医薬組成物。
3. プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を有効成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物。
4. プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬が（±）−３−ベンジル−５−（６−カルボキシヘキシル）−１−（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ヒダントイン、または（＋）−（３Ｒ）−３−（４−フルオロベンゼンスルホンアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−プロピオン酸、（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（５−ヒドロキシベンンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸、または（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸、もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である請求項３に記載の医薬組成物。
5. プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬が、式（Ｉ）：
   

   

   （式中、
   

   

   Ｒは水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アシルオキシまたは置換されていてもよいアリールスルホニルオキシを表わし、Ｘは水素またはアルキルを表わし、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
   で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である請求項３に記載の医薬組成物。
6. プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬が、式（ＩＡ）：
   

   

   （式中、ＲおよびＸは前記と同意義であり、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
   で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である請求項３に記載の医薬組成物。
7. プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬が、式（ＩＡ−ａ）：
   

   

   （式中、ＲおよびＸは前記と同意義であり、α鎖の二重結合はＥ配置またはＺ配置を表わす）
   で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である請求項３に記載の医薬組成物。
8. 有効量の造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤を投与することを含む脳損傷の治療方法。
9. 脳損傷の治療用薬剤を製造するための、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤の使用。
10. 有効量のプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を投与するすることを含む脳損傷の治療方法。
11. 脳損傷の治療用薬剤を製造するための、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の使用。
12. 造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤およびプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を活性成分として含む、脳損傷の治療または予防に用いる医薬組成物。
13. １）ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの脳に外傷を与え、
    ２）外傷を与える前又は後に候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
    ３）該マウスにおける外傷の状態を、候補化合物を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
    ことを含む脳損傷の治療または予防に用いる化合物のスクリーニング方法。

Images