JPWO2003040025A1 - 微粒子膜およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

高密度、且つ、高精度で規則的に配置された微粒子膜の提供を可能とする。微粒子膜は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜であって、前記各タンパク質は、それぞれ縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部および１個以上の第２結合部を有し、前記各第１結合部は、隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記第２結合部は、前記基板と結合しており、前記第２結合部を構成する縮合したアミノ酸の少なくとも一部が置換されている。

Description

［技術分野］
本発明は、微粒子膜の作製方法に関し、特に大きさが数十ナノメータ程度の微粒子を高精度で規則的に配置する技術に関する。
［背景技術］
微粒子は、その体積に対する表面積の比が大きく、体積に対する表面積の比が比較的小さい材料とは一般に異なる挙動を示す。例えば、酸化チタンおよび酸化亜鉛等の無機材料の微粒子は、紫外線除去作用、抗菌作用、触媒作用等を有する。
また、無機材料の微粒子のうち、ナノメーターサイズの直径を有する微粒子（超微粒子）には、量子効果が期待されている。このため、微粒子の工業的利用が注目されている。特に、直径がナノメーターサイズである超微粒子にあっては、量子効果を利用した素子の工業的な製造技術の開発が急務とされている。
直径が約１０〜２０ｎｍであるタンパク質微粒子は、バイオセンサー等への利用に関して注目されている。特に、種々のタンパク質微粒子には、無機材料を内包できる微粒子が存在する。このようなタンパク質微粒子は、上述した無機材料の微粒子と、タンパク質微粒子との両方の性質を兼ね備える。
上述した微粒子は、通常、コロイド溶液の形態で流通している。しかし、コロイド溶液のままでは微粒子の機能を有効利用する上で不利である。従って、原料として上記のコロイド溶液を利用した、微粒子の機能を工業的に有効利用できる技術が模索されている。
従来から、タンパク質微粒子からなる２次元結晶膜は、電子顕微鏡によるタンパク質の結晶構造解析に利用されている。このとき、タンパク質微粒子からなる２次元結晶膜は、トラフにタンパク質粒子のコロイド溶液を満たし、このコロイド溶液の気液界面でタンパク質微粒子を濃縮することによって作製されている。この方法では、２次元結晶膜が気液界面に形成されているので、振動によって２次元結晶膜が壊れやすい。
そこで現在、工業的に有効利用できる技術として、基板上に微粒子を配置する方法が最も有効と考えられている。従って、微粒子が高密度で規則的に配置された理想的な微粒子膜を基板上に簡単に形成する技術の確立が望まれている。
これまでに、タンパク質微粒子を基板上に配置する技術として、吉村らにより開発された転写法（Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、Ｖｏｌ．３４、ｐ９９〜１０７、（１９９７））を、以下、第１２図を参照しながら説明する。
まず、第１２図（ａ）に示すステップで、濃度２％のシュークロース溶液２３に、タンパク質微粒子４５を分散した液体２４を、シリンジ２５を用いて注入する。
次に、第１２図（ｂ）に示すステップで、液体２４は、シュークロース溶液２３上に浮上する。
次に、第１２図（ｃ）に示すステップで、最初に気液界面に到達した液体２４は、タンパク質微粒子のアモルファス膜２６を形成し、後から到達したタンパク質微粒子４５は、アモルファス膜２６の下に付着していく。
次に、第１２図（ｄ）に示すステップで、アモルファス膜２６の下に、タンパク質微粒子４５の２次元結晶膜２７を形成する。次いで、第１２図（ｄ）に示すように、アモルファス膜２６とタンパク質微粒子４５の２次元結晶膜２７とからなる膜２８の上に、基板２１（シリコンウェハ、カーボングリッド、ガラス基板等）を載置することによって、膜２８が基板２１の表面に転写される。
しかしながら、上記の従来の方法では、第１２図（ｄ）に示すステップで、膜２８の破断が発生する可能性が高く、また転写の際にも２次元結晶膜２７の一部のタンパク質微粒子が脱落する可能性が高い。このため、大面積の２次元結晶膜を欠陥なく基板に転写することが難しいという不具合がある。
そこで上述の吉村らの方法において、ｐＨ７付近でタンパク質がマイナス電荷を持つような場合に、基板の表面をｐＨ７付近でプラス電荷が帯電するようにアミノプロピルメトキシシランで処理することによって、タンパク質微粒子の基板表面への転写を促進する方法が示されている。また、タンパク質微粒子同士は互いに結合しやすいことも明らかにされている。
しかし、上記方法で得られた２次元結晶膜におけるタンパク質微粒子の基板への転写の状況をＳＥＭやＡＦＭで観察すると、タンパク質微粒子の対称軸の方向はランダムになっている。これは、上記方法では、タンパク質微粒子の基板に接触する部位がランダムになっているからである。従って、上記方法では、タンパク質微粒子が比較的凝集した構造を形成することがあっても、タンパク質微粒子の対称軸の方向が揃っており、タンパク質微粒子が高密度、且つ、高精度で規則的に配置された２次元結晶膜を得ることが困難である。つまり、２次元結晶膜の結晶軸の方向制御が非常に難しい。
［発明の開示］
本発明は、上記不具合を解決するためになされたものであり、ナノメーターサイズの直径を有する微粒子が、高密度、且つ、高精度で規則的に配置された微粒子膜を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜であって、前記各タンパク質は、それぞれ縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部および１個以上の第２結合部を有し、前記各第１結合部は、隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記第２結合部は、前記基板と結合しており、前記第２結合部を構成する縮合したアミノ酸の少なくとも一部が置換されているものである。
また、本発明は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を塩基性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成する工程、およびマイナスに帯電した基板に前記タンパク質に接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、を有する。
また、本発明は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を酸性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成する工程、およびプラスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、を有する。
また、本発明は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、前記各タンパク質は複数個の対称軸を有しており、前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を塩基性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成することにより、前記複数個の対称軸の中から特定の１つの対称軸を選択する工程、およびマイナスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、を有する。
また、本発明は、基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、前記各タンパク質は複数個の対称軸を有しており、前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を酸性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成することにより、前記複数個の対称軸の中から特定の１つの対称軸を選択する工程、およびプラスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、を有する。
［発明を実施するための最良の形態］
以下、本発明を詳細に説明する。
上記の従来の方法で得られる２次元膜では、タンパク質微粒子は、その対称軸がランダムな方向を向いた状態で配置されており、周期的な構造が見られない。この原因は、２次元結晶膜内でタンパク質微粒子同士の相互作用に特異性がないからであると考えられる。このため、タンパク質微粒子は、その表面エネルギーを最小化するために凝集し、タンパク質微粒子の対称軸の方向がランダムとなると考えられる。
そこで本発明者は、タンパク質微粒子を、その対称軸が基板に対して特定の方向に向いた状態で基板上に配置することによって、タンパク質微粒子の対称性を利用して周期的な構造を有する２次元結晶膜が作製可能であると考えた。つまり、タンパク質微粒子が基板上に配置される際に、全てのタンパク質微粒子の方向を１つの方向に向け、タンパク質微粒子の自由回転を抑制し、タンパク質微粒子間の特異的相互作用によって、タンパク質微粒子が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜が得られると考えた。
以下に説明する本発明の実施形態は、上記考察に基づくものである。以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。なお、簡単のために、各実施形態に共通する構成要素は同一の参照符号で示す。また、本明細書中における「結合」との記載は、特に指示のない限り「互いに引きつけ合うことによる固定」を意味する。
（実施形態１）
本実施形態では、基板の表面上に微粒子が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜を作製する方法を説明する。
まず、本実施形態の２次元結晶膜の作製方法の概略を、第１図を参照しながら以下に説明する。
最初に、第１図（ａ）に示す工程で、基板１１を用意し、その表面をマイナスチャージを持つように処理する。
次に、第１図（ｂ）に示す工程で、一部がプラスチャージを帯電したアポフェリチン微粒子１５を分散した液体１６を用意し、基板１１を液体１６中に浸漬する。このことによって、プラスチャージとマイナスチャージとが互いに引きつけ合い、マイナスチャージを持つように処理された基板１１の表面にアポフェリチン微粒子１５が結合する。
次に、第１図（ｃ）に示す工程で、液体１６中から基板１１を取り出す。
以上の工程を経て、基板１１の表面上に形成されたアポフェリチン微粒子１５の２次元結晶膜が得られる。
次に、各工程について詳細に説明する。
本実施形態では、第１図（ａ）に示す工程において、基板１１の表面をマイナスチャージに帯電させるために、基板１１上にカルボキシエチルトリメトキシシランのＳＡＭ膜（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｆｉｌｍ）を、横川らの手法（平成１１年度新エネルギー・産業技術総合開発機構新規産業創造型提案公募事業研究成果報告書「新規なディスプレイへの応用を目指したカメレオン型発色システムの創世」、平成１２年３月）により形成する。
本実施形態では、第１図（ｂ）に示す工程において、上記第１図（ａ）に示す工程で得られた基板１１を、アポフェリチン微粒子１５を分散した液体１６に浸漬する。本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、馬の脾臓や肝臓等の臓器から抽出されたフェリチンから得られたものである。アポフェリチン微粒子１５は、非常に対称性の高い構造を有するタンパク質であり、４回対称軸Ｓ４、３回対称軸Ｓ３および２回対称軸Ｓ２を有する。ここでは、容易に理解できるように、アポフェリチン微粒子１５をほぼ立方体であると見なして説明する。
第２図は、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５を模式的に表す図である。アポフェリチン１５を立方体であると見なすと、第２図に示すように、４回対称軸Ｓ４は立方体の６つの面のそれぞれの中心を、３回対称軸Ｓ３は立方体の各頂点を、２回対称軸Ｓ２は立方体の各辺の中点を通る。対称軸についてより詳細に説明する。４回対称軸Ｓ４は部位Ｒ４ａおよびＲ４ｂを通る軸である。３回対称軸Ｓ３は部位Ｒ３ａおよびＲ３ｂを通る軸である。２回対称軸Ｓ２は部位Ｒ２ａおよびＲ２ｂを通る軸である。なお、本図では、４回対称軸Ｓ４、３回対称軸Ｓ３および２回対称軸Ｓ２を代表的に１本ずつ示している。
アポフェリチン微粒子１５は、２回対称軸Ｓ２付近の各部位Ｒ２において、別のアポフェリチン微粒子１５と２価の陽イオンを介して２対の塩橋を形成することができる。さらに、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、３回対称軸Ｓ３付近の各部位Ｒ３が、中性条件下ではプラスチャージに帯電するように遺伝子工学的に改変されている。本実施形態のアポフェリチン微粒子１５における上述の塩橋および遺伝子工学的改変については後に詳しく述べる。
第３図（ａ）および第３図（ｂ）は、第１図（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する断面図および上面図である。上述のように準備された液体１６と基板１１とを用いることによって、アポフェリチン微粒子１５は、３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３のいずれか１つで基板１１の表面に静電相互作用により結合する。このとき、アポフェリチン微粒子１５は、３回対称軸Ｓ３を基板１１表面に対してほぼ垂直に向けた状態で、基板１１の表面上にまばらに存在する。さらに、アポフェリチン微粒子１５の基板１１の表面への結合が進行すると、第３図（ａ）に示すように、隣接するアポフェリチン微粒子１５は、部位Ｒ２において互いに塩橋Ｂ１を形成する。従って、３回対称軸Ｓ３を基板１１表面に対してほぼ垂直に向けた状態で、部位Ｒ２において互いに塩橋Ｂ１を形成しながら基板１１の表面に結合する。つまり、第３図（ｂ）に示すように、全てのアポフェリチン微粒子１５が基板１１の表面上に最密となるように整列する。
上記の現象は、基板１１の表面上で連続して起こり、第３図（ｂ）に示すように、上面からは見かけ上６回対称であり、実際には、３回対称の２次元結晶膜が形成される。なお、このとき、アポフェリチン微粒子１５は全体としてはマイナスチャージに帯電しているので、堆積された１層目のアポフェリチン微粒子１５の上に、さらに積層するようにアポフェリチン微粒子１５が結合することはない。従って、アポフェリチンは単層膜を形成することになる。
第４図は、本実施形態で得られる２次元結晶膜の電子顕微鏡写真である。第３図（ｂ）に模式的に示す２次元結晶膜は全く隙間のない膜であるが、実際のアポフェリチン微粒子１５はほぼ球状であるので、第４図に示すように隙間が存在する。
本実施形態によれば、第４図に示すように、アポフェリチン微粒子１５が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜が得られる。
特に、本実施形態では、基板１１を液体１６中に浸漬することによって、アポフェリチン微粒子１５が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜が容易に得られる。つまり、本実施形態の方法において、基板１１と液体１６とを接触させる際に高い精度が要求される操作は全くない。従って、量産化に非常に適している。
なお、本実施形態では、第１図（ｂ）に示す工程において、基板１１を液体１６中に浸漬したが、上記吉村らの方法に示すように、基板１１の表面に２次元結晶膜を転写する方法を用いることも可能である。つまり、液体１６と基板１１の表面とが接触する方法であれば、いかなる方法を用いてもよい。
また、本実施形態では、非常に対称性の高いアポフェリチン微粒子１５を用いたが、微粒子に対して高い対称性が必ずしも必要というわけではない。基板１１の表面に結合する１つ以上の基板結合部位（第２結合部）と、相互結合可能な複数個の相互結合部位（第１結合部）とを備える微粒子を用いることによって、高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜を得ることができる。これは、対称性がほとんどない微粒子であっても、２次元結晶膜内でタンパク質微粒子同士に特異的な相互作用があれば、その表面エネルギーを最小化するために基板１１の表面上に規則的に整列し、繰り返し構造を形成するからである。従って、本実施形態ではアポフェリチン微粒子１５を用いたが、これに限定されない。
勿論、本実施形態で用いるアポフェリチン微粒子１５のように、非常に高い対称性を有する微粒子を用いることがより好ましい。これは、高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜をさらに容易に得ることができ、また、得られる２次元結晶膜の対称性も非常に高くなるからである。アポフェリチン微粒子１５に代わる非常に高い対称性を有する微粒子としては、例えばＤｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質などのようなほぼ球状のタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質を、基板１１の表面に結合する１つ以上の基板結合部位と、相互に結合可能な３つ以上の相互結合部位とを備えるように遺伝子工学的に改変することによって、アポフェリチン微粒子１５の代わりに本実施形態で全く同様に用いることができる。
なお、微粒子の相互結合部位は、塩橋等の静電相互作用に限られず、親水相互作用、疎水相互作用および形状の補完性のうち、少なくともいずれか１つの作用によって互いに結合する部位であればよい。
以下、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５を詳細に説明する。
本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、分子量２万程度のサブユニットの２４量体であり、２４量体全体の外径が１２ｎｍ程度の球状のタンパク質である。通常、生体内ではフェリチンとして存在する。フェリチンは、アポフェリチン微粒子と、アポフェリチン微粒子の中に内包される３０００分子程度の酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）との複合体である。アポフェリチン微粒子は、金属粒子、金属酸化物等の様々な無機材料粒子を内包する性質があり、例えば、金、酸化鉄、水酸化コバルト等の粒子を内包することができる。従って、上述の２次元結晶膜を作製するアポフェリチン微粒子１５として、無機材料粒子を内包するものを用いることも可能である。
第５図は、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子の構造を表す図である。本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、第５図に示すように、無機材料粒子を保持することが可能な直径６ｎｍ程度の中空コア１２を有し、中空コア１２の周囲をアポフェリチンタンパク質分子（サブユニット）１４で囲む構造を有する。
アポフェリチン微粒子１５は、上記方法の説明でも述べたように、非常に対称性の高い構造を有している。第５〜７図は、アポフェリチン微粒子１５が備える異なる対称軸の方向から見た図をそれぞれ表す。第５〜７図に示すように、アポフェリチン微粒子１５は、４回対称軸Ｓ４、３回対称軸Ｓ３および２回対称軸Ｓ２を有している。
アポフェリチン微粒子１５は、全体としてはマイナスチャージが優位に帯電しているので、中性条件下ではアポフェリチン微粒子１５同士は、互いに反発し合う。このため、アポフェリチン微粒子１５は凝集体を作らずに液体１６中に分散する。
しかし、アポフェリチン微粒子１５は、第７図に示すように、２回対称軸Ｓ２の付近の表面にグルタミン酸残基が現れている部位（グルタミン酸表出部位）１７を備えている。このため、２つのアポフェリチン微粒子１５は、それぞれのグルタミン酸表出部位１７の間にイオン（例えば、カドミウム等）を挟んで互いに対向するような、静電相互作用による結合（塩橋）を形成することができる。なお、本明細書中では、上記の静電相互作用による結合を「塩橋」と称する。
第８図は、２つのアポフェリチン微粒子１５の間に形成された塩橋を模式的に示す図である。グルタミン酸表出部位１７は、第７図に示すように、２回対称軸Ｓ２付近の部位Ｒ２の表面に位置する１対のグルタミン酸残基１７ａを有する。グルタミン酸残基１７ａは、各サブユニット１４に１つずつ存在する。塩橋を形成する際には、第８図に示すように、１対のグルタミン酸残基１７ａの各々と、対向する１対のグルタミン酸残基１７ａの各々との間に２価の陽イオン（ここではカドミウムで示す）が挟まれる。従って、２つのアポフェリチン微粒子１５の間で塩橋が形成されると、２つのアポフェリチン微粒子１５のそれぞれの自由回転が互いに阻害される。また、第３図（ａ）に示すように、２つのアポフェリチン微粒子１５は、同じ方向を向いて互いの位置関係を固定する。
なお、塩橋を形成するためには、液体１６中に２価以上の陽イオン（例えばカドミウム）を添加しておく必要があり、５〜１０ｍＭの範囲内で添加しておくことが好ましい。一般的には２価の陽イオンが用いられる。
次に、アポフェリチン微粒子１５に施されている遺伝子工学的改変について説明する。アポフェリチン微粒子１５をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、アポフェリチン微粒子１５のアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。なお、アポフェリチン微粒子１５は、２４個の同一のサブユニット１４から構成されているので、本明細書中では「アポフェリチン微粒子１５をコードするＤＮＡの塩基配列」および「アポフェリチン微粒子１５のアミノ酸配列」は、それぞれサブユニット１４をコードするＤＮＡの塩基配列、およびサブユニット１４のアミノ酸配列を意味する。
ウマ肝臓由来の天然型アポフェリチン微粒子のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列は既知であり、立体構造についても解明されている。特に、天然型アポフェリチン微粒子は、３回対称軸Ｓ３に沿って内部の中空コアに通じるチャネルを有する。チャネルの周りには、中性条件下でマイナスチャージを有するアミノ酸（酸性アミノ酸）が存在している。
天然型アポフェリチン微粒子のサブユニットは、１７５残基のアミノ酸残基から構成され、そのうち、酸性アミノ酸は、３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３に多く位置する。なお、天然型アポフェリチン微粒子の１〜８番目のアミノ酸残基は、生体内においてプロセシングを受けて欠失する。このため、本実施形態のアポフェリチン微粒子１５のＤＮＡの塩基配列（配列番号１）では２５番目の塩基を１番目として、アミノ酸配列（配列番号２）では９番目のチロシンを１番目として記載している。
本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、配列番号１に示すＤＮＡの塩基配列に基づいて公知の遺伝子組み換え技術およびタンパク質の発現方法を用いることによって作製される。アポフェリチン微粒子１５は、３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３に位置するアミノ酸が中性条件下でプラス電荷を持つアミノ酸（塩基性アミノ酸）に置換されている。具体的には、配列番号１および２に示すように、アポフェリチン微粒子１５のアミノ酸配列の１１２番目および１１３番目のリジンは、それぞれアラニンおよびグルタミンから置換されたものである。このため、３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３の表面がプラスチャージに強く帯電する。従って、アポフェリチン微粒子１５は、３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３においてマイナスチャージに帯電した基板１１の表面に静電相互作用によって結合する。
なお、ここでは１１２番目および１１３番目のアミノ酸をリジンに置換したが、塩基性のアミノ酸であれば、他の塩基性のアミノ酸（すなわち、アルギニンおよびヒスチジン）であってもよい。ただし、この塩基性のアミノ酸の中でも、マイナスに帯電した基板との静電相互作用を考慮すれば、いずれもリジンに置換することが望ましい。また、１１２番目のアミノ酸と１１３番目のアミノ酸とは、同じアミノ酸であってもよく、異なるアミノ酸であってもよい。さらに、１１２番目および１１３番目のアミノ酸をリジンのような塩基性のアミノ酸に置換するとともにマイナスに帯電した基板を用いたが、極性を逆にして、１１２番目および１１３番目のアミノ酸を酸性のアミノ酸（すなわち、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、特にこの中でもグルタミン酸、アスパラギン酸）に置換し、基板をプラスに帯電させることにしてもよい。この場合においても、１１２番目のアミノ酸と１１３番目のアミノ酸とは、同じアミノ酸であってもよく、異なるアミノ酸であってもよい。このことは、後述する実施の形態２以降においても同様である。
一方、アポフェリチン微粒子１５の３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３以外の表面は、プラスチャージとマイナスチャージとが混在しており、全体としてはマイナスチャージが優位となっている。このため、上記第１図（ｂ）に示す工程において、アポフェリチン微粒子１５の３回対称軸Ｓ３付近の部位Ｒ３以外の表面と、マイナスチャージに帯電した基板１１の表面との間に斥力が働く。従って、アポフェリチン微粒子１５の３回対称軸Ｓ３は、基板１１の表面に対してほぼ垂直に固定される。
なお、上記第１図（ｂ）に示す工程において、液体１６のｐＨを、液体１６中において基板１１の表面がマイナスチャージを帯電し、アポフェリチン微粒子１５の部位Ｒ３がマイナスチャージに帯電するｐＨ３以上１１以下の範囲内に調整することが好ましく、ｐＨ５以上１０以下の範囲内に調整することが特に好ましい。
また、上記第１図（ｂ）に示す工程において、２次元結晶膜が形成され始める核が多数生じないように、アポフェリチン微粒子１５が十分希薄な液体１６を用意することが好ましい。実際には、液体１６におけるアポフェリチン微粒子１５の濃度は、１００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、さらには３０μｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
あるいは、液体１６を用いる代わりに、アポフェリチン微粒子１５を全く含まない分散媒を用意して基板１１を浸漬し、続いてこの分散媒にアポフェリチン微粒子１５を高濃度で含むコロイド溶液を極めて緩やかに添加する（例えば１０時間かけてアポフェリチン微粒子１５の最終濃度を１００μｇ／ｍｌにする）方法を用いてもよい。
本実施形態では、基板１１の表面上に２次元結晶膜を形成したが、これに限られない。例えば、液体および液晶等の表面上にも２次元結晶膜を形成することが可能である。
また、本実施形態では、基板１１の表面が、アポフェリチン微粒子１５を静電相互作用によって結合するように処理されている。しかし、静電相互作用に限られず、他の相互作用（例えば、親水相互作用、疎水相互作用および形状の補完性）を利用する構成としてもよい。
さらにまた、アポフェリチン微粒子１５の代わりに他のタンパク質微粒子を用いる場合、基板１１の表面に結合させる部位のアミノ酸と、基板１１の表面のチャージとの組み合わせは、塩基性アミノ酸とマイナスチャージ、あるいは、酸性アミノ酸とプラスチャージとなるように選択することが好ましい。これらの組み合わせでは、上記ｐＨ条件において、静電相互作用によってタンパク質微粒子と基板１１の表面とが容易に結合する。
使用するタンパク質微粒子の基板１１に結合させる部位に、基板１１の表面のチャージと反発するアミノ酸が含まれている場合には、静電相互作用によって結合するように遺伝子工学的に塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸とを置換したタンパク質微粒子を代わりに用いることが好ましい。
本実施形態では、基板１１の表面上にＳＡＭ膜を形成して用いている。ＳＡＭ膜は、基板１１の表面上に形成された単分子膜であり、アポフェリチン微粒子１５との距離を高い精度で制御できる。なお、基板１１の表面は、ＳＡＭ膜以外の単分子膜によって被覆されていてもよい。また、リン脂質からなる脂質二重膜（ＬＢ膜）を基板１１の表面上に形成してもよい。
（実施形態２）
本実施形態では、アポフェリチン微粒子１５の４回対称軸Ｓ４付近の部位を基板１１の表面に結合させることによって、基板の表面上に微粒子が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜を作製する方法を説明する。なお本実施形態は、上記実施形態１とほぼ同じ構成であり、本実施形態の２次元結晶膜の作製方法の概略は、第１図に示す通りである。但し、アポフェリチン微粒子１５のアミノ酸配列が異なる。
本実施形態のアポフェリチン微粒子１５は、２回対称軸Ｓ２付近の各部位Ｒ２において、別のアポフェリチン微粒子と２価の陽イオンを介して２対の塩橋を形成することができる。さらに、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５は、４回対称軸Ｓ４付近の各部位Ｒ４が、中性条件下ではプラスチャージに帯電するように遺伝子工学的に改変されている。
具体的には、本実施形態のアポフェリチン微粒子１５は、配列番号３に示すＤＮＡの塩基配列に基づいて公知の遺伝子組み換え技術およびタンパク質の発現方法を用いることによって作製される。アポフェリチン微粒子１５は、４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４に位置するアミノ酸が中性条件下でプラス電荷を持つアミノ酸（塩基性アミノ酸）に置換されている。具体的には、配列番号３および４に示すように、アポフェリチン微粒子１５のアミノ酸配列の１４９番目および１５１番目のリジンは、それぞれグリシンおよびグルタミンから置換されたものである。このため、４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４の表面がプラスチャージに強く帯電する。従って、アポフェリチン微粒子１５は、４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４においてマイナスチャージに帯電した基板１１の表面に結合する。
一方、アポフェリチン微粒子１５の４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４以外の表面は、プラスチャージとマイナスチャージとが混在しており、全体としてはマイナスチャージが優位となっている。このため、アポフェリチン微粒子１５の４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４以外の表面と、マイナスチャージに帯電した基板１１の表面との間に斥力が働く。従って、アポフェリチン微粒子１５の４回対称軸Ｓ４は、基板１１の表面に対してほぼ垂直に固定される。
第９図（ａ）および第９図（ｂ）は、第１図（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する断面図および上面図である。第１図（ｂ）に示す工程において、上述のように準備された液体１６と基板１１とを用いることによって、４回対称軸Ｓ４付近の部位Ｒ４のいずれか１つで基板１１と静電相互作用により結合する。このとき、アポフェリチン微粒子１５は、第９図（ａ）に示すように、４回対称軸Ｓ４を基板１１表面に対してほぼ垂直に向けた状態で、基板１１の表面上にまばらに存在する。さらに、アポフェリチン微粒子１５の結合が進行すると、第９図（ｂ）に示すように、隣接するアポフェリチン微粒子１５は、部位Ｒ２において互いに塩橋Ｂ１を形成する。従って、４回対称軸Ｓ４を基板１１表面に対してほぼ垂直に向けた状態で、部位Ｒ２において互いに塩橋Ｂ１を形成しながら基板１１の表面に結合する。この現象は、基板１１の表面上で連続して起こり、第９図（ｂ）に示すように、４回対称の２次元結晶膜が形成される。
第１０図は、本実施形態で得られる２次元結晶膜の電子顕微鏡写真である。第９図（ｂ）に模式的に示す２次元結晶膜は、アポフェリチン微粒子１５が市松模様状（チェッカー状）に整列した膜であるが、実際のアポフェリチン微粒子１５はほぼ球状であるので、第１０図に示すように各アポフェリチン微粒子１５の間の隙間が小さくなっている。
なお、これまでに３回対称および４回対称の２次元結晶膜の作製方法を示したが、本発明はこれらに限定されない。２回対称軸Ｓ２付近の部位Ｒ２を基板１１の表面に結合し、さらに３つ以上の相互結合部位を備えるアポフェリチン微粒子を準備すれば、第１図に示す方法によって２回対称の２次元結晶膜を作製することも可能である。従って、アポフェリチンのような複数個の対称軸を有するタンパク質を用いた場合には、タンパク質の基板に対する方向を変えることができる。すなわち、タンパク質の基板に対する方向を第３図（ｂ）のような方向にしたい場合には第２図に示す部位Ｒ３を塩基性アミノ酸に置換し、タンパク質の基板に対する方向を第９図（ｂ）のような方向にしたい場合には第２図に示す部位Ｒ４を塩基性アミノ酸に置換すればよい。図示していない２回対称軸に関しては、第２図に示す部位Ｒ２を塩基性アミノ酸に置換すればよい。その後、次いでマイナスに帯電した基板（部位Ｒ２〜４が酸性アミノ酸の場合にはプラスに帯電した基板）に接触させれば、同じタンパク質を用いても、そのタンパク質の基板に対する方向を変えることができる。これにより、微粒子膜の機能を変更することも可能になる。
（実施形態３）
本実施形態では、上記実施形態１および２で作製された２次元結晶膜の利用方法を説明する。
まず、上記実施形態１および２で作製された２次元結晶膜の利用例として、ＥＰ−ＲＯＭ、Ｅ２Ｐ−ＲＯＭなどの浮遊ゲートが挙げられる。第１１図（ａ）および（ｂ）は、上記実施形態１に示した方法で作製された２次元結晶膜を浮遊ゲートとして用いたＥＰ−ＲＯＭの上面図および断面図である。
上記実施形態１で作製された２次元結晶膜では、アポフェリチン微粒子１５に内包される金属粒子１２ａが、互いに絶縁された状態で、高密度且つ高精度で規則的に配置されている。このため、絶縁膜上に配置される金属粒子数を、２次元結晶膜１００のパターニング等により精密にコントロールすることが可能になる。金属粒子数を精密にコントロールすることによって、浮遊ゲートが蓄積する電荷量を精密にコントロールできる。従って、書き込み前後での各メモリセルのしきい値電圧の変化分Ｖｔｈのバラツキを抑制することができる。書き込み前後での各メモリセルのしきい値電圧の変化分Ｖｔｈのバラツキが抑制されると、しきい値電圧の変化分Ｖｔｈを従来よりも小さく設定できる。つまり、従来よりも低電圧で動作可能なＥＰ−ＲＯＭ、Ｅ２Ｐ−ＲＯＭなどが得られる。
なお、絶縁膜上に配置される金属粒子数を精密にコントロールするために、上述のように、２次元結晶膜１００をパターニングしてもよいが、他の方法を用いることもできる。具体的には、上記実施形態１において、基板１１として絶縁膜で被覆されたシリコン基板を用い、絶縁膜の表面のうち、プラスチャージに帯電させる面積を正六角形とすればよい。このことによって、アポフェリチン微粒子１５は、正六角形に沿って高密度且つ高精度で規則的に配置される。従って、正六角形の面積の大小に応じてアポフェリチン微粒子１５に内包される金属粒子１２ａの数を精密にコントロールすることができる。
また、上記実施形態１および２で作製された２次元結晶膜は、磁気ディスクの製造にも利用可能である。
具体的には、上記実施形態１および２において、磁性体粒子を内包したアポフェリチン微粒子１５を用いて２次元結晶膜を作製する。次に、この得られた２次元結晶膜から、アポフェリチン微粒子１５を熱処理などで除去し、内部の磁性体粒子だけを残存させることによって、記録面に磁性体粒子が高密度且つ高精度で規則的に配置された、記憶密度の高い磁気ディスクが得られる。
さらに、上記実施形態１および２で作製された２次元結晶膜は、ヌクレオチドセンサなどのバイオセンサの製造にも利用可能である。
具体的には、上記実施形態１および２において、金粒子を内包したアポフェリチン微粒子１５を用いて２次元結晶膜を作製する。次に、この得られた２次元結晶膜から、アポフェリチン微粒子１５を熱処理などで除去し、内部の金粒子だけを残存させる。この金粒子にチオールＤＮＡを結合させることによって、チオールＤＮＡが高密度且つ高精度に配置された、ＳＮ比が非常に高いヌクレオチドセンサを得ることができる。
本発明によれば、ナノメーターサイズの直径を有する微粒子が高密度且つ高精度で規則的に配置された２次元結晶膜が得られる。
［産業上の利用可能性］
以上のように、本発明に係るタンパク質微粒子からなる２次元結晶膜は、電子顕微鏡によるタンパク質の結晶構造解析に有用である。また、ＥＰ−ＲＯＭ、Ｅ２Ｐ−ＲＯＭなどの浮遊ゲートや、磁気ディスクの製造にも有用である。
［配列表のフリーテキスト］
配列番号１の〈２２３〉：Ｅｑｕｕｓ ｃｅｂｅｌｌｕｓの肝臓アポフェリチンの組換えＤＮＡ
配列番号２の〈２２３〉：Ｅｑｕｕｓ ｃｅｂｅｌｌｕｓの組換え肝臓アポフェリチン
配列番号３の〈２２３〉：Ｅｑｕｕｓ ｃｅｂｅｌｌｕｓの肝臓アポフェリチンの組換えＤＮＡ
配列番号４の〈２２３〉：Ｅｑｕｕｓ ｃｅｂｅｌｌｕｓの組換え肝臓アポフェリチン
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、実施形態１の２次元結晶膜の作製方法の概略を示す図であり、（ａ）は基板１１がマイナスチャージを持つように処理する工程、（ｂ）はアポフェリチン微粒子１５を分散した液体１６に基板１１を浸漬する工程、（ｃ）は液体１６中から基板１１を取り出す工程を示す図である。
第２図は、本実施形態で使用するアポフェリチン微粒子１５を模式的に表す図である。
第３図は、第１図（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する図であって、（ａ）は断面図（ｂ）は上面図である。
第４図は、実施形態１で得られる２次元結晶膜の電子顕微鏡写真である。
第５図は、実施形態１で使用するアポフェリチン微粒子の構造を表す図である。
第６図は、実施形態１で使用するアポフェリチン微粒子の構造を表す図である。
第７図は、実施形態１で使用するアポフェリチン微粒子の構造を表す図である。
第８図は、２つのアポフェリチン微粒子の間に形成された塩橋を模式的に示す図である。
第９図は、第１図（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する図であって、（ａ）は断面図（ｂ）は上面図である。
第１０図は、実施形態２で得られる２次元結晶膜の電子顕微鏡写真である。
第１１図は、ＥＰ−ＲＯＭを示す図であって、（ａ）は上面図（ｂ）は断面図である。
第１２図は、従来の微粒子膜の作製方法を示す図であって、（ａ）はタンパク質微粒子４５が分散した液体２４をシュークロース溶液２３に注入するステップ、（ｂ）は液体２４が浮上するステップ、（ｃ）はタンパク質微粒子４５がアモルファス膜２６の下に付着するステップ、（ｄ）は膜２８が基板２１の表面に転写されるステップを示す図である。

Claims (21)

1. 基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜であって、
   前記各タンパク質は、それぞれ縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部および１個以上の第２結合部を有し、
   前記各第１結合部は、隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、
   前記第２結合部は、前記基板と結合しており、
   前記第２結合部を構成する縮合したアミノ酸の少なくとも一部が置換されている、微粒子膜。
2. 前記第２結合部を構成する縮合したアミノ酸の少なくとも一部が塩基性アミノ酸である、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
3. 前記基板がマイナスに帯電している、請求の範囲第２項に記載の微粒子膜。
4. 前記第２結合部を構成する縮合したアミノ酸の少なくとも一部が酸性アミノ酸である、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
5. 前記基板がプラスに帯電している、請求の範囲第４項に記載の微粒子膜。
6. 前記複数個のタンパク質が前記基板の表面上で規則的に整列している、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
7. 前記各タンパク質が対称軸を有している、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
8. 前記対称軸が４回対称軸である、請求の範囲第７項に記載の微粒子膜。
9. 前記対称軸が３回対称軸である、請求の範囲第７項に記載の微粒子膜。
10. 前記対称軸が２回対称軸である、請求の範囲第７項に記載の微粒子膜。
11. 隣接する２つの微粒子が有するそれぞれの第１結合部は、イオン結合により結合している、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
12. 隣接する２つの微粒子が有するそれぞれの第１結合部は、間に２価以上の陽イオンを挟んだイオン結合により結合している、請求の範囲第１０項に記載の微粒子膜。
13. 前記タンパク質がアポフェリチンまたはＣＣＭＶタンパク質である、請求の範囲第１項に記載の微粒子膜。
14. 基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、
    前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、
    前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を塩基性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成する工程、および
    マイナスに帯電した基板に前記タンパク質に接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、
    を有する、微粒子膜の製造方法。
15. 基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、
    前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、
    前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を酸性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成する工程、および
    プラスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、
    を有する、微粒子膜の製造方法。
16. 基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、
    前記各タンパク質は複数個の対称軸を有しており、
    前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、
    前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を塩基性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成することにより、前記複数個の対称軸の中から特定の１つの対称軸を選択する工程、および
    マイナスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、
    を有する、微粒子膜の製造方法。
17. 前記特定の１つの対称軸上に前記第２結合部が位置している、請求の範囲第１６項に記載の微粒子膜の製造方法。
18. 前記タンパク質がアポフェリチンまたはＣＣＭＶタンパク質である、請求の範囲第１６項に記載の微粒子膜の製造方法。
19. 基板と、前記基板の表面上で前記基板の表面に対して平行な面方向に整列した複数個のタンパク質からなる微粒子とを有する微粒子膜の製造方法であって、
    前記各タンパク質は複数個の対称軸を有しており、
    前記各タンパク質は縮合したアミノ酸からなる複数個の第１結合部を有しており、各第１結合部は隣接する微粒子が有する他の第１結合部と結合しており、
    前記各タンパク質を構成する縮合したアミノ酸の一部を酸性アミノ酸に置換して前記各タンパク質に第２結合部を生成することにより、前記複数個の対称軸の中から特定の１つの対称軸を選択する工程、および
    プラスに帯電した基板に前記タンパク質を接触させることにより、前記基板と前記第２結合部とを結合させる工程、
    を有する、微粒子膜の製造方法。
20. 前記特定の１つの対称軸上に前記第２結合部が位置している、請求の範囲第１９項に記載の微粒子膜の製造方法。
21. 前記タンパク質がアポフェリチンまたはＣＣＭＶタンパク質である、請求の範囲第１９項に記載の微粒子膜の製造方法。

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