JPWO2000062809A1

JPWO2000062809A1 - Growth inhibitors for androgen-independent tumors

Info

Publication number: JPWO2000062809A1
Application number: JP2000-611945A
Authority: JP
Inventors: 亨田中
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2002-07-23

Abstract

(57)【要約】本発明は、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤、アンドロゲン非依存性腫瘍の治療薬および診断薬、アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法、ならびにアンドロゲン非依存性腫瘍細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法に関する。 (57) [Abstract] The present invention relates to growth inhibitors for androgen-independent tumors, therapeutic and diagnostic agents for androgen-independent tumors, diagnostic methods for androgen-independent tumors, and screening methods for substances that inhibit the growth of androgen-independent tumor cells.

Description

Detailed Description of the Invention

技術分野本発明は、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤、アンドロゲン非依存性腫
瘍の治療薬および診断薬、アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法、ならびにアン
ドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法に関する。背景技術前立腺癌は、欧米の成人男子の悪性腫瘍の死亡率では第２位、日本においても
年々増加しており、頻度の高い疾患といえる［赤座英之、癌と化学療法、２３、
４０１（１９９６）］。前立腺癌は、アンドロゲン依存性という特殊な生物学的
特性を有することで知られている。そのため、前立腺癌患者の治療方法としては
、抗アンドロゲン療法が治療の主体をなしており、該療法が前立腺癌患者の８０
〜９０％の症例に奏効する。しかし、抗アンドロゲン療法の最大の問題点は、患者に対し、抗アンドロゲン
療法を継続していくと、いずれ該療法が無効になることである。多くの場合、抗
アンドロゲン療法を開始した後、数ヶ月から数年で患者はアンドロゲン非依存性
となり、いったんアンドロゲン非依存性に陥ると、６〜１８ヶ月で癌死に至る。アンドロゲン非依存性腫瘍（再燃癌ともいう）の有効な治療法はなく、有効な
治療法が強く望まれている［赤座英之、癌と化学療法、２３、４０１（１９９６
）；平尾佳彦、癌と化学療法、２３、４１８（１９９６）］。また、アンドロゲ
ン依存性腫瘍かアンドロゲン非依存性腫瘍かを適確に診断する方法、およびアン
ドロゲン依存性より非依存性への変化をモニターする診断方法も強く望まれてい
る。アンドロゲン依存性腫瘍からアンドロゲン非依存性腫瘍が誘導されるメカニズ
ムはほとんど解明されていないが、以下に示すモデル実験系を利用した解析が試
みられている。マウス乳癌であるＳｈｉｏｎｏｇｉｃａｒｃｉｎｏｍａ１１５は、生理的
な濃度のアンドロゲン存在下で、アンドロゲン依存性に増殖が見られることから
、ホルモン依存性の乳癌および前立腺癌の実験モデルとして好適である［Ｋｏｇ
ａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５４，１（１９
９５）］。Ｓｈｉｏｎｏｇｉｃａｒｃｉｎｏｍａ１１５腫瘍由来のアンドロ
ゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３より、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌ
ａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ以下、ＦＧＦと略記する）ファミリーの増
殖因子であるＦＧＦ−８が単離され、ＦＧＦ−８はアンドロゲン依存性マウス乳
癌細胞ＳＣ−３のオートクライン増殖因子であることが明らかとなった［Ｔａｎ
ａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２８（１９９２）
］。オートクライン増殖因子とは、増殖因子を産生する細胞自身に作用する物質
である。抗ＦＧＦ−８抗体を用いた臨床組織標本の免疫組織染色により、ヒト前
立腺癌組織には高率にＦＧＦ−８が検出されることから、ＦＧＦ−８はホルモン
依存的なヒト前立腺癌への関与が示唆されている［Ｔａｎａｋａ，Ａ．ｅｔａ
ｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５８，２０５３（１９９８）］。アン
ドロゲン依存性マウス乳癌細胞Ｓｈｉｏｎｏｇｉｃａｒｃｉｎｏｍａ１１５
からアンドロゲンを除去することにより、アンドロゲン非依存性腫瘍を生じるこ
とが報告されている［Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓｅａｒｃｈ，３９，４７１３（１９７９）］。さらに、該アンドロゲン非依
存性腫瘍からマウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１［Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．
，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，
４７９（１９８９）］およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４［Ｎ
ｏｎｏｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４８
，４９０４（１９８８）］が樹立されている。しかしながら、アンドロゲン非依
存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１の産生する増殖因子については
解明されていない。以上のように、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖に関与する増殖因子について
は、解明されておらず、アンドロゲン非依存性腫瘍に有効な診断および治療方法
は確立されていない。アクチビンは、脳下垂体に働く卵胞刺激ホルモンＦＳＨ分泌促進因子として発
見された［Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２３１，７７６（１
９８６）］。アクチビンは１４キロダルトンのアクチビンβサブユニットのダイ
マーよりなり、タンパク質の一次構造上の類似性からＴＧＦ−βスーパーファミ
リーに属する増殖因子である。アクチビンβサブユニットにはβＡおよびβＢの
２種類が存在しているが、３種類のダイマーβＡβＡ、βＢβＢ、βＡβＢが報
告され、それぞれアクチビンＡ（βＡβＡ）、アクチビンＢ（βＢβＢ）、アク
チビンＡＢ（βＡβＢ）と命名されている［Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｃｅ
ｐｔｏｒｓＩＩ，ＥｄｉｔｏｒＳｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，
Ａ．Ｂ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社刊（１９９０）］。これまでにアクチビンの機能としては、脳下垂体ＦＳＨ分泌促進、赤芽球分化
誘導、骨形成、神経細胞の維持、インスリン生産促進作用等が報告されている［
Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ
ｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓＩＩ，ＥｄｉｔｏｒＳｐｏｒ
ｎ，Ｍ．Ｂ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社刊（１９９０
）］が、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖促進作用は知られていない。フォリスタチンは、哺乳動物の卵巣より単離されたＦＳＨ分泌抑制因子である
［Ｕｅｎｏ，Ｎ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａ
ｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８４，８２８２（１９８
７）］。フォリスタチンはアクチビンに結合性を示し［Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．
，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，８３６（１９９０）］、アクチビン
活性を中和する作用を示すことが報告されている［Ｋｏｇａｗａ，Ｋ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２８，１４３４（１９９１）］。しか
しながら、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制作用を有することについては、
知られていない。発明の開示アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖に関与する増殖因子の同定および当該増殖を
抑制するアンドロゲン非依存性腫瘍増殖抑制剤、ならびに、アンドロゲン非依存
性腫瘍に有効な診断薬および治療薬が求められている。また、アンドロゲン依存
性腫瘍ならびに非依存性腫瘍を適確に診断する方法、アンドロゲン依存性細胞よ
りアンドロゲン非依存性細胞への変化をモニターする診断方法が望まれている。本発明者らは、アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞より誘導されたアンドロゲ
ン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１が、繊維芽細胞ＮＩＨ３
Ｔ３およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４細胞の増殖を促進する
増殖因子であるアクチビンを産生すること、３種のアクチビン（アクチビンＡ：
βＡβＡ，アクチビンＢ：βＢβＢ、アクチビンＡＢ：βＡβＢ）の中で、とく
にアクチビンＢおよびアクチビンＡとアクチビンＢとの混合物がアンドロゲン非
依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４細胞の増殖を促進すること、およびアクチビン阻
害剤であるフォリスタチンがアンドロゲン非依存性乳癌細胞の産生する増殖促進
活性物質を阻害することからフォリスタチンがアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖
抑制剤となることを見出し、本発明を完成させた。さらに、本発明者らは、アンドロゲン依存性腫瘍のオートクライン増殖因子と
して知られていたＦＧＦ−８が、アンドロゲン依存性腫瘍だけでなくアンドロゲ
ン非依存性腫瘍に対しても増殖促進作用を示すこと、さらにアクチビンがＦＧＦ
−８と協同してアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖促進作用を有することなども見
出し、本発明を完成させた。本発明は、アンドロゲン非依存性癌細胞の増殖抑制
剤およびアンドロゲン非依存性腫瘍の診断または治療に関する。即ち本発明は以
下の（１）〜（２７）に関する。（１）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有
する、アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。アンドロゲン非依存性腫瘍としては、具体的には、前立腺癌、乳癌などがあげ
られる。（２）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、アクチビン阻害活
性を有する物質および線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する
物質から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）記載のアンドロゲン非依存
性腫瘍の増殖抑制剤。アクチビン阻害活性を有する物質としては、アクチビンによるアンドロゲン非
依存性腫瘍の増殖促進を阻害できるものであればいかなるものでもよい。具体的
には、アクチビン中和抗体［ＤｅＰａｏｌｏ，Ｌ．Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１７４１（１９９１）］、アクチビン受容体中
和抗体、フォリスタチン［Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４７，８３６（１９９０）；Ｋｏｇａｗａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２８，１４３４（１９９１）］等のアクチビン結合蛋
白質、アクチビンのアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ［ＤｅｍｕｒａＲ，ｅｔａ
ｌ．，ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＪｏｕｒｎａｌ，４３，４０３（１９９６）］、ア
クチビンの発現を阻害することができる低分子、アクチビンに結合してアクチビ
ンの機能を阻害する低分子、アクチビンのアンタゴニストおよび、それらの誘導
体等があげられる。好ましくは、フォリスタチンがあげられる。ＦＧＦ−８阻害活性を有する物質としては、抗ＦＧＦ−８中和抗体［特開平９
−２７１３９１；Ｔａｎａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，５８，２０５３（１９９８）］、抗ＦＧＦ−８受容体中和抗体、ＦＧＦ
−８のアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ、ＦＧＦ−８結合蛋白質、ＦＧＦ−８の発現
を阻害することができる低分子、ＦＧＦ−８に結合してＦＧＦ−８の機能を阻害
する低分子、ＦＧＦ−８のアンタゴニストおよび、それらの誘導体等があげられ
る。好ましくは、抗ＦＧＦ−８中和抗体、より好ましくは、抗ＦＧＦ−８中和抗
体ＫＭ１３３４（ＦＥＲＭＢＰ−５４５１）があげられる。上述のアクチビン阻害活性を有する物質およびＦＧＦ−８阻害活性を有する物
質は、単独でもアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制するが、アクチビン阻害
活性を有する物質とＦＧＦ−８阻害活性を有する物質とを併用すれば、より効果
的にアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制することができる。（３）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、アクチビン阻害活
性を有する物質である、上記（１）または（２）記載のアンドロゲン非依存性腫
瘍の増殖抑制剤。（４）アクチビン阻害活性を有する物質が、抗アクチビン中和抗体、抗アクチ
ビン受容体中和抗体、アクチビン結合蛋白質およびアクチビンのアンチセンスＤ
ＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質である、上記（２）または（３）記載のアンドロ
ゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。（５）アクチビン結合蛋白質が、フォリスタチンである、上記（４）記載のア
ンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。（６）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、線維芽細胞増殖因
子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する物質である、上記（１）または（２）記
載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。（７）線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する物質が、抗Ｆ
ＧＦ−８中和抗体である、上記（２）または（６）記載のアンドロゲン非依存性
腫瘍の増殖抑制剤。（８）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有
する、アンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。（９）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、アクチビン阻害活
性を有する物質および線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する
物質から選ばれる少なくとも１種である、上記（８）記載のアンドロゲン非依存
性腫瘍治療薬。（１０）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、アクチビン阻害
活性を有する物質である、上記（８）または（９）記載のアンドロゲン非依存性
腫瘍治療薬。（１１）アクチビン阻害活性を有する物質が、抗アクチビン中和抗体、抗アク
チビン受容体中和抗体、アクチビン結合蛋白質およびアクチビンのアンチセンス
ＤＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質である、上記（９）または（１０）記載のアン
ドロゲン非依存性腫瘍治療薬。（１２）アクチビン結合蛋白質が、フォリスタチンである、上記（１１）記載
のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。（１３）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、線維芽細胞増殖
因子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する物質である、上記（８）または（９）
記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。（１４）線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）阻害活性を有する物質が、抗
ＦＧＦ−８中和抗体、抗ＦＧＦ−８受容体中和抗体およびＦＧＦ−８アンチセン
スＤＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質である、上記（７）または（１３）記載のア
ンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。（１５）抗アクチビン抗体、アクチビン結合蛋白質およびアクチビンＤＮＡ／
ＲＮＡから選ばれる物質を用いる、アクチビンの検出方法。（１６）アクチビン結合蛋白質がフォリスタチンである、上記（１５）記載の
アクチビンの検出方法。（１７）抗アクチビン抗体、アクチビン結合蛋白質およびアクチビンＤＮＡ／
ＲＮＡから選ばれる物質を用いる、アクチビンの定量方法。（１８）アクチビン結合蛋白質がフォリスタチンである、上記（１６）記載の
アクチビンの定量方法。（１９）抗アクチビン抗体、アクチビン結合蛋白質、アクチビンＤＮＡ／ＲＮ
Ａ、抗ＦＧＦ−８抗体およびＦＧＦ−８ＤＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質を用
いる、アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法。（２０）アクチビン結合蛋白質がフォリスタチンである、上記（１９）記載の
アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法。（２１）抗アクチビン抗体、アクチビン結合蛋白質、アクチビンＤＮＡ／ＲＮ
Ａ、抗ＦＧＦ−８抗体およびＦＧＦ−８ＤＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質を用
いる、アンドロゲン依存性細胞からアンドロゲン非依存性細胞への転換の診断方
法。（２２）アクチビン結合蛋白質がフォリスタチンである、上記（２１）記載の
診断方法。（２３）抗アクチビン抗体、アクチビン結合蛋白質、アクチビンＤＮＡ／ＲＮ
Ａ、抗ＦＧＦ−８抗体およびＦＧＦ−８ＤＮＡ／ＲＮＡから選ばれる物質を有
効成分として含有する、アンドロゲン非依存性腫瘍診断薬。（２４）アクチビン結合蛋白質がフォリスタチンである、上記（２３）記載の
アンドロゲン非依存性腫瘍診断薬。（２５）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質を用いた、アンドロゲン非依存
性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法。本発明で見出されたアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖因子を用いて、アンドロ
ゲン非依存性腫瘍細胞の増殖促進活性を阻害する物質のスクリーニングを行うこ
とができる。アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖因子の好適なものとしては、アク
チビン、ＦＧＦ−８等をあげることができる。スクリーニング方法としては、後述するＭＴＴ法、３Ｈ−ＴｄＲ取り込み法な
どがあげられる。該方法により、アンドロゲン非依存性細胞の増殖を阻害する薬
剤をスクリーニングすることができる。スクリーニングにより取得される物質は
、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞の治療薬として有用である。（２６）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質がアクチビンである、上記（２
５）記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法。（２７）アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質が線維芽細胞増殖因子−８（Ｆ
ＧＦ−８）である、上記（２５）記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物
質のスクリーニング方法。１．アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質の単離および精製アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質は以下に示す方法により単離することが
できる。アンドロゲン非依存性腫瘍としては、アンドロゲン依存性細胞より誘導された
、アンドロゲン非依存性に増殖可能な細胞であればいかなるものでもよい。具体
的には、アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４、アンドロゲン非依存性
マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４
５（ＡＴＣＣＨＴＢ−８１）、ＰＣ３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４３５）等があ
げられる。アンドロゲン非依存性腫瘍の産生するアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質は
、腫瘍細胞を適当な培地中で培養することにより得られる培養液、あるいは、細
胞の破砕液より取得することができる。アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質の単離・精製は、溶媒抽出、有機溶媒に
よる分別沈殿、塩析、遠心分離、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単
独あるいは組み合わせて行うことができる。アンドロゲン非依存性腫瘍細胞の増
殖物質の特定は、アンドロゲン非依存性細胞に該増殖物質を添加し培養後、増殖
した細胞数をＭＴＴ法「Ｔａｎａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ，５８，２０５３（１９９８）」、^３Ｈ−ＴｄＲ取り込み法［Ｔａ
ｎａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２８（１９９２
）］等で測定することにより行うことができる。上記の方法により、アンドロゲン非依存性腫瘍が産生するアンドロゲン非依存
性腫瘍の増殖物質として、アクチビン［Ｖａｌｅ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２１，７７６（１９８６）；ＬｉｎｇＮ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２１，７７９（１９８６）］が取得できるが、アクチビンは、公知の遺
伝子組換え技術（モレキュラークローニング第２版）等を用いて取得すること
もできる。２．アンドロゲン非依存性腫瘍の診断薬および治療薬本発明のアクチビン活性を阻害する物質を含有する医薬は、治療薬として単独
で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ
以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法
により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投
与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与
をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることがで
きる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、
座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤
、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果
糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類
、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等
の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤
として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトー
ル等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグ
ネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセル
ロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の
可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用
いて調製される。または、蛋白質、ペプチドまたは抗体を常法に従って凍結乾燥
し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもで
きる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺
激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を
用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用い
る担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また
、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加するこ
ともできる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、
体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで
ある。３．アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法本発明で見出されたアンドロゲン非依存性腫瘍の産生する増殖物質であるアク
チビンを検出または定量することは、アンドロゲン非依存性腫瘍の診断に有用で
ある。アクチビンの検出または定量方法としては、抗アクチビン抗体またはフォ
リスタチンなどのアクチビン結合蛋白質などを用いた、以下の方法等を用いるこ
とができる。細胞または組織でのアクチビンの検出または定量方法としては、蛍光抗体法、
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組
織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）
、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法［単クロ
ーン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化
学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］などがあげら
れる。蛍光抗体法とは、細胞または組織に存在するアクチビンを、抗アクチビン抗体
またはフォリスタチンなどのアクチビン結合蛋白質と反応させ、さらにフルオレ
シン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗アクチビ
ン抗体に対する抗体あるいは抗フォリスタチン抗体またはそれらの結合断片と反
応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、細胞または組織に存在するアクチビンを
、抗アクチビン抗体またはフォリスタチンなどのアクチビン結合蛋白質と反応さ
せ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗アクチビ
ン抗体に対する抗体あるいは抗フォリスタチン抗体またはそれらの結合断片と反
応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、細胞または組織に存在するアクチ
ビンを、抗アクチビン抗体またはフォリスタチンなどのアクチビン結合蛋白質と
反応させ、さらに放射線標識を施した抗アクチビン抗体に対する抗体あるいは抗
フォリスタチン抗体またはそれらの結合断片と反応させた後、シンチレーション
カウンターなどで測定する方法である。免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、細胞または組織に存在するアクチビン
を、抗アクチビン抗体またはフォリスタチンなどのアクチビン結合蛋白質と反応
させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素
標識を施した抗アクチビン抗体に対する抗体あるいは抗フォリスタチン抗体また
はそれらの結合断片と反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。ウェスタンブロッティング法とは、細胞または組織に存在するアクチビンを、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニ
トロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗アクチビン抗体またはフォリス
タチンなどのアクチビン結合蛋白質を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質
、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗アクチビン抗体に対す
る抗体あるいは抗フォリスタチン抗体またはそれらの結合断片を反応させた後、
確認する方法である。ドットブロッティング法とは、細胞または組織に存在するアクチビンを、ニト
ロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗アクチビン抗体またはフォリスタ
チンなどのアクチビン結合蛋白質を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、
ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した、抗アクチビン抗体に対す
る抗体あるいは抗フォリスタチン抗体またはそれらの結合断片を反応させた後、
確認する方法である。免疫沈降法とは、細胞または組織に存在するアクチビンを、抗アクチビン抗体
またはフォリスタチンなどのアクチビン結合蛋白質と反応させ、プロテインＧ―
セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原
抗体複合体を沈降させる方法である。また、アクチビンをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、またはオリゴヌクレオ
チドを用いて、ノーザンブロット法（新細胞工学実験プロトコール秀潤社１
９９３年）、ＰＣＲ法（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ，１９９０年）、インサイツハイブリダイゼーション法（ｉｎｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション手法学際企画１９９２年）等の遺伝子工学的手法に
より、組織または細胞内のアクチビンを検出または定量することができる。ノーザンブロット法とは、細胞または組織よりｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡを抽
出し、アガロースゲル電気泳動（モレキュラークローニング第２報）等で分画
した後、該ゲルをニトロセルロース膜等にブロッティングし、該膜に放射線など
の標識を施したアクチビンｃＤＮＡの全長あるいは一部をプローブとして反応さ
せた後、オートラジオグラフィー等により、細胞あるいは組織に存在するアクチ
ビンのｍＲＮＡを確認する方法である。ＰＣＲ法とは、細胞または組織よりｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡを抽出し、アク
チビンの塩基配列に基づいて設計したプライマーおよびポリメラーゼ等を添加し
、アクチビンｃＤＮＡ断片を増幅し、アガロースゲル電気泳動等で確認する方法
である。インサイツハイブリダイゼーション法とは、細胞または組織に存在するアクチ
ビンｍＲＮＡに、ビオチンなどの標識を施したアクチビンｃＤＮＡの全長あるい
は一部をプローブとして反応させた後、酵素標識したアビジン等を反応させた後
、顕微鏡を用いて観察する方法である。さらに、ＦＧＦ−８とアクチビンはアンドロゲン非依存性腫瘍に対して付加的
増殖促進作用を有しており、さらに、ホルモン依存性腫瘍と非依存性腫瘍が産生
する増殖物質が異なることから、アクチビンとＦＧＦ−８とを単独あるいは同時
に検出または定量することにより、アンドロゲン依存性腫瘍からアンドロゲン非
依存性腫瘍への変換をモニターすることができる。具体的には、細胞または組織
に存在するアクチビンまたはＦＧＦ−８を、抗アクチビン抗体あるいはフォリス
タチンなどのアクチビン結合蛋白質、および抗ＦＧＦ−８抗体と反応させ、上述
した各種免疫学的方法により、検出または定量することにより行うことができる
。または、アクチビンまたはＦＧＦ−８をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ま
たはオリゴヌクレオチドを用いて、上述の遺伝子工学的手法によっても、アクチ
ビンおよびＦＧＦ−８を単独あるいは同時に検出または定量することができる。発明を実施するための最良の形態１．アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１培養上
清中のマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進作用アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４［Ｎｏｎｏｍｕｒａ，Ｎ．，ｅ
ｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４８，４９０４（１９８８）］
およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１［Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ
．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，３２，４７９（１９８９）］のオートクラインおよびパラクライン増殖
因子を取得する目的で、アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣ
ＡＤＯ２１の産生する増殖物質を、マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞［Ｔａ
ｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３６３，２２６（
１９９５）］の増殖促進活性を指標として、以下のように解析した。パラクライ
ン増殖因子とは、増殖因子を産生する細胞に隣接または近傍の他の形態の細胞に
作用する物質である。０．５×１０^６個のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４または０．
８×１０^６個のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１を、デキスト
ランチャーコール処理した牛胎児血清（ＦＢＳ）を２％含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’
ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水製薬社製）培地にそれぞれ懸濁して１００−
ｍｍディッシュに加え、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。翌日、
培養培地をＦＢＳを含まないＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ
日水製薬社製）培地に交換した。さらに４８時間培養後、培養上清を計２リット
ルずつ回収した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性の評価ＮＩＨ３Ｔ３細胞をデキストランチャーコール処理したＦＢＳを２％含むＤＭ
ＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水製薬社製）培地に懸濁し、９
６ウェルプレートの各ウェルに３×１０^３細胞／１００μｌずつ加え培養した。
翌日、培養培地を除去し、被検サンプルを含む１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ：Ｈａｍ
’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水製薬社製）培地１００μｌを加え培養した
。さらに２日間培養した後に、培養培地を除去し、１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ：Ｈ
ａｍ’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水製薬社製）培地１００μｌを加えて培
養した。２日後に文献［Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓｅａｒｃｈ，５８，２０５３（１９９８）］に記載の方法に従い、ＭＴＴア
ッセイ系により培養液中の細胞数を測定した。その結果を第１図に示した。被検サンプルとして上記アンドロゲン非依存性マ
ウス乳癌細胞ＳＣ−４培養上清をそれぞれ５０％、１００％添加すると、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性は１３２．５±１１．３％、１５８．８±３．
１％であった。また、アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１培養上
清をそれぞれ５０％、１００％添加すると、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進
活性は１５６．３±２．５％、１５３．１±２．５％であった。以上より、アン
ドロゲン非依存性細胞の培養上清には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進効果
が認められた。２．アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４培養上清中のマウス繊維芽
細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性物質の精製上記１に示したアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４の培養上清およ
びアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１の培養上清を、文献［Ｔａ
ｎａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２８（１９９２）
］記載の方法に従い、分子量１０キロダルトン以下の分子を除去するＰｅｌｌｉ
ｃｏｎ−Ｌａｂｏｃａｓｓｅｔｔｅ（ミリポア社製）を用いて濃縮操作を行った
。文献［Ｔａｎａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２
８（１９９２）］記載の方法に従い、得られた濃縮培養上清を０．１ＭＮａＣ
ｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ｛３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉ
ｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ和光純
薬工業社製｝、２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド，２００μｇ
／ｍｌロイペプチンを含む１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
（以下、平衡化緩衝液と記す）で平衡化したヘパリンセファロースカラム（ゲル
容積１ｍｌ：アマジャムファルマシアバイオテク社製）にのせた。上記平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、ＮａＣｌ濃度０．３Ｍ、０．６Ｍ、２Ｍ
を含む平衡化緩衝液を各１０ｍｌずつカラムに流し、カラム吸着タンパクを１ｍ
ｌずつ計１０本順次溶出した。ヘパリンカラム溶出画分の活性は、上記１に示し
たＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた増殖アッセイ系において溶出フラクション（最初の
各５本）を被検サンプルとして各２％添加して検討した。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１培養上清を精製した結果を
第２図に示した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖促進活性物質は０．３ＭＮａＣｌ溶出
画分に回収された。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４培養上清につ
いても、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖促進活性物質は、第１表に示したように、０．
３ＭＮａＣｌ溶出画分に回収された。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１培養上清については、０．
３ＭＮａＣｌ溶出画分を回収し、上記平衡化緩衝液で平衡化したＣｏｐｐｅｒ
−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（ゲル容量０．８ｍｌ：ファルマシア社製）にのせ
た。平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭイ
ミダゾールを含む平衡化緩衝液を各５ｍｌずつカラムに流し、カラムに吸着した
タンパク質を順次溶出した。溶出画分の活性は、上記１に示したＮＩＨ３Ｔ３細
胞を用いた増殖アッセイ系において溶出フラクションを被検サンプルとして各２
％添加して検討した。その結果を第２表に示した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖促進活性は１０ｍＭイ
ミダゾール溶出画分に回収された。３．アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４培養上清中のＮＩＨ３Ｔ３
細胞増殖促進活性物質の同定アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１培養上清中
の増殖促進活性物質は上記２のヘパリンカラムを用いた精製において０．３Ｍ
ＮａＣｌで溶出された。通常、ＦＧＦファミリーの増殖因子は、ヘパリンへの親
和性が高いが［Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖ
ｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８，５７５（１９８９）］、溶出
された増殖促進活性物質はヘパリンへの親和性が非常に弱いことから、ＦＧＦフ
ァミリーの増殖因子に属するものではないと考えられた。さらに、上記活性物質は、繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性
を有していることから、ＴＧＦ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦ
ａｃｔｏｒ）−βスーパーファミリーに属する物質と推定された。ＴＧＦ−βス
ーパーファミリーの中で内分泌系の臓器での発現が多いアクチビン［Ｍｕｎｉｅ
ｒ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌＡｃ
ａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８５，２４７−２５１（１９８８
）］に注目して以下の解析を行った。上記２で得られたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進する活性を有するアンドロゲ
ン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１培養上清のヘパリンカラムを用いた精製
画分を１％となるように、上記１で示したＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた増殖アッセ
イ系に添加し、さらに組換えヒトフォリスタチン［米国ＮａｔｉｏｎａｌＨｏ
ｒｍｏｎｅ＆ＰｉｔｕｉｔａｒｙＰｒｏｇｒａｍのＰａｌｏｗ博士よりの
供与：ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５４，５３５（
１９９７）］を終濃度１０ｎＭになるように添加した。フォリスタチンはアクチ
ビン結合タンパク質であり、アクチビン活性を中和する能力を有している。その結果を第３図に示した。ヒトフォリスタチンは終濃度１０ｎＭにおいて、
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に対して効果を示さなかったが、ヘパリンカラムを用い
て精製された画分の有するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進する活性を阻害する作
用を示した。また、陽性コントロールとして用いた精製したウシアクチビンＡ（
β鎖ホモ二量体：βＡβＡ）［Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｈｏｒ
ｍｏｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，４１（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１），５５（１９
９４）］は１０、１００ｎｇ／ｍｌにおいてＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進する
こと、およびフォリスタチンは１０ｎＭにおいてアクチビンＡの活性を阻害する
ことが確認された。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１細胞の培養上清中のＮＩＨ
３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性はフォリスタチンにより阻害されたことから、
フォリスタチン結合因子として報告されているアクチビンの存在が示唆された。
そこで、上記２で示した、Ｃｏｐｐｅｒ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラムにより精製
したＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性画分のアクチビンの有無を、抗アク
チビンβＡモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法を用いて以下のよ
うにして検討した。文献［Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ
，５８，２０５３（１９９８）］の方法に従い、１０〜２０％グラジエントポリ
アクリルアミドゲル（第一化学社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを以下のように
して行った。上記２で取得したＣｏｐｐｅｒ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラムで精製した画分の
１０分の１量をゲルのレーンにのせた後電気泳動し、泳動後、該ゲルをＰＶＤＦ
膜（バイオラッド社製）に転写した。これに１０万倍希釈の抗アクチビンβＡモ
ノクローナル抗体［Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＢＢＲＣ，１３６，
１１０３−１１０９（１９８６）］を反応させ、ＥＣＬＰｌｕｓｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて添付プロトコールに従い、アクチ
ビンβＡを検出した。その結果を第４図に示した。Ｃｏｐｐｅｒ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラムで精製
した画分中に、抗アクチビンβＡモノクローナル抗体に反応する分子量約１４．
８キロダルトン付近のバンドが検出された。また、バンドの移動度は陽性コント
ロールのヒト組換えインヒビンＡ［アクチビンβＡ鎖（分子量１８キロダルトン
）とインヒビンα（分子量１８キロダルトン）のヘテロダイマー］中のアクチビ
ンβＡのバンドと一致した。従って、Ｃｏｐｐｅｒ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム
で精製した画分中にはアクチビンβＡが含まれることが明らかとなった。アクチビンがＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖促進活性物質であることを確認する目的
で、精製したウジアクチビンＡ（β鎖ホモ二量体：βＡβＡ）、アクチビンＢ（
β鎖ホモ二量体：βＢβＢ）、アクチビンＡＢ（β鎖ホモ二量体：βＡβＢ）［
Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＨｏｒｍｏｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，
４１（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１），５５（１９９４）］および組換えヒトイン
ヒビンＡ（α鎖β鎖ヘテロ二量体：αＡβＢ）（米国ＮａｔｉｏｎａｌＨｏｒ
ｍｏｎｅ＆ＰｉｔｕｉｔａｒｙＰｒｏｇｒａｍ製）を用いて、上記１に示
した方法によりＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性を検討した。その結果を第５図に示した。３種の精製アクチビンは、全て濃度依存的にＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞の増殖促進活性を示した。一方、インヒビンＡはＮＩＨ３Ｔ３細胞
に対する増殖促進活性を全く示さなかった。従って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する
増殖促進活性は、β鎖のホモ二量体（βＡβＡ、βＢβＢ、βＡβＢ）が特異的
に有することが明らかとなった。４．アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４に対するアクチビンの増殖
促進効果アクチビンのアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４の増殖に対する効
果について、上記３で示した精製したウシアクチビンＡ、アクチビンＢおよびア
クチビンＡＢを用いて検討した。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４をテキストランチャーコール処
理したＦＢＳを２％含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水
製薬社製）培地で懸濁し、９６ウエルプレートの各ウエルに１．５×１０^３細胞
／１００μｌずつ加え培養した。翌日、培養培地を除去し被検サンプルを含む０
．１％ＢＳＡ添加ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ−１２（１：１、ｖ／ｖ日水製薬社
製）培地１００μｌ加え培養した。２日後に培養培地を交換し、さらに１日間培
養した後に文献［Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ，５８，２０５３（１９９８）］に記載の方法に従いＭＴＴアッセイ系
により培養液中の細胞数を測定した。結果を第６図に示した。アクチビンＢおよびアクチビンＡとアクチビンＢの混
合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加すると、アンドロゲン非依存性マウス乳癌
細胞ＳＣ−４の増殖は無添加に比べて、それぞれ１４５％、１３８％になった。
一方、アクチビンＡおよびアクチビンＡＢを添加した場合の増殖は無添加に比べ
て、それぞれ１１０％、１００％であった。従って、３種のアクチビンの中でも
、アクチビンＢのアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４に対する増殖促
進活性が最も高いことが明らかとなった。アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞Ｓｈｉｏｎｏｇｉｃａｒｃｉｎｏｍａ
１１５のオートクライン増殖物質として見出されたＦＧＦ−８は、アンドロゲン
依存性腫瘍の増殖物質として重要であると報告されている［Ｔａｎａｋａ，Ａ．
ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍ
ｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２８（１９９２）］が、アンド
ロゲン非依存性腫瘍での関連については知られていない。そこで、アンドロゲン
非依存性細胞の増殖物質である精製アクチビンＢの増殖促進活性に及ぼすＦＧＦ
−８の効果について、上記に示した方法と同様に検討した。その結果を第７図に示した。精製ＦＧＦ−８［Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａ
ｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３６３，２２６（１９９５）］は、５０ｎｇ
／ｍｌにおいて単独でアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４の増殖を促
進する活性を有していた。さらに、アクチビンＢおよびアクチビンＡとアクチビ
ンＢとの混合物は、１００ｎｇ／ｍｌの濃度においてＦＧＦ−８の有するアンド
ロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４増殖促進活性をさらに増強する作用を示
した。アクチビンＡおよびアクチビンＡＢにはＦＧＦ−８による増殖促進活性を
増強する作用は認められなかった。以上の結果から、アクチビンＢがアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−
４の増殖促進物質であること、ＦＧＦ−８はアンドロゲン依存性細胞増殖活性の
みならずアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４に対しても増殖促進活性
を有すること、およびＦＧＦ−８の有するアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞
ＳＣ−４増殖促進活性はアクチビンＢによりさらに増強されることが明らかとな
った。５．ＲＴ−ＰＣＲ法によるアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３、アン
ドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１におけるＦＧＦ−
８およびアクチビンｍＲＮＡの検出アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３、アンドロゲン非依存性マウス乳
癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１における、ＦＧＦ−８およびアクチビンのｍ
ＲＮＡの検出および発現変動を、ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３、アンドロゲン非依存性マウス乳
癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１細胞へのアンドロゲン刺激は、文献［Ｔａｎ
ａｋａ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＮａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，８９，８９２８（１９９２）
］記載の方法に従い行った。細胞からの全ＲＮＡの調製およびＲＴ−ＰＣＲ法は
、文献［Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３６
３，２２６（１９９５）］記載の方法に従い行った。ＲＴ−ＰＣＲ法は上述の文
献記載の方法で４８時間行い、また、用いたプライマーは、マウスアクチビンβ
Ｂ検出プライマーセットとして、配列番号１および２記載の合成ＤＮＡ、マウス
ＦＧＦ−８検出用プライマーセットとして、配列番号３および４記載の合成ＤＮ
Ａをそれぞれ用いた。遺伝子の発現量の検討のために通常用いられるコントロー
ル遺伝子であるマウスＧ３ＰＤＨ遺伝子（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−
ｐｈｏｓｐｈａｔｅＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）検出用プライマーセット（
ＭｏｕｓｅＧ３ＰＤＨＣｏｎｔｒｏｌＡｍｐｌｉｍｅｒＳｅｔ）はクロ
ーンテック社より購入した。その結果を第８図に示した。コントロール遺伝子Ｇ３ＰＤＨのＰＣＲバンドが
全て同等であることから、実験に用いたアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ
−３、アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１のｍＲ
ＮＡ量は同等であることが確認された。アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１では、アン
ドロゲン刺激および無刺激に関わらずアクチビンβＢ鎖ｍＲＮＡが検出された。
一方、アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３ではアンドロゲン刺激および
無刺激に関わらずアクチビンβＢ鎖ｍＲＮＡは検出されなかった。ＦＧＦ−８
ｍＲＮＡはアンドロゲン刺激したアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３の
みに検出され、アンドロゲン無刺激アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−３
およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１では検
出されなかった。以上の結果から、アンドロゲン依存性腫瘍は、アンドロゲン刺激下でＦＧＦ−
８を産生するが、アクチビンβＢを産生しないことが明らかとなった。また、ア
ンドロゲン非依存性腫瘍はＦＧＦ−８を産生しないが、アクチビンβＢ鎖を産生
することが明らかとなった。この結果は、アンドロゲン依存性から非依存性に変
換する際に細胞はＦＧＦ−８産生能を失い、アクチビンβＢ産生能を獲得するこ
とを示している。従って、細胞のＦＧＦ−８およびアクチビンβＢ鎖の産生能を
検出することにより、アンドロゲン依存性細胞から非依存性細胞への変換を診断
することができる。産業上の利用可能性本発明によりアンドロゲン非依存性腫瘍の治療および診断に有用なアンドロゲ
ン非依存性腫瘍の増殖抑制剤、アンドロゲン非依存性腫瘍の治療薬および診断薬
、アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞の増殖
抑制物質のスクリーニング方法が提供される。「配列表フリーテキスト」配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ TECHNICAL FIELD The present invention relates to an inhibitor of androgen-independent tumor growth, a therapeutic agent and diagnostic agent for androgen-independent tumors, a method for diagnosing androgen-independent tumors, and a method for screening for an inhibitor of androgen-independent tumor growth. BACKGROUND ART Prostate cancer is the second most common malignant tumor in adult males in Europe and the United States, and is increasing year by year in Japan as well, making it a common disease [Hideyuki Akaza, Cancer and Chemotherapy, 23 ,
401 (1996)]. Prostate cancer is known to have a unique biological characteristic of androgen dependence. Therefore, anti-androgen therapy is the mainstay of treatment for prostate cancer patients, and this therapy is effective in 80% of prostate cancer patients.
Anti-androgen therapy is effective in about 90% of cases. However, the biggest problem with anti-androgen therapy is that if the patient continues anti-androgen therapy, the therapy will eventually become ineffective. In many cases, after starting anti-androgen therapy, the patient becomes androgen independent within several months to several years, and once androgen independent, the patient will die from cancer within 6 to 18 months. There is no effective treatment for androgen-independent tumors (also called recurrent cancers), and an effective treatment is strongly desired [Hideyuki Akaza, Cancer and Chemotherapy, 23 , 401 (1996)]
); Hirao Yoshihiko, Cancer and Chemotherapy, 23 , 418 (1996)]. Furthermore, there is a strong demand for a method for accurately diagnosing whether a tumor is androgen-dependent or androgen-independent, and for a diagnostic method for monitoring the transition from androgen dependence to independence. Although the mechanism by which androgen-dependent tumors are induced into androgen-independent tumors has not been fully elucidated, attempts have been made to analyze it using the following model experimental systems. Shionogi carcinoma 115, a mouse mammary tumor, is suitable as an experimental model for hormone-dependent breast cancer and prostate cancer because it shows androgen-dependent growth in the presence of physiological concentrations of androgen [Kog
a,M. et al. , Journal of Steroid Bioche
Mistry and Molecular Biology, 54 , 1 (19
95)]. Fibroblast growth factor (Fibroblast growth factor 1) was secreted from androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3 derived from Shionogi carcinoma 115 tumor.
FGF-8, a growth factor of the FGF family, was isolated and found to be an autocrine growth factor for androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3 [Tan
aka, A. et al. ,Proceeding of National
Academy of Science USA, 89 , 8928 (1992)
Autocrine growth factors are substances that act on the cells that produce growth factors themselves. FGF-8 has been detected at a high rate in human prostate cancer tissues by immunohistochemical staining of clinical tissue specimens using anti-FGF-8 antibodies, suggesting that FGF-8 is involved in hormone-dependent human prostate cancer [Tanaka, A. et al.
I., Cancer Research, 58 , 2053 (1998)]. Androgen-dependent mouse breast cancer cell Shionogi carcinoma 115
It has been reported that androgen deprivation from the tumor causes androgen-independent tumors [Kitamura, Y. et al., Cancer R
Research, 39 , 4713 (1979)]. Furthermore, mouse breast cancer cell CADO21 [Noguchi, S. et al.
, Journal of Steroid Biochemistry, 32 ,
479 (1989)] and androgen-independent mouse mammary carcinoma cell line SC-4 [N
onomura,N. , et al. , Cancer Research, 48
, 4904 (1988)] has been established. However, the growth factors produced by androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21 have not been elucidated. As described above, the growth factors involved in the growth of androgen-independent tumors have not been elucidated, and effective diagnostic and therapeutic methods for androgen-independent tumors have not been established. Activin was discovered as a follicle-stimulating hormone (FSH) secretion promoter that acts on the pituitary gland [Vale, W., et al., Nature, 231 , 776 (1
986)]. Activin is a growth factor that consists of a dimer of 14 kilodalton activin β subunits, and is a member of the TGF-β superfamily due to the similarity in the primary structure of the protein. There are two types of activin β subunits, βA and βB, but three types of dimers, βAβA, βBβB, and βAβB, have been reported, and they are named activin A (βAβA), activin B (βBβB), and activin AB (βAβB), respectively [Vale, W., et al., P
eptide growth factors and their receipt
ptors II, Editor Sporn, M. B. & Roberts,
A.B., Springer (1990)]. The functions of activin have been reported to date to include promoting pituitary FSH secretion, inducing erythroblast differentiation, bone formation, maintaining nerve cells, and promoting insulin production.
Vale, W. , et al. , Peptide growth factor
s and their receptors II, Editor Spor
n, M. B. & Roberts, A. B., Springer (1990)
) ], but its growth-promoting effect on androgen-independent tumors is not known. Follistatin is an FSH secretion inhibitor isolated from mammalian ovaries [Ueno, N. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences,
l Academy of Science USA, 84 , 8282 (198
7)]. Follistatin exhibits binding activity to activin [Nakamura, T.
, et al., Science, 247 , 836 (1990)], and it has been reported to exhibit an action of neutralizing activin activity [Kogawa, K., et al.
al., Endocrinology, 128 , 1434 (1991)]. However, there are no reports of its inhibitory effect on androgen-independent tumor growth.
It is not known. Disclosure of the Invention There is a need for the identification of growth factors involved in the growth of androgen-independent tumors, and for androgen-independent tumor growth inhibitors that suppress said growth, as well as diagnostic and therapeutic agents that are effective against androgen-independent tumors. There is also a need for methods to accurately diagnose androgen-dependent and androgen-independent tumors, and for diagnostic methods to monitor the change from androgen-dependent cells to androgen-independent cells. The present inventors have demonstrated that androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21, which are induced from androgen-dependent mouse breast cancer cells, express androgen-independent tumors in a manner similar to that of fibroblasts NIH3.
The present study demonstrated that the activin-producing cells produced by the activin gene are capable of promoting the growth of T3 and androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4.
The present inventors have found that, among the various activin-dependent tumors (βAβA, activin B: βBβB, activin AB: βAβB), activin B and a mixture of activin A and activin B in particular promote the proliferation of SC-4 androgen-independent mouse breast cancer cells, and that follistatin, an activin inhibitor, inhibits growth-promoting active substances produced by androgen-independent breast cancer cells, and therefore, follistatin serves as a growth inhibitor for androgen-independent tumors, thereby completing the present invention. Furthermore, the present inventors have found that FGF-8, which was known as an autocrine growth factor for androgen-dependent tumors, exhibits a growth-promoting effect not only on androgen-dependent tumors but also on androgen-independent tumors, and further that activin acts as an FGF
The present invention has been completed based on the findings that the compound synergizes with activin and promotes the growth of androgen-independent tumors. The present invention relates to an agent for inhibiting the growth of androgen-independent cancer cells and to the diagnosis or treatment of androgen-independent tumors. Specifically, the present invention relates to the following (1) to (27): (1) An agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors, comprising as an active ingredient a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors. Specific examples of androgen-independent tumors include prostate cancer and breast cancer. (2) The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to (1), wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is at least one substance selected from the group consisting of a substance having activin inhibitory activity and a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity. The substance having activin inhibitory activity may be any substance that can inhibit the promotion of androgen-independent tumor growth by activin. Specifically, an activin neutralizing antibody [DePaolo, L. V., et al. , End
Ocrinology, 130 , 1741 (1991)], activin receptor neutralizing antibody, follistatin [Nakamura, T., et al., Science
e, 247 , 836 (1990); Kogawa, K. , et al. ,End
activin-binding proteins such as activin-binding proteins [Demura R, et al., J. Neurol. 1999, 128 , 1434 (1991)], and activin antisense RNA/DNA [Demura R, et al., J. Neurol. 1999, 128, 1434 (1991)].
1., Endocrine Journal, 43 , 403 (1996)], small molecules that can inhibit the expression of activin, small molecules that bind to activin and inhibit its function, activin antagonists, and derivatives thereof. Preferably, follistatin is used. Examples of substances having FGF-8 inhibitory activity include anti-FGF-8 neutralizing antibodies [JP Patent Publication No. 99-200044].
-271391; Tanaka, A. et al. , Cancer Resea
Arch, 58, 2053 (1998)], anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, FGF
Examples of the androgen-independent tumor growth inhibitor include antisense RNA/DNA of FGF-8, FGF-8 binding proteins, small molecules capable of inhibiting FGF-8 expression, small molecules that bind to FGF-8 and inhibit its function, FGF-8 antagonists, and derivatives thereof. Anti-FGF-8 neutralizing antibodies are preferred, and anti-FGF-8 neutralizing antibody KM1334 (FERM BP-5451) is more preferred. The above-mentioned substances having activin inhibitory activity and substances having FGF-8 inhibitory activity can inhibit the growth of androgen-independent tumors even when used alone, but the combined use of a substance having activin inhibitory activity and a substance having FGF-8 inhibitory activity can more effectively inhibit the growth of androgen-independent tumors. (3) The androgen-independent tumor growth inhibitor according to (1) or (2) above, wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is a substance having activin inhibitory activity. (4) The substance having activin inhibitory activity is an anti-activin neutralizing antibody, an anti-activin receptor neutralizing antibody, an activin binding protein, and an antisense DNA of activin.
(5) The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to (2) or (3) above, wherein the activin-binding protein is a substance selected from NA/RNA. (6) The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to (1) or (2) above, wherein the substance for inhibiting the growth of androgen-independent tumors is a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity. (7) The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to (1) or (2) above, wherein the substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity is anti-F
(8) A drug for treating androgen-independent tumors, comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors. (9) The drug for treating androgen-independent tumors according to (8), wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is at least one selected from the group consisting of a substance having activin inhibitory activity and a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity. (10) The drug for treating androgen-independent tumors according to (8) or (9), wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is a substance having activin inhibitory activity. (11) The drug for treating androgen-independent tumors according to (9) or (10), wherein the substance having activin inhibitory activity is a substance selected from the group consisting of an anti-activin neutralizing antibody, an anti-activin receptor neutralizing antibody, an activin binding protein, and an antisense DNA/RNA of activin. (12) The drug for treating androgen-independent tumors according to (11), wherein the activin-binding protein is follistatin. (13) The drug for treating androgen-independent tumors according to (8) or (9), wherein the substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors is a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity.
(14) The drug for treating androgen-independent tumors according to the above (7) or (13), wherein the substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity is a substance selected from the group consisting of an anti-FGF-8 neutralizing antibody, an anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, and an FGF-8 antisense DNA/RNA. (15) The drug for treating androgen-independent tumors according to the above (7) or (13), wherein the substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity is a substance selected from the group consisting of an anti-FGF-8 neutralizing antibody, an anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, and an FGF-8 antisense DNA/RNA.
(16) A method for detecting activin using a substance selected from RNA. (17) A method for detecting activin according to (15) above, wherein the activin-binding protein is follistatin. (18) A method for detecting activin using an anti-activin antibody, an activin-binding protein, and an activin DNA/RNA.
(18) A method for quantifying activin using a substance selected from RNA. (19) The method for quantifying activin according to (18) above, wherein the activin-binding protein is follistatin. (20) An anti-activin antibody, an activin-binding protein, an activin DNA/RNA
A. A method for diagnosing androgen-independent tumors using a substance selected from an anti-FGF-8 antibody and FGF-8 DNA/RNA. (20) The method for diagnosing androgen-independent tumors according to (19) above, wherein the activin-binding protein is follistatin. (21) An anti-activin antibody, an activin-binding protein, and an activin DNA/RNA.
A. A method for diagnosing the conversion of androgen-dependent cells to androgen-independent cells using a substance selected from an anti-FGF-8 antibody and FGF-8 DNA/RNA. (22) The diagnostic method according to (21) above, wherein the activin-binding protein is follistatin. (23) An anti-activin antibody, an activin-binding protein, and an activin DNA/RNA.
A diagnostic agent for androgen-independent tumors, comprising as an active ingredient a substance selected from anti-FGF-8 antibody and FGF-8 DNA/RNA. (24) The diagnostic agent for androgen-independent tumors according to (23) above, wherein the activin-binding protein is follistatin. (25) A method for screening for a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors using a growth factor for androgen-independent tumors. The growth factor for androgen-independent tumors discovered in the present invention can be used to screen for a substance that inhibits the growth-promoting activity of androgen-independent tumor cells. Suitable growth factors for androgen-independent tumors include activin and FGF-8. Examples of screening methods include the MTT method and the 3H-TdR uptake method described below. This method can screen for a drug that inhibits the growth of androgen-independent cells. The substance obtained by screening is useful as a therapeutic agent for androgen-independent tumor cells. (26) The diagnostic agent for androgen-independent tumors according to (23) above, wherein the growth factor for androgen-independent tumors is activin.
(27) The method for screening for a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors according to (5).
The method for screening for an androgen-independent tumor growth inhibitor according to (25) above, wherein the substance is selected from the group consisting of GF-8 and GF-9. 1. Isolation and purification of androgen-independent tumor growth inhibitors The androgen-independent tumor growth inhibitors can be isolated by the following method. The androgen-independent tumor may be any cell induced from an androgen-dependent cell and capable of growing independently of androgen. Specifically, androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4, androgen-independent mouse breast cancer cells CADO21, and androgen-independent human prostate cancer cells DU14 are used.
5 (ATCC HTB-81), PC3 (ATCC CRL-1435), etc. Proliferation substances of androgen-independent tumors produced by androgen-independent tumors can be obtained from the culture medium obtained by culturing tumor cells in an appropriate medium, or from the cell lysate. Proliferation substances of androgen-independent tumors can be isolated and purified by a single or combined separation procedure such as solvent extraction, fractional precipitation with organic solvents, salting out, centrifugation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reversed-phase chromatography, crystallization, and electrophoresis. Proliferation substances of androgen-independent tumor cells can be identified by adding the proliferation substance to androgen-independent cells, culturing them, and then counting the number of proliferated cells using the MTT method (Tanaka, A. et al., Cancer Rep.
search, 58 , 2053 (1998)"; ³ H-TdR uptake method [Ta
naka, A. et al. ,Proceeding of National
Academy of Science USA, 89 , 8928 (1992
By the above method, activin [Vale, W. et al., Nature 454:1999-2002] can be measured as a growth substance of androgen-independent tumors produced by androgen-independent tumors.
re, 321 , 776 (1986); Ling N. , et al. , Natu
re, 321 , 779 (1986)] can be obtained, but activin can also be obtained using known gene recombination techniques (Molecular Cloning, 2nd Edition), etc. 2. Diagnostic and Therapeutic Agents for Androgen-Independent Tumors The pharmaceutical agent containing the substance of the present invention that inhibits activin activity can be administered alone as a therapeutic agent, but it is usually desirable to mix it with one or more pharmacologically acceptable carriers and provide it as a pharmaceutical preparation prepared by any method well known in the technical field of pharmaceuticals. The route of administration should be the most effective for the treatment, and examples include oral administration, or parenteral administration such as oral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous administration. In the case of antibody preparations, intravenous administration is preferred. Administration forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions,
Examples of suitable oral preparations include suppositories, injections, ointments, tapes, etc. Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules, etc. Liquid preparations such as emulsions and syrups can be prepared using additives such as water, sugars such as sucrose, sorbitol, and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, and soybean oil, preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint. Capsules, tablets, powders, granules, etc. can be prepared using additives such as excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, and gelatin, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin. Preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays, etc. Injections are prepared using carriers such as salt solutions, glucose solutions, or a mixture of both. Alternatively, powder injections can be prepared by lyophilizing proteins, peptides, or antibodies according to conventional methods and adding sodium chloride to the resulting solution. Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fat, or carboxylic acids. Sprays are prepared using the compound itself or a carrier that does not irritate the recipient's oral and respiratory mucosa and disperses the compound into fine particles to facilitate absorption. Specific examples of carriers include lactose and glycerin. Depending on the properties of the compound and the carrier used, aerosols, dry powders, and other preparations are possible. Furthermore, the same components exemplified as additives for oral preparations can also be added to these parenteral preparations. The dosage or frequency of administration depends on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, and other factors.
Although it varies depending on factors such as body weight, it is usually 10 μg/kg to 20 mg/kg per day for an adult. 3. Method for diagnosing androgen-independent tumors Detection or quantification of activin, a growth substance produced by androgen-independent tumors discovered in the present invention, is useful for diagnosing androgen-independent tumors. The following methods can be used to detect or quantify activin, using anti-activin antibodies or activin-binding proteins such as follistatin. Methods for detecting or quantifying activin in cells or tissues include fluorescent antibody techniques,
Immunohistochemical staining methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioactive immunoassay (RIA), immunohistochemical staining, and immunocytochemical staining (ABC method, CSA method, etc.)
Examples of such methods include Western blotting, dot blotting, and immunoprecipitation [Monoclonal Antibody Experiment Manual (Kodansha Scientific, 1987), Continued Biochemistry Experiment Lecture Series 5: Immunobiochemistry Research Methods (Tokyo Kagaku Dojin, 1986)]. The fluorescent antibody method involves reacting activin present in cells or tissues with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then reacting it with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof that has been labeled with a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate (FITC), and then measuring the fluorescent dye with a flow cytometer. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a method in which activin present in cells or tissues is reacted with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof that has been labeled with an enzyme such as peroxidase or biotin, and then the color-developing dye is measured with an absorptiometer. The radioactive substance-labeled immunosorbent assay (RIA) is a method in which activin present in cells or tissues is reacted with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof that has been labeled with a radioactive substance, and then the color-developing dye is measured with a scintillation counter or the like. The immunocytostaining method and the immunohistostaining method are methods in which activin present in cells or tissues is reacted with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then further reacted with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof that has been labeled with a fluorescent substance such as FITC, or an enzyme such as peroxidase or biotin, and then observed using a microscope.
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Antibodies-A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor La
After fractionation using a blotting machine, the gel is blotted onto a PVDF membrane or a nitrocellulose membrane, and the membrane is reacted with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof that has been labeled with a fluorescent substance such as FITC, or an enzyme such as peroxidase or biotin.
The dot blotting method involves blotting activin present in cells or tissues onto a nitrocellulose membrane, reacting the membrane with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then adding a fluorescent substance such as FITC,
After reacting with an antibody against the anti-activin antibody or an anti-follistatin antibody or a binding fragment thereof, which has been labeled with an enzyme such as peroxidase or biotin,
Immunoprecipitation is a method to confirm the presence of activin in cells or tissues by reacting it with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then detecting it with protein G-
This method involves adding a carrier such as Sepharose that has specific binding ability to immunoglobulins to precipitate the antigen-antibody complex. Alternatively, the Northern blot method (New Cell Engineering Experimental Protocol, Shujunsha, 1999) uses DNA or RNA encoding activin, or oligonucleotides.
993), PCR Protocols, Academic Pr
ess, 1990), in situ hybridization method (in situ
Activin in tissues or cells can be detected or quantified by genetic engineering techniques such as hybridization techniques (Interdisciplinary Planning, 1992). Northern blotting involves extracting mRNA or total RNA from cells or tissues, fractionating it by agarose gel electrophoresis (Molecular Cloning, Report 2), blotting the gel onto a nitrocellulose membrane, etc., and then reacting the membrane with a full-length or partial activin cDNA labeled with radioactive material as a probe, followed by autoradiography or other methods to confirm the activin mRNA present in the cells or tissues. PCR involves extracting mRNA or total RNA from cells or tissues, adding primers and polymerase designed based on the activin base sequence, amplifying the activin cDNA fragment, and confirming it by agarose gel electrophoresis or other methods. In situ hybridization is a method in which the activin mRNA present in cells or tissues is reacted with the full length or part of the activin cDNA labeled with biotin or the like as a probe, and then reacted with enzyme-labeled avidin or the like, and then observed under a microscope.Furthermore, FGF-8 and activin have an additive growth-promoting effect on androgen-independent tumors, and the growth substances produced by hormone-dependent tumors and hormone-independent tumors are different.Therefore, the conversion of androgen-dependent tumors to androgen-independent tumors can be monitored by detecting or quantifying activin and FGF-8 alone or simultaneously.Specifically, activin or FGF-8 present in cells or tissues can be reacted with anti-activin antibody or activin-binding protein such as follistatin, and anti-FGF-8 antibody, and then detected or quantified by the various immunological methods mentioned above.Alternatively, activin and FGF-8 can be detected or quantified alone or simultaneously by the above-mentioned genetic engineering method using DNA, RNA, or oligonucleotide encoding activin or FGF-8. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION 1. Growth-promoting effect of culture supernatants of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21 on mouse fibroblast NIH3T3 cells. Androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 [Nonomura, N., et al., Cell Growth and Development, vol. 1, pp. 111-114, 2003]
tal. , Cancer Research, 48 , 4904 (1988)]
and androgen-independent mouse breast cancer cell line CAD021 [Noguchi, S
．． et al. , Journal of Steroid Biochemistry
androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and C
The growth factor produced by ADO21 was detected in mouse fibroblast cell line NIH3T3 cells [Ta
naka, A. , et al. , FEBS Letters, 363 , 226 (
The growth-promoting activity of the paracrine growth factors [of which the phenotype is unclear] was analyzed as follows. Paracrine growth factors are substances that act on cells of other types adjacent to or near the cells that produce the growth factors. 0.5 x 10 ⁶ androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 or 0.
8 x 10 ⁶ androgen-independent mouse breast cancer cells CAD021 were cultured in DMEM:Ham's medium containing 2% dextran charcoal-treated fetal bovine serum (FBS).
100-
The cells were added to a 200 mm dish and cultured in a _CO2 incubator at 37°C.
The culture medium was FBS-free DMEM:Ham's F-12 (1:1, v/v
After culturing for another 48 hours, 2 liters of culture supernatant was collected. Evaluation of proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells: NIH3T3 cells were cultured in DM containing 2% dextran charcoal-treated FBS.
The cells were suspended in EM:Ham's F-12 (1:1, v/v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) medium and
3 x ¹⁰³ cells/100 µl were added to each well of a 6-well plate and cultured.
The next day, the culture medium was removed, and the test samples were cultured in 1% FBS-supplemented DMEM:Ham
After culturing for another 2 days, the culture medium was removed and the cells were transferred to DMEM:H containing 1% FBS.
100 μl of Am's F-12 (1:1, v/v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) medium was added and the cells were cultured. After 2 days, the cells were cultured according to the literature [Tanaka, A., et al., Cancer R
Research, 58 , 2053 (1998)], the number of cells in the culture medium was measured using an MTT assay system. The results are shown in Figure 1. When 50% and 100% of the above-mentioned culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 was added as a test sample, the number of cells in the culture medium was measured using an MTT assay system.
The proliferation-promoting activity against 3T3 cells was 132.5±11.3% and 158.8±3.
1%. When 50% and 100% of the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell CADO21 was added, the proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells was 156.3±2.5% and 153.1±2.5%, respectively. From the above, it was found that the culture supernatant of androgen-independent cells has a proliferation-promoting effect on NIH3T3 cells. 2. Purification of a substance in the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 that has proliferation-promoting activity against mouse fibroblast NIH3T3 cells The culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 and the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell CADO21 shown in 1 above were purified according to the literature [Ta
naka, A. etal. ,Proceeding of National
Academy of Science USA, 89 , 8928 (1992)
], and removing molecules with a molecular weight of 10 kilodaltons or less.
Concentration was performed using a con-Labocassette (Millipore).
tional Academy of Science USA, 89 , 892
8 (1992)], the obtained concentrated culture supernatant was diluted with 0.1 M NaCl
l, 0.1% CHAPS{3-[(3-cholamidopropyl) di
methylammonio]-1-propanesulfonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 200 μg
/ml leupeptin in 10 mM Tris/HCl buffer (pH 7.5)
The column was washed with the equilibration buffer, and then loaded onto a heparin Sepharose column (gel volume 1 ml: manufactured by Amajam Pharmacia Biotech) equilibrated with NaCl at concentrations of 0.3 M, 0.6 M, 2 M, and 1 M.
10 ml of each equilibration buffer containing
A total of 10 tubes were sequentially eluted with 10 1/2 ml each. The activity of the heparin column elution fractions was examined in the proliferation assay system using NIH3T3 cells shown in 1 above, by adding 2% of each elution fraction (the first 5 tubes) as test samples. The results of purifying the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell CADO21 are shown in Figure 2. The substance with NIH3T3 cell proliferation-promoting activity was recovered in the 0.3 M NaCl elution fraction. As shown in Table 1, the substance with NIH3T3 cell proliferation-promoting activity was also recovered in the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 at 0.3 M NaCl.
It was collected in the 3M NaCl elution fraction. For the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell CAD021, 0.
The 3M NaCl elution fraction was collected and transferred to Copper Column equilibrated with the above equilibration buffer.
The column was washed with equilibration buffer, and then 5 ml of equilibration buffer containing 2 mM, 5 mM, 10 mM, and 20 mM imidazole was applied to the column, and the proteins adsorbed on the column were sequentially eluted. The activity of the eluted fractions was evaluated by measuring the activity of each fraction in the proliferation assay system using NIH3T3 cells shown in 1 above.
The results are shown in Table 2. The proliferation-promoting activity on NIH3T3 cells was recovered in the 10 mM imidazole eluted fraction. 3. NIH3T3 in the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell line SC-4
Identification of cell proliferation-promoting substances. The proliferation-promoting substances in the culture supernatants of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21 were purified using the heparin column described above.
The FGF family of growth factors generally has a high affinity for heparin [Burgess, W. H. et al., Annual Rev.
Journal of Biochemistry, 58 , 575 (1989)]. The eluted growth-promoting active substance had very weak affinity for heparin, and was therefore considered not to belong to the FGF family of growth factors. Furthermore, since the active substance had growth-promoting activity against NIH3T3 fibroblast cells, it was considered to be a TGF (Transforming Growth Factor)-like substance.
It was estimated that the substance belongs to the TGF-β superfamily. Among the TGF-β superfamily, activin [Munie
r,H. et al. ,Proceeding of National Ac.
Academy of Science USA, 85 , 247-251 (1988
The following analysis was carried out focusing on the heparin column-purified fraction of the culture supernatant of androgen-independent mouse breast cancer cell CADO21, which has the activity of promoting the proliferation of NIH3T3 cells, obtained in the above 2. The fraction was added to the proliferation assay system using NIH3T3 cells shown in the above 1 at a concentration of 1%.
Kindly provided by Dr. Palow of the Department of Endocrinology and Pituitary Program: Journal of Endocrinology, 154 , 535 (
1997)] was added to a final concentration of 10 nM. Follistatin is an activin-binding protein and has the ability to neutralize activin activity. The results are shown in Figure 3. Human follistatin at a final concentration of 10 nM
Although it had no effect on the proliferation of NIH3T3 cells, it did inhibit the activity of the fraction purified using a heparin column to promote the proliferation of NIH3T3 cells.
β-chain homodimer: βAβA) [Hasegawa, Y., et al., Hor
mone Research, 41 (supplement 1) , 55 (19
94)] at 10 and 100 ng/ml promoted the proliferation of NIH3T3 cells, and follistatin at 10 nM inhibited the activity of activin A.
The proliferation-promoting activity against 3T3 cells was inhibited by follistatin.
The presence of activin, which has been reported as a follistatin-binding factor, was suggested.
Therefore, the presence or absence of activin in the fractions purified by the Copper-chelating column as described in 2 above, which had proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells, was examined by Western blotting using an anti-activin βA monoclonal antibody as follows.
, 58 , 2053 (1998)], SDS-PAGE was carried out using a 10-20% gradient polyacrylamide gel (manufactured by Daiichi Kagaku Co., Ltd.) as follows: One-tenth of the fraction purified by the Copper-chelating column obtained in 2 above was loaded onto a gel lane and subjected to electrophoresis. After electrophoresis, the gel was washed with PVDF.
The resultant was transferred to a membrane (manufactured by Bio-Rad), and then a 100,000-fold diluted anti-activin βA monoclonal antibody [Miyamoto, K. et al., BBRC, 136 ,
1103-1109 (1986)] was reacted and the result was analyzed using ECL Plus detect.
Activin βA was detected using a cleavage kit (manufactured by Amersham) according to the attached protocol. The results are shown in Figure 4. In the fractions purified by the Copper-chelating column, a protein with a molecular weight of approximately 14.5 that reacted with anti-activin βA monoclonal antibody was detected.
A band around 8 kilodaltons was detected. The mobility of the band matched that of activin βA in the positive control human recombinant inhibin A [a heterodimer of activin βA chain (molecular weight 18 kilodaltons) and inhibin α (molecular weight 18 kilodaltons)]. Therefore, it was revealed that activin βA was contained in the fraction purified by the Copper-chelating column. In order to confirm that activin is a substance with growth-promoting activity in NIH3T3 cells, purified ujiactivin A (β chain homodimer: βAβA), activin B (
β-chain homodimer: βBβB), activin AB (β-chain homodimer: βAβB) [
Hasegawa, Y. , et al. , Hormone Research,
41 (supplement 1) , 55 (1994)] and recombinant human inhibin A (α chain β chain heterodimer: αAβB) (US National Hor
The growth-promoting activity of the three purified activins on NIH3T3 cells was examined using the method described in 1 above. The results are shown in Figure 5. All three purified activins increased the growth rate of NIH3T3 cells in a concentration-dependent manner.
Activin A showed proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells. On the other hand, inhibin A showed no proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells. Therefore, it was revealed that the proliferation-promoting activity against NIH3T3 cells is specifically possessed by β-chain homodimers (βAβA, βBβB, βAβB). 4. Proliferation-Promoting Effect of Activin on Androgen-Independent Mouse Breast Cancer Cells SC-4 The effect of activin on the proliferation of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 was examined using purified bovine activin A, activin B, and activin AB shown in 3 above. Androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 were suspended in DMEM:Ham's F-12 (1:1, v/v, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) medium containing 2% Textrancha-Call-treated FBS, and 1.5 x ¹⁰³ cells/100 μl was added to each well of a 96-well plate and cultured. The next day, the culture medium was removed and 0.01 ml of PBS containing the test sample was added.
100 μl of 1% BSA-added DMEM:Ham's F-12 (1:1, v/v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) medium was added and cultured. After 2 days, the culture medium was replaced, and after further culture for 1 day, the cells were cultured as described in the literature [Tanaka, A., et al., Cancer Research
Arch, 58 , 2053 (1998)], the number of cells in the culture medium was measured using an MTT assay system. The results are shown in Figure 6. When activin B and a mixture of activin A and activin B were added at a concentration of 100 ng/ml, the proliferation of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 increased to 145% and 138%, respectively, compared to the case without addition.
On the other hand, the proliferation of cells treated with activin A and activin AB was 110% and 100%, respectively, compared to the control group. Therefore, it was revealed that, among the three activins, activin B had the highest proliferation-promoting activity against androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4.
FGF-8, which was found as an autocrine growth factor of 115, has been reported to be important as a growth factor for androgen-dependent tumors [Tanaka, A.
et al. ,Proceeding of National Academ
Science USA, 89 , 8928 (1992)], but its relevance in androgen-independent tumors is unknown. Therefore, we investigated the effect of FGF on the proliferation-promoting activity of purified activin B, a growth factor for androgen-independent cells.
The effect of purified FGF-8 [Tanaka, A., et al., J. Immunol. 1999, 12, 141-142] on the growth of leukocytes was investigated in the same manner as described above. The results are shown in Figure 7.
l., FEBS Letters, 363 , 226 (1995)] is 50 ng
At a concentration of 100ng/ml, activin B alone had the activity of promoting the proliferation of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4. Furthermore, activin B and a mixture of activin A and activin B showed the effect of further enhancing the proliferation promoting activity of FGF-8 on androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 at a concentration of 100ng/ml. Activin A and activin AB were not found to have the effect of enhancing the proliferation promoting activity of FGF-8. From the above results, it can be seen that activin B has the activity of promoting the proliferation of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-
It was revealed that FGF-8 is a growth-promoting substance for androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, SC-4, and CAD021, and that FGF-8 has a growth-promoting activity not only for androgen-dependent cell proliferation but also for androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4, and that the growth-promoting activity of FGF-8 for androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 is further enhanced by activin B. 5. The effect of FGF-8 on androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, SC-4, and CAD021 by RT-PCR
Detection of FGF-8 and activin mRNA in androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, and androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21.
The detection of RNA and the change in expression were examined by RT-PCR. Androgen stimulation of androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4, and CADO21 cells was performed according to the literature [Tan
aka, A. et al. ,Proceeding of National
Academy of Science USA, 89, 8928 (1992)
The preparation of total RNA from cells and the RT-PCR method were carried out according to the method described in [Tanaka, A., et al., FEBS Letters, 36
3 , 226 (1995)]. RT-PCR was carried out for 48 hours according to the method described in the above-mentioned literature. The primers used were mouse activin β
The primer set for detecting B was composed of synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the primer set for detecting mouse FGF-8 was composed of synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
A mouse G3PDH gene (glyceraldehyde-3-
Phosphate dehydrogenase) detection primer set (
Mouse G3PDH Control Amplifier Set was purchased from Clontech. The results are shown in Figure 8. Since all PCR bands for the control gene G3PDH were equivalent, it is clear that the androgen-dependent mouse breast cancer cells SC
-3, androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21 mRNA
It was confirmed that the amount of NA was equivalent. In the androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21, activin βB chain mRNA was detected regardless of whether or not the cells were stimulated with androgen.
On the other hand, activin βB chain mRNA was not detected in androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, regardless of whether or not they were stimulated with androgen.
The mRNA was detected only in androgen-stimulated androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, and not in androgen-stimulated androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3.
These results suggest that androgen-dependent tumors express FGF-α under androgen stimulation, whereas FGF-α is not detected in androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21.
It has been revealed that androgen-independent tumors produce FGF-8 but not activin βB. It has also been revealed that androgen-independent tumors do not produce FGF-8 but do produce activin βB chain. These results indicate that when cells are converted from androgen-dependent to androgen-independent, they lose the ability to produce FGF-8 and acquire the ability to produce activin βB. Therefore, by detecting the ability of cells to produce FGF-8 and activin βB chain, it is possible to diagnose the conversion of androgen-dependent cells to androgen-independent cells. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides an androgen-independent tumor growth inhibitor, a therapeutic agent and diagnostic agent for androgen-independent tumors, a diagnostic method for androgen-independent tumors, and a screening method for a growth inhibitor of androgen-independent tumor cells, which are useful for the treatment and diagnosis of androgen-independent tumors. "Sequence Listing Free Text" SEQ ID NO: 1 - Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 2 - Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 3 - Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 4 - Description of artificial sequence: synthetic DNA

【配列表】 [Sequence List]

[Brief explanation of the drawings]

第１図アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４およびＣＡＤＯ２１培
養上清のマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に対する増殖促進活性を示す。第２図アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１培養上清をヘパリ
ンセファロースカラムで精製した画分のマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に対する
増殖促進活性を示す。第３図ヘパリンカラムで精製した画分および精製アクチビンのマウス繊維芽
細胞ＮＩＨ３Ｔ３に対する増殖促進活性および各々の増殖促進活性に対するフォ
リスタチンの阻害効果を示す。第４図Ｃｏｐｐｅｒ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラムで精製した画分中のアクチ
ビンβＡをウエスタンブロット法により検出した結果を示す。第５図精製アクチビンＡ，アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビ
ンＡとアクチビンＢとの混合物のマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に対する増殖促
進活性を示す。第６図精製アクチビンＡ，アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビ
ンＡとアクチビンＢとの混合物のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４
に対する増殖促進活性を示す。第７図ＦＧＦ−８単独、およびＦＧＦ−８存在下における精製アクチビンＡ
，アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡとアクチビンＢとの混合
物のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞ＳＣ−４に対する増殖促進活性を示す
。第８図アンドロゲン無刺激マウス乳癌細胞ＳＣ−３細胞（レーン１）、アン
ドロゲン刺激マウス乳癌細胞ＳＣ−３細胞（レーン２）、アンドロゲン無刺激マ
ウス乳癌細胞ＳＣ−４細胞（レーン３）、アンドロゲン刺激マウス乳癌細胞ＳＣ
−４細胞（レーン４）、アンドロゲン無刺激マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１細胞（
レーン５）、アンドロゲン刺激マウス乳癌細胞ＣＡＤＯ２１細胞（レーン６）の
、アクチビンβＢ、ＦＧＦ−８およびＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法に
より検出した結果を示す。 Figure 1 shows the growth-promoting activity of culture supernatants of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CADO21 against mouse fibroblast cells NIH3T3. Figure 2 shows the growth-promoting activity of fractions purified from culture supernatants of androgen-independent mouse breast cancer cells CADO21 using a heparin Sepharose column against mouse fibroblast cells NIH3T3. Figure 3 shows the growth-promoting activity of fractions purified using a heparin column and purified activin against mouse fibroblast cells NIH3T3, and the inhibitory effect of follistatin on each growth-promoting activity. Figure 4 shows the results of detecting activin βA in fractions purified using a Copper-chelating column by Western blotting. Figure 5 shows the growth-promoting activity of purified activin A, activin B, activin AB, and a mixture of activin A and activin B against mouse fibroblast cells NIH3T3. Figure 6. The effects of purified activin A, activin B, activin AB, and a mixture of activin A and activin B on androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4
Figure 7 shows the proliferation-promoting activity of purified activin A against FGF-8 alone and in the presence of FGF-8.
Figure 8 shows the growth-promoting activity of androgen-unstimulated mouse breast cancer cells SC-3 (lane 1), androgen-stimulated mouse breast cancer cells SC-3 (lane 2), androgen-unstimulated mouse breast cancer cells SC-4 (lane 3), androgen-stimulated mouse breast cancer cells SC-4 (lane 4).
-4 cells (lane 4), androgen-unstimulated mouse breast cancer cells CAD021 cells (
Lane 5) and androgen-stimulated mouse breast cancer cell CAD021 cells (lane 6) show the results of detecting activin βB, FGF-8, and G3PDH mRNA by RT-PCR.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/60 Ａ 33/60 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ（注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作成したものである。なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）により生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。───────────────────────────────────────────────────────── Continued from the front page (51) Int.Cl. ⁷ identification symbol FI A61K 39/395 A61K 48/00 48/00 A61P 35/00 A61P 35/00 43/00 111 43/00 111 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/50 Z 33/50 33/53 D 33/53 33/60 A 33/60 A61K 37/02 (81) Designated States EP(AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE , ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (Note) This publication is based on the gazette published internationally by the International Bureau (WIPO). The effect of the international publication of the Japanese patent application (Japanese utility model registration application) related to this publication arises pursuant to Article 184-10, Paragraph 1 of the Patent Act (Article 48-13, Paragraph 2 of the Utility Model Act), and is unrelated to this publication.

Claims

[Claims]

1. An agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors, comprising as an active ingredient a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors.

[Claim 2] The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors described in claim 1, wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is at least one substance selected from substances having activin inhibitory activity and substances having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity.

3. The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to claim 1, wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is a substance having activin inhibitory activity.

[Claim 4] An androgen-independent tumor growth inhibitor according to claim 2 or 3, wherein the substance having activin inhibitory activity is a substance selected from an anti-activin neutralizing antibody, an anti-activin receptor neutralizing antibody, an activin binding protein, and an activin antisense DNA/RNA.

5. The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to claim 4, wherein the activin-binding protein is follistatin.

6. The agent for inhibiting the growth of androgen-independent tumors according to claim 1 or 2, wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity.

[Claim 7] An androgen-independent tumor growth inhibitor according to claim 2 or 6, wherein the substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity is a substance selected from an anti-FGF-8 neutralizing antibody, an anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, and an FGF-8 antisense DNA/RNA.

8. A therapeutic agent for androgen-independent tumors, comprising as an active ingredient a substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors.

9. The androgen-independent tumor therapeutic agent according to claim 8, wherein the substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors is at least one substance selected from the group consisting of a substance having activin inhibitory activity and a substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity.

10. The drug for treating androgen-independent tumors according to claim 8 or 9, wherein the substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors is a substance having activin inhibitory activity.

11. The substance having activin inhibitory activity is an anti-activin neutralizing antibody,
The androgen-independent tumor therapeutic agent according to claim 9 or 10, which is a substance selected from an anti-activin receptor neutralizing antibody, an activin binding protein, and an antisense DNA/RNA of activin.

12. The method of claim 11, wherein the activin-binding protein is follistatin.
2. The androgen-independent tumor treatment drug described herein.

13. The method according to claim 8 or 9, wherein the substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors is a substance having an inhibitory activity against fibroblast growth factor-8 (FGF-8).
2. The androgen-independent tumor treatment drug described herein.

14. The androgen-independent tumor therapeutic agent according to claim 7 or 13, wherein the substance having fibroblast growth factor-8 (FGF-8) inhibitory activity is a substance selected from an anti-FGF-8 neutralizing antibody, an anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, and an FGF-8 antisense DNA/RNA.

15. Anti-activin antibodies, activin binding proteins, and activin D
A method for detecting activin using a substance selected from NA/RNA.

16. The method for detecting activin according to claim 15, wherein the activin-binding protein is follistatin.

17. Anti-activin antibodies, activin binding proteins and activin D
A method for quantifying activin using a substance selected from NA/RNA.

18. The method for quantifying activin according to claim 16, wherein the activin-binding protein is follistatin.

19. Anti-activin antibody, activin binding protein, activin DNA
A method for diagnosing androgen-independent tumors using a substance selected from FGF-8 DNA/RNA, anti-FGF-8 antibody, and FGF-8 DNA/RNA.

20. The method for diagnosing an androgen-independent tumor according to claim 19, wherein the activin-binding protein is follistatin.

21. Anti-activin antibody, activin binding protein, activin DNA
A method for diagnosing the conversion of androgen-dependent cells to androgen-independent cells using a substance selected from the group consisting of FGF-8 DNA/RNA, anti-FGF-8 antibody and FGF-8 DNA/RNA.

22. The diagnostic method according to claim 21, wherein the activin-binding protein is follistatin.

23. Anti-activin antibody, activin binding protein, activin DN
A diagnostic agent for androgen-independent tumors, comprising as an active ingredient a substance selected from the group consisting of anti-FGF-8 A/RNA, anti-FGF-8 antibody and FGF-8 DNA/RNA.

24. The diagnostic agent for androgen-independent tumors according to claim 23, wherein the activin-binding protein is follistatin.

25. A method for screening for a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors, using a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors.

26. The method for screening for a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors according to claim 25, wherein the substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors is activin.

27. The growth factor for androgen-independent tumors is fibroblast growth factor-
26. The method for screening for a substance that inhibits the growth of androgen-independent tumors according to claim 25, wherein the substance is FGF-8 (FGF-8).