JPS6387921A - ホモノ科植物を形質転換する方法 - Google Patents
ホモノ科植物を形質転換する方法Info
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
又所Ω宜員
土壌細菌アグロバクテリウム・テユメファシェンス（Ａ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）の病原性株（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ５ｔｒａｉｎｓ ）
は双子葉植物に感染してこれらの植物に新生物形成応答
を引き起こさせることが知られている。該細菌中の腫瘍
誘導剤はそのＤＮＡのいくつかを宿主植物細胞中に伝達
し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれることに
よって機能するプラスミドである。このプラスミドはＴ
ｉプラスミドと呼ばれ、Ａ、テユメファシエンスの種々
の株の病原性はＴｉ プラスミドの、Ｔ−ＤＮＡの可動
化及び伝達に関与する層重領域によっである程度決定さ
れる。Ｔ−ＤＮＡ部はそれぞれ右境界部（ｒｉｇｈｔ
ｂｏｒｄｅｒ ）及び左境界部（１ｅｆｔ ｂｏｒｄｅ
ｒ ）と名づけられる２つの２３塩基対反復によって境
界が定められている。これら２つの境界部配列の間に位
置する遺伝情ｆｌａ＆よいずれも可動性であり、感受性
宿主に伝達される。ひとたび染色体中に入るとＴ−ＤＮ
Ａ遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子と同様にふるまう。
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）の病原性株（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ５ｔｒａｉｎｓ ）
は双子葉植物に感染してこれらの植物に新生物形成応答
を引き起こさせることが知られている。該細菌中の腫瘍
誘導剤はそのＤＮＡのいくつかを宿主植物細胞中に伝達
し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれることに
よって機能するプラスミドである。このプラスミドはＴ
ｉプラスミドと呼ばれ、Ａ、テユメファシエンスの種々
の株の病原性はＴｉ プラスミドの、Ｔ−ＤＮＡの可動
化及び伝達に関与する層重領域によっである程度決定さ
れる。Ｔ−ＤＮＡ部はそれぞれ右境界部（ｒｉｇｈｔ
ｂｏｒｄｅｒ ）及び左境界部（１ｅｆｔ ｂｏｒｄｅ
ｒ ）と名づけられる２つの２３塩基対反復によって境
界が定められている。これら２つの境界部配列の間に位
置する遺伝情ｆｌａ＆よいずれも可動性であり、感受性
宿主に伝達される。ひとたび染色体中に入るとＴ−ＤＮ
Ａ遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子と同様にふるまう。
すなわちＴ−ＤＮＡ遺伝子は形質転換された植物によっ
て安定に維持され、発現されそして有性的に伝えられ、
通常のメンデル形式で遺伝される。
て安定に維持され、発現されそして有性的に伝えられ、
通常のメンデル形式で遺伝される。
Ａ、テユメファシエンス感染の部位で未分化状態で生長
する植物腫瘍ｍ織の瘤はクラウンゴールと呼ばれる。Ａ
、テユメファシエンスによって引き起こされたクラウン
ゴールの細胞はオバインと呼ばれる通常でないアミノ酸
を合成する。Ａ、テユメファシエンスの異なる菌株がク
ラウンゴール細胞による異なったオバインの合成を指示
し、誘導された特定のオパインは植物に感染した菌株の
１つの特性となる。さらに与えられた菌株によって誘導
された特定のオパインを異化する能力もその菌株の特性
である。
する植物腫瘍ｍ織の瘤はクラウンゴールと呼ばれる。Ａ
、テユメファシエンスによって引き起こされたクラウン
ゴールの細胞はオバインと呼ばれる通常でないアミノ酸
を合成する。Ａ、テユメファシエンスの異なる菌株がク
ラウンゴール細胞による異なったオバインの合成を指示
し、誘導された特定のオパインは植物に感染した菌株の
１つの特性となる。さらに与えられた菌株によって誘導
された特定のオパインを異化する能力もその菌株の特性
である。
オパインは通常Ａ、テユメファシエンスや未感染宿主植
物によっては合成されない、オパインの合成に関与する
酵素、オパインシンターゼをコードするのはＴ−ＤＮＡ
であるが、これらの遺伝子は感染した植物組織中でのみ
発現される。このような発現はこれらの遺伝子がＴ−Ｄ
ＮＡ上の真核調節配列の調節のもとにあるという所見と
一致する。
物によっては合成されない、オパインの合成に関与する
酵素、オパインシンターゼをコードするのはＴ−ＤＮＡ
であるが、これらの遺伝子は感染した植物組織中でのみ
発現される。このような発現はこれらの遺伝子がＴ−Ｄ
ＮＡ上の真核調節配列の調節のもとにあるという所見と
一致する。
もっとも通常のオパインはオクトピン及びツバリンであ
る。オクトピンの合成を触媒するオパインシンターゼは
リゾピンデヒドロゲナーゼであり、ツバリンの合成を触
媒するオパインシンターゼはツバリンデヒドロゲナーゼ
である。
る。オクトピンの合成を触媒するオパインシンターゼは
リゾピンデヒドロゲナーゼであり、ツバリンの合成を触
媒するオパインシンターゼはツバリンデヒドロゲナーゼ
である。
クラウンゴール細胞を培養すると、通常の植物細胞が培
養物中で生長するようにするために加えねばならない植
物ホルモンを欠く培地中でも生長してカルス培養物を生
ずる。カルス培養物は比較的に未分化な植物細胞の組織
化されていない塊である。クラウンゴール細胞の無ホル
モン培地中で生長する能力も形質転換された宿主細胞中
のＴ−ＤＮＡの存在に帰せられる。なぜなら、植物ホル
モンの合成を指示する遺伝子も又Ｔ−ＤＮＡと連合して
いるからである。
養物中で生長するようにするために加えねばならない植
物ホルモンを欠く培地中でも生長してカルス培養物を生
ずる。カルス培養物は比較的に未分化な植物細胞の組織
化されていない塊である。クラウンゴール細胞の無ホル
モン培地中で生長する能力も形質転換された宿主細胞中
のＴ−ＤＮＡの存在に帰せられる。なぜなら、植物ホル
モンの合成を指示する遺伝子も又Ｔ−ＤＮＡと連合して
いるからである。
Ａ、テユメファシエンス及び遺伝子操子操作によってＴ
−ＤＮＡを挿入される宿主植物の双方にとって外来のＤ
ＮＡ分節もＡ、テユメファシエンスによって宿主細胞中
に伝達される。このようにＴｉプラスミドは宿主植物の
遺伝子工学のためのベクターとして用いることができる
。野性型Ａ。
−ＤＮＡを挿入される宿主植物の双方にとって外来のＤ
ＮＡ分節もＡ、テユメファシエンスによって宿主細胞中
に伝達される。このようにＴｉプラスミドは宿主植物の
遺伝子工学のためのベクターとして用いることができる
。野性型Ａ。
テユメファシエンスにおいては細菌あたり１個のＴｉプ
ラスミドしかないが、遺伝学的にＡ、テユメファシエン
スではＴ−ＤＮＡの伝達が起こるために、幻工領域とＴ
−ＤＮＡとは同じＴｉプラスミド上に担持される必要は
ない。層重領域とＴ−ＤＮＡとは同じアグロバクテリウ
ムに含まれる別のプラスミド上に担持することができる
。
ラスミドしかないが、遺伝学的にＡ、テユメファシエン
スではＴ−ＤＮＡの伝達が起こるために、幻工領域とＴ
−ＤＮＡとは同じＴｉプラスミド上に担持される必要は
ない。層重領域とＴ−ＤＮＡとは同じアグロバクテリウ
ムに含まれる別のプラスミド上に担持することができる
。
Ａ、テユメファシエンスの宿主範囲は双子葉類に限り、
単子葉類の形質転換はこのｍ苗では行われないと一般に
考えられてきた。実際Ａ、テユメファシエシスの感染に
よる単子葉頬ホモノ科植物の形質転換について誰も報告
していない。
単子葉類の形質転換はこのｍ苗では行われないと一般に
考えられてきた。実際Ａ、テユメファシエシスの感染に
よる単子葉頬ホモノ科植物の形質転換について誰も報告
していない。
しかしながら、最近Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏ
ｇｔｅｒｅｎらはＮａｔｕｒｅ ３１１．７６３ （１
９８４）でユリ科及びヒガンバナ科の単子葉類にＡ、テ
ユメファシエンスが感染した傷部位に小さなふくれが生
成することを報告した。感染植物の偏部から取り出した
植物細胞中にオパインが検出された。
ｇｔｅｒｅｎらはＮａｔｕｒｅ ３１１．７６３ （１
９８４）でユリ科及びヒガンバナ科の単子葉類にＡ、テ
ユメファシエンスが感染した傷部位に小さなふくれが生
成することを報告した。感染植物の偏部から取り出した
植物細胞中にオパインが検出された。
又、Ｈｅｒｎａｌｓｆｅｅｎｓ らはＴｈｅ ＥＭＢＯ
Ｊｏｕｒｎａｌ。
Ｊｏｕｒｎａｌ。
３．３０３８（１９８４）において、Ａ、テユメファシ
エンスＣ５８株に感染したユリ科の１メンバーである、
単子葉類アスパラガス・オフィシナリス（ｏｆｆ １ｃ
ｉｎａｌｉｓ）の培養した茎断片が腫瘍状増殖を発展さ
せることを報告した。これらの腫瘍状増殖物の１つは無
ホルモン培地で増殖でき、又この腫瘍状増殖物から導か
れた樹立カルス培養物中にオパインが検出された。
エンスＣ５８株に感染したユリ科の１メンバーである、
単子葉類アスパラガス・オフィシナリス（ｏｆｆ １ｃ
ｉｎａｌｉｓ）の培養した茎断片が腫瘍状増殖を発展さ
せることを報告した。これらの腫瘍状増殖物の１つは無
ホルモン培地で増殖でき、又この腫瘍状増殖物から導か
れた樹立カルス培養物中にオパインが検出された。
１９８２年に、Ａｎｎｅ Ｃ０Ｐ、 Ｇｒａｖｅｓは“
ＳｏｍｅＴｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅ
ｓ ｏｆ ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ （Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｏｗｎ） Ｃｏｎ
ｎ、’ （アグロバクテリウム・テュメファシエンス
のいくつかの腫瘍発生活性）（Ｂｏｗｌｉｎｇ Ｇｒｅ
ｅｎ ５ｔａｔｅ ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）題する彼
女の博士論文中でＡ、テ二メファシエンスＣ５８Ｎ及び
Ｂ６の植菌によってグラジオラス円板上に組織の不規則
な塊りが発育することを報告した。これらの組織塊はじ
ゃがいも塊茎円板に発育させた組織塊と同じようであり
、同様な細胞形態を有しているように見えた。電気泳動
中オクトピン標品と一緒に移動した化合物は８６株によ
ってＰ！されたグラジオラス円板上の増殖物中に見い出
された。又、オクトピン標品のすぐ後を移動した化合物
はＣ５８Ｎ株によって誘導されたグラジオラス円板上の
増殖物中に生じていた。オクトピンデヒドロゲナーゼも
又Ａ、テユメファシエンスＢ６によって誘導された細胞
増殖物抽出液中に見い出されたが、Ａ、テユメファシェ
ンスＣ５８Ｎによって誘導された細胞増殖物抽出液中に
は見い出されなかった。
ＳｏｍｅＴｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅ
ｓ ｏｆ ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ （Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｏｗｎ） Ｃｏｎ
ｎ、’ （アグロバクテリウム・テュメファシエンス
のいくつかの腫瘍発生活性）（Ｂｏｗｌｉｎｇ Ｇｒｅ
ｅｎ ５ｔａｔｅ ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）題する彼
女の博士論文中でＡ、テ二メファシエンスＣ５８Ｎ及び
Ｂ６の植菌によってグラジオラス円板上に組織の不規則
な塊りが発育することを報告した。これらの組織塊はじ
ゃがいも塊茎円板に発育させた組織塊と同じようであり
、同様な細胞形態を有しているように見えた。電気泳動
中オクトピン標品と一緒に移動した化合物は８６株によ
ってＰ！されたグラジオラス円板上の増殖物中に見い出
された。又、オクトピン標品のすぐ後を移動した化合物
はＣ５８Ｎ株によって誘導されたグラジオラス円板上の
増殖物中に生じていた。オクトピンデヒドロゲナーゼも
又Ａ、テユメファシエンスＢ６によって誘導された細胞
増殖物抽出液中に見い出されたが、Ａ、テユメファシェ
ンスＣ５８Ｎによって誘導された細胞増殖物抽出液中に
は見い出されなかった。
叶、 Ｇｒａｖｅｓは又他のある単子葉植物のＡ、テ
ユメファシエンスの植菌に対する応答について記述した
。しょうが根茎円板上には細胞増殖はみられず、チュー
リップ球根円板についての結果ははっきりしなかった。
ユメファシエンスの植菌に対する応答について記述した
。しょうが根茎円板上には細胞増殖はみられず、チュー
リップ球根円板についての結果ははっきりしなかった。
がま及びざぜんそうの根茎円板上での細胞増殖は早春に
おける維管束の先端（ｅｎｄ ）での輪郭がくっきりし
た細胞（ｃｌｅａｎｃｅｌｌｓ ）のいくつかの層に限
られた。
おける維管束の先端（ｅｎｄ ）での輪郭がくっきりし
た細胞（ｃｌｅａｎｃｅｌｌｓ ）のいくつかの層に限
られた。
ＤｅＣｌｅｅｎｅ及びＤｅＬｅｙはＴｈｅ Ｂｏｔａｎ
ｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 、。
ｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 、。
■、３８９ （１９７６）において、Ａ、テユメファ
シエンスの植物宿主範囲についての広範囲に亘る研究の
結果を報告した。彼らの論文はＬｉ１ｉａｌｅｓ及びＡ
ｒａｌｅｓ目の単子葉植物はＡ、テユメファシエンスの
感染に感受性であるが、一般に単子葉類はＡ、テユメフ
ァシエンス感染に非感受性であることを教示している。
シエンスの植物宿主範囲についての広範囲に亘る研究の
結果を報告した。彼らの論文はＬｉ１ｉａｌｅｓ及びＡ
ｒａｌｅｓ目の単子葉植物はＡ、テユメファシエンスの
感染に感受性であるが、一般に単子葉類はＡ、テユメフ
ァシエンス感染に非感受性であることを教示している。
特に彼らの論文はホモノ科（にｒａｍｉｎｅａｅ ）植
物がＡ、テユメファシェンス感染に感受性でないことを
報告している。Ａ、テユメファシエンスに対する感受性
は傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決
定された。
物がＡ、テユメファシェンス感染に感受性でないことを
報告している。Ａ、テユメファシエンスに対する感受性
は傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決
定された。
Ｌｏｎｇ らはＭｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、
１９９．１７８（１９８５）において、Ｆｒｏｍｍらは
Ｎａｔｕｒｅ ５３１９．７９１ （１９８６）にお
いて、及びＰｏｒｔｒｙｋｕｓ らはＭｏ１． Ｇｅｎ
、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １９９．１８３（１９８５）にお
いて、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ
科植物の形質転換について報告した。プロトプラストは
細胞壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞
である。
１９９．１７８（１９８５）において、Ｆｒｏｍｍらは
Ｎａｔｕｒｅ ５３１９．７９１ （１９８６）にお
いて、及びＰｏｒｔｒｙｋｕｓ らはＭｏ１． Ｇｅｎ
、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １９９．１８３（１９８５）にお
いて、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ
科植物の形質転換について報告した。プロトプラストは
細胞壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞
である。
Ｌｏｎｇらはツバリンシンターゼプロモーター、及びオ
クトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグナ
ルを含有するＤＮＡを用いるＴｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏ
ｃｏｃｃｕｍのプロトプラストを形質転換した。
クトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグナ
ルを含有するＤＮＡを用いるＴｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏ
ｃｏｃｃｕｍのプロトプラストを形質転換した。
Ｆｒｏｍｍ らはプラスミドｐｃａＭＶＮＥｏ（カリフ
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、トランス
ボゾンＴｎ ５からのネオマイシンホスホトランスフヱ
ラーゼＩ／遺伝子、及びツバリンシンターゼ３′領域を
含有する）のとうもろこしプロトプラストへのエレクト
ロポレーションによる伝達の結果として、カナマイシン
抵抗性の、安定に形質転換されたとうもろこし細胞が得
られることを開示している。
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、トランス
ボゾンＴｎ ５からのネオマイシンホスホトランスフヱ
ラーゼＩ／遺伝子、及びツバリンシンターゼ３′領域を
含有する）のとうもろこしプロトプラストへのエレクト
ロポレーションによる伝達の結果として、カナマイシン
抵抗性の、安定に形質転換されたとうもろこし細胞が得
られることを開示している。
Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ら
、１ｌｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら、Ｇｒａｖｅｓ ％及
びＤｅＣＩｅｅｎｅ及びＤｅＬｅｙの感染技術、又はＬ
ｏｎｇら、Ｆｒｏｍｍら及びＰｏｒ ｔｒｙｋｕｓらの
直接遺伝子伝達技術を用いて発生した、形質転換された
細胞から形質転換された植物を得るためには、プロトプ
ラスト又は単一細胞培養物から植物が再生（ｒｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄ ）されなければならない。
、１ｌｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら、Ｇｒａｖｅｓ ％及
びＤｅＣＩｅｅｎｅ及びＤｅＬｅｙの感染技術、又はＬ
ｏｎｇら、Ｆｒｏｍｍら及びＰｏｒ ｔｒｙｋｕｓらの
直接遺伝子伝達技術を用いて発生した、形質転換された
細胞から形質転換された植物を得るためには、プロトプ
ラスト又は単一細胞培養物から植物が再生（ｒｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄ ）されなければならない。
しかしながらホモノ科植物のプロトプラスト又は単一細
胞培養物から植物を再生することに未だ誰も成功してい
ない。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は他の形
質転換された分化した器官もしくは組織を生産する手段
は現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上重要な
形態又は部分、例えば種子、花粉、穂（ｅａｒｓ ）又
は植物体において外来ＤＮＡの発現を許容する手法でホ
モノ科植物を形質転換する手段は未だ存在しない。
胞培養物から植物を再生することに未だ誰も成功してい
ない。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は他の形
質転換された分化した器官もしくは組織を生産する手段
は現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上重要な
形態又は部分、例えば種子、花粉、穂（ｅａｒｓ ）又
は植物体において外来ＤＮＡの発現を許容する手法でホ
モノ科植物を形質転換する手段は未だ存在しない。
最後に、１９８６年２月１３日に発行されたＰＣＴ国際
公開第ＷＯ８６／ ００９３１ （Ｓｉｍｐｓｏｎら）
は完全な植物体を形質転換し再生する生体内手法を教示
している。この特許出願はその発明の方法はＡ、テユメ
ファシエンス苗条（５ｈｏｏｔｙ ）変異株の感染につ
づいて苗条腫瘍（５ｈｏｏｔｙ ｔｕｍｏｒ ）を形成
するいかなる植物の形質転換にも用いることができるこ
とができると記載している。しかしながら上記したごと
く、ホモノ科植物がＡ、テユメファシエンスの植菌によ
って腫瘍又はふくれさえも生ずることは知られていない
。この発明の実施において、Ａ、テユメファシエンスの
植菌によるいかなる種類の腫瘍、ふくれ（ｓｉｙｅｌｌ
ｉｎｇｓ ）又は細胞増殖もホモノ科植物に観察されて
いない。
公開第ＷＯ８６／ ００９３１ （Ｓｉｍｐｓｏｎら）
は完全な植物体を形質転換し再生する生体内手法を教示
している。この特許出願はその発明の方法はＡ、テユメ
ファシエンス苗条（５ｈｏｏｔｙ ）変異株の感染につ
づいて苗条腫瘍（５ｈｏｏｔｙ ｔｕｍｏｒ ）を形成
するいかなる植物の形質転換にも用いることができるこ
とができると記載している。しかしながら上記したごと
く、ホモノ科植物がＡ、テユメファシエンスの植菌によ
って腫瘍又はふくれさえも生ずることは知られていない
。この発明の実施において、Ａ、テユメファシエンスの
植菌によるいかなる種類の腫瘍、ふくれ（ｓｉｙｅｌｌ
ｉｎｇｓ ）又は細胞増殖もホモノ科植物に観察されて
いない。
２皿少吉産
本発明によれば今ここに、急速に分裂している細胞を含
む実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ）部分に傷をつけ、ついで
その傷にｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスを植菌する
ことを傷に植菌する、形質転換されたホモノ科植物（禾
本科植物、Ｇｒａｔａｉｎｅａｅ ）の生産方法が提供
される。本発明の好ましい態様において、その傷は生殖
系列細胞のもととなる実生部分につけられる。又好まし
くは遺伝学的に設計された（ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ） Ｔ −Ｄ Ｎ Ａを含有
するベクターを含有するｖｉｒ” Ａ、テユメファシエ
ンスが用いられる。
む実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ）部分に傷をつけ、ついで
その傷にｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスを植菌する
ことを傷に植菌する、形質転換されたホモノ科植物（禾
本科植物、Ｇｒａｔａｉｎｅａｅ ）の生産方法が提供
される。本発明の好ましい態様において、その傷は生殖
系列細胞のもととなる実生部分につけられる。又好まし
くは遺伝学的に設計された（ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ） Ｔ −Ｄ Ｎ Ａを含有
するベクターを含有するｖｉｒ” Ａ、テユメファシエ
ンスが用いられる。
本発明の別の面によれば、（１）形質転換された花粉粒
、（２） ｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスに感染し
た実生から生長した植物によって生産された、形質転換
された花粉粒、（３）遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡ
を含有するベクターを含有する對工・Ａ、テユメファシ
エンスに感染した実生から生長した植物によって生産さ
れた形質転換された花粉粒、（４）その細胞がＴ−ＤＮ
Ａの少なくとも１つの分節（ｓｅｇｍｅｎｔ ）を含む
花粉粒、及び（５）これら４つの花粉粒から導かれるホ
モノ科植物が提供される。さらに（１）形質転換された
ホモノ科植物体（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ ｐｌａｎｔｓ以
下、同様にＧｒａｍｉｎｅａｅに対してはホモノ科植物
、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ ｐｌａｎｔに対してはホモノ科
植物体という） 、（２） ｖｉｒ” Ａ。
、（２） ｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスに感染し
た実生から生長した植物によって生産された、形質転換
された花粉粒、（３）遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡ
を含有するベクターを含有する對工・Ａ、テユメファシ
エンスに感染した実生から生長した植物によって生産さ
れた形質転換された花粉粒、（４）その細胞がＴ−ＤＮ
Ａの少なくとも１つの分節（ｓｅｇｍｅｎｔ ）を含む
花粉粒、及び（５）これら４つの花粉粒から導かれるホ
モノ科植物が提供される。さらに（１）形質転換された
ホモノ科植物体（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ ｐｌａｎｔｓ以
下、同様にＧｒａｍｉｎｅａｅに対してはホモノ科植物
、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ ｐｌａｎｔに対してはホモノ科
植物体という） 、（２） ｖｉｒ” Ａ。
テユメファシエンスに感染した実生から導かれた、形質
転換されたホモノ科植物体、（３）遺伝学的に設計され
たＴ−ＤＮＡを含有するベクターを含有するｖｉｒ”
Ａ、テユメファシエンスに感染した実生から導かれた、
形質転換されたホモノ科植物体、及び（４）その細胞が
Ｔ−ＤＮＡ分節を含有するホモノ科植物体が提供される
。最後にｖｉｒ’ Ａ、テユメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物、及び
遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベクターを
含有するｖｉｒ’ Ａ、テユメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物が提供
される。
転換されたホモノ科植物体、（３）遺伝学的に設計され
たＴ−ＤＮＡを含有するベクターを含有するｖｉｒ”
Ａ、テユメファシエンスに感染した実生から導かれた、
形質転換されたホモノ科植物体、及び（４）その細胞が
Ｔ−ＤＮＡ分節を含有するホモノ科植物体が提供される
。最後にｖｉｒ’ Ａ、テユメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物、及び
遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベクターを
含有するｖｉｒ’ Ａ、テユメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物が提供
される。
本発明は葉、植物体及び花粉のような形質転換された、
分化した器官及び組織の生産に帰結するホモノ科植物を
形質転換する方法をはじめて提供するので明らかに有用
である。かくのごとく、本発明はホモノ科植物の農業上
重要な形態や部分に外来のＤＮＡの発現を可能にする、
ホモノ科植物を形質転換する方法をはじめて提供する。
分化した器官及び組織の生産に帰結するホモノ科植物を
形質転換する方法をはじめて提供するので明らかに有用
である。かくのごとく、本発明はホモノ科植物の農業上
重要な形態や部分に外来のＤＮＡの発現を可能にする、
ホモノ科植物を形質転換する方法をはじめて提供する。
ホモノ科植物（例えばとうもろこし、オート麦、ライ麦
、大麦、ツルガム、米及び小麦）の多くはもちろん人及
び他の動物の商業上重要な食料源であり、本発明は変更
した特性又はより優れた特性を有するホモノ科株、例え
ばより高い収量をもたらす株、除草剤抵抗性又はよりよ
い栄養価値を有する株の開発を、そのような特性をコー
ドする外来ＤＮＡをホモノ科植物に入れることによって
可能にする。
、大麦、ツルガム、米及び小麦）の多くはもちろん人及
び他の動物の商業上重要な食料源であり、本発明は変更
した特性又はより優れた特性を有するホモノ科株、例え
ばより高い収量をもたらす株、除草剤抵抗性又はよりよ
い栄養価値を有する株の開発を、そのような特性をコー
ドする外来ＤＮＡをホモノ科植物に入れることによって
可能にする。
本発明によれば、急速に分裂している細胞を含む実生部
分に傷をつけ、その傷にｖｉｒ” Ａ、テユメファシエ
ンスを植菌することを傷に植菌する、形質転換されたホ
モノ科植物を生産する方法が提供される。ここで用いら
れるホモノ科植物（Ｇｒａａ＋１ｎｅａｅ）の語は植物
体（ｐｌａｎｔｓ） 、種子、実生、花粉、穀粒（ｋｅ
ｒｎｅｌｓ） 、穂（ｅａｒｓ）、葉、茎（ｓｔａｌｋ
ｓ）、胚を含むホモノ科植物のすべての形態及び部分を
いうものとする。同様に「とうもろこし」、「オート麦
」、「小麦」、「ライ麦」及び「大麦」の語はとうもろ
こし、オート麦、小麦、ライ麦及び大麦のすべての形態
及び部分を含むことを意味する。
分に傷をつけ、その傷にｖｉｒ” Ａ、テユメファシエ
ンスを植菌することを傷に植菌する、形質転換されたホ
モノ科植物を生産する方法が提供される。ここで用いら
れるホモノ科植物（Ｇｒａａ＋１ｎｅａｅ）の語は植物
体（ｐｌａｎｔｓ） 、種子、実生、花粉、穀粒（ｋｅ
ｒｎｅｌｓ） 、穂（ｅａｒｓ）、葉、茎（ｓｔａｌｋ
ｓ）、胚を含むホモノ科植物のすべての形態及び部分を
いうものとする。同様に「とうもろこし」、「オート麦
」、「小麦」、「ライ麦」及び「大麦」の語はとうもろ
こし、オート麦、小麦、ライ麦及び大麦のすべての形態
及び部分を含むことを意味する。
「形質転換された」の語は外来ＤＮＡを細胞中に入れる
ことによって遺伝的に修飾されることを意味するものと
してここでは用いられる。［外来Ｄ Ｎ Ａ Ｊ （ｅ
ｘｏｇｅｏｕｓ Ｄ Ｎ Ａ ）の語は形質転換される
ホモノ科株中に通常では見い出されないＤＮＡを意味す
る。外来ＤＮＡは形質転換されるホモノ科株以外のホモ
ノ科株を含んで原核源または真核源から得ることできる
。
ことによって遺伝的に修飾されることを意味するものと
してここでは用いられる。［外来Ｄ Ｎ Ａ Ｊ （ｅ
ｘｏｇｅｏｕｓ Ｄ Ｎ Ａ ）の語は形質転換される
ホモノ科株中に通常では見い出されないＤＮＡを意味す
る。外来ＤＮＡは形質転換されるホモノ科株以外のホモ
ノ科株を含んで原核源または真核源から得ることできる
。
本発明の方法を実施するにあたり、形質転換されるホモ
ノ科株は殺菌され、ついで種子から幼根（最初の根）及
び茎が出るまで発芽させる。この状態は発芽後約４日で
到来するが、この期間は最初に種子を浸漬することによ
って短縮することができる。
ノ科株は殺菌され、ついで種子から幼根（最初の根）及
び茎が出るまで発芽させる。この状態は発芽後約４日で
到来するが、この期間は最初に種子を浸漬することによ
って短縮することができる。
傷は生殖系列細胞（ｇｅｒｍ １ｉｎｅ ｃｅｌｌｓ）
のもととなる急速に分裂している細胞の部分につけるの
が好ましい。傷をつけた後、実生に傷の中にｖｉｒ゛Ａ
、テユメファシエンスの溶液をたらすことによって植菌
する。」１ｒΔ、テコメファシエンスはＴ−ＤＮＡを宿
主植物細胞中に可動化し伝達することができる細菌であ
り、これらの機能をコードする天然の又は合成のプラス
ミドを担持するＡ。
のもととなる急速に分裂している細胞の部分につけるの
が好ましい。傷をつけた後、実生に傷の中にｖｉｒ゛Ａ
、テユメファシエンスの溶液をたらすことによって植菌
する。」１ｒΔ、テコメファシエンスはＴ−ＤＮＡを宿
主植物細胞中に可動化し伝達することができる細菌であ
り、これらの機能をコードする天然の又は合成のプラス
ミドを担持するＡ。
テユメファシエンスはｖｉｒ＋である。かくして、野性
型のＴｉプラスミドを担持するＡ、テニメファシエンス
株はｖｉｒ“であり、本発明に用いることができる。か
かる菌株は数多く知られており、又公衆が入手すること
ができる。例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ
（ＡＴＣＣ） ｏｆＳｔｒａｉｎ Ｉ、 ｐ６６ （１
５ｔｈ ｅｄｄｉｔｉｏｎ、 １９８２）参照。野性型
Ｔｉプラスミドのｖｉｒ’領域を同じＴｉ プラスミド
上のＴ−ＤＮＡを可動化し伝達するために、又は同じ細
菌中に含まれる別のプラスミド上のＴ−ＤＮＡを引き渡
すために用いることができる。
型のＴｉプラスミドを担持するＡ、テニメファシエンス
株はｖｉｒ“であり、本発明に用いることができる。か
かる菌株は数多く知られており、又公衆が入手すること
ができる。例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ
（ＡＴＣＣ） ｏｆＳｔｒａｉｎ Ｉ、 ｐ６６ （１
５ｔｈ ｅｄｄｉｔｉｏｎ、 １９８２）参照。野性型
Ｔｉプラスミドのｖｉｒ’領域を同じＴｉ プラスミド
上のＴ−ＤＮＡを可動化し伝達するために、又は同じ細
菌中に含まれる別のプラスミド上のＴ−ＤＮＡを引き渡
すために用いることができる。
さらに可動化及び伝達機能はヘルパープラスミドによっ
て供給され得る。そのようなヘルパープラスミドはＤｉ
ｔｔａらによってＰＮＡＳ、 ７７．７３４７（１９
８０）及びＢａｇｄａｓａｒ ｉａｎらによってＧｅｎ
ｅ。
て供給され得る。そのようなヘルパープラスミドはＤｉ
ｔｔａらによってＰＮＡＳ、 ７７．７３４７（１９
８０）及びＢａｇｄａｓａｒ ｉａｎらによってＧｅｎ
ｅ。
１６．２３７ （１９８１）に記述されている。したが
って、ヘルパープラスミドを担持するＡ、テユメファシ
エンス株ちりｌ「゛である。最後に可動化及び伝達機能
はＴ−ＤＮＡを含有する同じ設計の（ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｅｄ）プラスミドにコードすることができ、かかるプラ
スミドを含有する細菌もｖｉｒ”である。
って、ヘルパープラスミドを担持するＡ、テユメファシ
エンス株ちりｌ「゛である。最後に可動化及び伝達機能
はＴ−ＤＮＡを含有する同じ設計の（ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｅｄ）プラスミドにコードすることができ、かかるプラ
スミドを含有する細菌もｖｉｒ”である。
ｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスによって伝達される
Ｔ−ＤＮＡは生来のＴ−ＤＮＡであってもよいが、好ま
しくは遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡであるのがよい
。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡは作動できる順序に
結合したＴ−ＤＮＡ境界配列、異種構造遺伝子（ｈｅｔ
ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）及び転写単位を含有す
るＤＮＡ構築物である。かかる構築物を調製する方法は
当業界で公知である。
Ｔ−ＤＮＡは生来のＴ−ＤＮＡであってもよいが、好ま
しくは遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡであるのがよい
。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡは作動できる順序に
結合したＴ−ＤＮＡ境界配列、異種構造遺伝子（ｈｅｔ
ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）及び転写単位を含有す
るＤＮＡ構築物である。かかる構築物を調製する方法は
当業界で公知である。
異種構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ中に通常見い出されず、か
つ形質転換されるホモノ科株のＤＮＡ中にも通常見い出
されない遺伝子である。異種構造遺伝子は形質転換され
る株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源から単離す
ることができる。それらを含有する植物に耕種掌上重要
な特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味深い。
つ形質転換されるホモノ科株のＤＮＡ中にも通常見い出
されない遺伝子である。異種構造遺伝子は形質転換され
る株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源から単離す
ることができる。それらを含有する植物に耕種掌上重要
な特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味深い。
異種構造遺伝子の横には形質転換されたホモノ科株中で
の当該異種構造遺伝子を発現することができる、例えば
プロモーター及びターミネータ−を含有する転写単位が
並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物の横
には境界配列が位置する。生来のものであろうと合成さ
れたものであろうといかなるＴ−ＤＮＡ境界配列も、そ
れが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株の細胞
ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構造遺伝
子−転写単位構築物にとなりあわせるために用いること
ができる。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡはホモノ科
株中で機能的であるレプリコンを含むＤＮＡ断片に結合
してベクターを形成させる。
の当該異種構造遺伝子を発現することができる、例えば
プロモーター及びターミネータ−を含有する転写単位が
並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物の横
には境界配列が位置する。生来のものであろうと合成さ
れたものであろうといかなるＴ−ＤＮＡ境界配列も、そ
れが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株の細胞
ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構造遺伝
子−転写単位構築物にとなりあわせるために用いること
ができる。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡはホモノ科
株中で機能的であるレプリコンを含むＤＮＡ断片に結合
してベクターを形成させる。
実生にｖｉｒ” Ａ、テユメファシエンスを植菌した後
、これを形質転換が起こるまでインキュベートし、つい
で植え、少なくとも花粉を生ずるようになるまで生長さ
せる。本発明方法を用いることによってクラウンゴール
、カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれの種類の
腫瘍生長も観察されなかった、最初に植菌された実生に
でさえも観察されなかったことは興味深いことである。
、これを形質転換が起こるまでインキュベートし、つい
で植え、少なくとも花粉を生ずるようになるまで生長さ
せる。本発明方法を用いることによってクラウンゴール
、カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれの種類の
腫瘍生長も観察されなかった、最初に植菌された実生に
でさえも観察されなかったことは興味深いことである。
実生の好ましい部位に植菌することによって花粉の形質
転換がなされた。得られた形質転換された花粉は形質転
換され及びされていない植物体を受精させるのに用いる
ことができる。得られる子孫の穂から胚を切り取り、こ
れを生長させることにより形質転換された植物体を得る
ことができる。
転換がなされた。得られた形質転換された花粉は形質転
換され及びされていない植物体を受精させるのに用いる
ことができる。得られる子孫の穂から胚を切り取り、こ
れを生長させることにより形質転換された植物体を得る
ことができる。
又は、もちろんこの交配により得られる植物体に種子を
つくらせ、これを種子の別の収穫を生ずる形質転換され
た植物体を生長させるために用いることもできる。かく
のごとく、有性生殖によって最初に形質転換された実生
から後の世代を導くことができる。当業者は種々の多く
の外来遺伝子によってコードされた特性を担持する子孫
を既知の育種技術を用いて生産することができることを
認識するであろう。
つくらせ、これを種子の別の収穫を生ずる形質転換され
た植物体を生長させるために用いることもできる。かく
のごとく、有性生殖によって最初に形質転換された実生
から後の世代を導くことができる。当業者は種々の多く
の外来遺伝子によってコードされた特性を担持する子孫
を既知の育種技術を用いて生産することができることを
認識するであろう。
とうもろこしのタ −１
実施例Ｉ
Ａ、細菌の調製
Ａ、テユメファシエンスＢ６株の単一コロニーを水中に
溶解した０、１％酵母エキス、０．８％栄養ブロス及び
０．５％ショ糖を含有する酵母抽出ブロス（ＹＥＢ）に
植菌した。酵母抽出ブロス及び栄養ブロスはＤｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｓデトロイト、ミシガンよ
り購入した。シｇ糖はＦｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ。
溶解した０、１％酵母エキス、０．８％栄養ブロス及び
０．５％ショ糖を含有する酵母抽出ブロス（ＹＥＢ）に
植菌した。酵母抽出ブロス及び栄養ブロスはＤｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｓデトロイト、ミシガンよ
り購入した。シｇ糖はＦｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ。
デトロイト、ミシガン又はＳｉｇｎ＋ａ ｓセントルイ
ス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させた水浴中核
ＹＥＢで２７℃で４８時間インキュベートするか、最終
濃度が３．８ Ｘ １０ ” ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌにな
るまでインキュベートした。
ス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させた水浴中核
ＹＥＢで２７℃で４８時間インキュベートするか、最終
濃度が３．８ Ｘ １０ ” ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌにな
るまでインキュベートした。
８６株はＡ、テユメファシエンスの標準野性型株である
。該閉は病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ） （ｖｔｒ”
）で適当な植物宿主中でリゾビンデヒドロゲナーゼを生
産するためのコードを有している。この株はＮｏｒｔｈ
ｗｅｓｔｅｒｎ大学、Ｅｖａｎｓ ｔｏｎ ％イリノイ
のＪａｌＩＩｅＳ及びＢａｒｂａｒａによって取得され
た。この株の性質のいくつかは５ｔｏｎｉｅｒ、 Ｊ、
Ｂａｃｔ、、１９，８８９（１９６０）に記述されて
いる。８６株は又アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、メリーラン
ドに寄託されており、受入れ番号２３３０８を与えられ
ている。
。該閉は病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ） （ｖｔｒ”
）で適当な植物宿主中でリゾビンデヒドロゲナーゼを生
産するためのコードを有している。この株はＮｏｒｔｈ
ｗｅｓｔｅｒｎ大学、Ｅｖａｎｓ ｔｏｎ ％イリノイ
のＪａｌＩＩｅＳ及びＢａｒｂａｒａによって取得され
た。この株の性質のいくつかは５ｔｏｎｉｅｒ、 Ｊ、
Ｂａｃｔ、、１９，８８９（１９６０）に記述されて
いる。８６株は又アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、メリーラン
ドに寄託されており、受入れ番号２３３０８を与えられ
ている。
Ｂ、とうもろこしの調製
とうもろこしの生得の黄色Ｉｏｃｈｉｅｆ株の種子はＡ
ｎｄｅｒｓｏｎｓ、 Ｍａｕｍｅｅ 、オハイオ又はＢ
ｏｔｚｕｍ＋ ４３Ｅａｓｔ Ｍａｒｋｅｔ、 Ａｋｒ
ｏｎ、オハイオより取得した。この株は商業的に購入で
きる標準株である。
ｎｄｅｒｓｏｎｓ、 Ｍａｕｍｅｅ 、オハイオ又はＢ
ｏｔｚｕｍ＋ ４３Ｅａｓｔ Ｍａｒｋｅｔ、 Ａｋｒ
ｏｎ、オハイオより取得した。この株は商業的に購入で
きる標準株である。
黄色１ｏｃｈｉｅｆ種子は以下の手法により殺菌した。
゛種子をまず９５％エタノール７部及び蒸留水２．
５部を含有する溶液に２分間浸漬した。ついで、種子を
蒸留水中の０．５％（ｗ／ｖ）ＨｇＣ１ｚ溶液中で５分
インキエベートした０種子を蒸留水中の１５％（ｖ ／
ｖ ） Ｃ１ｏｒｏｘ （Ｃ１ｏｒｏｘは５．２５％
次亜塩素酸ナトリウムを含有する水溶液である）及び０
、１％（Ｖ／Ｖ）のＰａｌｍｏｌｉｖｅのような皿洗い
用液体洗剤または他の適当な湿潤剤の溶液中で全部で３
０分洗浄した。最後に種子を殺菌した２度蒸留した水中
で５回洗った。
５部を含有する溶液に２分間浸漬した。ついで、種子を
蒸留水中の０．５％（ｗ／ｖ）ＨｇＣ１ｚ溶液中で５分
インキエベートした０種子を蒸留水中の１５％（ｖ ／
ｖ ） Ｃ１ｏｒｏｘ （Ｃ１ｏｒｏｘは５．２５％
次亜塩素酸ナトリウムを含有する水溶液である）及び０
、１％（Ｖ／Ｖ）のＰａｌｍｏｌｉｖｅのような皿洗い
用液体洗剤または他の適当な湿潤剤の溶液中で全部で３
０分洗浄した。最後に種子を殺菌した２度蒸留した水中
で５回洗った。
殺菌した種子を胚側を上にしてペトリ皿中の殺菌し湿ら
せたＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ、 ３濾紙上に置いた。種子
を一定の暗さに保つべくカバーしたベトリ皿中２５℃で
４日間インキュベートした。濾紙はインキュベート期間
中湿りを維持させた。
せたＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ、 ３濾紙上に置いた。種子
を一定の暗さに保つべくカバーしたベトリ皿中２５℃で
４日間インキュベートした。濾紙はインキュベート期間
中湿りを維持させた。
Ｃ９実生へのＡ、テユメファシエンスの植菌とうもろこ
しの実生中で急速に細胞が分裂している２つの基本的な
場所は根冠、及び胚盤瘤（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ ｎｏｄ
ｅ）のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤（ｃｏｌｅｏｐ
ｔｉｌｅ ｎｏｄｅ）よりわずかに先にまでまたがる部
分である。これらの場所は第１Ａ図及び１８図に示され
ている。中茎は胚盤瘤と子葉鞘瘤の間の部分である。
しの実生中で急速に細胞が分裂している２つの基本的な
場所は根冠、及び胚盤瘤（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ ｎｏｄ
ｅ）のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤（ｃｏｌｅｏｐ
ｔｉｌｅ ｎｏｄｅ）よりわずかに先にまでまたがる部
分である。これらの場所は第１Ａ図及び１８図に示され
ている。中茎は胚盤瘤と子葉鞘瘤の間の部分である。
本発明を好ましく行うためには胚盤瘤のふもとから子葉
鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に傷をつけ
る。その理由は生殖系列細胞（ｇｅｒａ＋ １ｉｎｅ
ｃｅｌｌｓ）のもととなる組織がその領域に含まれてい
るからである。特にこの領域に葉液原始細胞（ａｘｉｌ
ｌａｒｙ ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）のもとになる組織が見
い出され、このｍ織は今度は若木（ｔｉｌｌｅｒｓ）及
び穂（ｅａｒｓ） （雌生殖器官）のちとになる。こ
の領域には又ふさ毛のもととなる頂端分裂ｍ織があり、
ふさ毛は今度は花粉（雄生殖器官）のもととなる。この
好ましい領域の実生に接種することにって、生殖系列細
胞の形質転換体が得られる。
鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に傷をつけ
る。その理由は生殖系列細胞（ｇｅｒａ＋ １ｉｎｅ
ｃｅｌｌｓ）のもととなる組織がその領域に含まれてい
るからである。特にこの領域に葉液原始細胞（ａｘｉｌ
ｌａｒｙ ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）のもとになる組織が見
い出され、このｍ織は今度は若木（ｔｉｌｌｅｒｓ）及
び穂（ｅａｒｓ） （雌生殖器官）のちとになる。こ
の領域には又ふさ毛のもととなる頂端分裂ｍ織があり、
ふさ毛は今度は花粉（雄生殖器官）のもととなる。この
好ましい領域の実生に接種することにって、生殖系列細
胞の形質転換体が得られる。
この実施例の０部で調製した、発芽しつつある各とうも
ろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子葉鞘層を通
ってその少し先までにまたがる部分に全部で４つの傷を
つけた。実生は前面から第１Ｂ図に示すようにみえるが
、この傷はこの地域を縦に２分するｙＡ（中心％’ｉ）
を目にみえるようにつけることによってなされた。切込
みは中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に向け
て、実生を第１Ｂ図のようにみるときは実生の前面から
切込みがなされる部分におけるすべての組織を通して、
なされた。切込みは胚盤瑠の部位になすときは前面から
すべてのＵ織を通して胚盤中にまで、中茎になすときは
前面からすべての組織を完全に通してなされた。４つの
傷は第１Ｂ図の数字１によって示す。
ろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子葉鞘層を通
ってその少し先までにまたがる部分に全部で４つの傷を
つけた。実生は前面から第１Ｂ図に示すようにみえるが
、この傷はこの地域を縦に２分するｙＡ（中心％’ｉ）
を目にみえるようにつけることによってなされた。切込
みは中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に向け
て、実生を第１Ｂ図のようにみるときは実生の前面から
切込みがなされる部分におけるすべての組織を通して、
なされた。切込みは胚盤瑠の部位になすときは前面から
すべてのＵ織を通して胚盤中にまで、中茎になすときは
前面からすべての組織を完全に通してなされた。４つの
傷は第１Ｂ図の数字１によって示す。
これら４つの傷に上記Ａ部で記述したようにして培養し
たＹＥＢ中のＡ、テユメファシエンス８６株の１０９ｃ
ｅｌｌｓ／ｍ １ ′Ｍ、Ｋｉ液を全部で１００μｊま
たらすことによって接種した。コントロールとしていく
つかの実生には０．９％ＮａＣ１（食塩水）を接種した
。接種後、実生を胚側を上にしてペトリ皿中のバクト寒
天（Ｂａｃｔｏａｇａｒ）層上に、皿あたり５実生置い
た。ペトリ皿は蒸留水中２０ｇ／ｌの濃度の殺菌バクト
寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入
）２０ｍｌを含んでいた。カバーしたペトリ皿を一定の
暗さで２７℃でさらに７−１４日インキュベートした。
たＹＥＢ中のＡ、テユメファシエンス８６株の１０９ｃ
ｅｌｌｓ／ｍ １ ′Ｍ、Ｋｉ液を全部で１００μｊま
たらすことによって接種した。コントロールとしていく
つかの実生には０．９％ＮａＣ１（食塩水）を接種した
。接種後、実生を胚側を上にしてペトリ皿中のバクト寒
天（Ｂａｃｔｏａｇａｒ）層上に、皿あたり５実生置い
た。ペトリ皿は蒸留水中２０ｇ／ｌの濃度の殺菌バクト
寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入
）２０ｍｌを含んでいた。カバーしたペトリ皿を一定の
暗さで２７℃でさらに７−１４日インキュベートした。
Ｄ、検定
１、実生中の酵素活性の検定
７−１４日のインキュベーション期間の終りに実生を０
．５Ｍショ糖、０．１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸及び
０．１％（Ｗ／Ｖ）システィン−ＨＣＪを含有する０、
１ Ｍ ）リス−ＨＣＮバッフｙ−（ｐＨ８，０）中
でＷｈｅａ ｔｏｎ組織粉砕機を用いてホモゲナイズ物
が均質性を有するに至るまでホモゲナイズした。実生は
暗やみで生長したので、色素形成は遅れ、細胞壁は通常
と異なり柔軟なまま残された。従って実生の細胞は容易
に破れた。ついでホモゲナイズ物をＦｉｓｈｅｒＭｉｃ
ｒｏｆｕｇｅ中で１３，０００ｘｇで２分間回転して細
胞のない抽出物を得た。
．５Ｍショ糖、０．１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸及び
０．１％（Ｗ／Ｖ）システィン−ＨＣＪを含有する０、
１ Ｍ ）リス−ＨＣＮバッフｙ−（ｐＨ８，０）中
でＷｈｅａ ｔｏｎ組織粉砕機を用いてホモゲナイズ物
が均質性を有するに至るまでホモゲナイズした。実生は
暗やみで生長したので、色素形成は遅れ、細胞壁は通常
と異なり柔軟なまま残された。従って実生の細胞は容易
に破れた。ついでホモゲナイズ物をＦｉｓｈｅｒＭｉｃ
ｒｏｆｕｇｅ中で１３，０００ｘｇで２分間回転して細
胞のない抽出物を得た。
この無細胞抽出物の一部を同量の、リゾピンデヒドロゲ
ナーゼ活性を検出すべく企画した反応培地に加えた。こ
の培地は０．２ Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
７，０）中に溶解した３０ｍＭＬ−アルギニン、７５ｍ
Ｍピルベート及び２０ｍＭＮＡＤＨよりなっていた。酵
素反応は室温で以下に示す時間行わせた。
ナーゼ活性を検出すべく企画した反応培地に加えた。こ
の培地は０．２ Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
７，０）中に溶解した３０ｍＭＬ−アルギニン、７５ｍ
Ｍピルベート及び２０ｍＭＮＡＤＨよりなっていた。酵
素反応は室温で以下に示す時間行わせた。
酵素反応生産物はＷｈｅａｔｏｎ ３ Ｍ Ｍ紙上で電
気泳動によって分離した。酵素反応の開始時点（時間零
）で反応混合物の５μｌサンプルを紙の陽極部位につけ
、乾燥させた。ついで、合成オクトピン（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎｌｌｏｅｓｃｈｔ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ１ｉ
ｆｏｒｎｉａより購入）の１００μｇ ／ ｍ １ 溶
液の５μβサンプル、及び合成ツバリン（Ｓｉｇｍａ、
Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、 Ｍｔｓｓｏｕｒｉより購入）の
１００μｇ ／ ｍ １溶液の５μｌサンプルを紙の上
につけ乾燥させた。
気泳動によって分離した。酵素反応の開始時点（時間零
）で反応混合物の５μｌサンプルを紙の陽極部位につけ
、乾燥させた。ついで、合成オクトピン（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎｌｌｏｅｓｃｈｔ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ１ｉ
ｆｏｒｎｉａより購入）の１００μｇ ／ ｍ １ 溶
液の５μβサンプル、及び合成ツバリン（Ｓｉｇｍａ、
Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、 Ｍｔｓｓｏｕｒｉより購入）の
１００μｇ ／ ｍ １溶液の５μｌサンプルを紙の上
につけ乾燥させた。
電気泳動はギ酸（９０，８％）／氷酢酸／水（５：１５
：８０、ｖ ／ ｖ ）溶液（ｐＨ１，８）中、４５０
ボルトで２．５時間行われた。紙を乾燥させ、ついで無
水エタノール中の０．０２％（Ｗ／Ｖ）フェナントレン
キノン１部及び６０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中の１０％
（Ｗ／Ｖ）ＮａＯＨ１部を含有する溶液に浸して汚した
（ｓｔａｉｎｅｄ）。乾燥後、スポットを長波長紫外線
灯（３６６μｍ）のもとで視覚化した。
：８０、ｖ ／ ｖ ）溶液（ｐＨ１，８）中、４５０
ボルトで２．５時間行われた。紙を乾燥させ、ついで無
水エタノール中の０．０２％（Ｗ／Ｖ）フェナントレン
キノン１部及び６０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中の１０％
（Ｗ／Ｖ）ＮａＯＨ１部を含有する溶液に浸して汚した
（ｓｔａｉｎｅｄ）。乾燥後、スポットを長波長紫外線
灯（３６６μｍ）のもとで視覚化した。
Ｂ６植苗実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気泳動の結果を
第２Ａ図に示す。この図中、レーン（ｌａｎｅ） １
は時間零点で１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一
部を同量のりゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地に加えて
生産した反応混合物のサンプルを含み、レーン２は１０
個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量のりゾビ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベート
して生産した生産物を含み、レーン３は合成オクトピン
を含み、レーン４は時間零点で１０個の食塩水接種実生
の無細胞抽出液を同量のりゾピンデヒドロゲナーゼ反応
培地に加えて作成した生産物を含み、レーン５は１０個
の食塩水接種実生の無細胞抽出液の一部を同量のりゾビ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベート
して作成した生産物を含み、レーン６は合成ツバリンを
含む。
ゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気泳動の結果を
第２Ａ図に示す。この図中、レーン（ｌａｎｅ） １
は時間零点で１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一
部を同量のりゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地に加えて
生産した反応混合物のサンプルを含み、レーン２は１０
個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量のりゾビ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベート
して生産した生産物を含み、レーン３は合成オクトピン
を含み、レーン４は時間零点で１０個の食塩水接種実生
の無細胞抽出液を同量のりゾピンデヒドロゲナーゼ反応
培地に加えて作成した生産物を含み、レーン５は１０個
の食塩水接種実生の無細胞抽出液の一部を同量のりゾビ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベート
して作成した生産物を含み、レーン６は合成ツバリンを
含む。
第２Ａ図はオクトピン生産がＢ６植菌とうもろこし実生
の無細胞抽出液によって引き起こされるが（レーン２）
、食塩水コントロールでは引き起こされない（レーン５
）ことを示している。さらに、フェナントレンキノリン
螢光の増加で測定される、生産されたオクトピンの量は
インキュベーションの時間に比例して増加する。
の無細胞抽出液によって引き起こされるが（レーン２）
、食塩水コントロールでは引き起こされない（レーン５
）ことを示している。さらに、フェナントレンキノリン
螢光の増加で測定される、生産されたオクトピンの量は
インキュベーションの時間に比例して増加する。
時間零点ではオクトピンは検出されないのに（レーン１
）、１５時間のインキュベーションの後では明らかに存
在している（レーン２）。
）、１５時間のインキュベーションの後では明らかに存
在している（レーン２）。
このような結果は反応が酵素によって触媒され、Ｂ６惑
染とうもろこし実生から抽出した酵素がリゾピンデヒド
ロゲナーゼであるという提案と一致する。形質転換され
た植物ｍ織のみがオパイン合成遺伝子を発現することが
知られているので、これらの結果はとうもろこし実生が
層重゛Ａ、テユメファシエンス８６株の感染で形質転換
されたとする提案とも一致する。
染とうもろこし実生から抽出した酵素がリゾピンデヒド
ロゲナーゼであるという提案と一致する。形質転換され
た植物ｍ織のみがオパイン合成遺伝子を発現することが
知られているので、これらの結果はとうもろこし実生が
層重゛Ａ、テユメファシエンス８６株の感染で形質転換
されたとする提案とも一致する。
２、基質特異性の検定
リゾピンデヒドロゲナーゼはオクトピンの合成を触媒す
るが、ツバリンの合成は触媒しない。
るが、ツバリンの合成は触媒しない。
実生抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出
に許容される試薬を含有する反応培地に加えることによ
って得た生産物の電気泳動の結果を第２Ｂ図に示す。ツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地は０．２Ｍリン酸ナト
リウムバッフｙ−（ｐＨ７，０）中に溶解した６０ｍＭ
Ｌ−アルギニン、６０ｍＭα−ケトグルタレート及び１
６ｍＭＮＡＤＨよりなる。゛α−ケトグルタレートはツ
バリンデヒドロゲナーゼによってのみ基質として用いら
れる。第２Ｂ図のレーン１〜６は第２Ａ図のレーン１〜
６と反応培地がツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地であ
ることを除き同じである。第２Ｂ図は８６株を植菌した
実生の無細胞抽出液はアルギニンとの縮合反応でα−ケ
トグルタレートを用いてツバリンを生産することができ
ないことを示している。この基質特異性は８６株によっ
て形質転換された実生によって生産された酵素のりゾピ
ンデヒドロゲナーゼとしての同定を確認するものである
。
に許容される試薬を含有する反応培地に加えることによ
って得た生産物の電気泳動の結果を第２Ｂ図に示す。ツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地は０．２Ｍリン酸ナト
リウムバッフｙ−（ｐＨ７，０）中に溶解した６０ｍＭ
Ｌ−アルギニン、６０ｍＭα−ケトグルタレート及び１
６ｍＭＮＡＤＨよりなる。゛α−ケトグルタレートはツ
バリンデヒドロゲナーゼによってのみ基質として用いら
れる。第２Ｂ図のレーン１〜６は第２Ａ図のレーン１〜
６と反応培地がツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地であ
ることを除き同じである。第２Ｂ図は８６株を植菌した
実生の無細胞抽出液はアルギニンとの縮合反応でα−ケ
トグルタレートを用いてツバリンを生産することができ
ないことを示している。この基質特異性は８６株によっ
て形質転換された実生によって生産された酵素のりゾピ
ンデヒドロゲナーゼとしての同定を確認するものである
。
３、形質転換効率
この問題に対処するために、単一実生の検定を行い、オ
クトパンを生産した単一実生の無細胞抽出液の数を決定
した。結果を第３Ａ図に示すが、そこですべてのレーン
は単一Ｂ６植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た
生産物を含有する。第３Ａ図に示されるごとく、１０の
レーンのうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オク
トピン標品と共に移動するスポットを有している。すな
わち、この実験での形質転換効率は８０％であった。
クトパンを生産した単一実生の無細胞抽出液の数を決定
した。結果を第３Ａ図に示すが、そこですべてのレーン
は単一Ｂ６植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た
生産物を含有する。第３Ａ図に示されるごとく、１０の
レーンのうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オク
トピン標品と共に移動するスポットを有している。すな
わち、この実験での形質転換効率は８０％であった。
４、コントロール
生産されたオクトピンがある第２の及び興味のないでき
ごとの結果であったという可能性を除外するために、い
くつかの追加のコントロールを用いた。第４Ａ図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして４８時間培養し
たＢ６の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄
積したオクトピンを記していない（レーン１及び２）。
ごとの結果であったという可能性を除外するために、い
くつかの追加のコントロールを用いた。第４Ａ図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして４８時間培養し
たＢ６の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄
積したオクトピンを記していない（レーン１及び２）。
さらに、これらの超音波処理液をリゾビンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地と混合して４時間インキュベートしたとき
、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかった。
ーゼ反応培地と混合して４時間インキュベートしたとき
、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかった。
第４Ｂ図、レーン１．２及び３参照（そこではこのイン
キュベーションの生産物が電気泳動された）。かくのご
とく、リゾビンデヒドロゲナーゼ活性は４８時間細菌培
養物中に見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地単独はオクトピンを含有していなかった。第
４Ｂ図、レーン４参照（そこではこの反応培地単独が電
気泳動された）。同様にこのデヒドロゲナーゼが未感染
とうもろこし実生中に存在するという証拠は見い出され
ていない。第４Ｃ図参照（線図は電気泳動図であり、そ
こでレーン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出液をリ
ゾビンデヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベー
トして得た生産物を含有している）。これらの結果はＢ
６植菌実生の無細胞抽出液中におけるリゾビンデヒドロ
ゲナーゼ活性の存在が実生の形質転換によるものであり
、ある第２の又は興味のないできごとによるものでない
ことを確認している。
キュベーションの生産物が電気泳動された）。かくのご
とく、リゾビンデヒドロゲナーゼ活性は４８時間細菌培
養物中に見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地単独はオクトピンを含有していなかった。第
４Ｂ図、レーン４参照（そこではこの反応培地単独が電
気泳動された）。同様にこのデヒドロゲナーゼが未感染
とうもろこし実生中に存在するという証拠は見い出され
ていない。第４Ｃ図参照（線図は電気泳動図であり、そ
こでレーン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出液をリ
ゾビンデヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベー
トして得た生産物を含有している）。これらの結果はＢ
６植菌実生の無細胞抽出液中におけるリゾビンデヒドロ
ゲナーゼ活性の存在が実生の形質転換によるものであり
、ある第２の又は興味のないできごとによるものでない
ことを確認している。
実施例２
Ａ、微生物の調製：
Δ、ツメファシェンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ６
について記載したようにしてインキユヘートシた。Ｃ５
８菌株はＡ、ツメファシェンスの標準野外タイプの菌株
である。この菌株はｖｉｒ”であり適当な植物宿主中で
ツバリンデヒドロゲナーゼの産生をコードする。この菌
株はイリノイ州エバンストンのノースウェスタン大学の
ジエムス（Ｊａｍｅｓ） 氏およびバーバラ リッピン
コット氏（Ｂａｒｂａｒａ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）か
らあるいはカルホルニア州デービスのカルホルニア大学
植物病理学部門のクラレンス カド（Ｃ１ａｒｅｎｃｅ
Ｋａｄａ）氏より入手した。この菌株はデピッカ−（
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ） 等の“プラスミド（Ｐｌａｓｍｉ
ｄ）、３．１９３（１９８０）”およびカオ（Ｋａｏ）
等の”Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、。
に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ６
について記載したようにしてインキユヘートシた。Ｃ５
８菌株はＡ、ツメファシェンスの標準野外タイプの菌株
である。この菌株はｖｉｒ”であり適当な植物宿主中で
ツバリンデヒドロゲナーゼの産生をコードする。この菌
株はイリノイ州エバンストンのノースウェスタン大学の
ジエムス（Ｊａｍｅｓ） 氏およびバーバラ リッピン
コット氏（Ｂａｒｂａｒａ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）か
らあるいはカルホルニア州デービスのカルホルニア大学
植物病理学部門のクラレンス カド（Ｃ１ａｒｅｎｃｅ
Ｋａｄａ）氏より入手した。この菌株はデピッカ−（
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ） 等の“プラスミド（Ｐｌａｓｍｉ
ｄ）、３．１９３（１９８０）”およびカオ（Ｋａｏ）
等の”Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、。
１８８．４２．５（１９８２）”に記載されている。
菌株Ｃ５８はまたＡＴＣＣに寄託してあり、寄託番号３
３９７Ｄが与えられている。
３９７Ｄが与えられている。
Ｂ、とうもろこしの形質転換：
とうもろこしの近文黄色イオチーフ（Ｊｏｃｈｉｅｆ）
系を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパー
トＢおよびＣに記載したようにして７〜１４日間インキ
ュベートしたが、とうもろこし実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ｓ）は菌株Ｂ６ではなくて菌株Ｃ５８を接種した。
系を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパー
トＢおよびＣに記載したようにして７〜１４日間インキ
ュベートしたが、とうもろこし実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ｓ）は菌株Ｂ６ではなくて菌株Ｃ５８を接種した。
Ｃ，アッセイ：
１、実生中の酵素活性のアッセイニ
ア−１４日インキュベーション期間の終了時に、細胞を
含まない抽出物（エキス）、即ち、無細胞抽出物を調製
し実施例１、バー）Ｄに記載したようにして酵素活性を
アッセイした。使用した反応培地はツバリンデヒドロゲ
ナーゼ活性をアッセイするように意図したものであった
。
含まない抽出物（エキス）、即ち、無細胞抽出物を調製
し実施例１、バー）Ｄに記載したようにして酵素活性を
アッセイした。使用した反応培地はツバリンデヒドロゲ
ナーゼ活性をアッセイするように意図したものであった
。
この培地は実施例１、パートＤで示したように、０．２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）中に溶解さ
せた６０ｍＭのし一アルギニン、６０ｍＭのα−ケトグ
ルグル酸および１６ｍＭのＮＡＯＨとからなっていた。
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）中に溶解さ
せた６０ｍＭのし一アルギニン、６０ｍＭのα−ケトグ
ルグル酸および１６ｍＭのＮＡＯＨとからなっていた。
結果は第２Ｂ図に示す。第２Ｂ図のレーン８は時間零で
１０回Ｃ−５８接種実生無細胞抽出物部分を等容量のツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合することによっ
て生成させた生成物を含み、レーン７は１０回Ｃ−５８
接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートするこ
とによって生じた生成物を含む。即ち、第２Ｂ図はノン
ぐリンがＣ５８接種とうもろこし実生の無細胞抽出物に
よって産生されるが（レーン７）、そのような産生は塩
水対照では生じない（レーン５）ことを示している。さ
らに、フェナンスレンキノン螢光の増加によって測定し
たときの産生ツバリン量はインキュベーション時間に比
例して増大するが、時間零ではツバリンは反応混合物中
に検出されず（レーン８）、１５時間のインキュベーシ
ョン後に明らかに存在しくレーン８）、かかる結果は反
応が酵素触媒されかつＣ５８接種実生から抽出した酵素
はツバリンデヒドロゲナーゼであるという命題に従って
いる。形質転換植物組織のみがオパインシンターゼ遺伝
子を発現することは知られているので、これらの結果は
またとうもろこし実生がｖｉｒ” Ａ、 ツメファシェ
ンス菌株Ｃ５８による怒染によって形質転換されるでい
るという命題によっている。
１０回Ｃ−５８接種実生無細胞抽出物部分を等容量のツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合することによっ
て生成させた生成物を含み、レーン７は１０回Ｃ−５８
接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートするこ
とによって生じた生成物を含む。即ち、第２Ｂ図はノン
ぐリンがＣ５８接種とうもろこし実生の無細胞抽出物に
よって産生されるが（レーン７）、そのような産生は塩
水対照では生じない（レーン５）ことを示している。さ
らに、フェナンスレンキノン螢光の増加によって測定し
たときの産生ツバリン量はインキュベーション時間に比
例して増大するが、時間零ではツバリンは反応混合物中
に検出されず（レーン８）、１５時間のインキュベーシ
ョン後に明らかに存在しくレーン８）、かかる結果は反
応が酵素触媒されかつＣ５８接種実生から抽出した酵素
はツバリンデヒドロゲナーゼであるという命題に従って
いる。形質転換植物組織のみがオパインシンターゼ遺伝
子を発現することは知られているので、これらの結果は
またとうもろこし実生がｖｉｒ” Ａ、 ツメファシェ
ンス菌株Ｃ５８による怒染によって形質転換されるでい
るという命題によっている。
２、 ピロノパインアッセイ：
Ｃ５８により形質転換した実生からの抽出物によるツバ
リンの合成は電気泳動性よりはむしろ他の基準によって
確認される。ツバリンを水によるペーパークロマトグラ
ムにより溶出し、減圧により蒸発させて容量を減じ等容
量のホット（１００℃）２Ｍ酢酸と１時間反応させると
、ピロノバリンが生成する。この転換反応はツバリン用
の検証であり他のオパリン用ではない。
リンの合成は電気泳動性よりはむしろ他の基準によって
確認される。ツバリンを水によるペーパークロマトグラ
ムにより溶出し、減圧により蒸発させて容量を減じ等容
量のホット（１００℃）２Ｍ酢酸と１時間反応させると
、ピロノバリンが生成する。この転換反応はツバリン用
の検証であり他のオパリン用ではない。
第２Ｃ図においては、レーン１は合成ツバリンを上述し
たようにホット２Ｍ＃酸で処理することによって合成ツ
バリンから生成させたピロノバリンであり、レーン２は
合成ツバリン（そのいく分かが同時にピロノバリンに転
換する）であり、レーン３は１０回Ｃ−５８接種の実生
からの無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすることに
よって産生させた生成物であり、レーン４はこの生成物
を上述のようにしてホット２Ｍ酢酸によって処理したも
のである。
たようにホット２Ｍ＃酸で処理することによって合成ツ
バリンから生成させたピロノバリンであり、レーン２は
合成ツバリン（そのいく分かが同時にピロノバリンに転
換する）であり、レーン３は１０回Ｃ−５８接種の実生
からの無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすることに
よって産生させた生成物であり、レーン４はこの生成物
を上述のようにしてホット２Ｍ酢酸によって処理したも
のである。
明らかに、Ｃ５８接種実生からの無細胞抽出物をツバリ
ンデヒドロゲナーゼ反応混合物でインキュベートするこ
とによって産生させた生成物（レーン３）はピロノバリ
ン（レーン４）に完全に転換されており、Ｃ５８接種実
生がツバリンデヒドロゲナーゼを産生していることが確
認される。
ンデヒドロゲナーゼ反応混合物でインキュベートするこ
とによって産生させた生成物（レーン３）はピロノバリ
ン（レーン４）に完全に転換されており、Ｃ５８接種実
生がツバリンデヒドロゲナーゼを産生していることが確
認される。
３、 ツバリンの異化作用：
最後に、ツバリンをＣ５Ｂでインキュベートしツバリン
がＣ５８の唯一のエネルギー源として作用する場合には
、この微生物はツバリンを分解させるにつれて増殖する
であろう。しかしながら、ツバリンを唯一のエネルギー
源として含む培地で増殖させたＢ６はツバリンを破壊せ
ず分解しないであろう。何故ならば、Ｂ６はツバリンの
異化作用に必要な特異性オパインオキシダーゼを欠如し
ているからである。
がＣ５８の唯一のエネルギー源として作用する場合には
、この微生物はツバリンを分解させるにつれて増殖する
であろう。しかしながら、ツバリンを唯一のエネルギー
源として含む培地で増殖させたＢ６はツバリンを破壊せ
ず分解しないであろう。何故ならば、Ｂ６はツバリンの
異化作用に必要な特異性オパインオキシダーゼを欠如し
ているからである。
この原理に基づくアッセイを用いてＣ５８接種実生の無
細胞抽出物により産生された生成物のツバリン同一性を
確認した。このアッセイの結果は第２Ｄ図に示しており
、レーン１は合成ツバリンを含み、レーン２は１０回Ｃ
５Ｂ接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリン
デヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートす
ることによって産生させた生成物であって、ピロノバリ
ンアッセイに関して上述したようにして電気泳動させ、
水で溶出し、蒸発し、菌株Ｂ６で２４時間インキュベー
トさせたものを含み、レーン３は１０回Ｃ−５８接種実
生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすることによ
って産生させた生成物であって、電気泳動させ、溶出し
さらに菌株Ｃ５８で２４時間インキュベートさせたもの
を示す。Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物により産生させ
た生成物は菌株Ｃ５８により消滅した（レーン３）が、
菌株Ｂ６によっては消滅せず（レーン２）、生成物がツ
バリンであることを確認した。
細胞抽出物により産生された生成物のツバリン同一性を
確認した。このアッセイの結果は第２Ｄ図に示しており
、レーン１は合成ツバリンを含み、レーン２は１０回Ｃ
５Ｂ接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリン
デヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートす
ることによって産生させた生成物であって、ピロノバリ
ンアッセイに関して上述したようにして電気泳動させ、
水で溶出し、蒸発し、菌株Ｂ６で２４時間インキュベー
トさせたものを含み、レーン３は１０回Ｃ−５８接種実
生の無細胞抽出物の部分を等容量のツバリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすることによ
って産生させた生成物であって、電気泳動させ、溶出し
さらに菌株Ｃ５８で２４時間インキュベートさせたもの
を示す。Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物により産生させ
た生成物は菌株Ｃ５８により消滅した（レーン３）が、
菌株Ｂ６によっては消滅せず（レーン２）、生成物がツ
バリンであることを確認した。
４、形質転換の効率：
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｃ５８を用いた近交黄色イオ
チーフとうもろこしの形質転換の効率を試験した。結果
は第３Ｃ図に示されており、１０ケのレーンすべてが１
回Ｃ５８接種実生からの無細胞抽出物をツバリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で６時間インキュベートすることに
よって産生じた生成物を含んでいる。明らかなように、
１０の実生のうちの９つが形質転換されていた。、追加
の１同棲種実生のアッセイをＢ６またはＣ５８のいずれ
かで形質転換させた実生を用いて行った。菌株Ｂ６また
はＣ５８のいずれかで１同棲種した実生の合計１５０回
のアッセイうち、６０％が形質転換されていた。
チーフとうもろこしの形質転換の効率を試験した。結果
は第３Ｃ図に示されており、１０ケのレーンすべてが１
回Ｃ５８接種実生からの無細胞抽出物をツバリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で６時間インキュベートすることに
よって産生じた生成物を含んでいる。明らかなように、
１０の実生のうちの９つが形質転換されていた。、追加
の１同棲種実生のアッセイをＢ６またはＣ５８のいずれ
かで形質転換させた実生を用いて行った。菌株Ｂ６また
はＣ５８のいずれかで１同棲種した実生の合計１５０回
のアッセイうち、６０％が形質転換されていた。
５、対照（コントロール）：
産生じたツバリンがある二次的な興味のない事実の結果
である可能性を排除するために、いくつかの対照試験を
行った。第４Ａ図に示すよ 。
である可能性を排除するために、いくつかの対照試験を
行った。第４Ａ図に示すよ 。
うに、実施例２のパートＡで記載したようにして４８時
間培養したＣ５Ｂの懸濁液の無細胞音波処理物の電気泳
動は何らの含有ツバリンを示さなかった（レーン３およ
び４）。さらに、これらの音波処理物をツバリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地と混合し２５℃で４時間インキュベ
ートさせたときも、ツバリンデヒドロゲナーゼ活性は検
出できなかった。このインキュベーションの生成物を電
気泳動させている第４Ｂ図のレーン６および７を参照さ
れたい。即ち、ツバリンデヒドロゲナーゼ活性は４８時
間後の微生物培養物中で見い出されなかった。また、ツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何らのツバリン
を含んでなかった。この反応培地単独を電気泳動させて
いる第４Ｂ図レーン５を参照されたい。同様に、未感染
とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲナーゼの証拠は
見い出せなかった。レーン６〜１０が未感染単実生の無
細胞抽出物を６時間ツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地
でインキュベートすることによって産生させた生成物を
含んでいる電気泳動図を示す第４Ｃ図を参照されたい。
間培養したＣ５Ｂの懸濁液の無細胞音波処理物の電気泳
動は何らの含有ツバリンを示さなかった（レーン３およ
び４）。さらに、これらの音波処理物をツバリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地と混合し２５℃で４時間インキュベ
ートさせたときも、ツバリンデヒドロゲナーゼ活性は検
出できなかった。このインキュベーションの生成物を電
気泳動させている第４Ｂ図のレーン６および７を参照さ
れたい。即ち、ツバリンデヒドロゲナーゼ活性は４８時
間後の微生物培養物中で見い出されなかった。また、ツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何らのツバリン
を含んでなかった。この反応培地単独を電気泳動させて
いる第４Ｂ図レーン５を参照されたい。同様に、未感染
とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲナーゼの証拠は
見い出せなかった。レーン６〜１０が未感染単実生の無
細胞抽出物を６時間ツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地
でインキュベートすることによって産生させた生成物を
含んでいる電気泳動図を示す第４Ｃ図を参照されたい。
これらの結果は、Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物中のツ
バリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生の形質転換に基
づくものであり何らかの二次的な興味のない事実による
ものでないことを明確にしている。
バリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生の形質転換に基
づくものであり何らかの二次的な興味のない事実による
ものでないことを明確にしている。
実施例３
Ａ、とうもろこしの形質転換：
菌株Ｃ５８を実施例２、パートＡで記載したようにして
培養し、近文系黄色イオチーフとうもろこしを実施例２
、パートＢで記載したようにして滅菌し、発芽させ、接
種し、インキュベートさせた。７日間のインキュベーシ
ョン後に、感染実生を鉢植え土壌を含む鉢に植付けた。
培養し、近文系黄色イオチーフとうもろこしを実施例２
、パートＢで記載したようにして滅菌し、発芽させ、接
種し、インキュベートさせた。７日間のインキュベーシ
ョン後に、感染実生を鉢植え土壌を含む鉢に植付けた。
Ｂ、アッセイ：
１、萌芽系の葉の中の酵素活性のアッセイ：植付け３週
間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系（ｅｍｂｒｙ
ｏｎｉｃ ｏｒｉｇｉｎ）の３枚の葉をツバリンデヒド
ロゲナーゼ活性の存在を測定するためにアッセイした。
間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系（ｅｍｂｒｙ
ｏｎｉｃ ｏｒｉｇｉｎ）の３枚の葉をツバリンデヒド
ロゲナーゼ活性の存在を測定するためにアッセイした。
アッセイ用に選定した葉はまだ大きくなってない植付物
の幹からの第１葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生
中に存在する分化構造に由来するが、これらの分化構造
は接種領域には存在しない。
の幹からの第１葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生
中に存在する分化構造に由来するが、これらの分化構造
は接種領域には存在しない。
アッセイを行うために、３枚の各萌芽葉をそれぞれトリ
ス−ＨＣＪバッファー中で均質化し、遠心して実施例２
、パートＣにおいて実生について記載したようにして酵
素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の無細胞抽出物
をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で２４時間インキ
ュベートすることによって産生した生成物の電気泳動の
結果は第５Ａ図に示され、この図においては、レーン１
．２および３がこのインキュベーションの生成物を含ん
でいる。第５Ａ図から明らかなように、各萌芽葉の無細
胞抽出物はツバリンデヒドロゲナーゼを含むものはなく
これらの葉は上記の接種手順によっては形質転換されて
ないことを示していた。
ス−ＨＣＪバッファー中で均質化し、遠心して実施例２
、パートＣにおいて実生について記載したようにして酵
素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の無細胞抽出物
をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で２４時間インキ
ュベートすることによって産生した生成物の電気泳動の
結果は第５Ａ図に示され、この図においては、レーン１
．２および３がこのインキュベーションの生成物を含ん
でいる。第５Ａ図から明らかなように、各萌芽葉の無細
胞抽出物はツバリンデヒドロゲナーゼを含むものはなく
これらの葉は上記の接種手順によっては形質転換されて
ないことを示していた。
２、分裂系の葉中の酵素活性のアッセイ：分裂組織に由
来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）を、実生の植え付
け７週間後に、ツバリンデヒドロゲナーゼの存在につい
てアッセイした。分裂Ｍｉ織は分裂して器官および他の
分化組織を形成できる急速分裂性の未分化小細胞からな
る組織である。葉に分化する分裂組織は接種領域に存在
している。
来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）を、実生の植え付
け７週間後に、ツバリンデヒドロゲナーゼの存在につい
てアッセイした。分裂Ｍｉ織は分裂して器官および他の
分化組織を形成できる急速分裂性の未分化小細胞からな
る組織である。葉に分化する分裂組織は接種領域に存在
している。
アッセイを行うために、分裂組織由来の葉から一部を切
り取り、名菓から切り取った部分をトリス−ＨＣｌバッ
ファー中で一緒に均質化し、遠心し、実施例２のパート
Ｃで実生について記載したようにして酵素活性について
アッセイした。アッセイに用いた名菓の部分は第５Ｂ図
の数字２および３で示される。数字３で示される部分は
線６および７に沿って切り取った。線７は葉の中央脈と
一致している。部分３は通常植物に結合している葉の基
幹部に位置する。この葉の基幹部は葉の成長端であり、
この領域は葉の最も新しい細胞を含んでいる。数字２で
示される部分は中央脈４に水平である線５に沿って切る
ことによって切り取った。部分２．２は葉の先端部にあ
り、葉の最も古い細胞を含んでいる。各部分２および３
は葉の表面積の約１／６を占める。分裂組織系の４枚の
葉の上記部分の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地でインキュベーションすることによって産生
じた生成物の電気泳動の結果を第５Ｃ図に示す。第５Ｃ
図において、レーン１はツバリンデヒドロゲナーゼ反応
培地を含み、レーン２〜５は葉の無細胞抽出物をツバリ
ンデヒドロゲナーゼ培地で１２時間インキュベートする
ことによって産生じた生成物を含んでいる。図示するよ
うに、４枚の葉のうちの３枚の無細胞抽出物がツバリン
を産生しこれらはツバリンデヒドロゲナーゼ活性を含む
ことを示していた。これらの葉は細胞分裂および分化に
よる分裂組織に由来するので、これらの結果は実生の接
種領域中の細胞がとうもろこし細胞の次の世代に対して
ツバリンデヒドロゲナーゼを合成する能力を促進できる
ことを示している。即ち、これらの結果は接種した領域
の細胞およびこれらの細胞に由来する細胞の形質転換が
起っていることを示している。
り取り、名菓から切り取った部分をトリス−ＨＣｌバッ
ファー中で一緒に均質化し、遠心し、実施例２のパート
Ｃで実生について記載したようにして酵素活性について
アッセイした。アッセイに用いた名菓の部分は第５Ｂ図
の数字２および３で示される。数字３で示される部分は
線６および７に沿って切り取った。線７は葉の中央脈と
一致している。部分３は通常植物に結合している葉の基
幹部に位置する。この葉の基幹部は葉の成長端であり、
この領域は葉の最も新しい細胞を含んでいる。数字２で
示される部分は中央脈４に水平である線５に沿って切る
ことによって切り取った。部分２．２は葉の先端部にあ
り、葉の最も古い細胞を含んでいる。各部分２および３
は葉の表面積の約１／６を占める。分裂組織系の４枚の
葉の上記部分の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地でインキュベーションすることによって産生
じた生成物の電気泳動の結果を第５Ｃ図に示す。第５Ｃ
図において、レーン１はツバリンデヒドロゲナーゼ反応
培地を含み、レーン２〜５は葉の無細胞抽出物をツバリ
ンデヒドロゲナーゼ培地で１２時間インキュベートする
ことによって産生じた生成物を含んでいる。図示するよ
うに、４枚の葉のうちの３枚の無細胞抽出物がツバリン
を産生しこれらはツバリンデヒドロゲナーゼ活性を含む
ことを示していた。これらの葉は細胞分裂および分化に
よる分裂組織に由来するので、これらの結果は実生の接
種領域中の細胞がとうもろこし細胞の次の世代に対して
ツバリンデヒドロゲナーゼを合成する能力を促進できる
ことを示している。即ち、これらの結果は接種した領域
の細胞およびこれらの細胞に由来する細胞の形質転換が
起っていることを示している。
３、花粉中の酵素活性のアッセイ：
実生植付け６０日後に、２本の植付物の花粉サンプルを
それぞれツバリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッ
セイした。アッセイを行うために、約５〜ｌ０ＸＩＯ’
個の花粉粒子を含む０．５〜１．０＋＋１１の花粉をト
リス−ＨＣ１！バッファー中で均質化し、遠心し実施例
２、パートＣで実生について記載したようにして酵素活
性をアッセイした。２本の植付は物からの花粉の無細胞
抽出物をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１２時間
インキュベートすることによって産生じた生成物の電気
泳動の結果は第５Ｄ図示に示しており、レーン２と３が
このインキュベーションの生成物を含んでおり、レーン
１はツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を含んでいる。
それぞれツバリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッ
セイした。アッセイを行うために、約５〜ｌ０ＸＩＯ’
個の花粉粒子を含む０．５〜１．０＋＋１１の花粉をト
リス−ＨＣ１！バッファー中で均質化し、遠心し実施例
２、パートＣで実生について記載したようにして酵素活
性をアッセイした。２本の植付は物からの花粉の無細胞
抽出物をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１２時間
インキュベートすることによって産生じた生成物の電気
泳動の結果は第５Ｄ図示に示しており、レーン２と３が
このインキュベーションの生成物を含んでおり、レーン
１はツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を含んでいる。
この図から分るとおり、２本の植付は物からの花粉はツ
バリンデヒドロゲナーゼ活性を含んでいた。花粉は細胞
分裂および分化により頂端分裂組織から誘導されるので
、これらの結果は、上記の分裂組織系の葉の結果同様に
、形質転換が起っていることを示している。
バリンデヒドロゲナーゼ活性を含んでいた。花粉は細胞
分裂および分化により頂端分裂組織から誘導されるので
、これらの結果は、上記の分裂組織系の葉の結果同様に
、形質転換が起っていることを示している。
４、形質転換花粉からの実生中の酵素活性のアッセイ：
上記パートＢの３で示した２木の形質転換植付は物から
の花粉を用いて未怒染黄色イオチーフとうもろこし種か
ら生長した植付は物の穂に受精させた。この交配の結果
として受精植付は物により育成したＦ１種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜１４日のインキュベーション後に、実
生を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。
の花粉を用いて未怒染黄色イオチーフとうもろこし種か
ら生長した植付は物の穂に受精させた。この交配の結果
として受精植付は物により育成したＦ１種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜１４日のインキュベーション後に、実
生を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。
これらの実生の無細胞抽出物はツバリンを産生ずること
が分り、この実生のＦ３世代が形式転換されていること
を示している。
が分り、この実生のＦ３世代が形式転換されていること
を示している。
５、形質転換花粉からの作物から採取した萌芽系の葉の
酵素活性のアッセイ： 本実施例のパートＢの４で記載した交配により生じた種
実を収穫し、発芽させ、実生を接種しないことを除いて
は実施例１のパートＢおよびＣで記載したようにしてイ
ンキュベートする。
酵素活性のアッセイ： 本実施例のパートＢの４で記載した交配により生じた種
実を収穫し、発芽させ、実生を接種しないことを除いて
は実施例１のパートＢおよびＣで記載したようにしてイ
ンキュベートする。
７〜１４日のインキュベーション後に、実生を本実施例
のパートＡで記載したようにして植え付ける。植付け３
週間後に、萌芽葉を本実施例のパートＢの１で記載した
ようにしてツバリンデヒドロゲナーゼ活性についてアッ
セイし、この萌芽葉の無細胞抽出物はツバリンを産生し
、形質転換されていることを示している。
のパートＡで記載したようにして植え付ける。植付け３
週間後に、萌芽葉を本実施例のパートＢの１で記載した
ようにしてツバリンデヒドロゲナーゼ活性についてアッ
セイし、この萌芽葉の無細胞抽出物はツバリンを産生し
、形質転換されていることを示している。
尖隻Ｍ工
Ａ、とうもろこしの形質転換：
黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽させ、接種
し、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして７〜１４日間インキュベートした。ただし、とう
もろこし実生の別々のグループをＡ、ツメファシェンス
の菌株Ａ３４８、菌株ＪＫ１９５または菌株２３８ＭＸ
のいずれかで接種した。
し、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして７〜１４日間インキュベートした。ただし、とう
もろこし実生の別々のグループをＡ、ツメファシェンス
の菌株Ａ３４８、菌株ＪＫ１９５または菌株２３８ＭＸ
のいずれかで接種した。
Ａ３４８菌株は菌株Ａ６ＮＣからの広域宿主範囲のプラ
スミドｐＴｉＡ６ＮＣを担持する。この菌株はｖｔｒ”
であり適当な植物ホスト中でリソパインデヒドロゲナー
ゼの産生をコードする。菌株Ａ６ＮＣとプラスミドｐＴ
ｉＡ６Ｎｃはシアキイ （Ｓｃｉａｋｙ）等の“プラス
ミド（Ｐ１ａｓｎ＋ｉｄ）、１．２３８ （１９７７）
”に記載されている。使用したＡ３４８はワシントン州
シアトルのワシントン大学の微生物学および免疫学部門
のユーゲン ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｎｅ５ｔｅｒ）
氏より入手した。この菌株は実施例１のパートＡで菌株
Ｂ６について記載したようにして培養した。
スミドｐＴｉＡ６ＮＣを担持する。この菌株はｖｔｒ”
であり適当な植物ホスト中でリソパインデヒドロゲナー
ゼの産生をコードする。菌株Ａ６ＮＣとプラスミドｐＴ
ｉＡ６Ｎｃはシアキイ （Ｓｃｉａｋｙ）等の“プラス
ミド（Ｐ１ａｓｎ＋ｉｄ）、１．２３８ （１９７７）
”に記載されている。使用したＡ３４８はワシントン州
シアトルのワシントン大学の微生物学および免疫学部門
のユーゲン ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｎｅ５ｔｅｒ）
氏より入手した。この菌株は実施例１のパートＡで菌株
Ｂ６について記載したようにして培養した。
菌株ＪＫ１９５と２３８ＭＸは、それぞれ、臨界的なハ
エ領域に突然変異を有しておりｖｉｒ−である。従って
、これらはそのそれぞれの宿主へＴｉプラスミドの必要
な部分を運ぶことができない。
エ領域に突然変異を有しておりｖｉｒ−である。従って
、これらはそのそれぞれの宿主へＴｉプラスミドの必要
な部分を運ぶことができない。
結果として、これらの微生物を接種した材料から製せら
れた植物抽出物は適当な反応培地に加えたとき何らのオ
パインも産生ずることは期待されないであろう。
れた植物抽出物は適当な反応培地に加えたとき何らのオ
パインも産生ずることは期待されないであろう。
２３８ＭＸは背景的および起源的にはへ３４８菌株と同
じであるが、ハエ領域を對ニーとするハエ領域に挿入さ
れた微生物トランスポズンＴｎ３を有する。菌株２３８
ＭＸはユーゲン ネスター氏（前出）から入手した。こ
の菌株は実施例１のパートＡで菌株Ｂ６について記載し
たようにしてインキュベートし１００μｇ／１ｅｌｌの
カルベニシリンを含むＹＥＢ上で用いた。
じであるが、ハエ領域を對ニーとするハエ領域に挿入さ
れた微生物トランスポズンＴｎ３を有する。菌株２３８
ＭＸはユーゲン ネスター氏（前出）から入手した。こ
の菌株は実施例１のパートＡで菌株Ｂ６について記載し
たようにしてインキュベートし１００μｇ／１ｅｌｌの
カルベニシリンを含むＹＥＢ上で用いた。
ＪＫ１９５菌株はＣ５８由来の對エーミュータントであ
る。この菌株はり工領域の相補群Ｖｌ中に挿入された微
生物トランスボズンＴｎ５を有する。
る。この菌株はり工領域の相補群Ｖｌ中に挿入された微
生物トランスボズンＴｎ５を有する。
菌株ＪＫ１９５の詳細な記載はカオ（Ｋａｏ）等の“Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １８８．４２５
（１９８２）”およびランギスト （Ｌｕｎｄｇｕｉ
ｓｔ）等の“Ｍｏ１． Ｇｅｎ。
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １８８．４２５
（１９８２）”およびランギスト （Ｌｕｎｄｇｕｉ
ｓｔ）等の“Ｍｏ１． Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、 、 １９３．１ （１９８４）”に見
い出し得る。使用したＪＫ１９５はクラーレンス カオ
氏（前出）より入手した。また、この菌株は実施例１の
パートＡで記載したようにしてインキュベートし、５０
μｇ／ｍｌのりファムビシンを含むＹＥＢで使用した。
い出し得る。使用したＪＫ１９５はクラーレンス カオ
氏（前出）より入手した。また、この菌株は実施例１の
パートＡで記載したようにしてインキュベートし、５０
μｇ／ｍｌのりファムビシンを含むＹＥＢで使用した。
Ｂ、アッセイ：
１、実生中の酵素活性のアッセイ：
第３Ｂ図および第３Ｄ図に示すように、２３８ＭＸ菌株
またはＪＫ１９５菌株を接種した実生の無細胞抽出物は
オパイン類を産生じない。第３Ｂ図においては、レーン
６〜１０が２３８ＭＸ接種単実生の無細胞抽出物をリソ
パインデヒドロゲナーゼ反応媒質で４時間インキュベー
トすることによって生じた生成物を含む。明らかに、オ
クトパインが無細胞抽出物によって合成されないので実
生は何ら形質転換されない。第３Ｄ図においては、１０
のレーンすべてがＪ１９５接種単実生の無細胞抽出物を
ツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で６時間インキュベ
ートすることによって生じた生成物を含んでいる。こ＼
でも、ツバリンが産生されないので実生はどれも形質転
換されてない。
またはＪＫ１９５菌株を接種した実生の無細胞抽出物は
オパイン類を産生じない。第３Ｂ図においては、レーン
６〜１０が２３８ＭＸ接種単実生の無細胞抽出物をリソ
パインデヒドロゲナーゼ反応媒質で４時間インキュベー
トすることによって生じた生成物を含む。明らかに、オ
クトパインが無細胞抽出物によって合成されないので実
生は何ら形質転換されない。第３Ｄ図においては、１０
のレーンすべてがＪ１９５接種単実生の無細胞抽出物を
ツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地で６時間インキュベ
ートすることによって生じた生成物を含んでいる。こ＼
でも、ツバリンが産生されないので実生はどれも形質転
換されてない。
しかしながら、Ａ３４８株は形質転換に関して適格性が
ある。第３Ｂ図においては、レーン１〜５はＡ３４８接
種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ
反応培地で４時間インキュベートすることによって生じ
た生成物を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロ
ゲナーゼがＡ３４８を接種した５つの単実生のうちの１
つの無細胞抽出物中に見出されて実生が形質転換されて
いることを示している。
ある。第３Ｂ図においては、レーン１〜５はＡ３４８接
種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ
反応培地で４時間インキュベートすることによって生じ
た生成物を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロ
ゲナーゼがＡ３４８を接種した５つの単実生のうちの１
つの無細胞抽出物中に見出されて実生が形質転換されて
いることを示している。
即ち、Ｔ−ＤＮＡを転写できるりｒ” Ａ、ツメファシ
ェンス菌株のみがとうもろこし実生を形質転換している
。ｖｔｒ領域に突然変異を有し従って転写マイナスであ
るものは感染植物から生成させた抽出物中のオパインシ
ンターゼ活性を刺激しない。
ェンス菌株のみがとうもろこし実生を形質転換している
。ｖｔｒ領域に突然変異を有し従って転写マイナスであ
るものは感染植物から生成させた抽出物中のオパインシ
ンターゼ活性を刺激しない。
実施貫立
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｔ３７の単コロニーをＹＥＢ
中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ
６について記載したようにしてインキュベートした。
中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ
６について記載したようにしてインキュベートした。
Ｔ３７菌株はＡ、ツメファシェンスの標準野外タイプ菌
株である。この菌株はハエ゛であり、適当な植物ホスト
中でツバリンデヒドロゲナーゼの産性をコードする。Ｔ
ａ２はワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理
学部門のジョン ケンプ（Ｊｏｈｎ Ｋｅｍｐ）氏から
入手したが、オハイオ州トレンドのトレンド大学生物学
部門のアンＣ，Ｆ。
株である。この菌株はハエ゛であり、適当な植物ホスト
中でツバリンデヒドロゲナーゼの産性をコードする。Ｔ
ａ２はワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理
学部門のジョン ケンプ（Ｊｏｈｎ Ｋｅｍｐ）氏から
入手したが、オハイオ州トレンドのトレンド大学生物学
部門のアンＣ，Ｆ。
グレープス（Ａｎｎｅ Ｃ，Ｆ、 Ｇｒａｖｅｓ）氏か
らも入手できる。この菌株はチューゲオン（Ｔｕｒｇｅ
ｏｎ）等のＰＮＡＳ、７３．３５６２ （１９７６）
”およびシアキイ （Ｓｃｉａｋｙ）等の“Ｐｌａｓｍ
ｉｄ、 １ ＋ ２３８（１９７８） ”に記載さ
れている。
らも入手できる。この菌株はチューゲオン（Ｔｕｒｇｅ
ｏｎ）等のＰＮＡＳ、７３．３５６２ （１９７６）
”およびシアキイ （Ｓｃｉａｋｙ）等の“Ｐｌａｓｍ
ｉｄ、 １ ＋ ２３８（１９７８） ”に記載さ
れている。
近文黄色イオチーフ系とうもろこしの種実を滅菌し、発
芽させ、さらに実施例１のパー１−ＢおよびＣで記載し
たようにして７〜１４日間インキュベートした。ただし
、とうもろこし実生は菌株Ｂ６でなく菌株Ｔ３７で接種
した。
芽させ、さらに実施例１のパー１−ＢおよびＣで記載し
たようにして７〜１４日間インキュベートした。ただし
、とうもろこし実生は菌株Ｂ６でなく菌株Ｔ３７で接種
した。
７〜１４日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例２のパートＣで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。この手順により、Ｔ３７接種とうもろ
こし実生の細胞なし抽出物によるツバリン産生が示され
実生は形質転換されていることを示した。
施例２のパートＣで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。この手順により、Ｔ３７接種とうもろ
こし実生の細胞なし抽出物によるツバリン産生が示され
実生は形質転換されていることを示した。
尖旌桝ｉ
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
中に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載し
たようにしてインキュベートした。
中に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載し
たようにしてインキュベートした。
とうもろこしの近交ＰＡ９１株の種実を滅菌し、発芽さ
せ、接種し、さらに、実施例１のパートＢとＣで近交黄
色イオチーフ株について記載したようにして７〜１４日
間インキュベートした。ＰＡ９１株は商業的に入手でき
る標準のとうもろこし近交株である。この株はインデア
ナ州グリーンビルのイーライ リリー社のジーン ロバ
ーツ（Ｊｅａｎ Ｒｏｂｅｒｔｓ）氏より入手した。
せ、接種し、さらに、実施例１のパートＢとＣで近交黄
色イオチーフ株について記載したようにして７〜１４日
間インキュベートした。ＰＡ９１株は商業的に入手でき
る標準のとうもろこし近交株である。この株はインデア
ナ州グリーンビルのイーライ リリー社のジーン ロバ
ーツ（Ｊｅａｎ Ｒｏｂｅｒｔｓ）氏より入手した。
７〜１４日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤで記載したようにしてアッセイし
た。第７図に示すように、無細胞抽出物によるツバリン
産生が示されＰＡ９１株とうもろこしは形質転換されて
いることが示された。
を実施例２のパートＤで記載したようにしてアッセイし
た。第７図に示すように、無細胞抽出物によるツバリン
産生が示されＰＡ９１株とうもろこしは形質転換されて
いることが示された。
第６図においては、レーン１〜１０が一回Ｃ５８接種実
生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地
で６時間インキュベートすることにより生じた生成物を
含んでいる。明らかに、無細胞抽出物の１０すべてがツ
バリンを産生じ実生が形質転換されていることを示して
いた。
生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地
で６時間インキュベートすることにより生じた生成物を
含んでいる。明らかに、無細胞抽出物の１０すべてがツ
バリンを産生じ実生が形質転換されていることを示して
いた。
尖１±ユ
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートシた。近交黄色イ
オチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したように
して７〜１４日間インキュベートしたが、種実は次のよ
うにして発芽させた。滅菌後、種実を約１２時間滅菌蒸
留水に浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿
潤ワットマンｒｌｈ３紙上でインキュベートしたが、浸
漬した種実は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するの
で１．５〜２．０日の間インキュベートさせたのみであ
った。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートシた。近交黄色イ
オチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したように
して７〜１４日間インキュベートしたが、種実は次のよ
うにして発芽させた。滅菌後、種実を約１２時間滅菌蒸
留水に浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿
潤ワットマンｒｌｈ３紙上でインキュベートしたが、浸
漬した種実は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するの
で１．５〜２．０日の間インキュベートさせたのみであ
った。
７〜１４日間のインキュベーション期間の終了時点で、
実生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活
性についてアッセイした。この手順により、感染実生の
無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が
形質転換されていることを示していた。
実生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活
性についてアッセイした。この手順により、感染実生の
無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が
形質転換されていることを示していた。
実施例８
Ａ、ツメファシェンス菌株ＬＢＡ４０１３の単コロニー
をＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュベート
した。ＬＢＡ４０１３菌株はＡ、ツメファシェンス菌株
Ａｃｈ５由来の変異株である。ＬＢＡ４０１３はｖｉｒ
ゝである野外タイプＴｉプラスミドｐＴｉＡｃｈ５を含
んでおり、またＬＢＡ４０１３は適当な植物宿主中でリ
ソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードする。ＬＢＡ
４０１３はインデアナ州インデアナポリスのイーライリ
リー社のタレフグワルドロン（Ｃｌｅｇｇ Ｖｌａｒｄ
ｒｏｎ）氏より入手した。この菌株はマートン（Ｍａｒ
ｔｏｎ）等の” Ｍａｔｕｒｅ、 ２７ ？、１２９
（１９７９）”に記載されている。
をＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュベート
した。ＬＢＡ４０１３菌株はＡ、ツメファシェンス菌株
Ａｃｈ５由来の変異株である。ＬＢＡ４０１３はｖｉｒ
ゝである野外タイプＴｉプラスミドｐＴｉＡｃｈ５を含
んでおり、またＬＢＡ４０１３は適当な植物宿主中でリ
ソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードする。ＬＢＡ
４０１３はインデアナ州インデアナポリスのイーライリ
リー社のタレフグワルドロン（Ｃｌｅｇｇ Ｖｌａｒｄ
ｒｏｎ）氏より入手した。この菌株はマートン（Ｍａｒ
ｔｏｎ）等の” Ｍａｔｕｒｅ、 ２７ ？、１２９
（１９７９）”に記載されている。
近文黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発
芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにして７〜１４日間インキュベートしたが、と
うもろこし実生は菌株Ｂ６ではな（菌株ＬＢＡ４０１３
を接種した。
芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにして７〜１４日間インキュベートしたが、と
うもろこし実生は菌株Ｂ６ではな（菌株ＬＢＡ４０１３
を接種した。
７〜１４日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例１のパー）Ｄに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。この手順によりＬＢＡ４０１３形
質転換実生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認
められ、実生は形質転換していることが示されていた。
を実施例１のパー）Ｄに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。この手順によりＬＢＡ４０１３形
質転換実生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認
められ、実生は形質転換していることが示されていた。
実上斑主
Ａ、微生物の調製：
Ａ、ツメファシェンス菌株ＣＡ１９の単コロニーをＹＥ
Ｂ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株
Ｂ６について記載したようにしてインキュベートした。
Ｂ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株
Ｂ６について記載したようにしてインキュベートした。
ＣＡ１９菌株は菌株ＬＢＡ４０１３に由来し、実施例８
で記載したようにユｒであるｐＴｉＡｃｈ５を含んでお
り、また菌株ｃＡ１９は適当な植物宿主中でリソパイン
デヒドロゲナーゼの産生をコードする。
で記載したようにユｒであるｐＴｉＡｃｈ５を含んでお
り、また菌株ｃＡ１９は適当な植物宿主中でリソパイン
デヒドロゲナーゼの産生をコードする。
菌株ＣＡ１９はまたミクロ−ＴｉプラスミドｐＣＥＬ４
４を含んでいる。ミクロプラスミドｐＣＥＬ４４はオク
トパインシンターゼ遺伝子の５′プロモーターと会合ア
ミノ末端領域をコードしている配列およびオクトパイン
シンターゼ遺伝子の３′末末端列間に挿入されたハイグ
ロマイシンホスホトランスフェラーゼ箪Ｉ Ｖ ）をコ
ードする遺伝子からなる構築体である。この構築体は広
域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１０中のＴ−ＤＮＡのよ
り広いフラグメント間に集まっている。
４を含んでいる。ミクロプラスミドｐＣＥＬ４４はオク
トパインシンターゼ遺伝子の５′プロモーターと会合ア
ミノ末端領域をコードしている配列およびオクトパイン
シンターゼ遺伝子の３′末末端列間に挿入されたハイグ
ロマイシンホスホトランスフェラーゼ箪Ｉ Ｖ ）をコ
ードする遺伝子からなる構築体である。この構築体は広
域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１０中のＴ−ＤＮＡのよ
り広いフラグメント間に集まっている。
ミクロプラスミドｐＣＥＬ４４は植物細胞を形質転換し
ハイグロマイシン耐性とすることができる。
ハイグロマイシン耐性とすることができる。
菌株ＣＡ１９は次の如くして調製する。
１、 エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｔ）ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＣＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐＣＥＬ３０の単離ニ プラスミドｐｃＥＬ３０はＴ−ＤＮＡの右手方向に広い
配列およびプラスミドｐ ＴｉＡ ６６由来のオクトパ
インシンターゼ（匹■の５′末端からなる。特異なｌ■
ＬＩＩサイトを含むリンカ−をｏｃｓ遺伝子の１１番目
のコドンに結合している。リンカ−にはプラスミドｐＴ
ｉＣ５Ｂのツバリンシンターゼ遺伝子の末端化およびポ
リアデニル化信号が結合されている。これらの配列には
プラスミドｐＴｉＡ６６由来のＴ−ＤＮＡの左手方向に
広い配列を含む配列が結合している。プラスミドｐＣＥ
Ｌ３０の制限サイトと機能マツプは第８図に示されてい
る。
ｃｏｌｔ）ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＣＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐＣＥＬ３０の単離ニ プラスミドｐｃＥＬ３０はＴ−ＤＮＡの右手方向に広い
配列およびプラスミドｐ ＴｉＡ ６６由来のオクトパ
インシンターゼ（匹■の５′末端からなる。特異なｌ■
ＬＩＩサイトを含むリンカ−をｏｃｓ遺伝子の１１番目
のコドンに結合している。リンカ−にはプラスミドｐＴ
ｉＣ５Ｂのツバリンシンターゼ遺伝子の末端化およびポ
リアデニル化信号が結合されている。これらの配列には
プラスミドｐＴｉＡ６６由来のＴ−ＤＮＡの左手方向に
広い配列を含む配列が結合している。プラスミドｐＣＥ
Ｌ３０の制限サイトと機能マツプは第８図に示されてい
る。
プラスミドｐＣＥＬ３０はエシェリキアコリに１２ＲＲ
１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０から都合よく単離される。Ｅ
、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０はイリノイ州ペオ
リア６１６０４のノーサンリージョナルリサーチラボラ
トリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＮＲＲＬ）に寄託
されており、寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５９１５を有して
いる。
１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０から都合よく単離される。Ｅ
、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０はイリノイ州ペオ
リア６１６０４のノーサンリージョナルリサーチラボラ
トリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＮＲＲＬ）に寄託
されており、寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５９１５を有して
いる。
単離は次のようにして行う。Ｅ、コリＲＲＩΔＭｌ ５
／ｐｃＥＬ３０を５Ｑｍｇ／ｍＡのアンピシリンを含む
し培地（１０ｇ／ｌのカゼイン氷解物、５ ｇ／ｊ！の
酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣＲ１Ｉｇ／ｊ２のグルコ
ース、ｐＨ７，４）の７５０ｍ、ｆ！中で通常の微生物
手法により増殖させる。この培養株は激しく振とうさせ
ながら３７℃で２４時間インキュベートさせた後に収穫
する。
／ｐｃＥＬ３０を５Ｑｍｇ／ｍＡのアンピシリンを含む
し培地（１０ｇ／ｌのカゼイン氷解物、５ ｇ／ｊ！の
酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣＲ１Ｉｇ／ｊ２のグルコ
ース、ｐＨ７，４）の７５０ｍ、ｆ！中で通常の微生物
手法により増殖させる。この培養株は激しく振とうさせ
ながら３７℃で２４時間インキュベートさせた後に収穫
する。
培養株を遠心し、細胞ペレットを５Ｑｍｊ！の新に調製
した溶解バッファー（５０ｍＭのトリス−Ｈ（１、ｐＨ
８，０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、９ｍｇ／ｍｊ！のグルコ
ース、２ｍｇ／Ａのりソザイム）に再懸濁させる。４５
分間の氷上インキュベーションの後、懸濁液を０．２
Ｍ ＮａＯＨと１％のＳＤＳである溶液１００ｍでと混
合する。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持する。
した溶解バッファー（５０ｍＭのトリス−Ｈ（１、ｐＨ
８，０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、９ｍｇ／ｍｊ！のグルコ
ース、２ｍｇ／Ａのりソザイム）に再懸濁させる。４５
分間の氷上インキュベーションの後、懸濁液を０．２
Ｍ ＮａＯＨと１％のＳＤＳである溶液１００ｍでと混
合する。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持する。
３Ｍの酢酸ナトリウムにさらに９Ｑ＋ｎｊ！を加え、混
合物をさらに追加の６０分間氷上に保持する。
合物をさらに追加の６０分間氷上に保持する。
細胞片を遠心により除去し、上清を５００ｍｌのエタノ
ールと混合する。−２０℃で２時間後、核酸を遠心によ
りペレット化し、１０ｍＭのトリス−Ｈ（ｌＳｐＨ８、
ｌ Ｑ＋＋＋Ｍ ＥＤＴＡの９０＋ｎｊ！中に再懸濁さ
せる。
ールと混合する。−２０℃で２時間後、核酸を遠心によ
りペレット化し、１０ｍＭのトリス−Ｈ（ｌＳｐＨ８、
ｌ Ｑ＋＋＋Ｍ ＥＤＴＡの９０＋ｎｊ！中に再懸濁さ
せる。
核酸溶液を９０ｇｍの塩化セシウム、および１０ｍｇ／
ｎｊ！の臭化エチジウム含有溶液０．９ ｍ ｌと混合
する。この混合物を次いで４０．００ Ｏｒｐｍで２４
時間遠心してプラスミドＤＮＡを精製する。プラスミド
ＤＮＡバンドを回収し次いで４０、００ Ｏｒｐｍで１
６時間遠心する。プラスミドＤＮＡバンドを再び回収し
通常の方法により塩化セシウムと臭化エチジウムを除去
する。次にプラスミドＤＮＡバンドを９０ ｇ ／ １
の酢酸アンモニウムを含む２容量のエタノールで沈澱さ
せる。ペレット化ＤＮＡｆｃＴＥバッファー（１０ｍＭ
）リス−ＨＣ１１ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に０．２
ｍｇ／ｍＩｌの濃度で溶解させる。
ｎｊ！の臭化エチジウム含有溶液０．９ ｍ ｌと混合
する。この混合物を次いで４０．００ Ｏｒｐｍで２４
時間遠心してプラスミドＤＮＡを精製する。プラスミド
ＤＮＡバンドを回収し次いで４０、００ Ｏｒｐｍで１
６時間遠心する。プラスミドＤＮＡバンドを再び回収し
通常の方法により塩化セシウムと臭化エチジウムを除去
する。次にプラスミドＤＮＡバンドを９０ ｇ ／ １
の酢酸アンモニウムを含む２容量のエタノールで沈澱さ
せる。ペレット化ＤＮＡｆｃＴＥバッファー（１０ｍＭ
）リス−ＨＣ１１ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に０．２
ｍｇ／ｍＩｌの濃度で溶解させる。
２、Ｅ、コリＪＡ２２１／ｐＯＷ２０の培養およびプラ
スミドｐＯＷ２０の単離： Ｅ、コリＪＡ２２１／ｐＯＷ２０を本実施例のパートへ
の１でＥ、コリＲＲＩＡΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０につい
て記載したようにして増殖させ、プラスミドｐＯＷ２０
を本実施例のパートＡの１でプラスミドｐｃＥＬ３０に
ついて記載したようにして調製する。
スミドｐＯＷ２０の単離： Ｅ、コリＪＡ２２１／ｐＯＷ２０を本実施例のパートへ
の１でＥ、コリＲＲＩＡΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０につい
て記載したようにして増殖させ、プラスミドｐＯＷ２０
を本実施例のパートＡの１でプラスミドｐｃＥＬ３０に
ついて記載したようにして調製する。
３．Ｅ、コリＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＣＥＬ４０の構築：
５μｇのプラスミドｐＣＥＬ３０ＤＮＡを酵素製造業者
により推奨される組成の１５０μ！反応混合物中の５０
単位のＢｇ ｌ ＩＩ制限酵素によって消化する。制限
酵素および他の酵素は次の供給者より容易に入手できる
： ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ消化は３７
℃、９０分で進行せしめる。
により推奨される組成の１５０μ！反応混合物中の５０
単位のＢｇ ｌ ＩＩ制限酵素によって消化する。制限
酵素および他の酵素は次の供給者より容易に入手できる
： ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ消化は３７
℃、９０分で進行せしめる。
反応混合物を先ず０．５ Ｍ ）リス−ＨＣβ、ｐＨ８
，１ｍＭのＥＤＴＡの８．７５μｌと混合し、次いで１
．２５単位の子牛腸ホスファターゼ（べ一すンガーマン
ハイム社より購入できる）と混合し、３７℃で１５分間
インキュベートする。混合物を次に緩衝化フェノールで
次いでエーテル □で抽出し、酢酸アンモニウム含有
エタノール２容量で沈澱させる。−７０℃で３０分後に
、ＤＮＡをペレット化しＴＥバッファー中に１０μｇ７
ｍ！！の濃度で再溶解する。
，１ｍＭのＥＤＴＡの８．７５μｌと混合し、次いで１
．２５単位の子牛腸ホスファターゼ（べ一すンガーマン
ハイム社より購入できる）と混合し、３７℃で１５分間
インキュベートする。混合物を次に緩衝化フェノールで
次いでエーテル □で抽出し、酢酸アンモニウム含有
エタノール２容量で沈澱させる。−７０℃で３０分後に
、ＤＮＡをペレット化しＴＥバッファー中に１０μｇ７
ｍ！！の濃度で再溶解する。
約２０μｇのプラスミドｐＯＷ２０ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍ旧とＢｇｌｌｌにより酵素製造業者が推奨する手順
に従って消化しａｐｈｌＶ遺伝子を得る。ａｐｈｌＶ遺
伝子はハイグロマイシンに耐性の遺伝子を含む植物を形
成するＥ、コリ遺伝子である。
ａｍ旧とＢｇｌｌｌにより酵素製造業者が推奨する手順
に従って消化しａｐｈｌＶ遺伝子を得る。ａｐｈｌＶ遺
伝子はハイグロマイシンに耐性の遺伝子を含む植物を形
成するＥ、コリ遺伝子である。
この消化により得たＤＮＡフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動の通常方法により分画しアガロースゲル中に
挿入したＮ Ａ −４５’ＤｌＥＡＥ紙にューハンプシ
ャー州０３４３’ｌのキーンのシニレイチャー アンド
シュウエル社）上に電気泳動中に包括させることによ
って単離した。
ル電気泳動の通常方法により分画しアガロースゲル中に
挿入したＮ Ａ −４５’ＤｌＥＡＥ紙にューハンプシ
ャー州０３４３’ｌのキーンのシニレイチャー アンド
シュウエル社）上に電気泳動中に包括させることによ
って単離した。
ＤＮＡを上記の紙から上記紙を５秒間子分量の高温バフ
フｙ −（１，ＯＭ ＮａＣＩｔ 、 ０．１ ｍＭ
ＥＤＴＡ。
フｙ −（１，ＯＭ ＮａＣＩｔ 、 ０．１ ｍＭ
ＥＤＴＡ。
および２０ｍＭ）リス、ｐ）１８．０）でスピニングす
ることにより溶出して紙をミクロ遠心機中に回収する。
ることにより溶出して紙をミクロ遠心機中に回収する。
この紙を５５〜６０℃で１０〜４５分間必要に応じて渦
巻かせることによってインキュベートする。バッファー
を除去し、紙を約５０μｌのバッファーで洗浄する。Ｄ
ＮＡを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出し、ＴＥ
バッファー中に約２５μｇ／ｌａｌ！の濃度で再懸濁さ
せる。
巻かせることによってインキュベートする。バッファー
を除去し、紙を約５０μｌのバッファーで洗浄する。Ｄ
ＮＡを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出し、ＴＥ
バッファー中に約２５μｇ／ｌａｌ！の濃度で再懸濁さ
せる。
１０ｎｇのホスホターゼ処理旦）Ｊ−Ｉ Ｉ切断プラス
ミドｐｃＥＬ３０を１５μｌの０．８ユニツトＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ含有リガーゼバツフアー（５０ｍＭ）リス−
ＨＣ１、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ 、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、および１ｍＭＡＴｐ）巾で５０ｎｇの精製
〜１．３ ｋｂ旦ザー旦ａｉｌＩフラグメントと混合す
る。この混合物を一夜１５℃でインキュベートする。
ミドｐｃＥＬ３０を１５μｌの０．８ユニツトＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ含有リガーゼバツフアー（５０ｍＭ）リス−
ＨＣ１、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ 、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、および１ｍＭＡＴｐ）巾で５０ｎｇの精製
〜１．３ ｋｂ旦ザー旦ａｉｌＩフラグメントと混合す
る。この混合物を一夜１５℃でインキュベートする。
この連結反応混合物を１５μｌの滅菌６０ｍＭＣａＣｌ
、溶液と混合する。次に一７０℃で３０ｍＭ ＣａＣ
ｌ ｚ 、１５％グリセロール中で２０倍濃縮で貯蔵し
た適格Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５細胞の懸濁液７０μｌを
加える。氷上で６０分経過後、形質転換混合物を４２℃
で２分間加熱処理し、次いで０．５ｍ１ｌＬ培地で３７
℃、９０分間インキュベートする。
、溶液と混合する。次に一７０℃で３０ｍＭ ＣａＣ
ｌ ｚ 、１５％グリセロール中で２０倍濃縮で貯蔵し
た適格Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５細胞の懸濁液７０μｌを
加える。氷上で６０分経過後、形質転換混合物を４２℃
で２分間加熱処理し、次いで０．５ｍ１ｌＬ培地で３７
℃、９０分間インキュベートする。
混合物のサンプルをアンピシリンを５０ｍｇ／ｌで含む
し培地上に拡散させ寒天により１５ｇ／ｌで固化する。
し培地上に拡散させ寒天により１５ｇ／ｌで固化する。
これらのサンプルを次いで一夜３７℃でインキュベート
して形質転換細胞からのコロニーの増殖を行う。
して形質転換細胞からのコロニーの増殖を行う。
形質転換により得られるコロニーをアンピシリンを５０
ｍｇ／Ｊで含む５Ｉｎ１のＬ培地中に接種し、３７℃で
一夜増殖させる。プラスミドＤＮＡは、これら培養物の
１ｍｊｌ’サンプルから、ホルメスＯｌｏ１ｍｅｓ）と
キーグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ）の”Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １１４．１９３（
１９８１） ”の方法により調製し、５０μｌのＴＥ
バッファー中に再溶解させる。
ｍｇ／Ｊで含む５Ｉｎ１のＬ培地中に接種し、３７℃で
一夜増殖させる。プラスミドＤＮＡは、これら培養物の
１ｍｊｌ’サンプルから、ホルメスＯｌｏ１ｍｅｓ）と
キーグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ）の”Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １１４．１９３（
１９８１） ”の方法により調製し、５０μｌのＴＥ
バッファー中に再溶解させる。
４、 ミクロＴｉプラスミドｐＣＥＬ４４の構築ニブラ
スミドｐｃＥＬ４０はアグロバクテリウム中の複製たり
得ないので、プラスミドｐ ＣＥＬ４０のミクロＴ−Ｄ
ＮＡを先ずＥ ｃｏＲＩフラグメントとして広域宿主範
囲のベクターｐＫＴ２１０中に転写した。この広域宿主
範囲ベクターはカルホルニア州（９４３０５）のパロア
ルトのスタンフォード大学のプラスミドリファレンスセ
ンターより入手できる。
スミドｐｃＥＬ４０はアグロバクテリウム中の複製たり
得ないので、プラスミドｐ ＣＥＬ４０のミクロＴ−Ｄ
ＮＡを先ずＥ ｃｏＲＩフラグメントとして広域宿主範
囲のベクターｐＫＴ２１０中に転写した。この広域宿主
範囲ベクターはカルホルニア州（９４３０５）のパロア
ルトのスタンフォード大学のプラスミドリファレンスセ
ンターより入手できる。
５μｇのプラスミドｐＫＴ２１０を酵素製造業者の推奨
する組成の１５０μｌの反応液中でＥｃｏＲＩ制限酵素
の５０単位で消化する。３７℃で９０分後に、反応物を
本実施例のパートＡの３で記載したような子牛腸ホスフ
ァターゼで処理しＴＥバフファ中に１０μｇ／ｍｌｌの
濃度に？容解する。
する組成の１５０μｌの反応液中でＥｃｏＲＩ制限酵素
の５０単位で消化する。３７℃で９０分後に、反応物を
本実施例のパートＡの３で記載したような子牛腸ホスフ
ァターゼで処理しＴＥバフファ中に１０μｇ／ｍｌｌの
濃度に？容解する。
本実施例のパートＡの３で記載したようにして増殖させ
たプラスミドｐｃＥＬ４０ＤＮＡＩ製物１５μｌを１０
単位のＥｃｏＲＩ制限酵素で２０μｌ反応液中で３７℃
、９０分間消化し、次いでフェノールで抽出し、エーテ
ルで抽出する。消化したＤＮＡを酢酸アンモニウム含有
エタノールの２容量で〜２０℃で沈澱させ、２０μｌの
ＴＥバッファー中に再溶解する。
たプラスミドｐｃＥＬ４０ＤＮＡＩ製物１５μｌを１０
単位のＥｃｏＲＩ制限酵素で２０μｌ反応液中で３７℃
、９０分間消化し、次いでフェノールで抽出し、エーテ
ルで抽出する。消化したＤＮＡを酢酸アンモニウム含有
エタノールの２容量で〜２０℃で沈澱させ、２０μｌの
ＴＥバッファー中に再溶解する。
１０ｎｇのホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ切断ｐＫＴ２
１０を本実施例のパートＡの３で記載したようにして５
．ｃｒＪのＥｃｏＲＩ切断ｐｃＥＬ４０と連結反応させ
て本実施例のパートＡの３で記載したようにしてＥ、コ
リＲＲＩΔＭ１５に形質転換する。
１０を本実施例のパートＡの３で記載したようにして５
．ｃｒＪのＥｃｏＲＩ切断ｐｃＥＬ４０と連結反応させ
て本実施例のパートＡの３で記載したようにしてＥ、コ
リＲＲＩΔＭ１５に形質転換する。
ｐＣＥＬ４４含有の形質転換細胞をその能力により用い
てクロラムフェニコールを１０ｍｇ／ｌ含む固化し培地
上で増殖させる。ｐＣＥＬ４４の制限サイトおよび機能
マツプは第９図に示される。
てクロラムフェニコールを１０ｍｇ／ｌ含む固化し培地
上で増殖させる。ｐＣＥＬ４４の制限サイトおよび機能
マツプは第９図に示される。
５、菌株ＣＡ１９を形成するためのｐＣＥＬ４４のＡ、
ツメファシェンスＬＢＡ４０１３への接合： ＲＲＩΔＭ１５／ｐＣＥＬ４４とＥ、コリｐＲＫ２０１
３を固化り培地上で３７℃、−夜増殖させる。Ａ、ツメ
ファシェンスＬ Ｂ Ａ４０１３は固化り培地上で２８
℃、２日間増殖させる。
ツメファシェンスＬＢＡ４０１３への接合： ＲＲＩΔＭ１５／ｐＣＥＬ４４とＥ、コリｐＲＫ２０１
３を固化り培地上で３７℃、−夜増殖させる。Ａ、ツメ
ファシェンスＬ Ｂ Ａ４０１３は固化り培地上で２８
℃、２日間増殖させる。
Ｅ、コリに１２ ＲＲＩΔＭ１５／ｐＣＥＬ４４の１
個のループ、Ｅ、コリｐＲＫ２０１３の１個のループお
よびＡ、ツメファシェンスＬＢＡ４０１３の１個のルー
プとを１ｍＪの３０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液中に混合
する。次に、この混合物の１滴を固化ＴＹ培地（５ｇ／
ｌのカゼイン氷解物、５ｇ／ｌの酵母抽出物、１５ｇ／
ｆの寒天）上に乗せ２８℃で一夜インキユヘートする。
個のループ、Ｅ、コリｐＲＫ２０１３の１個のループお
よびＡ、ツメファシェンスＬＢＡ４０１３の１個のルー
プとを１ｍＪの３０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液中に混合
する。次に、この混合物の１滴を固化ＴＹ培地（５ｇ／
ｌのカゼイン氷解物、５ｇ／ｌの酵母抽出物、１５ｇ／
ｆの寒天）上に乗せ２８℃で一夜インキユヘートする。
上記細菌増殖物を３ｍ！！の１０ｍＭ硫酸マグネシウム
溶液に再：脈濁し、０．１ｍｊ２の階階希釈サンプルを
１００ｍｇ／Ｅのナリジキシン酸と２ｍｇ／ｌのクロラ
ムフェニコールとを含む固化ＴＹ培地上に拡散し２８℃
でインキュベートする。
溶液に再：脈濁し、０．１ｍｊ２の階階希釈サンプルを
１００ｍｇ／Ｅのナリジキシン酸と２ｍｇ／ｌのクロラ
ムフェニコールとを含む固化ＴＹ培地上に拡散し２８℃
でインキュベートする。
接合完了体は２〜４日間増殖後個々のコロニーに生長す
る。これらのコロニーを１００ｍｇ／ｌのナリジキシン
酸と２ ｍ ／ Ｉｌのクロラムフェニコールを含む液
体ＴＹ培地２５ｍｊ２中に１同棲種しさらに２日間振と
うさせながら２８℃でインキュベートする。接合完了体
のプラスミド含有量を次いでカッセ（Ｃａｓｓｅ）等の
方法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｔｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ、 １１３．２２９−２４２．１９．
７９）によりチェックし、野外タイプｐＴｉＡｃｈ５プ
ラスミドとｐＣＥＬ４４プラスミドを含む菌株ＣＡ１９
を単離する。
る。これらのコロニーを１００ｍｇ／ｌのナリジキシン
酸と２ ｍ ／ Ｉｌのクロラムフェニコールを含む液
体ＴＹ培地２５ｍｊ２中に１同棲種しさらに２日間振と
うさせながら２８℃でインキュベートする。接合完了体
のプラスミド含有量を次いでカッセ（Ｃａｓｓｅ）等の
方法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｔｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ、 １１３．２２９−２４２．１９．
７９）によりチェックし、野外タイプｐＴｉＡｃｈ５プ
ラスミドとｐＣＥＬ４４プラスミドを含む菌株ＣＡ１９
を単離する。
本発明の方法を実施するのに用いるＣＡ１９はインジア
ナ州インジアナポリスのイライ リリー社のフレック
ウォルトロン氏より入手した。菌株ＣＡ１９の調製はウ
ォルトロン等の”Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏｌ
、、 ５．１０６（１９８５）″にも記載されており
、その記載は本明細書に参考として引用する。
ナ州インジアナポリスのイライ リリー社のフレック
ウォルトロン氏より入手した。菌株ＣＡ１９の調製はウ
ォルトロン等の”Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏｌ
、、 ５．１０６（１９８５）″にも記載されており
、その記載は本明細書に参考として引用する。
Ｂ、とうもろこしの形質転換：
近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発
芽させ、接種しさらに実施例１のパートＢ、！：Ｃで記
載したようにして７〜１４日間インキュベートしたが、
とうもろこし実生は菌株Ｂ６ではなく菌株ＣＡ１９で接
種した。
芽させ、接種しさらに実施例１のパートＢ、！：Ｃで記
載したようにして７〜１４日間インキュベートしたが、
とうもろこし実生は菌株Ｂ６ではなく菌株ＣＡ１９で接
種した。
Ｃ，アッセイ：
１．実生のりソバインデヒドロゲナーゼ活性のアッセイ
ニ アル１４日間インキュベーション期間終了時に、実生を
実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであり、
レーン１〜１０は一回ＣＡ１９接種実生の無細胞抽出物
をリソバインヒドロキゲナーゼで４時間インキエベート
することによって生じた生成物を含んでいる。
ニ アル１４日間インキュベーション期間終了時に、実生を
実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであり、
レーン１〜１０は一回ＣＡ１９接種実生の無細胞抽出物
をリソバインヒドロキゲナーゼで４時間インキエベート
することによって生じた生成物を含んでいる。
それより明らかなように、１同棲種ＣＡ１９とうもろこ
し実生の無細胞抽出物１０のうちの９つにおいてオクト
バイン産生が認められ、実生かりソバインデヒドロゲナ
ーゼを含有して形質転換されていることが示された。
し実生の無細胞抽出物１０のうちの９つにおいてオクト
バイン産生が認められ、実生かりソバインデヒドロゲナ
ーゼを含有して形質転換されていることが示された。
２、実生のハイグロマイシン耐性のアッセイ：菌株ＣＡ
１９を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日間のみ
インキエベートし、その時点で次のようにしてハイグロ
マイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および杯盤（
第１Ａ図および第１Ｂ図参照）から切り取り約３ＩＩｌ
ｆｆｌの断面積に切断した。これらの断面切断物を各々
２００μｇ７ｍｌ！のカルベニシリン（シグマ）とバン
コマイシン（リリー）とを加えたダンカン培地（ダンカ
ン等により”Ｐｌａｎｔｓ、 １６５．３２２ （１
９８５）”中に記載されている）、または各々２００μ
ｇ／ｍｊ！のカルベニシリンとバンコマイシンを加えた
ＢＮ４ 培ｍ （ムラシージ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）お
よびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）の主要および微量塩（Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、 １５ 、４７３（１９６
２）に記載されている）、４ｍｇ／ｌのオーキシンとし
ての２．４−ジクロロフェノキシ酢酸、９ｇ／ｉ’のデ
フコバクトアガー（Ｄｉｆｃ。
１９を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日間のみ
インキエベートし、その時点で次のようにしてハイグロ
マイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および杯盤（
第１Ａ図および第１Ｂ図参照）から切り取り約３ＩＩｌ
ｆｆｌの断面積に切断した。これらの断面切断物を各々
２００μｇ７ｍｌ！のカルベニシリン（シグマ）とバン
コマイシン（リリー）とを加えたダンカン培地（ダンカ
ン等により”Ｐｌａｎｔｓ、 １６５．３２２ （１
９８５）”中に記載されている）、または各々２００μ
ｇ／ｍｊ！のカルベニシリンとバンコマイシンを加えた
ＢＮ４ 培ｍ （ムラシージ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）お
よびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）の主要および微量塩（Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、 １５ 、４７３（１９６
２）に記載されている）、４ｍｇ／ｌのオーキシンとし
ての２．４−ジクロロフェノキシ酢酸、９ｇ／ｉ’のデ
フコバクトアガー（Ｄｉｆｃ。
Ｂａｃｔｏａｇｅｒ）、および２０ｇ／ｌのサクロ−ス
フ上で暗中で２５〜２７℃で３週間培養し、さらに３週
間抗菌剤への通過を行った。
フ上で暗中で２５〜２７℃で３週間培養し、さらに３週
間抗菌剤への通過を行った。
上記とうもろこし実生由来の組織培養物のハイグロマイ
シンに対する応答性を試験するためには、全断面プラス
断面から生長した組織または１００ｍｇ０カルスサンプ
ルのいずれかをファルコン１００５ペトリ皿中の上記濃
度のバンコマイシンおよびカルベニシリンを加え約１２
５μｇ／ｌｌ１ｌのハイグロマイシンＢ（リリー社）を
含む５０ｍｌのダンカン培地またはＢ Ｎ ａ培地上に
乗せる。この試験は２７℃での暗中インキュベーション
３週間後に増殖の観察チェックにより読み取る。増殖中
の培養物は淡色であり粒度の増大を示している。この試
験を用いて、正増殖表現型をＣＡ１９接種実生由来の培
養物から回収し、実生が異種ハイグロマイシン遺伝子に
より形質転換されていることを示す。
シンに対する応答性を試験するためには、全断面プラス
断面から生長した組織または１００ｍｇ０カルスサンプ
ルのいずれかをファルコン１００５ペトリ皿中の上記濃
度のバンコマイシンおよびカルベニシリンを加え約１２
５μｇ／ｌｌ１ｌのハイグロマイシンＢ（リリー社）を
含む５０ｍｌのダンカン培地またはＢ Ｎ ａ培地上に
乗せる。この試験は２７℃での暗中インキュベーション
３週間後に増殖の観察チェックにより読み取る。増殖中
の培養物は淡色であり粒度の増大を示している。この試
験を用いて、正増殖表現型をＣＡ１９接種実生由来の培
養物から回収し、実生が異種ハイグロマイシン遺伝子に
より形質転換されていることを示す。
災施炭上度
Ａ、除草剤グリホサイトに対する耐性を与える遺伝子を
担持するＡ、ツメファシェンス菌株の調製： １、Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐｃＥＬ３０の単離： Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０を実施例９のパ
ートＡの１で記載したようにして増殖し、プラスミドｐ
ｃＥＬ３０を実施例９のパート１のＡで記載したように
して単離する。
担持するＡ、ツメファシェンス菌株の調製： １、Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐｃＥＬ３０の単離： Ｅ、コリＲＲＩΔＭ１５／ｐｃＥＬ３０を実施例９のパ
ートＡの１で記載したようにして増殖し、プラスミドｐ
ｃＥＬ３０を実施例９のパート１のＡで記載したように
して単離する。
２、プラスミドｐｃＥ、Ｌ３０のＢｇｌｌ■ｌ消化と子
牛腸ホスファターゼによる処理： ５ｇのプラスミドｐＣＥＬ３０ＤＮＡを実施例９のパー
トＡの３で記載したようにして消化し子牛腸ホスファタ
ーゼで処理する。
牛腸ホスファターゼによる処理： ５ｇのプラスミドｐＣＥＬ３０ＤＮＡを実施例９のパー
トＡの３で記載したようにして消化し子牛腸ホスファタ
ーゼで処理する。
３、 グリホサイト耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の単
離： グリホサイト耐性５−エノールビルボイルシキミ酸−３
リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＩ？ＩＥＰＳＰＳ遺伝子）
をコードする遺伝子をコマイ（Ｃｏ’ｎ＋ａｉ）等の“
Ｎａｔｕｒｅ、 ３１７．７１４ （１９８５）”お
よびスタルカー（Ｓｔａｌｋｅｒ）等の“Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ。
離： グリホサイト耐性５−エノールビルボイルシキミ酸−３
リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＩ？ＩＥＰＳＰＳ遺伝子）
をコードする遺伝子をコマイ（Ｃｏ’ｎ＋ａｉ）等の“
Ｎａｔｕｒｅ、 ３１７．７１４ （１９８５）”お
よびスタルカー（Ｓｔａｌｋｅｒ）等の“Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ。
Ｃｈｅｍ、、 ２６０．４７２４ （１９８５） ”
に記載されたようにして単離する（これら文献の記載は
参考として本明細書に引用する）。この方法の最終工程
において、プラスミドｐＰＭＧ３４から切断されたＢａ
ｍ旧のフラグメント中のＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子をプラス
ミドｐＵｃ７にクローン化してプラスミドｐＰＭＧ３８
を得る。
に記載されたようにして単離する（これら文献の記載は
参考として本明細書に引用する）。この方法の最終工程
において、プラスミドｐＰＭＧ３４から切断されたＢａ
ｍ旧のフラグメント中のＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子をプラス
ミドｐＵｃ７にクローン化してプラスミドｐＰＭＧ３８
を得る。
ＧＲＥＰＳＰＳ ｉｆｔ伝子はその後プラスミドｐＰＭ
Ｇ３８からＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取る。
Ｇ３８からＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取る。
ＥｃｏＲ１フラグメントは次いで適当な商業的に入手で
きる分子リンカ−を用いて修飾してＢｇｊ２ＩＩ消化ｐ
ＣＥＬ３０プラスミド上の特異的Ｂｇｌｒｌサイトと連
結反応できるようにまたＥｃｏＲＩサイトを除去できる
ようにする。
きる分子リンカ−を用いて修飾してＢｇｊ２ＩＩ消化ｐ
ＣＥＬ３０プラスミド上の特異的Ｂｇｌｒｌサイトと連
結反応できるようにまたＥｃｏＲＩサイトを除去できる
ようにする。
除草剤グリホサイト（Ｎ−ホスホノメチル−グリシン）
は雑草および作物種の両方を殺す広汎に使用される広域
スペクトル除草剤である。
は雑草および作物種の両方を殺す広汎に使用される広域
スペクトル除草剤である。
この除草剤は芳香族化合物の生合成の代謝段階を抑制し
、グリホサイトの細胞ターゲットは５−エノールビルボ
イルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンタ
ーゼ）であり、これはホスホエノールビルベイトとシキ
メートからの５−エノールビルボイルシキミ酸３−リン
酸の形成を触媒し、該シキミ酸塩経路のこの段階の抑制
が実際に細胞死をもたらしている。
、グリホサイトの細胞ターゲットは５−エノールビルボ
イルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンタ
ーゼ）であり、これはホスホエノールビルベイトとシキ
メートからの５−エノールビルボイルシキミ酸３−リン
酸の形成を触媒し、該シキミ酸塩経路のこの段階の抑制
が実際に細胞死をもたらしている。
ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子はサルモネラ チフィムリウム（
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のａ
ｒｏ Ａ部位の変異体対立遺伝子であり、この遺伝子は
ＥＰＳＰシンターゼをコードし、セリンのプロリンへの
置換により該酵素のグリホサイトに対する親和性を減少
せしめる。
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のａ
ｒｏ Ａ部位の変異体対立遺伝子であり、この遺伝子は
ＥＰＳＰシンターゼをコードし、セリンのプロリンへの
置換により該酵素のグリホサイトに対する親和性を減少
せしめる。
４、連結反応：
実施例９のパー）Ａの３で調製した１０ｎｇのホスファ
ターゼ処理ＢｇＡｉＩ切断プラスミドｐｃＥＬ３０を１
５μβの０，８ユニツトＴ４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ含
含有リガーゼバッフアーマ５０ｎｇのＧＲＥＰＳＰＳ遺
伝子（結合リンカ−を含ム）と混合する。混合物を１５
℃で一夜インキニベートする。この連結反応混合物を用
いて実施例９のパー）Ａの３で記載したようにして適格
Ｅ、コ！ＪＲＲＩΔＭ１５細胞を形質転換する。
ターゼ処理ＢｇＡｉＩ切断プラスミドｐｃＥＬ３０を１
５μβの０，８ユニツトＴ４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ含
含有リガーゼバッフアーマ５０ｎｇのＧＲＥＰＳＰＳ遺
伝子（結合リンカ−を含ム）と混合する。混合物を１５
℃で一夜インキニベートする。この連結反応混合物を用
いて実施例９のパー）Ａの３で記載したようにして適格
Ｅ、コ！ＪＲＲＩΔＭ１５細胞を形質転換する。
５、 ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するミクロ−Ｔ１
プラスミドの構築： 実施例９のパートＡの３に記載したようなアンピシリン
含有し培地上での本実施例のパートＡの４で記載したよ
うにして生成させた形質転換細胞の選定後、形質転換Ｅ
、コＩＪ ＲＲ１△Ｍ１５細胞からのプラスミドを、実
施例９のパートＡの４で記載したように、ＥｃｏＲＩフ
ラグメントとして、広域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１
０に転写する。
プラスミドの構築： 実施例９のパートＡの３に記載したようなアンピシリン
含有し培地上での本実施例のパートＡの４で記載したよ
うにして生成させた形質転換細胞の選定後、形質転換Ｅ
、コＩＪ ＲＲ１△Ｍ１５細胞からのプラスミドを、実
施例９のパートＡの４で記載したように、ＥｃｏＲＩフ
ラグメントとして、広域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１
０に転写する。
６、Ａ、ツメファシェンスＬＢＡ４０Ｌ３への接合：
広域宿主範囲ベクターｐＫＴ２１０上にＧＲＥＰＳＰＳ
遺伝子を担持するプラスミドを、実施例９のパートＡの
５に記載したような接合により、Ａ、ツメファシェンス
菌株ＬＢＡ４０１３へ転写する。得られた接合完了体を
実施例９のパートＡの５に記載したようにして選択し、
ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するＡ、ツメファシェンス
の新規な菌株（以下、菌株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳ
ＰＳと称す）を単離する。
遺伝子を担持するプラスミドを、実施例９のパートＡの
５に記載したような接合により、Ａ、ツメファシェンス
菌株ＬＢＡ４０１３へ転写する。得られた接合完了体を
実施例９のパートＡの５に記載したようにして選択し、
ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するＡ、ツメファシェンス
の新規な菌株（以下、菌株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳ
ＰＳと称す）を単離する。
Ｂ、とうもろこしの形質転換：
近文黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発
芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにしてインキュベートしたが、とうもろこし実
生は菌株Ｂ６ではなく菌株Ｌ Ｂ Ａ ４０１３ ／Ｇ
ＲＥＰＳＰＳを接種した。７日間のインキュベーション
後、この感染実生を鉢植土壌を含む鉢に植付ける。
芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにしてインキュベートしたが、とうもろこし実
生は菌株Ｂ６ではなく菌株Ｌ Ｂ Ａ ４０１３ ／Ｇ
ＲＥＰＳＰＳを接種した。７日間のインキュベーション
後、この感染実生を鉢植土壌を含む鉢に植付ける。
Ｃ，アッセイ：
１、花粉中の酵素活性のアッセイ：
実生の植付け６０日後に、５本の植付は物の花粉の各サ
ンプルを、それぞれ、実施例３のパー）Ｂで記載したよ
うにして、リソパインデヒドロゲナーゼの存在について
アッセイする。５本の植付は物から花粉の無細胞抽出物
をインキュベートすることによって生じた生成物の電気
泳動の結果は花粉の無細胞抽出物の５つのうちの３つが
オクトパインを産生することを示しており、花粉が形質
転換していることを示している。
ンプルを、それぞれ、実施例３のパー）Ｂで記載したよ
うにして、リソパインデヒドロゲナーゼの存在について
アッセイする。５本の植付は物から花粉の無細胞抽出物
をインキュベートすることによって生じた生成物の電気
泳動の結果は花粉の無細胞抽出物の５つのうちの３つが
オクトパインを産生することを示しており、花粉が形質
転換していることを示している。
２、 ＥＰＳＰシンターゼ活性のアッセイ；分裂組織か
らの葉を、実生の植付け７週間後に、ブーコック（Ｂｏ
ｏｃｏｃｋ）とコギング（Ｃｏｇｇｉｎｓ）の方法（“
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 １５４．１２７（１９
８３）”；その記載は参考として本明細書に引用する）
により、ＥＰＳＰシンターゼ活性についてアッセイする
。
らの葉を、実生の植付け７週間後に、ブーコック（Ｂｏ
ｏｃｏｃｋ）とコギング（Ｃｏｇｇｉｎｓ）の方法（“
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 １５４．１２７（１９
８３）”；その記載は参考として本明細書に引用する）
により、ＥＰＳＰシンターゼ活性についてアッセイする
。
５本の個々の植付は物からの５枚の葉をアッセイし、３
枚がＥＰＳＰシンターゼ活性を含むことが認められ、形
質転換が起っていることを示している。
枚がＥＰＳＰシンターゼ活性を含むことが認められ、形
質転換が起っていることを示している。
３、 グリホサイトに対する耐性のアンセイ：本実施例
のパートＣの２の結果として葉中にＥＰＳＰシンターゼ
活性を含んでいることを確認した３本の植付は物に０．
５ｋｇ／ヘククールに等価のグリホサイトイソプロビル
アミン塩を噴霧する。３本の植付は物はすべて対照に比
べ著しいグリホサイト耐性を示す。
のパートＣの２の結果として葉中にＥＰＳＰシンターゼ
活性を含んでいることを確認した３本の植付は物に０．
５ｋｇ／ヘククールに等価のグリホサイトイソプロビル
アミン塩を噴霧する。３本の植付は物はすべて対照に比
べ著しいグリホサイト耐性を示す。
好ましい実施態様を示す以上の記載により、特許請求す
る本発明の範囲を何ら限定する積りはない。当業者なら
ば多くの修正、変形および応用が可能であることは理解
されるであろう。
る本発明の範囲を何ら限定する積りはない。当業者なら
ば多くの修正、変形および応用が可能であることは理解
されるであろう。
去施用上上
Ａ、とうもろこしの形質転換：
菌株ＣＡ１９を実施例９のパートＡで記載したようにし
て培養し、黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽
させ、ＣＡ１９を接種し、実施例１のＢとＣで記載した
ようにしてインキュベートした。実生をまたＡ、ツメフ
ァシェンス菌株ＣＡ１７でも接種した。ＣＡ１７は菌株
ＣＡ１９と同じであるが、ハイグロマイシン耐性をコー
ドする遺伝子が反対方向に挿入さ、れている。さらに、
実生はまたＹＥＢ単独でも接種した。７日間のインキュ
ベーション後、接種した実生すべてを植付けた。
て培養し、黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽
させ、ＣＡ１９を接種し、実施例１のＢとＣで記載した
ようにしてインキュベートした。実生をまたＡ、ツメフ
ァシェンス菌株ＣＡ１７でも接種した。ＣＡ１７は菌株
ＣＡ１９と同じであるが、ハイグロマイシン耐性をコー
ドする遺伝子が反対方向に挿入さ、れている。さらに、
実生はまたＹＥＢ単独でも接種した。７日間のインキュ
ベーション後、接種した実生すべてを植付けた。
Ｂ、アッセイ：
１、形質転換植付物の上部葉中の酵素活性のアッセイ：
植付は物が成熟に達したとき、その上部の葉を実施例３
のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒド
ロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただし、
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。ＣＡ１
９接種実生からの５本の植付は物の葉、ＣＡ１７接種実
生からの２本の植付は物の葉およびＹＥＢ接種０３本の
植付は物の葉をアッセイした。
のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒド
ロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただし、
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。ＣＡ１
９接種実生からの５本の植付は物の葉、ＣＡ１７接種実
生からの２本の植付は物の葉およびＹＥＢ接種０３本の
植付は物の葉をアッセイした。
結果は第１４図に示す。第１４図において各レーンは次
の物質を含む。
の物質を含む。
物
３ １９−６ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉
− ４１９−６ＣＡ１９ ひこばえ −５１７−４Ｃ
Ａ１７ 穂の苗条 −６１９−３ＣＡ１９
〃 −７１９−３ＣＡ１９ 刀状葉の 下の葉 − ＢＳ−５ＹＥＢ 〃 −９１７−３ＣＡ
１７ 刀状葉の 下の葉 − １０１７−３ＣＡ１７ 月状葉の下 の第２葉 − １１１９−４ＣＡ１９ 刀状葉の 下の葉 − １２ｓ−８ＹＥＢ 〃 −１３１９−５
ＣＡｌＱ 刀状葉 −１５１９−２ＣＡ１９
刀状葉 −第１４図に示すように、ＹＥＢ接種
実生からの葉の抽出物はいずれもオクトパインを産生せ
ず、一方ＣＡ−１９接種およびＣＡ−１７接種実生の１
２抽出物のうちの８つがオクトパインを産生じた。
− ４１９−６ＣＡ１９ ひこばえ −５１７−４Ｃ
Ａ１７ 穂の苗条 −６１９−３ＣＡ１９
〃 −７１９−３ＣＡ１９ 刀状葉の 下の葉 − ＢＳ−５ＹＥＢ 〃 −９１７−３ＣＡ
１７ 刀状葉の 下の葉 − １０１７−３ＣＡ１７ 月状葉の下 の第２葉 − １１１９−４ＣＡ１９ 刀状葉の 下の葉 − １２ｓ−８ＹＥＢ 〃 −１３１９−５
ＣＡｌＱ 刀状葉 −１５１９−２ＣＡ１９
刀状葉 −第１４図に示すように、ＹＥＢ接種
実生からの葉の抽出物はいずれもオクトパインを産生せ
ず、一方ＣＡ−１９接種およびＣＡ−１７接種実生の１
２抽出物のうちの８つがオクトパインを産生じた。
２、形質転換植付物の上部葉中の微生物のアッセイ：
本実施例のパートＢの２で記載したりソバインデヒドロ
ゲナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを塗
抹してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在するか
どうかを測定した。
ゲナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを塗
抹してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在するか
どうかを測定した。
これら塗抹の結果として増殖する微生物コロニーをアク
ロバクテリウム検出用ラクトーズ含有培地に転写した。
ロバクテリウム検出用ラクトーズ含有培地に転写した。
原塗抹の結果として増殖しラクトースを酸化してラクト
ン酸とした微生物はなく （ＹＥＢ接種実生、ＣＡ１９
接種実生またはＣＡ １７接種実生の葉からのいずれの
抽出物においても）、微生物中には実生を接種するのに
用いた種類のアブロバクリラムは存在しないことが示さ
れた。
ン酸とした微生物はなく （ＹＥＢ接種実生、ＣＡ１９
接種実生またはＣＡ １７接種実生の葉からのいずれの
抽出物においても）、微生物中には実生を接種するのに
用いた種類のアブロバクリラムは存在しないことが示さ
れた。
３、Ｆ１植付物の葉中の酵素活性のアッセイ：上記アッ
セイの結果を用いて、植付物１９−５および１９−３を
用いてさらに試験を行った。
セイの結果を用いて、植付物１９−５および１９−３を
用いてさらに試験を行った。
植付物１９−５はその最上部の２枚の葉の抽出物が該植
付物が房毛（ｔａｓｓｅｌ）まで拡大する形質転換領域
を有し得ることを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性
に対して陽性であったので用いた。植付物１９−３はそ
の“穂の苗条”、および“刀状葉の下の葉”の抽出物が
該植付は物が穂まで延びた形質転換領域および房毛まで
延びた形質転換領域を有し得ることを示すリソパインデ
ヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であるので用いた。こ
れら２本の植付物は自己受粉させた。次いで、受粉２６
〜２７日後、植付物１９−３と１９−５の未成熟穂を採
取し表面を滅菌した。これら植付物からの穂の遅成熟胚
を切り取り早強カムラシゲースリーグ培地に植付けた。
付物が房毛（ｔａｓｓｅｌ）まで拡大する形質転換領域
を有し得ることを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性
に対して陽性であったので用いた。植付物１９−３はそ
の“穂の苗条”、および“刀状葉の下の葉”の抽出物が
該植付は物が穂まで延びた形質転換領域および房毛まで
延びた形質転換領域を有し得ることを示すリソパインデ
ヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であるので用いた。こ
れら２本の植付物は自己受粉させた。次いで、受粉２６
〜２７日後、植付物１９−３と１９−５の未成熟穂を採
取し表面を滅菌した。これら植付物からの穂の遅成熟胚
を切り取り早強カムラシゲースリーグ培地に植付けた。
胚を光中で８〜１０日間無菌状態で発芽させ、その時点
で土壌に植付けた。
で土壌に植付けた。
土壌に移植して生長したＦ、種実の分裂組織由来の葉を
実施例３のパー）Ｂの２に記載したようにして、ただし
、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリソパ
インデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。オク
トパインと共遊走（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ） した
電気泳動図上のスポットの染色度を評価した。結果は第
１表に示す。そこで示されるように、実生のいくつかは
オクトパインを産生じ、本特性のＦ１世代への有性伝播
を示した。
実施例３のパー）Ｂの２に記載したようにして、ただし
、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリソパ
インデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。オク
トパインと共遊走（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ） した
電気泳動図上のスポットの染色度を評価した。結果は第
１表に示す。そこで示されるように、実生のいくつかは
オクトパインを産生じ、本特性のＦ１世代への有性伝播
を示した。
死滅 ８５９
（試験せず）
強拍性 ３３
（その後死滅０） （その後死滅０）実施例１２
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートシた。ライムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣで記載したようにして７〜１４日間イ日間インキ
トベート実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じ
る急速分裂細胞領域に接種した。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートシた。ライムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣで記載したようにして７〜１４日間イ日間インキ
トベート実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じ
る急速分裂細胞領域に接種した。
７〜１４日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例１のパー）Ｄで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。Ｂ６接種ライムギ実生の無細胞抽出物
をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることに
よって生じた生成物の電気泳動の結果は第１０図に示す
。この図においては、レーン１が合成オクトパイン標準
物を含み、レーン２−６は単Ｂ６接種ライムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。第
１０図に示された結果はオクトパイン産生が試験した４
つの３６接種ライムギ実生（レーン２．３．４および６
）のうちの３つにより生じていることを示している。こ
れらの結果はライムギ実生がｖｉｒ” Ａ、ツメファシ
ェンス菌株Ｂ６による感染によって形質転換されている
ことを示している。
施例１のパー）Ｄで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。Ｂ６接種ライムギ実生の無細胞抽出物
をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることに
よって生じた生成物の電気泳動の結果は第１０図に示す
。この図においては、レーン１が合成オクトパイン標準
物を含み、レーン２−６は単Ｂ６接種ライムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。第
１０図に示された結果はオクトパイン産生が試験した４
つの３６接種ライムギ実生（レーン２．３．４および６
）のうちの３つにより生じていることを示している。こ
れらの結果はライムギ実生がｖｉｒ” Ａ、ツメファシ
ェンス菌株Ｂ６による感染によって形質転換されている
ことを示している。
実施例１３
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
に記載したようにしてインキュベ−トシた。オオムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣに記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ず
る急速分裂細胞領域で接種した。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
に記載したようにしてインキュベ−トシた。オオムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣに記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ず
る急速分裂細胞領域で接種した。
７〜１４日インキュベーション期間の終了時に、実生を
実施例１のパー）Ｄで記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。Ｂ６６接オオムギ実生の無細胞抽出
物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えること
によって生じた生成物の電気泳動の結果は第１１図に示
す。この図に右いて、レーン１は合成オクトパイン標準
物を含み、レーン２〜６は単Ｂ６接種オオムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。第
１１図で示す結果はオクトパイン産生がＢ６６接オオム
ギ実生の５つの無細胞抽出物のうちの５つによって生じ
ていることおよび実生が形質転換されていることを示し
ている。
実施例１のパー）Ｄで記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。Ｂ６６接オオムギ実生の無細胞抽出
物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えること
によって生じた生成物の電気泳動の結果は第１１図に示
す。この図に右いて、レーン１は合成オクトパイン標準
物を含み、レーン２〜６は単Ｂ６接種オオムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。第
１１図で示す結果はオクトパイン産生がＢ６６接オオム
ギ実生の５つの無細胞抽出物のうちの５つによって生じ
ていることおよび実生が形質転換されていることを示し
ている。
実施例１４
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載した
ようにしてインキュベートした。
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載した
ようにしてインキュベートした。
オートムギの種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに
実施例１のパー）ＢとＣで記載したようにして７〜１４
日間インキュベートした。実生を先端分裂組織、即ち、
生殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領域で接種した。
実施例１のパー）ＢとＣで記載したようにして７〜１４
日間インキュベートした。実生を先端分裂組織、即ち、
生殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領域で接種した。
７〜１４日間のインキュベート期間終了時に、実生を実
施例２のパー）Ｄに記載したようにしてアッセイした。
施例２のパー）Ｄに記載したようにしてアッセイした。
結果は第１２図に示す。第１２図では、レーン１がツバ
リンデヒドロゲナーゼ反応培地のみを含み・、レーン２
はツバリン標準物を含み、レーン３〜１１は１回Ｃ５ｇ
接種オートムギ実生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地でインキュベートすることによって生
じ “た生成物を含み、レーン１２は合成オクトパイ
ンを含む。明らかに、１回Ｃ５８接種オートムギ実生の
無細胞抽出物の９つのうちの６つはツバリンを産生し実
生が形質転換されていることを示している。
リンデヒドロゲナーゼ反応培地のみを含み・、レーン２
はツバリン標準物を含み、レーン３〜１１は１回Ｃ５ｇ
接種オートムギ実生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地でインキュベートすることによって生
じ “た生成物を含み、レーン１２は合成オクトパイ
ンを含む。明らかに、１回Ｃ５８接種オートムギ実生の
無細胞抽出物の９つのうちの６つはツバリンを産生し実
生が形質転換されていることを示している。
実施例１５
Ａ、ツメファシェンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載した
ようにしてインキュベートした。
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載した
ようにしてインキュベートした。
コムギの種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施
例１のパートＢとＣに記載したようにして７〜１４日間
インキュベートした。実生は先・端分裂組織、即ち、生
殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領域で接種した。
例１のパートＢとＣに記載したようにして７〜１４日間
インキュベートした。実生は先・端分裂組織、即ち、生
殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領域で接種した。
７〜１４日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイし
た。結果は第１３図に示す。第１３図において、レーン
１はツバリン標準物を含み、レーン２〜６は１回Ｃ５８
接種コムギ実生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地でインキュベートすることによって生じた
生成物を含み、レーン７は合成オクトパインを含み、レ
ーン８は合成オクトパインとりソバインデヒドロゲナー
ゼ反応培地との混合物を含み、レーン９〜１５は１回Ｃ
５８接種コムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒド
ロゲナーゼ反応培地でインキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、Ｃ５８接種コムギ実生
の５つの無細胞抽出液のうちの３つがツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地とインキュベートさせたときツバリン
を産生じ、実生が形質転換されていることを示している
。リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベー
トした場合にはツバインを産生じた無細胞抽出物はなか
った。
を実施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイし
た。結果は第１３図に示す。第１３図において、レーン
１はツバリン標準物を含み、レーン２〜６は１回Ｃ５８
接種コムギ実生の無細胞抽出物をツバリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地でインキュベートすることによって生じた
生成物を含み、レーン７は合成オクトパインを含み、レ
ーン８は合成オクトパインとりソバインデヒドロゲナー
ゼ反応培地との混合物を含み、レーン９〜１５は１回Ｃ
５８接種コムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒド
ロゲナーゼ反応培地でインキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、Ｃ５８接種コムギ実生
の５つの無細胞抽出液のうちの３つがツバリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地とインキュベートさせたときツバリン
を産生じ、実生が形質転換されていることを示している
。リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベー
トした場合にはツバインを産生じた無細胞抽出物はなか
った。
第１図は９６時間令のとうもろこし実生を示す。
第１Ａ図は実生の側面図であり、第１Ｂ図は同じ実生の
前面図である。 第２Ａ図はＡ、テユメファシエンス８６株を植菌した黄
色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細胞抽出液をリ
ゾピンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬を
含有する反応培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地
）を用いてインキュベートすることによって生産した生
産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳
動グラムの図である。ある種のコントロールも電気泳動
した。 第２Ｂ図は黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出す
ることができる試薬を含有する反応培地（ツバリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地）を用いてインキュベートするこ
とによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展
開したペーパー電気泳動グラムの図である。ある種のコ
ントロールも電気泳動した。 第２Ｃ図は種々の物質中のピロノバリンの存在又は不存
在を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。 第２Ｄ図は展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。電気泳動された物質はＡ、テユメファシエンスＣ５８
を植菌した黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物をＡ、
テユメファシエンスのある菌株によって異化することに
よって生産された。ある種のコントロールも電気泳動し
た。 第３Ａ図は単一Ｂ６植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこ
し実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応
培地を用いてインキュベートすることによって生産した
生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気
泳動グラムの図である。 １３Ｂ図はＡ、テユメファシエンスＡ３４８株または２
３ｇＭＸ株を植菌した単一黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろ
こし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。 第３Ｃ図は単一Ｃ５８植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろ
こし実生の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。 第３ＤＩＨ１Ａ、テユメファシエンスＪＫ１９５株を植
菌した単一黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第４Ａ図はＡ、テユメファシエンスＢ６及びＣ５８株の
無細胞超音波処理液の電気泳動の結果である、展開した
ペーパー電気泳動グラムの図である。 第４Ｂ図はＡ、テニメファシエンスＢ６及びＣ５８株の
無細胞超音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュ
ベートすることによって生産した生産物の電気泳動の結
果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。反応培地単独も電気泳動した。 第４Ｃ図はとうもろこしの黄色Ｉｏｃｈｉｅｆ株の単−
未感染実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地又はツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
て４時間インキュベートすることによって生産した生産
物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動
グラムの図である。 第５Ａ図はＣ５８植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし
実生から生長した植物からの単一のほう芽期の葉の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果である、展開した電気泳動グラムの図である
。 第５Ｂ図はツバリンデヒドロゲナーゼ活性の検定のため
に切開した部分を示す分裂起源（ｍｅｒｉｓｔｅ−ｍａ
ｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ）のとうもろこし葉の図である。 第５Ｃ図はＣ５８植閑黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし
実生から生長した４つの植物体からの４つの分裂葉の切
開部の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培
地を用いてインキュベートすることによって生産した生
産物の電気泳動の結果を示す、展開した電気泳動グラム
の図である。 第５Ｄ図はＣ５８植菌黄色Ｉｏｃｈ ｉｅｆとうもろこ
し実生から生長した個々の植物体からの花粉の無細胞抽
出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。 第６図はＡ、テユメファシエンスＣΔ１９株を植菌した
、黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこしの単一実生の無細胞
抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果である、展開したペーパー電気泳動グラムの図
である。 第７図はとうもろこしＰＡ９１株の単一Ｃ５８植菌実生
の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を
用いてインキュベートすることによって生産した生産物
の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グ
ラムの図である。 第８図はプラスミドｐｃＥＬ３０の制限部位及び機能地
図である。 第９図はプラスミドｐＣＥＬ４４の制限部位及び機能地
図である。 第１０図は単一Ｂ６植菌ライ麦実生の無細胞抽出液をリ
ゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第１１図は単一Ｂ６細菌大麦実生の無細胞抽出液をリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第１２図は単一Ｃ５８細菌オート麦実生の無細胞抽出液
をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュ
ベートすることによって生産した生産物の電気泳動の結
果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。 第１３図は単一Ｃ５８細菌小麦実生の無細胞抽出液をツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物の電気泳動の結果である、展開した
電気泳動グラムの図である。 第１４図はＣＡ１９接種実生からの５本の植付は物の葉
、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付は物の葉およびＹ
ＥＢ接種の３本の植付は物の葉の無細胞抽出液をリソパ
インデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開した電気泳動グラムの図である。 これらすべての図において、「０」及びｒＯｃＴＪはオ
クトピンを、「Ｎ」又は［Ｎ０ＰＪはツバリンを表わす
。これらの記号は各図において、合成オクトピン又はツ
バリン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及す
るため、又電気泳動後の合成オクトピン又はツバリン標
品によって生じたスポットの位置を示すために用いられ
ている。 いくつかの図面においては、合成オクトピン又はツバリ
ン標品と共に移動しないスポットがある。 これらのスポットは反応培地中の未反応試薬によって、
又とうもろこし実生の無細胞抽出液中に見い出される天
然に生じた物質によって形成される。 ｍ業のＳ警洒容に１更なし） ０１２３４う６７ａｃ１０ｓ ＦＩＧ、 １０ ＦＩＧ、１１ＦＩＧ、１
２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４ ＋ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １１ ９ １０ １
＋ １２ １３ １４ １５ １６昭和 年 月
日 ２、発明の名称 ホモノ科植物を形質転換する方法及
びその生産物 ３、補正をする者 事件との関係 出願人 名 称 ユニヴアーシティ オブ トレド４、代理
人 ５、補正命令の日付 昭和６２年９月２２日（１）
訂正願書、代理権を証明する書面、願書に最初に添付し
た明細書及び図面の浄書（内容に変更なし）別紙のとお
り。 （２） 明細書第９８頁第１４行と第１５行の間に以
下の文を加入する。 こ 第１４図はＣＡ１９接種実生からの５本の植付は物
の葉、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付は物の葉およ
びＹＥＢ接種の３本のは付は物の葉の無細胞抽出液をリ
ソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベ
ートすることによって生産した生産物の電気泳動の結果
を示す、展開した電気泳動グラムの図である。」
前面図である。 第２Ａ図はＡ、テユメファシエンス８６株を植菌した黄
色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細胞抽出液をリ
ゾピンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬を
含有する反応培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地
）を用いてインキュベートすることによって生産した生
産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳
動グラムの図である。ある種のコントロールも電気泳動
した。 第２Ｂ図は黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出す
ることができる試薬を含有する反応培地（ツバリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地）を用いてインキュベートするこ
とによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展
開したペーパー電気泳動グラムの図である。ある種のコ
ントロールも電気泳動した。 第２Ｃ図は種々の物質中のピロノバリンの存在又は不存
在を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。 第２Ｄ図は展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。電気泳動された物質はＡ、テユメファシエンスＣ５８
を植菌した黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物をＡ、
テユメファシエンスのある菌株によって異化することに
よって生産された。ある種のコントロールも電気泳動し
た。 第３Ａ図は単一Ｂ６植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこ
し実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応
培地を用いてインキュベートすることによって生産した
生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気
泳動グラムの図である。 １３Ｂ図はＡ、テユメファシエンスＡ３４８株または２
３ｇＭＸ株を植菌した単一黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろ
こし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。 第３Ｃ図は単一Ｃ５８植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろ
こし実生の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。 第３ＤＩＨ１Ａ、テユメファシエンスＪＫ１９５株を植
菌した単一黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし実生の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第４Ａ図はＡ、テユメファシエンスＢ６及びＣ５８株の
無細胞超音波処理液の電気泳動の結果である、展開した
ペーパー電気泳動グラムの図である。 第４Ｂ図はＡ、テニメファシエンスＢ６及びＣ５８株の
無細胞超音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュ
ベートすることによって生産した生産物の電気泳動の結
果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。反応培地単独も電気泳動した。 第４Ｃ図はとうもろこしの黄色Ｉｏｃｈｉｅｆ株の単−
未感染実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地又はツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
て４時間インキュベートすることによって生産した生産
物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動
グラムの図である。 第５Ａ図はＣ５８植菌黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし
実生から生長した植物からの単一のほう芽期の葉の無細
胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果である、展開した電気泳動グラムの図である
。 第５Ｂ図はツバリンデヒドロゲナーゼ活性の検定のため
に切開した部分を示す分裂起源（ｍｅｒｉｓｔｅ−ｍａ
ｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ）のとうもろこし葉の図である。 第５Ｃ図はＣ５８植閑黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこし
実生から生長した４つの植物体からの４つの分裂葉の切
開部の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培
地を用いてインキュベートすることによって生産した生
産物の電気泳動の結果を示す、展開した電気泳動グラム
の図である。 第５Ｄ図はＣ５８植菌黄色Ｉｏｃｈ ｉｅｆとうもろこ
し実生から生長した個々の植物体からの花粉の無細胞抽
出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。 第６図はＡ、テユメファシエンスＣΔ１９株を植菌した
、黄色１ｏｃｈｉｅｆとうもろこしの単一実生の無細胞
抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果である、展開したペーパー電気泳動グラムの図
である。 第７図はとうもろこしＰＡ９１株の単一Ｃ５８植菌実生
の無細胞抽出液をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を
用いてインキュベートすることによって生産した生産物
の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グ
ラムの図である。 第８図はプラスミドｐｃＥＬ３０の制限部位及び機能地
図である。 第９図はプラスミドｐＣＥＬ４４の制限部位及び機能地
図である。 第１０図は単一Ｂ６植菌ライ麦実生の無細胞抽出液をリ
ゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第１１図は単一Ｂ６細菌大麦実生の無細胞抽出液をリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第１２図は単一Ｃ５８細菌オート麦実生の無細胞抽出液
をツバリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュ
ベートすることによって生産した生産物の電気泳動の結
果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である
。 第１３図は単一Ｃ５８細菌小麦実生の無細胞抽出液をツ
バリンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物の電気泳動の結果である、展開した
電気泳動グラムの図である。 第１４図はＣＡ１９接種実生からの５本の植付は物の葉
、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付は物の葉およびＹ
ＥＢ接種の３本の植付は物の葉の無細胞抽出液をリソパ
インデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開した電気泳動グラムの図である。 これらすべての図において、「０」及びｒＯｃＴＪはオ
クトピンを、「Ｎ」又は［Ｎ０ＰＪはツバリンを表わす
。これらの記号は各図において、合成オクトピン又はツ
バリン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及す
るため、又電気泳動後の合成オクトピン又はツバリン標
品によって生じたスポットの位置を示すために用いられ
ている。 いくつかの図面においては、合成オクトピン又はツバリ
ン標品と共に移動しないスポットがある。 これらのスポットは反応培地中の未反応試薬によって、
又とうもろこし実生の無細胞抽出液中に見い出される天
然に生じた物質によって形成される。 ｍ業のＳ警洒容に１更なし） ０１２３４う６７ａｃ１０ｓ ＦＩＧ、 １０ ＦＩＧ、１１ＦＩＧ、１
２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４ ＋ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １１ ９ １０ １
＋ １２ １３ １４ １５ １６昭和 年 月
日 ２、発明の名称 ホモノ科植物を形質転換する方法及
びその生産物 ３、補正をする者 事件との関係 出願人 名 称 ユニヴアーシティ オブ トレド４、代理
人 ５、補正命令の日付 昭和６２年９月２２日（１）
訂正願書、代理権を証明する書面、願書に最初に添付し
た明細書及び図面の浄書（内容に変更なし）別紙のとお
り。 （２） 明細書第９８頁第１４行と第１５行の間に以
下の文を加入する。 こ 第１４図はＣＡ１９接種実生からの５本の植付は物
の葉、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付は物の葉およ
びＹＥＢ接種の３本のは付は物の葉の無細胞抽出液をリ
ソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベ
ートすることによって生産した生産物の電気泳動の結果
を示す、展開した電気泳動グラムの図である。」
Claims (31)
- （１）ホモノ科植物の実生の急速に細胞分裂している部
分に傷をつけ、ついでその傷に￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバ
クテリウム・テュメファシエンスを植菌することを特徴
とする形質転換されたホモノ科植物を生産する方法。 - （２）傷を生殖系列細胞のもととなる部分につける特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）約４つの傷をつけ、約１０＾８のアグロバクテリ
ウム・テュメファシエンスを傷に植菌する特許請求の範
囲第２項記載の方法。 - （４）￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・テュメファ
シエンスが遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有する
ベクターを含有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）傷を生殖系列細胞のもととなる部分につける特許
請求の範囲第４項記載の方法。 - （６）約４つの傷をつけ、約１０＾６のアグロバクテリ
ウム・テュメファシエンスを傷に植菌する特許請求の範
囲第５項記載の方法。 - （７）ホモノ科植物がとうもろこし、小麦、ライ麦、大
麦及びオート麦よりなる群から選ばれる特許請求の範囲
第１〜６項のいずれかに１項に記載の方法。 - （８）ホモノ科植物がとうもろこしである特許請求の範
囲第７項記載の方法。 - （９）傷を胚盤瘤のふもとから子葉鞘瘤を通ってその少
し先までにまたがる部分につける特許請求の範囲第８項
記載の方法。 - （１０）形質転換された、ホモノ科植物の花粉粒。
- （１１）特許請求の範囲第１０項記載の花粉粒から導か
れたホモノ科植物。 - （１２）￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・テュメフ
ァシエンスに感染した実生から生長した植物によって生
産された、形質転換された、ホモノ科植物の花粉粒。 - （１３）特許請求の範囲第１２項記載のとうもろこし花
粉から導かれたホモノ科植物。 - （１４）遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベ
クターを含有する￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・
テュメファシエンスに感染した実生から生長した植物に
よって生産された、形質転換された、ホモノ科植物の花
粉粒。 - （１５）特許請求の範囲第１４項記載の花粉粒から導か
れたホモノ科植物。 - （１６）その細胞がＴ−ＤＮＡ分節を含有する、ホモノ
科植物の花粉粒。 - （１７）特許請求の範囲第１６項記載の花粉粒から導か
れたホモノ科植物。 - （１８）ホモノ科植物がとうもろこし、小麦、大麦、オ
ート麦及びライ麦よりなる群から選ばれる特許請求の範
囲第１０、１２、１４又は１６項のいずれか１項に記載
の形質転換された花粉粒。 - （１９）ホモノ科植物がとうもろこしである特許請求の
範囲第１８項記載の花粉粒。 - （２０）とうもろこし、小麦、ライ麦、大麦及びオート
麦よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１１、１
３、１５又は１７項のいずれか１項に記載のホモノ科植
物。 - （２１）とうもろこしである特許請求の範囲第２０項記
載のホモノ科植物。 - （２２）形質転換されたホモノ科植物体。
- （２３）￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・テュメフ
ァシエンスに感染した実生から導かれた、形質転換され
たホモノ科植物体。 - （２４）遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベ
クターを含有する￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・
テュメファシエンスに感染した実生から導かれた形質転
換された、ホモノ科植物体。 - （２５）その細胞がＴ−ＤＮＡ分節を含有する形質転換
されたホモノ科植物体。 - （２６）ホモノ科植物がとうもろこし、小麦、オート麦
、大麦及びライ麦よりなる群から選ばれる、特許請求の
範囲第２２〜２５項のいずれか１項に記載の形質転換植
物体。 - （２７）ホモノ科植物がとうもろこしである特許請求の
範囲第２６項記載の形質転換植物体。 - （２８）￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・テュメフ
ァシエンスに感染した実生から導かれた、形質転換され
たホモノ科植物。 - （２９）遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベ
クターを含有する￥ｖｉｒ￥＾＋アグロバクテリウム・
テュメファシエンスに感染した実生から導かれた、形質
転換されたホモノ科植物。 - （３０）とうもろこし、小麦、ライ麦、オート麦及び大
麦よりなる群より選ばれる、特許請求の範囲第２８又は
２９項に記載の、形質転換されたホモノ科植物。 - （３１）とうもろこしである特許請求の範囲第３０項記
載の形質転換されたホモノ科植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88027186A | 1986-06-30 | 1986-06-30 | |
| US880271 | 1986-06-30 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12116197A Division JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6387921A true JPS6387921A (ja) | 1988-04-19 |
| JP2693443B2 JP2693443B2 (ja) | 1997-12-24 |
Family
ID=25375913
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62163867A Expired - Lifetime JP2693443B2 (ja) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | ホモノ科植物を形質転換する方法 |
| JP12116197A Expired - Lifetime JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12116197A Expired - Lifetime JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP2693443B2 (ja) |
| AU (1) | AU606874B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341455C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0604662A4 (en) * | 1992-07-07 | 1996-04-17 | Japan Tobacco Inc | Method of transforming monocotyledon. |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340766C (en) * | 1984-12-24 | 1999-09-28 | Clive Waldron | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants |
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| US4795855A (en) * | 1985-11-14 | 1989-01-03 | Joanne Fillatti | Transformation and foreign gene expression with woody species |
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Family Cites Families (1)
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