JPS6351336A - プロトロンビン含量の低いビタミンｋ依存性凝固因子製剤の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロトロンビン含量の低い凝固因子製剤の製法
、ならびにそれによシ得られる薬剤に関する。

ビタミンに依存性凝固因子は止血障害の治療に使用され
る。かかる凝固因子濃縮物の使用はある場合には、一部
は部分的なプロトロンビン活性化に原因がある望ましか
らぬ副反応と結びついている。

それゆえ本発明の目的はプロトロンビン含量の低いビタ
ミンに依存性凝固因子の製法、ならびにそれによυ得ら
れる薬剤を開発することであった。プロトロンビンの除
去は、他の凝固因子の活性を損なうことなく選択的かつ
緩和々条件下に行われるべきである。

他の凝固因子とは、特にビタミンに依存性血漿タンパク
質とシわけ第■因子、第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、
タンパク質Ｃ、タンパク質ＳならびにタンノξりｆｉＺ
が理解されるべきである。プロトロンビンは−１７，５
〜８でトロンビンによる限定されたタンパク分解によシ
断片に分解されうろことは知られている（Ａｒｃｈ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９８５）　２４０　（２）、６
０７〜６１２参卸。

驚くべきことに、プロトロンビンのトロンビンによシ触
媒される分解がプロトロンビン含量の低い凝固因子の製
造に使用されうろことが見出された。

さらにゑ１ぐべきことに、適尚な緩＠系中で適轟な声値
を保持しそして場合により化学物質添加の下に他の凝固
因子を損うとと彦く選択的なプロトロンビン分解が行わ
れうろことも見出された。

さらに驚くべきことに、トロンビンの作用により生成し
たプロトロンビン断片が好ましくは難溶性のカルシウム
塩、バリウム＃Ｌまたはアルミニウム塩、アニオン交換
体または担体に結合したヘハリンまたは硫酸デキストラ
ンに吸着させることＫより他の凝固因子から実質上分離
されうろことが見出された。これら凝固因子はこの方法
で比較的高収量で得られうる。

従って本発明はプロトロンビン含量の低い凝固因子製剤
の製法、ならびにそれｉｃよシ得られる薬剤に関する。

この方法は、プロトロンビンおよび少くとも１種類の他
の凝固因子ならびに緩衝液を含有する水浴液にトロンビ
ンを添加し、トロンビンを作用せしめ、トロンビンを除
去し、トロンビンの作用によシ生成したプロトロンビン
断片を好ましくは難溶性のカルシウム塩、バリウム塩ま
たはアルミニウム塩、アニオン交換体または担体に結合
したヘノリンまたは硫酸デキストランに吸着させること
により他の凝固因子から実質上分離しそして凝固因子を
取得することからなる。

トロンビンは好ましくは０．００１〜１モル／ｌの燐酸
ナトリウムまたはカリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム
またはカリウム緩衝液、グリシン緩衝液、イミダゾール
緩衝液または酢酸ナトリウム緩衝液中−５〜７、温度０
〜４５℃および場合により他の化合物例えば０．００１
〜３モル／ｌのＮａ１Ｊ　、　ＬｌＣｌまたはＫｃｌ　
、　０〜０．１モル／１のＥＤＴＡまたは１〜４０ｇ／
１００＋７＋７！の硫酸アンモニウムを添加して５〜５
００分間作用せしめる。

特に好ましくは、トロンビンは０．０１〜０．６モル／
１１の燐酸ナトリウムまたはイミダゾール緩衝液および
０．　ＯＯ１〜０．０５モル／ｌのＥＤＴＡ緩衝液中ｐ
Ｈ５，５〜６．５および温度２０〜４０℃で３０〜１８
０分間作用せしめる。

特に好ましい実施態様においては、トロンビンは例えば
０．０２モル／ｌのイミダゾールおよび０．００１モル
／ｌのｇＤＴＡを含有する−６の溶液中、または０．０
２５モル／ｌの燐酸カリウムを含有するｐＨ６の溶液中
で、約３７℃で約１２０分間作用せしめる。

トロンビンとしては、特に場合により担体に結合したヒ
トトロンビンまたは牛トロンビンの溶液１ｒＩＬｔ当シ
０．１〜５０００Ｕの濃度のものが使用されうる。２５
００単位のトロンビンがタンツク質物質１ｎｑｌｔＣ相
当する。

しかし場合によシ担体に結合したヒトトロンビンの１〜
３００　Ｕ／−のものが好ましい。

特に好ましい実施態様においては担体に結合したヒトト
ロンビンの５〜３０　Ｕ　／　ｖ、ｉの濃度のものが使
用される。

１単位（Ｕ）とトロンビンはＰＨ７，５および６７℃で
色原体基質Ｔｏｓ−Ｃ）ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
の分層にょす４０５ｎｍて１０Ｄ／ｍ！、・分を生ずる
酵素量に和尚する。

担体物質へのトロンビンの結合は文献記載の方法、例え
ばＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ　、Ｐ、　、氏他の（１９６
８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
６１　、６５６−６４３記載の方法に従い実施され、そ
の場合トロンビンは例えばＣＮｌ１ｒ−またはエポキシ
−活性化されたセファロース■またはアガロース■１−
当り１０〜５０００、好ましくは５０〜１０００μｇの
濃度で使用される。

好ましい実施形においてはトロンビン１００〜５００μ
ｇをＣＮＢｒ活性化されたセファロース１ｍｅと反応さ
せる。

凝固因子を得るには、溶液からトロンビンを除去したの
ち離溶性のカルシウム、バリウムまたはアルミニウム塩
あるいはアニオン交換体または担体に結合したヘパリン
または硫酸デキストランに吸着させる。この溶液から吸
着物質を分離し、吸着剤を場合によシ洗浄しそして凝固
因子を溶出させる。

この目的には、溶液に場合によシロ００１〜３そル／ｌ
の溶性アルカリ金属塩、％　Ｋ　ＮａＣＡ！　。

ＫＣＩＩま走はＬｉＣＪ　、またｈ　１〜４０　？／　
１０　Ｄｍｔの硫酸アンモニウムを添加したのち、声５
〜９で無機吸着剤例えば燐酸トリカルシウム、ヒドロキ
シアパタイト、ＢａＳＯ４”！たはＡＩ！（ＯＨ）３　
”またはアニオン交換体例えばＤＥＡＥ−セファデック
ス、ＤＦＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ、）■ま
たはＤＥＡＥ−セファロース、または担体に結合したヘ
パリンまたは硫酸デキストラン例えばへＡリン−セファ
四−スまたは硫酸デキストランーセフアロースと接触さ
せる。

好ましい実施形においては、溶液１ゴ轟シ少くとも０．
０１Ｐの燐酸トリカルシウム、ＢａＳＯ４またはＡｌ　
（ＯＨ）　５、または例えば溶液ＩＷｌｔ当ｐ少くとも
ｏ、ｏｌｒのヒドロキシアパタイトを−６〜７で、場合
によ＃）５〜３５ｒ／１００ｍの硫酸アンモニウムまた
は１〜３モル／ｌのＮａＣ１を添加したのち使用する。

全く特別に好ましい実施形においては、この溶液に１０
〜２Ｃ１／１００ゴの硫酸アンモニウム添加ノ下≠６〜
＆５で燐酸トリカルシウムと、または添加なしで聞６〜
６．５でヒドロキシアパタイトと接触させる。硫酸アン
モニウムの添加により沈殿が生成するならば、この沈殿
は吸着に先立ち例えば遠心分離または濾過によシ溶液が
ら除去せねばならない。

次に吸着剤を溶液から分離しそして場合によ多緩衝溶液
、例えば０．００１〜０，５モル／ｌの燐酸ナトリウム
またはカリウム、Ｏ，ＯＯ５〜０．１モル／ｌのイミダ
ゾール、０．００１〜０，０２モル／ｌのクエン酸ナト
リウムまたはカリウム、または０．００１〜０．０３モ
ル／ｌのＥＤＴＡを用いｐＨ５，５〜７で、ま之は好ま
しくはｏ、ｏｏｓ〜０．０５モル／！！のイミダゾール
まｆｃは０．００１〜０．０３モル／／のクエン酸ナト
リウムを用いｐＨ，ｉＱ〜６．８で、またＦｉ特に好ま
しくは約０．０２モル／ｌのイミダゾールま九は０．０
１〜０．０１５モル／ｌのクエン酸ナトリウムを用いｐ
Ｈ６で洗浄する。吸着剤七してヒドロキシア／４タイト
を用いる場合はこれを例えばＱ、００１〜０．５モル／
ｌの燐酸ナトリウムまたはカリウム、０．００１〜０．
０２モル／ｌのクエン酸ナトリウムまたはカリウムを用
い−５，５〜７で、ま之は好ましくは０．０１〜０．０
５モル／ｌの燐酸カリウムを用い…６〜＆５で、または
特に好ましくは約０．０２５モル／ｌの燐酸カリウムを
用い田６で洗い、そして次に約０．１６モル／ｌの燐酸
カリウムを用いｐｌ（６，２で洗浄する。次に凝固因子
を既知方法、例えばＴｈｒＯｍｂ、Ｄｉａｔｈ、Ｈａｅ
ｍｏｒｒｈ、５ｕｐｐ、（１９６９）３５１６１記載の
方法に従い溶離する。

ここに記載される方法によって得られる凝固因子１単は
、プロトロンビン含着が低すことおよび凝固因子の本来
の生物学的活性がほとんど損われない点で優れている。

かかる製剤はそれ自体知られ念力法、例えば加熱、透析
、滅菌濾過および凍７結乾燥だよυさらに処理でき、そ
して場合により、血液と等張性となされ、殺菌剤および
ウィルス不含（！−なされ、そして場合によシ生理学的
に受容されうる添加剤および安定剤を含有する薬剤の形
態で医薬として投与されうる◇ 以下の実施例によ）本発明を説明する。

実施例　１ プロトロンビン含量の低い第Ｘ因子、第Ｘ因子、タンパ
ク質Ｃおよびタンパク質Ｓ濃縮物の調製３０単位／ｗｔ
の凝固第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子ならびにタンパク
質ＣおよびＳを含有する溶液５０ａ／を、２０ミリモル
／ｊのイミダゾ−ル／　Ｆ、Ｃ１オよび１ミリ％　ル／
ｌのＥＤ’ｒＡを含有するｐＨ６の緩衝液で透析した。

凝固因子１単位はクエン酸塩添加正常血漿１−中の各凝
固因子の活性に相当する。透析後トロンビンーセファロ
ース０．４−を加えた（トロンビン−セファロース１ゴ
は結合型ヒトトロンビン５００μｇを含有）。

この溶液を次に３７℃で２時間攪拌し、濾過によりトロ
ンビン−セファロースを除去しそして硫酸アンモニウム
濃度１７１／１１００ｚとなした。

沈殿が生成した場合は、これを遠心分離によシ分離して
捨てた。上澄み液に溶液１ｄ当、Ｑｏ、１５２の燐酸ト
リカルシウムを加え、室温で３０分１’！［攪拌した。

遠心分離したのち、２０ミリモル／ｌのイミダゾール／
ＨＣＩおよび１０ミリモル／ｌのクエン酸ナトリウムを
含有する溶液（声６）１００−を用いて固形物を４回洗
い、次に２０ミリモル／ｌのイミダゾール／　ＨＣＪお
よび２５０ミリモル／ｌのクエン酸カリウムを含有する
溶液（ｐ［（６，５）　１　ｏ　ｏ　ｒｎｔを用いて呂
離する。

凝固活性 第］因子　　第Ｘ因子　　第Ｘ因子　　　タンパク質Ｃ
Ａ　３０　　麹　２８Ｖ成　　２７Ｕ／づ　　２２ル曾
Ｂ　　Ｏ，９Ｕ／ｃｄ　　２５−６Ｕ／ｄ　　　２４８
Ｕ％＋＋／　　　２０．５Ｕ／ｙＣ０，１５Ｕ／ｖＬｔ
１２２Ｕ／ｒｒｌ　　　１１．８Ｕ／ｄ　　　　９．８
Ｕ／ｍＡ＝当初溶液、５０−１第■因子、第Ｘ因子、第
Ｘ因子およびタンパク質ＣおよびＳを含有。

Ｂ＝＝＝トロンビン−セファロースで処理（２時間、３
７℃）後の溶液、５０ｍ１゜ Ｃ＝Ｃａ５（ＰＯ４）２溶出液、１００−０ここに記載
される凝固因子活性にりいての単位は個々の因子につい
ての凝固時間を適切に測定することにより得られ、た。

１単位（Ｔｊ）はクエン酸塩添加正常血漿１ゴ中の各凝
固因子の活性に相当する。

実施例　２ 実施例１におけるとＰ１様にして、［Ｊ、０２５モル／
ｌの燐酸カリウム（声６）を含有する凝固因子溶液を使
用。この浴液５０−をトロンビン−セファロース（実施
例１参照ンで処理したのち１２．５Ｆのヒドロキシアパ
タイトを添加して６０分間攪拌した。上澄み液を分離し
之のち吸着剤を２５ミリモル／ｌの燐酸カリタム（声６
　）　１００−次ＶＣ１６０ミリモル／ｌの燐酸カリウ
ム（田６．２）１０ｏＴｎｔで洗った。凝固因子は０．
５　モル／ｌの燐酸カリウム（ｐＨ６，５）　１００　
ｇ！ｌヲ用イテ溶離した。出発物質中における個々の凝
固因子の活性および０．３モル／ｌの燐酸カリウム溶出
液中の活性は実施例１で示される表中の値とほぼ一致す
る。

特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プロトロンビンおよび少くとも１種の他の凝固因子
   ならびに緩衝液を含有する溶液にトロンビンを添加し、
   トロンビンを作用せしめ、トロンビンおよびトロンビン
   の作用により生成したプロトロンビン断片を除去しそし
   て凝固因子を取得することからなる、プロトロンビン含
   量の低いビタミンに依存性凝固因子製剤の製法。 ２）トロンビンを０．００１〜１モル／ｌの燐酸ナトリ
   ウムまたはカリウム緩衝液、クエン酸ナトリウムまたは
   カリウム緩衝液、グリシン緩衝液、イミダゾール緩衝液
   または酢酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ５〜７、温度０〜４
   ５℃、および場合により０．００１〜３モル／ｌのＮａ
   Ｃｌ、ＬｉＣｌまたはＫＣｌ、０〜０．１モル／ｌのＥ
   ＤＴＡまたは１〜４０ｇ／１００ｍｌの硫酸アンモニウ
   ムを添加して５〜５００分間作用せしめることからなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）担体に結合したヒトトロンビンまたは牛トロンビン
   を溶液１ｍｌ当り０．１〜５０００Ｕの濃度で使用する
   ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）トロンビンを分離したあとの溶液に場合により０．
   ００１〜３モル／ｌの溶性アルカリ金属塩を添加したの
   ち、これをｐＨ５〜９で無機吸着剤、アニオン交換体、
   または担体と結合したヘパリンまたは硫酸デキストラン
   と接触させることからなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ５）特許請求の範囲第１項記載の方法により得られる凝
   固因子を含有する凝固障害の治療用薬剤。