JPS63500169A - ペプチドの自動合成方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドの自動合成方法および装置 光里少公立 この発明は、一連の化学反応の関与する物質の製造を自動化する方法及び装置に 関し、特に、ペプチド及び蛋白質等の有機化合物の合成システムに関する０本発 明はペプチドの固相合成に特に適している。

光ｊしとえ送 ペプチドの固相合成は、アミノ末端がブロックされたアミノ酸のペプチド鎖への 段階的付加を包含し、そのカルボキシル末端は固相支持体に係留されている０合 成は鎖のアミノ酸のカルボキシル末端から始まり、鎖のアミノ末端に単一アミノ 酸を次々に付加してゆく、これはカルボキシル末端アミノ酸のカルボキシル端を 不溶性固相支持体に共有的に付着させることがら始められるが、この支持体は、 代表的には、濾過によって液相がら分離するのに充分な大きさの樹脂ビーズのマ トリックスである。

次に付加されるべきアミノ酸は、そのアミノ末端が先ずブロンキング基で保護さ れるので、この末端部は最早、ペプチド結合の形成を促進する試薬と反応するこ とができない、このブロックされたアミノ酸は、ジシクロへキシル−カルボジイ ミド等の凝縮剤の存在下で、係留されたアミノ酸と反応させられて、ブロックさ れたアミノ酸のカルボキシル末端と係留されたアミノ酸のアミノ末端との間にペ プチド結合を形成する。

その結果として得られたペプチド鎖（これは今は２つのアミノ酸から成る）は不 溶性樹脂に係留されたままであるので、徹底的に洗うことによって反応物質から 容易に分離することができる。

次に、ペプチド鎖のアミノ末端アミノ酸のアミノ末端からブロッキング基が除去 され、ペプチドの端部は、次に鎖に付加されるべきブロックされたアミノ酸と反 応するべき自由アミノ基となる。

同様にして、係留されたペプチド鎖にアミノ酸が次々に付加されて完全なペプチ ドが作られる。完成したペプチドは不溶性樹脂から除去され遊離される。

実際には、ペプチド合成はもっと複雑である０例えば、ペプチド結合を形成する ために使われる試薬はアミノ酸のうちの幾つがの側基とも反応する（ペプチドを ゛形成するために約２０種のアミノ酸が通常使われる）、従って、これらの敏怒 な側基は、ペプチド合成の全過程を通じて特別のブロッキング基で保護されなけ ればならない、これらの特別のブロッキング基は、ペプチド鎖のアミノ末端のブ ロック解除の環境下で安定でなければならず、また、完成したペプチドから直ち に除去されねばならない。

また、各アミノ酸は固有の最適反応機構を有し、これらの機構はペプチド鎖のア ミノ末端を取巻く環境に影響される。この環境はアミノ末端自体におけるアミノ 酸によってのみならず、ペプチド鎖束の他のアミノ酸及びそれらの固相及び液相 との相互作用によって決定される。

特に、種々のアミノ酸配列はペプチドを三次元的に折曲させ、そのためにアミノ 末端の自由アミノ末端の、ペプチド鎖に付加されるべきブロックされたアミノ酸 との反応が立体的に妨げられることがある。また、鎖の中の種々のアミノ酸は自 由アミノ末端の環境に対して、特に樹脂自体の溶媒和に対して、種々の疎水／親 水効果を有し、これは自由アミノ末端の液体反応物質に対する近づきやすさ及び 反応速度に影響を与える。従って、合成されるべき各ペプチドの順序は異なるか ら、各アミノ酸付加の最適反応条件は予測し難い。

その結果、合成の各工程での反応が完成することは稀である。

すなわち、歩止まりは一般に１００％より幾分少ない、明らかに、相当な長さの ペプチド鎖を相当量調製しなければならない場合には、各工程における歩止まり は非常に高くなければならない。例えば、一工程あたりの歩止まりが９９．０％ であれば、２０個のアミノ酸を付加した後の生成物の歩止まりは精々８１％であ るが、各工程あたりの歩止まりが０．５％高くなれば（工程あたり９９．５％に なれば）生成物の歩止まりは９０％となる（はぼ１０％近く高くなる）、工程あ たりの歩止まりが僅か０．４％だけ更に高くなれば（９９，９％になれば）最終 の歩止まりは９８％となる０歩止まりは、単に得られるペプチドの総量を表わす だけでなく、その純度をも表わす、不完全な反応から生じる、僅が数個のアミノ 酸が異なるだけの、望ましくないペプチドを所望のペプチドから分離するのは困 難であり且つ高価であるので、純度は重要である。

歩止まりが低ければ、それに応じて高価な出発材料の量を増やさねばならないの で、総量は重要である。

従って、これらのペプチドを合成するためのシステムは多数の工程と様々の反応 条件とを含まねばならない、また、それは、そのプロセスに使われたアミノ酸同 士、溶剤及び試薬の混合を最小テムは、次のアミノ酸をペプチド鎖に付加する前 に各アミノ酸付加工程の完成度をモニターする方法を更に包含するべきである。

そのようなシステムは各工程の歩止まりをできる限り高くする。

ペプチドを合成する従来の装置は次の２種類に分けることができる。すなわち、 米国特許第４，３６２，６９９号に記載されたカラム合成装置と、米国特許第４ ，３６２，６９９号、第３，５３　Ｌ２５８号、第３，６４７，３９０号及び第 ３，５５７，０７７号に記載されたシューカー反応容器とに分けることができる 。

カラム合成装置においては、成長するペプチド鎖が付着される固体支持体ビーズ はカラムに詰め込まれる。ペプチドを合成するために必要な試薬、溶剤及びアミ ノ酸は順次にカラムに通されて固体支持体と反応させられる。はどよい流速を得 るため、これらのカラム合成装置は普通は１４ｋｇ／ｃｄ　（２００ｐｓｉ　） より高い高圧で運用される。一方向の流れがカラムを通るので高圧のために固体 支持体が圧縮され、背圧が高まってボンピングの問題が生じる。この圧力の問題 があるので、システムの設計に特別の用心が必要である。

従来のシェーカー反応システムは、液体及び気体を通過させつつ反応容器内に粒 状の不溶性マトリックスを保留するための、ガラスフリフトから作られたフィル ターを含む、一般に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ外への米国特許第３．５２１．２５ ８号及びＢｒｕｎｄｆｅｌｄｔ外への米国特許第３，５５７，０７７号などに記 載されているように、これらの反応容器は反応容器及びそのフィルターを通る一 方向流のための別々の入口と出口とを持っている。

各アミノ酸付加に必要な種々の中間工程の間、種々の溶剤は固体支持体を膨張さ せたり収縮させたりする。収縮したビーズが成る工程中にフィルター〇細孔に入 り込み、次の工程で膨張してフィルターに捉えられてしまうことがある。フィル ターを通る流れは一定方向に流れるので、捉えられたビーズはフィルターから除 去されず、ペプチド合成過程で終に多量に集積して、フィルターを通る流れを妨 げるようになる。また、フィルターが詰まると、捉えられたビーズは少くとも部 分的には反応溶剤及び試薬に接近し得なくなり、各工程の反応条件が不完全とな る。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの特許第３，５２１，２５８号においては、このフィルタ ーの詰まりはシステム中に背圧を蓄積させる原因となって、厳密に計量された流 れを反応容器に送り込むことを困難にする。

移送の不確定性が増大すると、それに応じて、移送させる高価な試薬の量を増や して、この不確定性を埋め合わせなければならない。

これらの従来システムには他の欠点もある。例えば、Ｍｅｒｒｉ　ｆ　１ｅｌｄ の特許では、選択バルブ及びポンプにおける溶剤と試薬との混交が問題である。

また、計量ポンプが比較的に狭い容積範囲に調整可能であるに過ぎないので、こ の装置は広い反応容積範囲に対応することができない、従って、この装置は、分 析的量（少量）及び商業的量（大量）の双方のベブーチドを製造するために使う ことはできない。

Ｋｕｂｏｄｅｒａ外の米国特許第３，６４７，３９０号は、フィルターの詰まり を避けるシステムを記載している。その反応容器は流入物及び流出物の双方のた めの単一の孔を有する。この孔と反応チャンバとの間に単一のフィルターがある 。液状の原料及び試薬が容器に加えられる度に、フィルターを通るその流れが、 その前に容器から液体が除去される際にフィルターに保留されたマトリックス・ ビーズを除去する。Ｋｕｂｏｄｅｒａ外の特許では、貯蔵器からの液体は中間の 計量容器に移され、次に、この中間の計量容器から反応容器に移される。計量は 、真空チャンバを真空にし、このチャンバを中間の計量容器に連通させることに よって行なわれる。

その結果として中間計量容器内の圧力が下がると、中間計量容器及び真空チャン バ内の圧力が標準圧力に増加するまで液体が貯蔵容器から中間計量容器へ移され る。このようにして、移される液体の量は中間計量容器及び真空チャンバの容積 に直接関連している。

このシステムは、種々の液体を正確に計量するために真空チャンバに高真空を引 かねばならないという点で厄介である。また、種々の寸法の反応容器や種々の量 に対処するために引く量を変更することが困難である０本質的に、種々の寸法の 真空チャンバに変えねばならない、このシステムでは、次の液体が導入される前 に中間計量容器の壁から種々の液体を完全に除去することは困難であるので、中 間計量容器内で混交が生じる可能性が大きい。

３里見適！ 従って、本発明の意図は、シェーカー反応容器に入る種々の液体の流れを正確に 計量するシェーカー反応容器型のペプチド自動合成システムを提供することであ る。

本発明の他の目的は種々の量の種々の試薬を計量するために応用することのでき るその種のシステムを提供することである。

本発明の他の目的は、最小限の混交を伴って試薬、溶剤及びアミノ酸を順次に反 応容器に移すことのできるその種のシステムを提供することである。

本発明の他の目的は、ペプチドの大量合成及び少量合成の双方に対応することの できるシステムを提供することである。

本発明の更に他の目的は、反応の各段階の完了度がモニターされるその種のシス テムを提供することである。

その他の目的は、以下、部分的に明白となり、部分的に表現される。

本発明は、広義には、一定の基準圧力下に維持され、ペプチド合成過程で使われ る種々の液体の注入及び排出の双方のための単一のポートを有する反応容器を包 含するシステムを構成する。このシステムは、各注入工程の第１段階として反応 容器内の圧力を下げるために反応容器から制御された量のガスを排除することに よって反応容器内の圧力を下げるための容積排除型ポンプ、特にピストン型注射 器、をも包含する。その後、選択された貯蔵器が反応容器に接続され、容器と貯 蔵器との圧力差に起因して貯蔵器から容器に流れが生じる６反応容器内の圧力が 平衡基準レベルに戻ると、移送は完了する。

制御された体積のガスを反応容器から排除するためにチャンバを排気する必要は ないので、高真空を用いずに容易に行なうことができる０選択された試薬の種々 の量に対処すると共に種々のペプチド量の合成に対処するために、移される液体 の量を容易に調整することができる。移送は、中間チャンバを用いずに反応容器 中へ直接に行なわれる。従って、アミノ酸、溶剤及び試薬の混交を妨げるために 移送システムを容易に洗うことができる。更に、自然に、自動操作となる。この ことは、１種類のアミノ酸を鎖に付加するのにさえ数時間の反応時間が必要なの で、ペプチド合成においては重要である。

本発明の性質及び目的をもっと充分に理解するために、添付図面と関連させて以 下の詳細な説明を参照するべきである。

第１図は本発明を具現する装置全体の略図である。

第２図は本発明装置に用いられる反応容器の断面図である。

奸ｊ方夫旅貫ｉ落所 第１図を参照すると、ペプチドを合成するためのシステム１゜は、ペプチド鎖が その中で製造される反応容器１２と；ペプチドの「組立用ブロックｊサブユニッ トであるアミノｇ　Ａ　ａ　−Ａ　ｎをそれぞれ内包する複数のアミノ酸貯蔵器 １４３〜１４ｎと；ペプチドの合成を促進するための複数の試薬又は溶剤Ｒａ　 −Ｒｎをそれぞれ内包する複数の試薬貯蔵器１６ａ−１６ｎと；所定体積のガス を容器１２から排除するだめの容積排除型ポンプ１８と；試薬及びアミノ酸を貯 蔵器から反応容器に移送するための主移送ライン２０と；容器および移送ライン からガス状及び液状の廃物を排除するための排出システム２２と；当該システム の種々の構成部分の働きを制御する中央プロセッサ２４とから成っている。

試薬及び溶剤に接触するシステムの全ての部分は、テフロン、ガラス、又はステ ンレス綱等の化学的耐性材料で作られる。

窒素圧力源２６と圧力レギュレータ２８とによって基準圧力Ｐがシステムに供給 される。この圧力は典型的には１４０〜３５０ｇ／ｃｄ（２〜５ｐ、ｓ、ｉ、） であるが、好ましくは大気圧より高い如何なる圧力にも設定することができる。

これは圧力源２６がらライン３０ａ、３０ｂを介して貯蔵器１６ａ〜１６ｎに加 えられる、このラインはマニフォールド３２に入る。マニフォールド３２は複数 のライン３４ａ〜３４ｎを介して貯蔵器１６２〜１６ｎに結合する。ライン３４ ａ〜３４ｎは更に対応するバルブ３６ａ〜３６ｎを備えている。これらのバルブ は、通常の又は休止接続状態では、貯蔵器をマニフォールド３２及び圧力源２６ に対して閉鎖する。貯蔵器１６ａ〜１６ｎの加圧の際、選択された貯蔵器を圧力 Ｐと平衡させるため、バルブ３６ａ〜３６ｎは別々に作動すれたり休止化された りする。別々のバルブ作動により貯蔵器の各々が分離されるので、全貯蔵器が同 時にマニフォールド３２に接続されたならば揮発性状Ｎ　Ｒａ　−Ｒｎの逆流か ら生ずるであろう混交が妨げられる。

バルブ３６ａ〜３６ｎは、システム１ｏの他のバルブと同様に、バルブを通る液 体により化学的に引き起こされる腐食を防ぐため、電気的にではなく空気圧の作 用により作動される。バルブの通常の、すなわち休止接続の状態は図においては 実線で表わされ、バルブの作動接続状態は破線で表わされている。空気圧で作動 されるバルブを操作するための圧力は、別の調整下で圧力源２６から供給され、 個別に電気的に作動されるアクチュエータ（図示せず）によって制御される。

同様に、基準圧力Ｐはライン３０ａ、３０ｅ及び第２のマユフォールド３８を介 してアミノ酸貯蔵器１４ａ〜１４ｎに加えられる。マユフォールド３８はライン ４０３〜４０ｎを介して貯蔵器１４２〜１４ｎに結合する。アミノ酸は揮発性で はなく、従ってマユフォールド３Ｂに逆流する揮発性成分からの混交の危険はほ とんど無いので、ライン４０３〜４０ｎはバルブ３６ａ〜３６ｎに類似したバル ブを備えていない。

貯蔵器１６ａ〜１６ｎは対応するブランチ・ライン４２ａ〜４２ｎ及びバルブ４ ４２〜４４ｎを介して主移送ライン２０に接続されている。同様に、貯蔵器１４ ａ〜１４ｎは対応するブランチ・ライン４６２〜４６ｎ及びバルブ４８ａ〜４８ ｎを介して主移送ライン２０に接続されている。バルブ４４ａ〜４４ｎ及び４８ ａ〜４８ｎは主移送ライン２０に沿って直列Ｗ接続されており、その通常の接続 状態は、主ライン２０に沿っては「開」であり、その各々の貯蔵器１６ａ〜１６ ｎ及び１４ａ〜１４ｎに対しては「閉」である。

反応容器１２を第２図にもっと詳しく示しである。これは下側セクション５２に ネジ結合された上側セクション５０から成る。

下側セクション５２は、華−のボート５２ａを有し、容器１２を、従ってボート ５２ａを横切って延在する多孔性フィルタ５４を収容している。上側セクション ５０と共に、フィルタ５４は反応チャンバ５６を画定する。チャンバ５６は、典 型的にはポリスチレン又はその他の樹脂ビーズから成る不溶性支持体マトリック スＭを囲んでおり、組み立てるべきペプチド鎖のカルボキシル末端アミノ酸がマ トリックスＭに付着される。ガス及び液体はボート５２及びフィルタ５４を介し てチャンバ５６に流入、流出する。

もっと詳しく述べると、フィルタ５４は下側セクション５２に予め形成された凹 所５５にきちんと嵌合している。ボート５２ａとフィルタ５４との間の連絡を保 証するため、凹所５５はボート５２ａに向ってテーバとなっている。ガスゲット ５８と弾性的Ｏ−リング６０とによってシールが設けられている。上側セクショ ン５０が下側セクション５２にネジ結合されるとき、肩部５０ａはガスゲット５ ８に緊密に当接して０−リング６０を圧縮する。

これによりＯ−リングはフィルタ５４の周囲に締付りられ、流れがフィルタを通 ってチャンバ５６に入る際にフィルタはしっかりと保持される。

ペプチド鎖が係留される不溶性支持体マトリックスＭは典型的にはポリスチレン 又はポリアクリルアミド等の樹脂から作られるが、ペプチド鎖を付着させること ができるけれど容器１２内で行なわれる反応の環境中で不活性であるようなアク リルアミド含浸シリ男又は多孔性ガラス等の他の適当な材料から作ることもでき る。

フィルタ５４の多孔度は、フィルタ５４を介して液体及びガスをチャンバ５６に 出入りさせるけれどマトリックスＭをチャンバ５６内に保留する程度である。従 って、マトリックスＭ及びこれに係留されたペプチド鎖は、容器１２内で生じる プロセスに関与する液状及びガス状の反応物質及び副産物からフィルターによっ て容易に分離することができる。

容器１２は、約１８０°の角度のゆっくりした往復運動のためのシェーカー６２ （第２図に略示）を更に備えており、マトリックスＭのビーズ、及びこれに付着 したペプチド鎖はチャンバ５６の中の液状溶剤、試薬又はアミノ酸と徹底的に混 合される。マトリックスＭのビーズは、使用された成る種の有機溶剤中で「粘着 性ｊとなり、その結果チャンバ５６の壁に付着することがある。

従って、チャンバの壁に粘着したビーズを含めて、マトリックスＭの全てのビー ズが全プロセスの各段階の液状反応物質と接触し得ることを保証するため、容器 １２の寸法は、その全容積が液体反応体積の２倍より少ないように設定されてい る。そのため、チャンバの壁に粘着したビーズを含めて全てのマトリックス・ビ ーズが各振動サイクル中に容器内の液状反応物質に接触することが可能となる。

第１図に戻ると、容器１２はそのボート５２ａを通して可撓性移送ライン６４及 びバルブ６６によりシステム１０の他の部分に接続されている１作動されると、 バルブ６６は反応容器１２を主移送ライン２０にのみ接続する。休止化されると 、バルブ６６は二重接続を形成する：すなわち、反応容器１２を廃物排除ライン ６８に接続し、同時に、主移送ライン２０を、反応容器１２を迂回する第２廃物 排除ライン７０に接続する。

貯蔵器１６ａ〜１６ｎ及び１４ａ〜１４ｎから反応容器１２への溶剤、試薬、及 びアミノ酸の移送は、バルブ７２を介して主移送ライン２０に直接接続する容積 排除型ポンプ１８によって行なわれる。バルブ７２の通常の接続状態は、ポンプ １８に対しては閉し、移送ライン２０に沿って開いている。

ポンプ１８は、アクチュエータに取付けられたプランジャー７４ｂを有する堅固 に取付けられた注射器７４から成っている。

注射器７４はライン７６とバルブ７８とによってバルブ７２に接続された単一の ボート７４ａを有する。

移送を始めるために、システム１０は基準圧力Ｐに平衡させられる。容器１２は 、バルブ６６と、主移送ライン２０を圧力源２６からの基準圧力に接続するバル ブ８０とを作動させることによって、ライン２０を介して基準圧力に加圧される ０次にバルブ８０が休止される。この時、ポンプ１８はそのゼロ位置にあり。

注射器プランジャー７４ｂばその最低位置にある。

次にバルブ７２が作動され、注射器７４の内部と容器１２とはバルブ６６とそれ らの間のライン２ｏの部分２０ａとを介して互いに接続する。次にプランジャー ７４ｂは所定容積まで引き出される。この引き出しによって容器１２の実効容積 は注射器内の容積だけ増大し、従って、容器１２内の圧力が低下する。

次に、バルブ７２を休止化し、バルブ４Ｂａを作動させて、選択された貯蔵器１ ４ａを容器１２に接続することによって、例えば貯蔵器１４ａ内のアミノ酸Ａａ などの、選択されたアミノ酸の移送が行なわれる。成る体積の液体Ａａを貯蔵器 １４ａがら容器１２に移送することによって圧力は平衡に戻る。

ポンプ１８の行程容積と反応容器１２に移送される液体の体積との間には単純な 関係がある６例えば、プランジャ７４をそのゼロ容積位置から、注射器内の容積 が容器１２内のガス体積に等しくなる点まで移動させると仮定する０次に、ポン プ１８と容器１２との間のライン２０の部分２０ａ中の小容積を無視すると、容 器１２内のガスの半分がポンプ１日に移ることになる。これは、容器１２の半分 を排気し、他の半分をその当初の、すなわち基準の圧力に保つことと等価である 。従って、次に貯蔵器が容器１２に接続される時、容器１２に移送される液体の 量は容器の容積の半分である。

同様に、ポンプ１８の行程容積が容器１２のガス体積の半分であれば、容器１２ 内のガスは容器１２とポンプ１８とに２対１の比率で分配されることになろう（ すなわち、容器１２内のガスの１／３がポンプ１８に移る）、従って、次に貯蔵 器から移送される液体の体積は容器１２のガス体積の１７３になろう。

容器１２への液体移送のより高い精度は、ポンプ１８のゼロ位置容積、すなわち バルブ７２及びその最低位置にあるプランジャー７４ｂの底の間の容積、ライン 部分２０ａ及び選択された貯蔵器及びバルブ７２０間のう・イン２ｏの部分の容 積を説明することによって得られる。ライン部分２０ａの容積及びポンプ１８の ゼロ位置容積は、ポンプ１８のストロークを計算する際には容器１２のガス体積 の一部分と見なすことができる。

一方、選択された貯蔵器とバルブ７２との間のライン２０部分中のガスは液体よ り前に容器１２に移送される。従っ一部このガスはその貯蔵器からの移送の直前 には基準圧力であるから、ライン２０のこの部分の容積は、ポンプ１８のストロ ークを１ｉｒＸするにあたって、移送されるべき液体の体積に加えられるべきで ある。

また、容器１２が液体移送の終了時に圧力平衡に達する時、移送ライン部分２０ ａは選択された貯蔵器から受け取った液体の一部を含んでいる。従って、バルブ ８０と貯蔵器バルブ４４ａ〜４４ｎとの間でライン２０に通じ、ライン２０を圧 力レギユレータ２８の手ｉ訂の点で圧力源２６に接続するバルブ１１２は、高圧 をライン２０に加えてこの液体を容器１２に押し込むために作動される。この高 圧は第２圧力レギユレータ１１４によって調節される。

バルブ６６が次に作動され、容器１２を主ライン２０に対して閉じさせ、同時に 、ライン２０を廃物排除ライン７０に切換える。

バルブ６６が休止化されている時、容器１２は廃物排除う１゛ン６８の一端に直 結し、これは、ライン６８の他端に位置するバルブ８２が休止状態であるので、 この時点ではシステム１０に対して閉じている。この時（又はその後）、ポンプ １８のプランジャー７４ｂＬ；！その当初の（底）位置へ戻される。プランジャ ーのこの移動の際、ポンプを大気に通じさせるためバルブ７８が作動される。

反応容器１２は次にシェーカー６２によって短時間振られ、容器１２内に導入さ れた液状アミノ酸は固体マトリックスＭと混合する。次に、ペプチド鎖の自由喘 へのアミノ酸の付加を促進するため（あるいは、初期に、鎖のカルボキシル末端 アミノ酸の場合、そのアミノ酸のマトリックスＭへの付着を促進するため）に必 要とされる、例えば貯蔵器１６ａ内の試薬Ｒａ等の試薬又は溶剤が、例えば貯蔵 器１６３等の選択された貯蔵器から容器１２に移送される。

この第２の移送のために、（また、その後の移送のためにも）、容器１２は先ず 上下逆転され、チャンバ５６のガス状部分はボート５２ａに通じる。次に、容器 １２は大気圧に連通され、容器１２の内容物の混合に起因する蒸気圧の上昇を排 除する。容器１２の連通は、以下に説明するように、排出システム２２を介して 行なわれる。

容器１２は次に基準圧力Ｐと平衡され、バルブ６６．７２を操作すると共に注射 器のプランジャー７４ｂを所望の行程容積まで後退させることによって第２の体 積のガスが容器１２がら排除される。バルブ７２が休止化されバルブ４４ａが作 動され、選択された貯蔵器１６ａを容Ｆｉ１２に接続する。貯蔵器と容器との間 の圧力差によって貯蔵器１６ａから試薬Ｒａ（容器から排除されたガスの容積と 釣り合う体積）が容器１２に移送される０次に、バルブ４４ａが休止化され、ラ イン２０に先述の如くに窒素が通され、容器１２が短時間振られ、その液状内容 物と固体内容物とを混合させる。

上記の工程の次に、反応に必要な他の溶剤又は試薬を容器】２に加える１次に、 シェーカー６２によって容器１２をゆっくり往復運動させることにより、反応を 進行させる０反応を所定時間行なわせた後、シェーカー６２を止め、容器ｊ２を 正立させて、容器１２の液体部分をポート５２ａに通じさせる。この位置で、容 器１２の液状及びガス状の内容物は真空を用いて排出システム２２に移される。

もっと詳しく述べると、排出システム２２はおおむねコールド・トラップ８６と 、廃物収集容器８８とから成っている。システム２２は、ライン９０及びコネク ティング・バルブ９２を介して、バルブ８２でシステム１０の残余の部分と結合 している。バルブ９２は、その休止接続状態において、排出システム２２をシス テム１０の残余の部分から隔離する０作動されるた時、バルブ９２はライン９４ を介してシステム１０の残余の部分を廃物容器８８に接続する。

容器１２の液状内容物の排出の第１段階は、バルブ９６を作ｖｊさせて廃物収集 容器８８を大気に対して閉じることである。次に、真空ポンプを始動させ、コネ クティング・ライン１０２を介して容器８８から排気する。ライン１０２に位置 する抽気／逆止バルブ１０４は、容器８８及びこれに接続されたシステＪ、１０ の部分の中に所定レベルの真空のみを許容し、容：！Ｓ１２及びコネク子イング ・バルブ及びラインへの過剰な真空に上る損傷を防ぐ４、抽気、ｌ逆止バルブ１ ０４はまたポンプ８４が止められた時排出システム中の真空を保持する。

容器８８が空にされた後、真空ポンプ８４は停止され、バルブ９２．８２は作動 される。従って容器１２と容器８８とはライン６８、作動されたバルブ８２、ラ イン９０、作動されたバルブ９２、及びライン９４を介して連通ずる。容器８８ と容器１２との間の圧力差により容器１２の液状内容物が容器８８に移される。

液状内容物が移されつつある間真空ポンプは停止されているので、容器８８に引 き込まれた揮発物は真空ポンプ８４に引き込まれない０反応容器１２を空にした 後、バルブ９２を休止させ、排出システム２２を容器１２から切離す。

次に、バルブ８０．６６が作動され、容器１２は基準圧力Ｐまで与圧され、バル ブ６６の中に残っている液体が容器１２に押し込まれる。容器の再与圧の後、バ ルブ８ｏ、６６は再び休止され、バルブ９２が作動されて容器１２を排出システ ム２２に接続し、上記の如くに容器の２度目の排出が行なわれる。この２度目の 容器１２の与圧及び排出によって容器１２内の液状及びガス状の内容物が完全に 且つ効果的に排出される。バルブ９２が次に休止され・排出システム２２をシス テム１０及び容器１２に対し閉鎖させる。

容器８８に集められた廃物はバルブ９６を休止させることによって排除される。

休止したバルブ９６は二方向の接続を形成する。

容器８８内の廃物はライン９８と、休止したバルブ９６の一方の接続とを介して 排除される。この時、容器８８はライン１００と休止したバルブ９６の他方の接 続を介して大気に通じる。

このようにして、所マの組合せの反応物質（アミノ酸、溶剤、試薬）を貯蔵器か ら反応容器１２に容易に移送することができ、この移送は、ブロセフザ２４によ り、バルブと容積排除型ポンプのストロークとを調整することによって、自動的 に制御される。

全ペプチド合成過程が、排出システム中の真空ポンプ、シエーカ−６２、及びシ ステム中の残りのバルブをも制御することによってプロセッサ制御される。

システムのユーザーは、所望のペプチド合成シーケンスをプロセッサ２４に入力 することだけを必要とする。適当なプログラムの制御の下で、プロセッサはペプ チドへの各アミノ酸付加の所定の適切な反応条件（時、持続期間、アミノ酸、溶 剤又は試薬）を自動的に選択し、これらの条件を得るために適切な指令を適切な 順序で適切な時に出す。

排出システム２２はまた排出によって主移送ライン２０を浄化する。この機能の ために、バルブ８０．９２が作動され、真空ポンプ８４が始動される。従って、 休止したバルブ６６、ライン７０、休止したバルブ８２、ライン９０、作動され たバルブ９２及びライン９１、及び容器８８を介して、ライン２０は真空ポンプ ８４と連通ずる。ライン２０の中に残っていた液体はこのようにして容器８８に 集められる。

また、上記したように、揮発性溶剤の蒸気圧及び容器の振動に起因する過剰な圧 力が反応容器中に生じることがある。これはまたペプチド合成に必要な反応のう ちの成るもののガス状副産物から生じる場合もある。この過剰圧力は、排出シス テム２２を介して容器１２を大気に連通させることによって容器１２から排除さ れる。連通は、真空ポンプ９４が止められている間にバルブ９６を休止させ、バ ルブ９２．８２を作動させることによりて行なわれる。このようにして容器１２ は容器８８及びバルブ９６を介して大気に連通ずる。その後、容器を基準圧力に 再与圧すれば試薬移送を正確に計量することができる。

更に、貯蔵器から容器に移送される反応物質の量は、容積排除型ポンプ１８のス トロークを変えて反応容器１２から排出されるガスの体積を変化させることによ って移送毎に容易に変えることができる。更に、排出されるべき体積がポンプ１ ８のプランジャー７４ｂの単一ストローク排除の容量を上回る場合には、所望の 体積を得るために複数ストロークを用いることができる。

特に、第１ストローク後、バルブ７８が作動されてシステム中に真空を維持する と共にポンプ１８の内部に通気口を設け、プランジャー７４ｂがそのゼロ容積位 置に戻される０次に、バルブ７８が休止され、プランジャーが再び後退させられ る。この工程は、容器１２から所望の体積を排出するのに必要な回数だけ反復さ れる。このように、ポンプの複数ストロークを用いることによ７て、大きな体積 を排出させるために単一の小容積注射器を使用することができる。また、同一の 注射器を大きな体積を排出させるためにも小さな体積を排出させるためにも随意 に使うことができる。

貯蔵器１４ａ〜１４ｎのうちの１つを補充又は置換するために、ライン３０ｃに 位置するバルブ１０６を作動させる。バルブ１０６は圧力源２６からマニフォー ルド３８への窒素流を制御する。バルブ１０６を作動させると、マニフォールド ３８は圧力源２６から切離され、マニフォールド３８の中の圧力は大気に通じる ０次に、補充又は置換のために選択した貯蔵器１４ａ〜１４ｎを取外すことがで きる。

同様に、貯蔵器１６２〜１６ｎを補充又は置換するために、バルブ１０８をライ ン３０ｂに設けである。バルブ１０８を作動させた後、対応するバルブ３６ａ〜 ３６ｎを作動させ、このようにして、選択された貯蔵器１６ａ〜Ｌ６ｎを大気に 連通させ、これを補充又は置換のために取外すことができる。

上述したように、適切な順序を有するペプチド鎖を組み立てなければならない場 合にはアミノ酸同士の混交を避けなければならない、この理由から、試薬貯蔵器 １６ａ−１６ｎは共通の移送ライン２０に沿ってアミノ酸貯蔵器１４ａ〜１４ｎ から上流側に接続されねばならない。選択したアミノ酸を移送した後に試薬及び ／又は溶剤を移送する時、主ライン２０に残留しているアミノ酸は、ライン２０ を通る溶剤及び／又は試薬の流れによって容器中に流し込まれる。

システム１０中の圧力は、種々の蒸気圧の溶剤を使う場合でも、一定に保たれる 。その理由は、蒸気圧及び圧力源２６からの成分を含む全システム圧力をレギュ レータ２８が調節するからである。

従って、システムが一定の基準圧力に保たれるので、溶剤、試薬及びアミノ酸の 正確な配給を保証することができる。

各アミノ酸付加の完了度を評価するために歩止まりモニター１２０をシステム１ ０に備え付けるのが好ましい、ペプチド鎖に最後に加えられたアミノ酸と反応し ないペプチド鎖の自由アミノ末端に可逆的に結合する共有可逆モニタリング剤を 用いて歩止まりを評価することができる。

このような薬剤を用いるモニタ一方法は次のように行なわれる。

係留されたペプチド鎖へのブロックしたアミノ酸の各付加の後、ペプチド鎖へ付 加されるべき次のアミノ酸を受け取るためブロック解除する前に、係留されたペ プチド鎖を含むマトリックスＭをモニタリング剤と反応させる。次に容器の内容 物を完全に洗い、先の最後のアミノ酸と反応したペプチド鎖のブロックされた端 部を無傷に保ち、ペプチド鎖自体を無傷に保つ条件の下で、モニタリング剤は、 それが付着されているペプチド鎖から選択的に除去される。切られたモニタリン グ剤は次にモニター１２０のサンプル・セル１２２に移され、そこでモニタリン グ剤の濃度が測定される。

更に詳しく述べると、モニター１２０はバルブ９２を介してシステム１０の残余 の部分に結合している。バルブ９２は、その休止接続すなわち通常の接続状態で は、モニター１２０をバルブ８２に連通させている。サンプル・セル１２２への 移送を行なわせるために、バルブ８２を作動させ、それによって、バルブ６６、 ライン６８及びバルブ９２を介して容器１２をセル１２２に接続する。この移送 は、大気圧であるサンプル・セル１２２とシステム圧力Ｐである容器１２との間 の圧力差によって押し進められる。

スペクトル光度計等の検出器１２４はセル１２２の内容物の吸光度を感知し、そ れによって、その中のモニタリング剤の濃度を測定する。モニタリング剤の量は このようにして定量され、先のアミノ酸付加工程における歩止まりは、この値を 所望の歩止まりと比較するプロセッサ２４によって決定される。この歩止まりは 、係留されたペプチド鎖の未反応自由アミノ末端の数に直接的に対応し、従って 、最後のアミノ酸付加で反応しなかったペプチド鎖の部分を表わす、若し歩止ま りが充分に高くなければ、先のアミノ酸付加を、所望の歩止まりを達成するまで 反復することができる。若し次々に反復しても歩止まりが向上しなければ、全合 成過程を終わらせるか、又は第２ブロツキング基を付加してこれらのペプチド鎖 の未反応アミノ末端を永久的にブロックし、それらへの、それ以上の付加を妨げ ることができる。従って、目的のペプチド鎖からたった１つのアミノ酸残基しか 違わないペプチド鎖を分離するより、目的のペプチド鎖から、よれより短いこれ らのペプチド鎖を分離する方が容易である８ 我々が使う共有・可逆モニタリング剤は、トリチル・クロライド、ジメトキシ・ トリナル・クロライド、モノメトキシ・トリチル・クロライド、及びトリメトキ シ・トリチル・クロライド等の一種のトリチル（トリフェニル・メチル）化合物 である。これらは自由アミノ基を特徴とし、ブロックされたアミノ酸側基とは反 応しない、それ故、モニタリングのバックグラウンド・ノイズは極めて低く、ま たペプチド鎖が長くなっても低いままである。これらの化合物は吸光係数が大き く、そのためモニタリングが極めて敏感になる。モニタリング剤の存在は適当な 波長におけるスペクトル光度計の吸収によって容易に検出することができ、従っ て単純で経済的なモニタリングを行なうことができる。

下記はトリチル・クロライドを代表的モニタリング剤として用いる特定の反応観 察記録である。

（Ａ）途附卯ユニ！ル・クロライドと以則上工尺筈慶±Ａ−ブロックされたアミ ノ酸の各付加工程の終了時、ただしブロック解除以前に、容器１２の内容物をジ メチルホルマリン（ＤＭＦ）で二回洗う。次に、５％のトリチル・クロライドと ５％のジイソプロピル・エチルアミンを含むＤＭＦ溶液を容器１２に加え、内容 物を室温で１５分間混合する。

（Ｂ）　旦■［外り一縛されたトリチル　を除去する次に容器１２の内容物をＤ ＭＦで２回洗って余分の未反応トリチル・クロライドを除去する。容器１２に残 留したトリチル基は全てマトリックスＭの自由アミノ基に束縛される。詳しく述 べると、それらは、最後の先行するアミノ酸と反応しなかったペプチド鎖の末端 に束縛される。容器内のマトリックスＭに束縛されたトリチル基は次に、７％の トリクロロアセチック・アシド（Ｔｒｉ−ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　Ａｃ１ｄ 　）を含むジクロロメタン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ　）溶液を固相に 加えて緩やかに混合させながらこれを１０分間反応させることによって、除去さ れる。これらの条件の下で、トリチル−アミノ結合が壊れ、可溶性トリチル・カ ルボニウム・イオンを形成する。

（Ｃ）３溶性トリチル　の　を　する 次に液相を前述の如（にモニターに移し、２５９ナノメートルにおける吸収を測 定することによってトリチル・カルボニウム・イオンのレベルを定量する。上記 のトリクロロアセチック・アシド−ジクロロメタン溶剤においては、トリチル部 分は１０］のオーダーのモル吸光係数を有する。従って、反応容器１２内での各 アミノ酸付加工程の歩止まりは、高精度で、しかも正しく合成されたペプチド鎖 を著しく破壊せずに、決定することができる。

ジメトキシ・トリチル・クロライドを使う場合には、これを可視光波長で分光測 光法により検出することができるので、より簡単に且つ安価に検出を行ない得る こととなる。ジメトキシ・トリチル部分は１０’のオーダーのモル吸光係数を有 するので、これはトリチル・クロライドより敏感なモニタリング剤である。

このように、我々は、それぞれの貯蔵器から反応容器へのアミノ酸、試薬及び溶 剤の移送が容積排除と圧力平衡とによって迅速に、容易に、しかも経済的に行な われる改良されたペプチド合成システムを提供した。移送ライン及びバルブにお ける試薬の混交は最小である。このシステムは各アミノ酸付加工程において高い 歩止まりを与えるために容易に最適化することができ、各工程における歩止まり を容易に且つ効果的にモニターして、高い最終歩止まりを存するペプチド生産を 助長することができる。

上述の目的、とりわけ先の説明から明らかなものが効果的に達成されることが判 ろう。また、本発明の範囲から逸脱せずに、上記方法の実施にあたって、及び上 記構成において変更をすることができる。

例えば、廃物及び洗剤を一層速（除去するために、容器１２を洗い流す際に基準 圧力を瞬間的に高めることができる。また、モニター１２０を改造して他のモニ タ一方法に適応させることもできる。

従って、上の説明に包含され又は添付図面に示された事項は全て例示的なもので あって、制限的な意味に解釈されるべきではない。

また、次の請求の範囲はここに記載した本発明の包括的及び特定の特徴の全てを カバーするものであると理解されねばならない。

・手続補正書（方式） ６２．９．２４ １′８１　年　５１ 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ１０３８６１００８１４２、発明の名称　ペプチドの自 動合成方法および装置３、補正をする者 事件との関係　出願人 ７、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．固体支持体マトリックスに係留されたペプチド領にアミノ酸を順次に付加す ることによってペプチドを固相合成するためのシステムであって、 Ａ．固体支持体マトリックスを囲む反応容器であって、（１）該容器に出入りす る２方向の流れを通すための単一のポートと、
2. （２）該容器内の該単一のポートの近傍に位置して該固体支持体マトリックスを 該反応容器内に保留するとともに該容器からの法体の通過を許容する多孔性フィ ルタとから成る反応容器と； Ｂ．前記ペプチドの合成に使われる溶剤若しくは試薬、若しくはアミノ酸を各々 内包する複数の貯蔵器と；Ｃ．該容器及び該貯蔵器及び該システムの残りの部分 に基準圧力を供給するための手段と； Ｄ．所定の連続的に変化し得る体積のガスを該容器から排除するための手段と； Ｆ．該基準圧力と該容器内の圧力との圧力差に応答して前記貯蔵器のうちの１つ から所定体積の選択された溶剤、試薬又はアミノ酸で前記の排除された体積のガ スを置換するための手段とから成ることを特徴とするシステム。 ２．固相ペプチド合成を、未反応ペプチド領の自由アミノ端のために固相に係留 されたペプチド鎖にブロックされたアミノ酸を付加する各付加工程の終了時にモ ニターするための方法であって、 Ａ．共有結合を促進する反応条件下でアミノ基と共有結合するモニタリング剤と 該固相とを反応させる工程と；Ｂ．該固相を洗って、非共有的に束縛されたモニ タリング剤を該固相から除去する工程と； Ｃ．ブロックされたアミノ末端及びペプチド鎖を無傷に保ちながら未反応ペプチ ド鎖のアミノ端から、共有的に束縛されたモニタリング剤を選択的に除去する試 薬と該固相とを反応させる工程と； Ｄ．除去されたモニタリング剤の量を定量的に計測する工程とから成ることを特 徴とする方法。