JPS6345561A - ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、完全な本来の免疫グロブリン又はそのフラグ
メントのような抗体試薬が、酵素に共有連結してなる酵
素標識抗体試薬に関する。特に、本発明は、抗体試薬及
び酵素部分がそれらの本来の結合及び触媒特性を、それ
ぞれ実質的に保持する該標識試薬を製造するための方法
及びカップリング剤に関する。

酵素標識抗体試薬は、主に、抗体試薬部分が関係する抗
原及びハプテンの検出及び測定において多種の用途を有
し、放射性同位元素標識抗体試薬の使用に代わる安全で
便利な代替物を提供する。酵素標識抗体試薬の重要な分
析的用途は酵素イムノアッセイ法である。その方法は、
当業界で周知のように、種々の形式又はプロトコルを取
ることができる。一般に、抗原性又はハプテン様分析対
象物の存在又は量を測定する試験試料は、ｌもしくはそ
れ以上の工程で、最終的に結合種と遊離種の間に分配さ
れる酵素標識成分を含む試薬と−ｇにされる。結合種及
び遊離種のいずれか一方の酵素活性を測定し、試験試料
中の分析対象物の存在又は量と関連づけることができる
。

標識試薬の結合種及び遊離種の物理的分離を必要とする
酵素イムノアッセイは不均一系と称され、米国特許第３
．６５４．０９０号；４．０１６，０４３号；及び米国
再発行特許第３１．００６号に記載されている方法が例
として挙げられる。結合種及び遊離種を物理的に分離せ
ずに行なわれるものは均一系と称され、米国特許第３，
８１７，８３７号及び４，０４３，８７２号の記載が例
として挙げられる。標識抗体試薬を使用する特に有用な
酵素イムノアッセイプロトコ、ルは、免疫学的測定方法
（ｉｍｍｕｎｏ膓ｅｔｒｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）及び
サンドイッチ技法として一般に知られているものである
。

イムノアッセイ以外にも、酵素標識抗体試薬は、抗原性
又はハプテン性を有する物質を検出するどんな分析方法
においても使用される。そのような物質は重要な分析対
象物であってもよく、なんらかの間接的又は中間的な測
定の相互作用によって重要な分析対象物と関連づけられ
るものであってもよい０例としては、組織学的、細胞学
的試料中の抗原の検出及び視覚化、及び、抗原性及びハ
プテン性標識又は核酸のハイブリッド形成試験における
抗原性ハイブリッドの検出がある。後者の測定法として
は、どちらも本譲受人に譲渡されているヨーロッパ特許
公報第１４６，０３９号及び１６３，２２０号明細書に
記載されている方法が例として挙げられる。

上記の方法及び酵素標識抗体試薬の使用はすべて、所望
の酵素及び抗体試薬成分の、必要とされる複合体を都合
よく、また再現性よく製造する能力に依存している。さ
らに、標識試薬の臨界的な特徴は、複合抗体及び酵素部
分のそれぞれの、結合性及び触媒性である０種々の蛋白
質間の結合技術が文献において公知であり、多くのもの
が酵素標識抗体試薬の製造に適用されている。この分野
における最近の研究論文には、Ｐｅｔｅｒｓ及びＲｉｃ
ｈａｒｄｓのＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
　４７：５２３（１９７７）；Ｄａｓ及びＣｏｗのＡｎ
ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、旧ｏｅｎｇ。

８：１８５（１９７９）；　Ｊｉ　のＢｉｏｃｈｅ＋ｓ
、　Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ａｃｔａ５５９：３９　（１９
７９）；及びＣｏｎｎ、　Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ。

１０３：４９（１９８３）がある０代表的な同種二官能
性の連結試薬としては、アミン間のカップリング剤、例
えばジメチルスペルイミデート、ジメチルマロンイミデ
ート及びジメチルスペルイミデートのようなジメチルイ
ミデート類；スペリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳ）及
び酒石酸ジスクシンイミジルのようなビス−Ｎ−オキシ
スクシンイミジルエステル類；及び１，５−ジフルオロ
−２，４−ジニトロベンゼン及び４．４′−ジフルオロ
−３゜３′−ジニトロフェニルスルホンのようなビス−
ニトロフルオロベンゼン類；メルカプトカップリング剤
、例えば１，２−フェニレンジマレイミド及び１．４−
フェニレンジマレイミドのようなどスーマレイミド試ｉ
：Ｎ、Ｎ−エチレンービスーイオドアセトアミドのよう
なビスーイオドアセトアミド類；及び３，６−ビス−（
メルクリメチル）−ジオキサンのようなビス−有機水銀
試薬；４．４′−ジイソチオシフノー２，２′−ジスル
ホン酸及びｐ−フェニレン−ジイソチオシアネート（Ｄ
ＴＩＣ）のような高反応性ジイソチオシアネート類及び
４．４′−ジチオ−ビス−フェニルアジドのようなアリ
ールアジド類が挙げられる。

異種二官能性のカップリング試薬は、概念上上記の化学
的に適合する反応性基を合わせることにより製造される
。一般例としては、４−フルオロ−３−二トロフェニル
アジド（ＦＮＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４
’−アジド−２′−二トロフェニルアミノ）ヘキサノエ
ート　（ＳＡＮＰＡＨ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）及び
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸エステルが挙げられる。

二官能性の試薬に共通する欠点は、湿気に対する感受性
（例えばアジボイミデート、Ｎ−オキシスクシンイミジ
ル（ＮＯ３）エステル及びインチオシアネート試薬）、
又は光に対する感受性（フェニルアジド類）である。数
種の試薬は水溶性に乏しいが、この欠点は、ＤＳ及びＭ
ＢＳのようなＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル
試薬では、Ｎ−３−スルホスクシンイミジルエステル類
縁体の製造による解消されている。また、最も一般的に
用いられる二官能性の試薬のスペーサー腕（ｓｐａｃｅ
ｒ　ａｒｍ）は短かすぎるか又は過度に親油性であり、
それぞれカップリングの効率及び異型性に影響を及ぼす
、さらに、従来のアミン間のカップリング試薬は、一般
に抗体成分が、第一級アミンと反応する試薬により非常
に不活性化されやすいという欠点を有する。

親水性のスペーサー基を介する蛋白質のカップリングは
、Ｌｏｗｅ及びＤｅａｎのＡｆｆｉｎｉｔ７　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏ−ｇｒａｐｈｙ、　Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ
　５ｏｎｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７４）　。

第５章、２００−２５９頁に記載されている。特定の親
水性スペーサー腕は、Ｐｏｒａｔｈｃ））　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｗｏｌ、　３４：２４−２７（１９７４）　−
ｒビス−オキシランカップリング剤Ｊ　　；　　Ｏ’Ｃ
ａｒｒａらｃ７）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

３４：１１８−１１８（１９７４）−ｒ　１　、３−ジ
アミノプロパン−２−オール」　；及び特開昭５８−１
７６５４７号（Ｃ：ｈｅｍ、　Ａｂｓｔｒ、　１００：
４８０８？ｕ）　−ｒポリエチレンゲルコールジアミン
類及びジヒドラジド類」に記載されている。交差結合剤
としての脂肪族ビス−マレイミド類の使用は、Ｌｕｎｄ
ｂａｄ及びＮｏｙｅｓのＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅ
ｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ。

第２巻、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　（Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ
、　ＦＬ　１９８４）、第５章、１２９−１３９頁に記
載されており、特定の試薬の例としては、特開昭５８−
１８３０９４号（Ｃｈｅｗ、　Ａｂｓｔ、　１００：Ｈ
Ｏ９８ｄ）及び特開昭５８−４９８２１号（Ｃｈｅｗ、
　Ａｂｓｔ、　１００：１３５４４１ｙ）；Ｃｏｏｎｅ
ｙらのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ、　２７
（２）＋　１５１−１８８（１９７８）；　）Ｉｅｉｌ
ｗａｎｎ及びＨｏ１ｚｎｅｒの日ＢＲＣＨ：１１４Ｂ（
１９８１）　；及びサトー（Ｓａｔｏ）及びナカオ（Ｎ
ａｋａｏ）のＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９０：１１７？
（ＩＨｌ）に記載されているものが挙げられる。

ビス−マレイミド類は、β−ガラクトシダーゼをはじめ
とする酵素を抗体試薬へ結合させるために使用されてき
た［ヨシタケ（ＹｏＳｈ　ｉ　ｔａｋｅ　）らの５ｃａ
ｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎａｌ、　ＩＱ：８１（１９７
９）１　ｍ　シかし、試用されたものは水性緩衝剤への
溶解性に乏しいため、合成が再現不可能であることが判
明した。ビス−マレイミドポリアルキレングリコール類
は公知であるが、そのような化合物をカップリング剤と
して酵素標識抗体試薬の製造に使用する試みは知られて
いない、しかし、全く関連のない目的には使用されてい
る［特開昭５８−１５５１５号ＣＣｈｅｍ、　Ａｂｇｔ
、　９９ニア１＆２５ｎ）　、特開昭５８−１３６，６
３７号（ＣｈｅＩＩｌ、　Ａｂｓｔ、　１００：１０４
８８８ｖ）及び特開昭５８−４０３７４号（Ｃｈｅｍ。

Ａｂｓｔ、　９９：１２４２０Ｇｋ）参照］。

［発明の概要］ 現在、有利な酵素標識抗体試薬が、蛋白質のメルカプト
基に連結したビス−マレイミドポリアルキレングリコー
ル架橋基を介して、それぞれの蛋白質成分を共有結合的
に連結することにより調製されることが見い出されてい
る。架橋基は、得られた標識試薬に高い水溶性を与え、
抗体及び酵素部分のそれぞれの結合性及び触媒性を実質
的に保持する。さらに、標識試薬の合成は、その他のタ
イプのビス−マレイミドカップリング剤を用いる従来の
試みよりも極めて再現可能が高い。

［好ましい実施態様の説明］ 本発明の酵素標識抗体試薬は、酵素及び抗体部分のそれ
ぞれにおけるメルカプト基を連結するビス−マレイミド
ポリアルキレングリコール架橋基を特徴とする。ポリア
ルキレングリコール残基は、エーテル結合の形態の酸素
によって互いに連結した、少なくとも２つの、好ましく
はそれ以上のアルキレン基を有する直鎖からなることが
理解されるであろう、フルキレン基は置換されうるが、
好ましくは未置換であり、任意数のメチレン単位からな
るが、好ましくは、少なくとも２つの、かつ通常ｌＯ又
はそれ以下の単位１例えばエチレン、プロピレン、ヘキ
シレン等からなる。ポリアルキレングリコール残基は、
同一の又は長さ及び／又は置換の異なるアルキレン繰り
返し単位からなる。１つ又はそれ以上のアルキレン単位
の置換基はいずれも、Ｎうまでもなく、本発明の有利な
性質が実質的に損われないように選択される。当業者は
適切な選択を行なうことが可能であろう０代表的には、
そのような置換基としては、ヒドロキシル、アルコキシ
ル、又は、二基置換されたアミノ成分が挙げられる。

好ましい架橋基は次式： （式中、（Ｓ）は架橋基がそれぞれ共有結合で連結して
いる、抗体試薬及び酵素のメルカプト基を表わし、ｎは
２からＩＯの整数であり、Ｘは１から１，０００の整数
である。）で示される。より好ましくは、ｎは６以下、
最も好ましくは２であり、Ｘは約５０未満、より一般的
には約２０未満、＠も好ましくは１２未満であり、特に
有用な化合物のＸは５である。このタイプの特に好まし
い架橋基のｎとＸの組み合わせは次表から選ばれる； 千十 別のタイプの有用な架橋基は次式： （式中、（Ｓ）は上記で定義した通りであり、ｍは２か
ら１０の整数であり、ｙはＯからｌＯの整数であり、２
はＯからｉ、ｏｏｏの整数である。

より好ましくは、ｍとｙは６以下であり、２は約５０未
満、より一般的には約２０未満、最も好ましくは１２未
満である。）で示される。これらの架橋基において、ポ
リアルキレングリコール鎖は、非対称数の炭素原子で構
成されている。数種の鎖は文献において公知であり、ポ
リアミド及びポリウレタン類の製造に使用される。関連
する分岐鎖は適切なグリコール類から、シアンエチル化
及び還元（例えばＣｈｅｗ、　Ａｂｓｔｒ、　８に４９
２５８ｂ。

Ｃｈｅｒｔｒ、　Ａｂｓｔｒ、　７８：１１１９３４ｎ
、及びＣｈｅＩ！＋、　Ａｂｓｔｒ。

４９：４８５４ｈ）により又は、トシル化／ガブリエル
連続反応により製造される。非対称的なポリアルキレン
グリコールのスペーサー腕のｍ　＋　ｙ＊　Ｚの組み合
わせの例としては、次表より選ばれたものが挙げられる
： ！　　　！　　　ｚ　　　　　　　　　　圀３　　　　
０　　　　　Ｑ　　　　Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔ、７２：１
Ｇ１５５θ３　　　　１　　　　２　　　　Ｃｈｅｍ、
Ａｂｓｔ、４９：３００３３　　　　２　　　　２　　
　　Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔ、７２：１０１５５Ｂ３　　　
　１　　　　４　　　０ｈａｍ、Ａｂｓｔ、８１：４９
２５８Ｅｉ３　　　　　ｔ　　　　　５　　　　Ｃｈｅ
ｍ、Ａｂｓｔ、？２：１０１５５θ所望の複合を達成す
るために必要なビス−マレイミドポリアルキレングリコ
ールのカップリング剤は、従来の合成方法により製造さ
れる。好ましい架橋基（Ａ）からなる標識試薬を製造す
るためのカップリング剤は次のように製造される。

α、ω−ジアミノポリアルキレングリコール誘導体を、
上記した化学技術を用いてグリコール類から製造する。

次に、ジアミンを無水マレイン酸でジアシル化して、対
応するＮ　、　Ｎ　’−ヒスーマレアミド酸中間体を得
る。これらを単離せずに、↑ｒｏｍｍｅ　ｒ及びＨｅｎ
ｄｒｉｃｋ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　１９７３．４８４）
により述べられているように、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾールとジシクロへキシルカルボジイミドを用いて
、所望のビス−マレイミド誘導体に辺比させる。

本発明による酵素で標識されうる抗体試薬は、活性抗体
結合部位とカップリング反応に利用可能なメルカプト基
からなる、いかなる全免疫グロブリン又はそのフラグメ
ント、凝集体、誘導体もしくは変種であってもよい。全
免疫グロブリンの形態である場合、いかなる公知の種及
び亜種、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ等にも属することができ
る。それぞれの抗原又はハプテンに特異的結合親和力を
保持する該免疫グロブリンのいかなるフラグメント、例
えば、通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａ　ｂ　’）　
２と称されるＩｇＧのフラグメントもまた使用すること
ができる。さらに、該免疫グロブリン又はフラグメント
の凝集体、ポリマー、誘導体及びその他のいかなる化学
物質又はその他の変種もまた、適当な場合に使用するこ
とができる。

抗体試薬の免疫グロブリン源は、通常の抗血清及びモノ
クローナル技法のようなどのような使用可能な方法によ
っても得られる。抗血清は、マウス、ウサギ、モルモッ
ト又はヤギのような宿王の動物を適切な免疫原で免疫化
することを包含する、十分に確立された技法により得ら
れる。免疫グロブリンは、リンパ球などを作る抗体の体
細胞のハイブリッド形成により得られるハイブリドーマ
の分泌物からも得られ、一般に、そのような免疫グロブ
リンはモノクローナル抗体と称される。抗体試薬が結合
する抗原又はハプテンによって、本発明が限定されない
ことは明らかである。

言うまでもなく、抗体試薬は、カップリング反応を起こ
すために少なくとも１つの利用可能なメルカプト基を有
する。１又は複数のそのようなメルカプト基は、本来の
抗体試薬中に存在しても、又は合成的に導入されていて
もよい、ＩｇＧのＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２
フラグメントは、天然免疫グロブリン中のジスルフィド
架橋を還元して得られる利用可能なメルカプト基を有す
る。メルカプト基を全抗体のような蛋白質に合成的に導
入するために、従来の数種の方法が使用できる。全抗体
−酵素複合体の製造方法が、最近イシカワ（Ｉｓｈｉｋ
ａｗａ）及び協力者らにより報告されている［Ｊ、　Ｉ
ｍｍｎｏａｓｓａｙ　４：２０９（１９８３）　］　、
これらの方法の１つにおいては、無水Ｓ−アセチルメル
カプトコハク酸を用いてチオール基をウサギＩｇＧに導
入する０次に、チオール基を脱保護化し、マレイミド−
活性化酵素に結合せしめる。一方、ウサギＩｇＧをメル
カプトエチルアミンで、ヒンジ部において還元し、Ｎ−
Ｎ　’−０−フェニレンジマレイミドで処理し、本来の
β−ガラクトシダーゼに結合せしめる。この手順の逆、
即ち還元されたＩｇＧとマレイミド−活性化β−ガラク
トシダーゼとのカップリングも用いることができる。

利用可能なメルカプト基を含有するが又は合成的に導入
しうるちのであれば、本質的にはいかなる酵素も本発明
による抗体試薬を標識するために用いることができる。

メルカプト基の合成的導入は上記と同様にして達成され
る。使用しうる酵素のほんの数種の例としては、西洋わ
さび（ホースラデイツシュ）ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げら
れる。その安定性、高転換性及び測定の容易性故に、所
望の酵素標識が、β−ガラクトシダーゼである場合、本
発明は特に有用である。

適切などスーマレイミドポリアルキレングリコールカッ
プリング剤と酵素標識及び抗体試薬とのカップリングは
、任意の順序の工程で、また適切に選ばれた条件下で進
行せしめることができる０通常、酵素及び抗体試薬の１
方がカップリング剤との反応により活性化され、未反応
物質から単離された後、活性化された成分が、酵素及び
抗体試薬のもう一方に結合する。カップリング剤に対し
て適当に過剰量の活性化すべき物質、即ち酵素又は抗体
試薬を用いることにより、分子間架橋物質の著しい生成
が避けられる。

活性化及びカップリング反応は、通常、温和な条件下で
、例えばほぼ中性のＰＨ及び室温下で、適度の熟成時間
、例えば活性化反応に１時間またカップリング反応に２
４時間までの時間をかけて行なわ・れる０条件とインキ
ュベーション時間は所望により広い範囲で変更すること
ができる。活性化された中間体及びｉ終的な酵素標識抗
体試薬の分離は、任意の手段、通常クロマトグラフィー
により得ることができる。ビス−マレイミドカップリン
グ剤は、上記記載の架橋基を生ぜしめるものから選ばれ
る。好ましいカップリング剤は次式： （式中、ｎ及びＸは前述した通りである。）で示される
。

得られた酵素標識抗体試薬は、当業界で公知の、また今
後開発される分析及びその他の方法のいずれにおいても
有用であろう、該試薬は上記で述べたようなイムノアッ
セイ、及び、分析される、又は重要な分析対象物に関連
する、特定の抗原又はハプテンの検出を必要とするその
他の方法、例えば標識プローブ又はハイブリッドの免疫
化学的検出を包含する核酸のハイブリッド形成において
特に有用であろう、有利な水溶性、及び、高い免疫反応
性及び酵素活性故に１本発明の試薬はこれらの分析方法
において特に有用となる。

ここで本発明を以下の実施例により説明するが、本発明
を限定するものではない。

［実施例］ β−Ｄ−ガラクトシダーゼとＦａｂ’抗体フラグメント
の複合体を製造し、核酸のハイブリッド形成測定法で生
成したＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドの検出に使用して、
尿中のバクテリアの存在を測定した。

二　　　カープリング 脱水したテトラ上１０フラン２０−中に、１゜１７−ジ
アミツー３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘプタ
デカン［ＫｅｒｎらのＭａｋｒｏｍｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　１８０：２５３９（１９７９）１２　、８
０　ｇ　（１０ミリモル）を含有する溶液を、テトラヒ
ドロフラン２０−中に、無水マレイン酸４．５０ｇ（４
５ミリモル）を含有する撹拌された溶液に１時間かけて
滴下した０反応の過程で沈泥様の沈殿物が認められた。

１時間後、反応混合物を濾過し、炉液を真空下（１２ｍ
ｍＨｇ、続いて０　、２ｍａ＋Ｈｇ）　５０℃で、油状
物に濃縮した。ビス−マレアミン酸中間体を含有する黄
色の粗ベース）６．３４ｇを得た０次に、この残留物を
、ヒドロキシベンゾトリアゾールの水利物２．９７ｇ（
２２ミリモル）で処理し、脱水したジメチルホルムアミ
ド（Ｄ　Ｍ　Ｆ）２０−に溶解した。この溶液を真空下
で蒸発させた。残留物を０ＭＦ２０−に２回溶解し、蒸
発させた０次にその残留物を不活性雰囲気下に置き、０
ＭＦ２０−に溶解し、０℃に冷却し、ジシクロへキシル
カルボジイミド４．５４ｇ（２２ミリモル）で処理した
。得られた混合物を０℃で１時間、次に雰囲気温度で一
晩撹拌した。得られた暗かっ色の混合物を濾過し濃縮し
て、暗かっ色の粗油状物５．６２ｇを得た。１％ＣＨ，
０Ｈ−ＣＨＣ文３溶媒混合物を用い、３００ｇのＳｉＯ
□−６０（２３０−４００メツシユ、米国、ニューシャ
ーシー州、チェリーヒルのＥ、　Ｍ。

５ｃｉｅｎｃｅ社製）上で、フラッシュクロマトグラフ
ィーによって試料を精製した０部分的に精製された生成
物を含有する画分を貯留し、濃縮して、黄色の油状物２
．７６ｇを得た。同じ溶媒混合物を用イ、２００ｇのＳ
　ｔｏ２−６０上で、再び試料にフラッシュクロマトグ
ラフィーを行ない、１．１７−ジマレイミドー３．６，
９，１２゜１５−ペンタオキサヘプタデカンの純生成物
を１．６２ｇの油状物として得た（収率３７％）。

Ｃ２Ｄ　Ｈｎ　８２　０９の分析 計算値　　　　　　　　　：　Ｃ，５４，５３；　Ｈ。

６．４１；Ｎ、　８．３８ 実測値　　　　　　　　　：　Ｃ，５４，９８；　Ｈ。

８．２８；　Ｎ、６．４８ ＰＭＲ（８０ＭＨｚ）　　ＣＤＣｌ３δ　：　３．８３
　（ｓ、　ｌ０Ｈ）；３．７０　（ｓ、　＋４Ｈ）； ８．７０　（ｓ、　４Ｈ） ｆＲ（ＣＨＣ：１３）　ｃ＋＋−’　　　　　：　２Ｂ
８０．１７１０゜１４０５．１１００ｃｍ’ 質量スペクトル（ＦＡＢ）　ｙｒ／ｅ：　４４１　（Ｍ
＋１．５Ｈ）。

β−ガラクトシダーゼをＦｏｗｌｅｒの方法［Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔｍ、　２５８：１４３５４（１９
８３）　］により製造し、５０％硫酸アンモニウム懸濁
液として保存した。酵素懸濁液の一部を取出してこれを
遠心分離し、ペレットをＮａ０文０．１５Ｍを含むＰＨ
７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。

ジチオトレイトールを２ｍＭの最終濃縮物に加え、２５
℃で４時間インキュベートした後、ＮａＣｌ０．１５Ｍ
、！：ＥＤＴＡ１ｍＭを含むＰＨ７，０の０．１Ｍリン
酸ナトリウム中で、ＢｉｏＧｅｌＰ６−ＤＧカラム（米
国、カリフォルニア州、リッチモンドのＢｉｏ−Ｒａｄ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）上で、混合物にクロ
マトグラフを行なった。メルカプトの含有量は、酵素１
モルにつき９．１−１０．４モルであった０次に、還元
したβ−ガラクトシダーゼを、ＮａＣｕＯ，１５ＭとＥ
ＤＴＡｌｍＭを含むｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液中で、上記で述べたように新たに製造した２
００倍モル過剰の１．１７−ジマレイミドー３．６，９
，１２．１５−ペンタオキサヘプタデカンと室温で１時
間反応させた。同様の緩衝液を用いＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　
６−　Ｄ　Ｇ上で、得られたマレイミド−β−ガラクト
シダーゼにクロマトグラフィーを行ない、直ちにＦａｂ
’とのカップリングに用いた。活性化されたβ−ガラク
トシダーゼのマレイミド含有量は、酵素誘導体の１部と
過剰のグルタチオンを反応させ、その過剰のグルタチオ
ンをＥｌ１ｍａｎ試薬［Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
　２５：４５７（１９７２）］で測定することにより決
定された。マレイミド含有量は、酵素１モルにつき８．
９−１０．５モルであった。

Ｆａｂ’抗体フラグメントを次の様にして製造した。Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対するマウスのモノクロー
ナルＩｇＧを、ＢｏｇｕｓｌａｗｓｋｉらのＪ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　８９：１２３（１９８５）
に記載されているように製造した。　ｐ）１４　、２の
０．１Ｍ酢酸ナトリウム中で、ＩｇＧに対し１：３３の
重量比のペプシンで３７℃で１６時間消化することによ
りＦ（ａｂ’）２を得た［　Ｌａｍｏｙ　ｉ及びＮ１５
ｏｎａｆｆ、Ｊ、　Ｉｍ＋ｗｕｎｏ１．　Ｎｅｔｈ、　
５ｆｌ：２３５（１９８３）］　、　Ｎ　ａ　Ｃ文０．
１５Ｍを含むｐＨ６、０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液中で、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　ｓ　−２００（米国、
ニューシャーシー州、ビスキャタウェイのＰｈａ　ｒｍ
ａｃ　ｉａ社製）カラム上で、消化生成物にクロマトグ
ラフィーを行なった。

０Ｆ（ａｂ’）２の一部をジクロロトリアジニルアミノ
フルオレセイン（ＤＴＡＦ）（米国、モンタナ州、セン
トルイスのＳｉｇ＋ｓａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

製）でＷ″ｉ＠して、複合体の製造における抗体トレー
サーとして使用した＊　Ｆ　（ａ　ｂ　’）　２に対し
３；１のモル比のＤＴＡＦを用い、ＰＨ９、０の０．１
Ｍ［酸ナトリウム緩衝液中で、標識反応を１時間行なっ
た［ＢＩａｋｅｓｌｅｅ及びＢａ１ｎｅＳ）Ｊ。

Ｉｌｌｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　１３：３０５（１９
７Ｂ）］　、標識抗体をＢｉｏＧｅｌＰ　６−　Ｄ　Ｇ
カラム上で遊離ＤＴＡＦから分離した。実験的に引き出
した式から計算したＤＴＡＦ／Ｆ（ａｂ′）２のモル比
は２．１であった［Ｔｈｅ及びＦｅｌｔｋａｍｐのＩｍ
ｍｕｎｏｌ、　１８：８８５（１９７０）コ　。

Ｆ（ａｂ’）２を２０：１の割合でＤＡＴＦ−Ｆ（ａｂ
’）　　と混合し、ＮａＣ交０．１５Ｍ、ＥＤＴＡｆｍ
Ｍ、ジチオトレイトール１０ｍＭを含むｐ）１７．０の
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でＦａｂ’に還元し
た。還元は室温で３時間行なった。ＮａＣｌ０．１５Ｍ
、ＥＤＴＡｌｍＭを含むＰＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム中、ＢｉｏＧｅｔ　Ｐ　６−　Ｄ　Ｇカラム上
でＦａｂ’を単離し、直ちに上記記載の様に製造したマ
レイミド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼへのカップリング
に使用した。Ｅｌ１ｍａｎ法［Ｎａｔｈ、　Ｅｎｚ７ｍ
ｏ１．２５：４５７（１９７２月により測定されたＦａ
ｂ’のメルカプト含有量は、Ｆａｂ’１モルにつきメル
カプト２．５−３．０モルであった。

マレイミド−β−ガラクトシダーゼを１＝５のモル比で
Ｆａｂ’と混合した。マレイミド−β−ガラクトシダー
ゼの最終濃縮物は１．５ｇＭであり、Ｆａｂ　’の最終
濃縮物は７．５ＪＬＭであった。結合反応を５℃で２２
時間撹拌しながら行なった。多少の凝集物質が生成され
、遠心分離により除去された。ＮａＣｆＬｏ、１５Ｍを
含むｐＨ６，０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、
ＢｉｏＧｅｌＡ　−１、５ｍ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）
カラム上で、上澄み液にクロマトグラフィーを行なった
。４９２ｎｍの勤先と５１２ｍｍの発光を用いて、１８
０ｎａ＋における吸収とＤＴＡＦ−Ｆａｂ’の蛍光に関
して、各両分を調べた。酵素活性と蛍光を示した両分は
複合体を含有していた。それらを貯留し、ＮａＣＪＩｏ
、１５Ｍ、Ｏ，１％ＮａＮ３゜ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）ｌｆｆｉｇ／ｄ、５０％グリセリンを含むｐＨ７
、０の０．１Ｍリン酸ナトリウム中で一１５°Ｃで保存
した。酵素活性と蛍光の検出に基づくと、複合体は酵素
１モルにつき４．１モルのＦａｂ　’を含有していた。

隻改立上】 リポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃａｌｉ）から製造し、１６ｓ及び２
３Ｓ成分を密度勾配遠心分離により分離した［タカナミ
　（Ｔａｋａｎａｍｉ）　ノＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｎｏ
ｌ。

１２Ａ：４９１（１９８７）；　ＭｃＣｏｎｋｅｙ　（
７）Ｍｅｔｈ、　Ｅｒ＋ｚｙｍｏｌ。

１２Ａ：１１７０（１９Ｂ？）］。

サケ精子ＤＮＡ中のＲＮＡ　（米国、ニューシャーシー
州、ピスキャタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａ製）の極微
量を０．３ＭのＮａＯＨに溶解した〜５ｍｇのＤＮＡ／
−の溶液を３７℃で１６時間インキュベートすることに
より減成した。この溶液を３０％酢酸で中和し、ＤＮＡ
を冷却したエタノールで沈殿させた。ＥＤＴＡｏ　、４
ｍＭを含むＰＨ７，４の２０ｍＭリン酸ナトリウムにＤ
ＮＡを溶解した。

標準的な方法［Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ、　Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９８２）］　を用いて、２３３　
　ｒＲＮＡ遺伝子を含む制限フラグメントを大腸菌と枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からＭ１３
ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９［Ｎｏｒｒａｎａｎｄｅｒ　
らのＧｅｎｅ　２６：１０１（１９８３）ｌヘクローン
化することによりＤＮＡプローブを製造した。制限エン
ドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＳｍａ　Ｉで消化すること
により、ＰＮＯ１３０１［Ｊ　１ｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｏｎらのＣｅ１ｌ　３３：８８５（１９８３）］から
大大腸菌３Ｓ　　ｒＲＮＡ遺伝子を含む３．２キロベー
スのＤＮＡフラグメントを得た。得られたフラグメント
を予めＸ　ｂ　ａ　Ｉ及びＳｍａＩで消化されたＭ１３
ベクターにクローン化した。制限エンドヌクレアーゼＢ
ａｍ）（Ｉ及びＳｍａｌで消化することにより、ｐ　１
４　Ｂ　１　［ＳｔｅｗａｒｔらのＧｅｎｅ１９：１５
３（Ｉｎ２）］から３分の２の枯草菌２３ＳｒＲＮＡ遺
伝子を含む１．０キロベースのＤＮＡフラグメントを得
た。得られたフラグメントをＭ　３５　ｍ　ｐ　１８の
同一の制限部位にクローン化した。

ポリエチレングリコール沈殿によって、感染した培養の
上澄み液からバクテリオファージの粒子を回収し［ヤマ
モト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）及びＡｌｂｅｒｔｓのＶｉｒ
ｏｌｏｇ７４０ニア３４（１９６０）］、一本鎖ビリオ
ンＤＮＡをフェノール抽出によって精製した後、上記の
ようなアルカリ処理を行なった。精製されたＤＮＡをＥ
ＤＴＡｌｍＭを含むＰＨ６、５の１０ｍＭ）リス・ＨＣ
文中で保存した。

ノ　　ナイロンビーズへのプローブＤＮＡ但 ＭｏｒｒｉｓらのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１４７：５
９３（１９７５）に記載されている方法を修正した方法
を用いて、第一級アミン基をナイロンビーズ（米国、イ
リノイ州、シカゴのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉ
ｃ　Ｂａ１１社製）上に導入した。その方法はナイロン
ポリマーとテトラフルオロ硼酸トリメチルオキソニウム
との、及びその後の１．６−ヘキサンジアミンとの反応
毫包含する。変性ビーズは、ポリマー内にアミジン基に
結合した第一級アミンを含有する。

直径４．８ｍｍのナイロンビーズ１００個を変性させる
方法は次の通りである。真空下８０℃でベータしてビー
ズを完全に乾燥させた。それらを無水塩化メチレン３０
−とともに１２５−のフラスコに入れ、テトラフルオロ
硼酸トリメチルオキソニウムを加えた。溶媒上に浮遊し
たビーズを激しく撹拌した。その撹拌はまた、溶媒に部
分的にしか溶解しないテトラフルオロ硼酸トリメチルオ
キソニウムの溶解も容易にした。３０分後、ビーズと溶
媒をガラス製漏斗に注ぎ、そこでビーズが捕捉され、溶
解しなかったテトラフルオロ硼酸トリメチルオキソニウ
ムとともに溶媒を流出させた。ビーズを溶媒で２度すす
ぎ、速やかに１，６−ヘキサジアミン０．３６ｇを含む
溶媒３〇−中に入れた。混合物を４〜５時間激しく撹拌
した。溶媒を上記のように漏斗で除去し、ビーズを溶媒
で一度すすぎ、次に蒸留水ですすいだ、少なくとも一晩
、３度水（各５００ａＪ）を取り換えてビーズを振盪し
た後、真空下で乾燥させた（４０−５０℃）。

アミノアミジンナイロンビーズを丸底フラスコに入れ、
ＥＤＴＡｌ、Ｏミルモルを含むｐＨ７，４の、最少量の
５０ミルモルリン酸ナトリウム緩衝液で浸漬せしめた。

ビーズ１個につき２．ｏ＝ＨのプローブＤＮＡを加え、
混合物を５０’０で６〜８時間振盪した。ビーズ１個に
つき５０ＩＬｇのサケ精子ＤＮＡを加え、５０℃での振
盪を６〜８時間続けた。

ビーズから液体を除去し、ホルムアミド４部と１０ＸＳ
ＳＰＥ６部、０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシルスルホン
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、サケ精子ＤＮＡ０．１履ｇ／
ＰＪ、並びに、ウシアルブミン、ポリビニルピロリドン
及びＦｉｃｏｌｌ　（米国、ニューシャーシー州、ピス
キャタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａ製）各１．０＋ｗｇ
／−からなるハイブリッド形成溶液中で５５℃で１７時
間ビーズを振盪した。５ＳＰＥは、ＮａＣ１０，１５Ｍ
とＥＤＴＡｌｍＭを含むｐＨ７、８の１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液である。この後、ビーズ１個につき０　
、５ｍｌのｌＸ５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでビーズを２
度すすいだ。

住 標準の目盛りを定めた接種ループを用いて、５％ヒツジ
血液／　ＭａｃＣａｎｋｅＹ寒天パイプレート（ｂｊｐ
ｌａｔａｓ）　　（米国、ニュー−ｔ−り州、クランド
アイランドのＧｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
製）でトリプシンのダイズ寒天上に部分標本を平板培養
することによって、臨床用尿試料中の生存しうる微生物
の定量を行なった。平板培地を３７℃で１８時間から２
４時間インキュベートした。

ハイブリードｌ　′号　・ 尿中のバクテリアからのｒＲＮＡのハイブリッド形成の
ために、尿の部分標本０．５４を遠心分離し、ペレット
を、ＥＤＴＡｌｍＭ、１ｒｓｌにつき２００ｐｇのリソ
チーム及び１−につき２５μｇのリソスタフ　イア　（
ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）を含むｐＨ８、０の５０ｍＭ
）リスーＨＣ文緩衝液３３ル文中に懸濁させた。混合物
を３７℃で１０分間インキュベートし、次に、ハイブリ
ッド形成溶液（この溶液の成分は上記の濃度の１．２８
倍であった）１１７牌交とアミノアミジンナイロンビー
ズヲ固定化されたプローブとともに加えた。精製された
ｒＲＮＡを使用した実験では、１×ハイブリッド形成溶
液１５０ｇＪｌ中でビーズと配合した。どちらの場合に
おいても、混合物を５５℃で、別の時間が指示されてい
ない限り一晩振盪した０次に、ビーズを室温で２度、５
５℃で３０分、さらに室温で１度、ｌＸ５ＳＰＥと０．
１％ＳＤＳ各０．５−で洗浄した。ピース上に形成され
たハイブリッドを、以下に述べるイムノアッセイ法のう
ちの１つにより測定した。

ＤＮＡ　：　ＲＮＡハイプツトに関して測定されるビー
ズを、１ｍｌあたり５ｍｇのＢ　Ｓ　Ａ　、　Ｍ　ｇ　
Ｃｌ　２５．０ｍＭ、及びβ−ガラクトシダーゼ−抗Ｄ
ＮＡ　：　ＲＮＡ複合体１１００ｎを含む０．５％（Ｖ
／Ｖ）　　τｗｅｅｎ２０　（ＰＢＭＴ）を含むｐ）！
７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１５０ＩＬ立
とともに６０分間振盪した０次に、溶液を除去し、０．
５ＭＮａＣＪｌを含むＰＢＭＴ各０．５４でビーズを３
度洗浄した。各ビーズを、Ｍ　ｇ　ＣｆＬ２５　ｍ　Ｍ
及び０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノミド
３ｍＭを含むｐＨ７、４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液とともに３７℃で３０分間インキュベートすること
により、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。Ｏ，
１ＭＮａ２Ｃｏ３１．８ｗＪを加えて酵素反応を停止し
た。４０５ｎｍでの吸収を記録した。

イムノアッセイによりハイブリッド形成の経吟試験を行
ない、生成されたＤＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドの量
を測定した。固定化されたプローブＤＮＡを有するビー
ズを、ハイブリッド形成溶液中でビーズ１個につき１．
Ｏｎｇ＋７）２３ＳｒＲＮＡとともに５５°Ｃでインキ
ュベートした。指示された時間にビーズを取り除き洗浄
した。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、及び、アルカリホ
スファターゼに結合した抗マウスＩｇＧに対するモノク
ローナル抗体を用いて、生成されたＤＮＡ　：ＲＮＡハ
イブリッドの量を測定した。その結果、ハイブリッド形
成は１５〜２０時間で完了したことが示された。

ハイブリード／　によ　バ　テリアの 種々の濃度の大腸菌細胞の溶解産物を、プローブＤＮＡ
を含むビーズで、ハイブリッド化すると、イムノアッセ
イの応答は溶解産物の添加量とともに線状に増加した。

ｒＲＮＡ配列は細菌種間で逆になるが、ダラム陰性バク
テリアとグラム陽性バクテリアに対して同様の感受性を
与えるためには、大腸菌と枯草菌の両方から誘導された
ｒＲＮＡプローブを組み合わせて使用しなければならな
いことが判明した。尿路感染に通常認められる種々のバ
クテリアの培養物を平板培養して細胞数を測定し、ハイ
ブリッド形成の測定において溶解産物の一部を取りその
試験を行なった。下記の表中の結果は、該測定が同様の
感受性を有する全種を検出したことを示している。

２３Ｓ　　ｒＲＮＡのハイブリッド形成による種々のバ
クテリア検出に関する感受性吸収 ユｌ」Ｌ去７　　　　　　　　　　　　　　１立り二〇
大陽菌　　　　　　　　　　　　　　０．４４３緑購菌
　　　　　　　　　　　　　　０．４８Ｂ肺炎杆菌　　
　　　　　　　　　　　０．４！３９黄色ブドウ球菌　
　　　　　　　　　０．４９７表皮ブドウ球菌　　　　
　　　　　　　０．４５Ｓ腸球菌ｓｐ、　　　　　　　
　　　　　　　０．４３Ｓ各種の溶解産物を固定化され
たＤＮＡプローブで、５．０００細胞当量でハイブリッ
ド化し、β−ガラグトシダーゼー抗ＤＮＡ：　ＲＮＡ複
合体を用いてイムノアッセイの応答を測定した。

上に示した結果は、固定化されたＤＮＡプローブによる
、試料２３ＳｒＲＮＡの／Ｘイブリッド形成により比較
的少数のバクテリアが検出されうること、したがって細
菌尿検出方法の予＠評価を試みなかったことを示してい
る。５４の臨床用尿をすべてハイブリッド形成により、
また、感染の表示として１４につき≧１０’のコロニー
形成単位を用いた標準培養方法により調べた。培養と比
較すると、ハイブリッド形成では、偽陰性結果は１例（
１，９％）、偽陽性結果は５例（９，３％）であった。

以上が本発明の詳細な説明及び実施例である。明らかに
、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、多くのそ
の他の修正及び変形を行なうことが可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体試薬と、メルカプト（スルフヒドリル）基に共
   有結合したビス−マレイミドポリアルキレングリコール
   架橋基を介して該抗体試薬に共有結合した酵素からなる
   酵素標識抗体試薬。 ２、該架橋基が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（Ｓ）はそれぞれ、架橋基が共有連結している
   抗体試薬及び酵素におけるメルカプト基を表わし、ｎは
   ２から１０の整数であり、ｘは１から１，０００の整数
   である、） で示される特許請求の範囲第１項記載の標識試薬。 ３、ｘが１から１２の整数である特許請求の範囲第２項
   記載の標識試薬。 ４、ｎが２である特許請求の範囲第３項記載の標識試薬
   。 ５、ｘが５である特許請求の範囲第４項記載の標識試薬
   。 ６、抗体試薬がＩｇＧ又はそのフラグメン トである特許請求の範囲第１項記載の標識試薬。 ７、抗体試薬がＩｇＧのＦａｂ又はＦａｂ′のフラグメ
   ントである特許請求の範囲第１項記載の標識試薬。 ８、酵素がβ−ガラクトシダーゼである特許請求の範囲
   第１項記載の標識試薬。 ９、架橋基が連結している該メルカプト基が、抗体試薬
   及び酵素本来の基である特許請求の範囲第１項記載の標
   識試薬。 １０、架橋基が連結している一方の又は両方の該メルカ
   プト基が、抗体試薬および酵素の一方又は両方に合成的
   に導入されている特許請求の範囲第１項記載の標識試薬
   。 １１、抗体試薬に結合しうる抗原又はハプテンを検出す
   るイムノアッセイにおける特許請求の範囲第１項記載の
   酵素標識抗体試薬の使用。 １２、（ａ）利用可能なメルカプト基を有する酵素又は
   抗体試薬の一方をビス−マレイミドポリアルキレングリ
   コール架橋化合物と反応させ、得られた活性化生成物を
   単離し； （ｂ）活性化生成物を、利用可能なメルカプト基を有す
   る該酵素又は抗体試薬のもう一方と反応させ、得られた
   酵素標識抗体試薬を単離することを特徴とする酵素標識
   抗体試薬の製造方法。 １３、該架橋化合物が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは２から１０の整数であり、ｘは１から１，
   ０００の整数である。） で示される特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ｘが１から１２の整数である特許請求の範囲第１
   ３項記載の方法。 １５、ｎが２である特許請求の範囲第１４項記載の方法
   。 １６、ｘが５である特許請求の範囲第１５項記載の方法
   。 １７、抗体試薬がＩｇＧ又はそのフラグメントである特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １８、抗体試薬がＩｇＧのＦａｂ又はＦａｂ′フラグメ
   ントである特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、酵素がβ−ガラクトシダーゼである特許請求の範
   囲第１２項記載の方法。 ２０、該メルカプト基が、抗体試薬及び酵素本来の基で
   ある特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２１、一方の又は両方の該メルカプト基が、抗体試薬お
   よび酵素の一方又は両方に合成的に導入されている特許
   請求の範囲第１２項記載の方法。