JPS6344890A - 糸状菌の発現システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 宿主細胞の遺伝子型又は表現型における変化をもたらす
、機能的な１）ＮＡ　Ｋ工り広範囲の種類の細胞を形質
転換するための能力が、広範囲の種類のタン／ぐり質な
産生することに実質的な機会を提供して来た。多くの哺
乳類のタンパク質が、単細胞微生物、たとえば細菌及び
酵母において産生されるにつれて、そのようなタンノ４
り質が報告されて来た。細菌及び酵母は、異種タンパク
質の産生のために多くの所望とする特性を有するが、こ
れらの生物はまた多くの欠点をも有する。多くの異種タ
ン／４り質に存在する問題の１つは、正しいプロセシン
グ及び折りたたみである。プロセシングは多くの異なっ
た変性の形を取ることができる。グリコジル化、末端ア
ミノアシル化、エキソペプチダーゼ及びエンドペプチダ
ーゼによるペプチド結合の切断、ヒドロキシル化及び同
様のものがプロセシングに含まれる。

上記プロセシングの他に１細胞周辺腔への、細胞膜への
、又は培地へのペプチドの移行に関与され得る種々のシ
グナルリーダーが使用され得る。

プロセシングに関する他に、折りたたみ及び封入体の変
形に関することも存在する。しばしば、産生される対象
のタンパク質が比較的多量に産生される場合、再生され
にくい封入体が得られ、そして生成物の損失、活性の損
失及び変性されたタンパク質を含まない活性物質の単離
の困難さ金もたらす。

従って、タンパク質の産生のために新規システムを開発
することに興味が存在する。おのおのの場合、そのシス
テムは、経済的条件下で宿主を増殖する能力、生理学的
に活性なタンパク質が産生される効率及びその産生物が
宿主又は栄養培地から単離され得る容易さに関係される
べきである。

からのミトコンドリアに見出された新規プラスミドの特
性を記載する。Ｃａ５ｅｓなど、　ｅ　Ｐｒｏｅ。

（１９８２）７９：３６４１〜３６４５はそれぞれＮ、
クレサ及びポドスボラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）のノＡイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを用いて形質転換を記載する
。Ｋｅｌｌｙ　ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ　、ＥＭＢＯＪ　（
１９８５）東＝４７５〜４７９は、Ａ、ニジュランス（
Ａ。

ｎ１ｄｕｌａｎｓ）のａｍｄ　Ｓ遺伝子を用いてん　ミ
Ｌ二（Δ、リエ証）の形質転換を報告する。Ｐａ１ｅｔ
ｔａａｎｄ　Ｍａｒｚｌｕｆ　＊　Ｍｏｌ、　ａｎｄ　
Ｃｓ＋１１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８５）５：１５５４〜１５５９は、細菌の配列が
凡　クレサを形質転換するために必要とされないことを
報告する。Ｎｕｎｂ＠ｒｇ　・ｆｘ　ｈ　、　ｅＭｏ　
ｌ　。

駐車」１μ工１り工、（１９８４）±：２３０β〜２３
１５（引用によって本明細書に組込まれている）は、Ａ
、　　Ｌ２玉」（Ａ、　ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミ
ラーゼ遺伝子のクローニングを例示し、そしてＢｏｓｌ
、至ｇ　、　−ＥＭＢＯＪ、（１９８４）　３　：　１
５８１〜１５８３は、Ａ、ニガーのグルコアミラーゼ遺
伝子における２種の介在配列を記載する。Ｎ、りＶ４ｊ
　ａｍ　　（ＮＡＤＰ−特異性のグルタミン酸デヒドロ
ｒナーゼ）遺伝子を含む２．７Ｋｂのｒツムフラグメン
トのヌクレオチド配列がＫｉｎｎａｉｒｄ　ａｎｄＦｉ
ｎｅｈａｍ　ａ　Ｇｅｎ５（１９８３）　２６　：　２
５３〜２６０によって報告され、そして二遺伝子座での
不安定な突然変異遺伝子がＲｒ、ｍｂｏｓｅｋ　ａｎｄ
Ｋｉｎｓｓｙｓ旦ａｎｓ（１９８４）旦：１０１〜１０
７によって報告される。Ｈｕｇｈｅｓ　＊など、　ｔ　
ｐｒｏｅＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ
、Ａ、（１９８３）　８旦：１０５３〜１０５７は、機
能的なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ酵素（Ｔ
ｎ９０３から得られた）をＮ、えとヱ中に産生すること
に関連する困難さを記載する。

発明の要約 糸状菌において機能的な転写及び翻訳開始領域、シグナ
ルリーダー又は分泌リーダー配列及び場合によってはプ
ロセシングシグナルの少なくとも一部、対象のタンパク
質をコードする読み取り枠又は該読み取り枠の挿入のた
めの１又はそれよりも多くの制限部位及び翻訳終結シグ
ナルを含んでもよく又は含むことができない転写終結領
域を、転写の方向に含んで成る、ペプチドの分泌のため
の発現カセットを含有するハイブリッドＤＮＡ構成体が
提供される。その構成体は、該構成体が宿主中に組込ま
れる条件下で糸状菌宿主中に導入される。

次に、その宿主が増殖され、そして分泌された生成物が
単離され、そして精製される。

特定の態様の記載 新規ＤＮＡ構成体が、対象のタンノ９り質の発現及び分
泌のために糸状菌宿主において使用される。

その構成体は、安定した染色体外要素を使用す２か又は
糸状菌宿主細胞のゲノム中への該構成体の組込み、特に
多重組込みを提供するかいづれかによって、糸状菌宿主
に安定して保持される。

対照の発現構成体は、転写のために、５’−３’のコー
ド又はセンス鎖、転写及び翻訳開始領域、シグナルリー
ダー（糸状菌において機能的な、天然に存在するシグナ
ルリーダーのすべて又は一部である）及び場合によって
はプロセシングシグナル、対照のタンパク質又は該シグ
ナルリーダーと天然において関連される読み取り枠より
も他の対照のタンＡ／り質をコードする読み取り枠の挿
入のための１又はそれよりも多くの制限部位及び糸状菌
において機能的な転写終結領域（場合によってはその５
′末端で翻訳停止シグナルを含む）を有するでおろう。

転写開始領域は広範囲の種類の源、すなわち発現宿主に
対して内因性又は外因性の源に由来する。

従って、宿主と同じ又は異なった糸状菌に対して内因性
である開始領域が好ましいだろうけれども、菌宿主にお
いて機能的であるいづれかの翻訳及び転写開始領域も使
用され得る。開始領域は構成的又は誘導的であり、その
結果、連続した又は調節された転写が得られる。転写開
始領域は、ウィルス、糸状菌又は他の源から得られる。

例示的な転写開始領域は、グルコアミラーゼ遺伝子、グ
ルタミン酸デヒドロｒナーゼ遺伝子、β−チューブリン
遺伝子、解糖遺伝子、たとえばグリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロｒナーゼ、及び同様のものに関連する
これらの領域を含む。これらの遺伝子は、アスペルギラ
ス、色久三王ｆｌ・（Ｎｅｕｒｏｓ　ｏｒａ）＊　７サ
リウＡ　（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Ｓ等のような属の種々の
種から得られる。この属の間の種は１ｙ、乙之ヱ＃Δ、
ニガー・ム、立−／、之２二、Δ、アワモリ、！、クリ
ソｒ＝ウム（乙。

ｅｈｒｙｓｏｇｓｎｕｍ）　＃　　Ｆ−ソラニビシ（！
’ｌ１ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ　　）、等を含む。

誘導的発現のためには、調節領域が、広範囲の種類の遺
伝子、たとえば熱ショック遺伝子、解糖酵素遺伝子、グ
ルコアミラーゼ遺伝子、等から得られるその調節領域は
、ＲＮＡ／リマラーゼ結合領域と共に使用され得又は異
なったＲＮＡポリマラーゼ結合領域に連結され、キメラ
性転与開始領域を提供する。その調節領域は、糸状菌、
宿主中で機能的な調節を提供するいづれかの源から得ら
れる。

転写開始領域は、一般的に約０．１〜２Ｋｂｐ、普通０
．２〜ＩＫｂｐであろう。

シグナルリーダーは、小胞体の内腔中への新生タンパク
質の移行を提供する領域から成るであろう。すべての又
は一部の天然に存在するシグナルリーダーが使用され得
、普通少なくとも約６０％、より普通には少なくとも約
８０−のコード配列が存在し、分泌機能を提供する。プ
ロセシングシグナルは、生成物の目的、タン／４′り質
生成物からシグナルリーダーを除くための必要性又は４
７ｅｄ？又は±ｙ？Σ！で続くプロセシングを可能にす
る他のプロセシングシグナルの入手可能性に依存して、
存在しても良いし又は存在しないでも良い。

プロセシングシグナルは、プロテアーゼによって認識さ
れる塩基性アミノ酸の単純なジー又はポリペプチドを含
み、又は特定のペプチダーゼによって認識されるシグナ
ルを含むことができる。さらに、プロセシングシグナル
は、ペプチド結合の切断がシグナルリーダーを除去した
後、ペプチダーゼによって除去されるメペーサーを含む
ことができる。続く切断のためには、メチオニンが切断
部　、位に導入され、ここで臭化シアンがその部位で切
断するために働くことができる。

シグナルリーダー及びプロセシングシグナルと読み枠金
合せて対象の遺伝子の便利な導入を提供するためには、
シグナルリーダーの３′末端に近い方の領域をコードす
る又はプロセシングシグナル又は切断部位をコードする
ヌクレオチドが、便利な制限部位を提供するために、保
存的に突然変異され得る。他方によれば、制限部位は、
対象の読み取り枠の挿入のためにシグナルリーダー又は
切断部位の後に導入され、ここで対象のイプチドのＮ−
末端での余分なアミノ酸の存在は、タン／４り質生成物
の使用に対して悪影響を持たな−であろう。他方、シグ
ナルリーダー及び適切な場合、プロセシングシグナルと
正しく読み枠を合せている読み取り枠を供給するために
、シグナルリーダー、プロセシングシグナル及び／又は
読み取り枠の再構成部分をもたらすアダプターが使用さ
れ得る。

読み取り枠は、通常、タンパク質生成物のＣ−末端の正
しいプロセシングのために１又はそれよりも多くの停止
コドンにおいて終結するであろう。

終結領域は、糸状菌宿主において機能的であるいづれか
の源からのいづれか便利な領域でおることができる。終
結領域は、転写開始領域と同じか又は異なる遺伝子に関
連される。普通、その転写開始領域は、上限は必要とさ
れないが、約１００〜５００　ｂｐであろう。

その遺伝子を含む発現構成体は、特に組込みが所望され
乙形質転換のためには単独で使用され得、又は種々の目
的のために池のＤＮＡ配列に連結され得る。

連結され得る１つのＤＮＡ配列は、宿主細胞のＤＮＡ配
列と相同のＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列は、普通
、少なくとも約５０ｂｐ、より普通には少なくとも約１
００　ｂｐであり、そして２０００ｂｐ又はそれ以上で
あっても良い。その配列は、宿主に原栄養性及び目的と
するＤＮＡ　Ｋ工り形質転換された生物の選択を提供す
るために、栄養要求性宿主を補足する遺伝子を含むこと
ができ名。他方、宿主に対して耐殺菌性を付与する選択
性優性マーカーを使用することができる。特に、耐抗生
物質マーカー、たとえば耐カナマイシン、耐ネオマイシ
ン又は耐Ｇ４１８マーカーが使用される。

この耐性を付与することができる１つの遺伝子は、Ｔｎ
　Ｓ上に見出されるネオ！イシンホスホトランスフェラ
ーゼ■遺伝子である。他の特定の対象ので一カーは、耐
殺菌性々ノミル（Ｂｅｎｏｍｙｌ）を含む。その優性マ
ーカー遺伝子は、糸状菌宿主においてその優性選択ブー
カーの発現に適切な転写及び翻訳開始及び終結シグナル
を有する発現カセットとして提供されるであろう。

種々の構成体が通常、原核生物のベクター、特にＥ、　
　”　！Ｊ　（Ｅ、　Ｃｏ１１）において複製できるベ
クターにおいて調製されるので、原核生物の複製システ
ムがその発現構成体に連結され得る。種々の複製システ
ムが良く知られ、通常ｐＢＲ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４
及びｐＵＣ（シリーズ）が適用されている。さらに、原
核生物の複製システムはまた、普通、原核生物において
選択を可能にするマーカー、特に耐殺菌、特に耐抗生物
質又は耐殺真菌のための相補性マーカーを含むであろう
。

次に１発現構成体は、糸状菌の形質転換のために、単独
で又は追加のＤＮＡと一緒に使用され得る。

形質転換は、菌糸類からスフェロプラストを調製し、細
胞破壊物を含まないスフェロプラストを単離し、そして
適切な緩衝化培地中において該スフェロプラストと形質
転換性ＤＮＡとを混合し、そしてその混合物をインキュ
ベートすることに工り形質転換することによって達成さ
れ得る。次に、ヌ１フエロプ２ストを単離し、細胞壁の
再生のために適切な栄養培地に懸濁し、そしてマーカー
が存在する場合、形質転換体の選択のために選択培地と
混合され得る。次に、形質転換体を単離し、増幅し、そ
して目的とするタンパク質の発現のために使用され得る
。

広範囲の種類のタンパク質が興味の対象であり、そして
本発明に従って調製され得る。はとんどの場合、そのタ
ンパク質は、少なくとも約１０００分子量、エリ普通に
は少なくとも約２０００’分子量、及び一般的には約１
０００．０００分子量よりも低く、普通には約６００，
０００分子量よりも低いであろう。対象の一次構造タン
パク質は、一般的に約３０，０００〜４００，０００分
子量、より普通には約３０，０００へ２５０，０００分
子量の範囲であろう。対象のタンノリ質は原核生物又′
は真核生物源に由来することができる□。哺乳類のタン
パク質、より特定にはヒトタンパク質が特に興味の対象
である。

対象の例示的なタンパク質は、酵素、たとえばグルコア
ミラーゼ、凝固又は血塊溶解性カスケ−ドに関与される
血液タンｔ４り質、たとえばトロンビン、第■Ｃ因子、
第Ｘ因子、第Ｘ因子及び第■因子、組織プラスミノ−ｒ
ン活性化因子、プラスミノーゲン、ウロキナーゼ、スト
レプトキナーゼ、血清アルブミン、等；ホルモン、たと
えばインシュリン、ソマトメジン、ソマトスタチン；リ
ンフ才力イン、たとえばインターロイキン、−１，−２
及び−３；成長因子、たとえば血小板由来成長因子、腫
瘍壊死因子、上皮成長因子、骨格成長因子、α−形質転
換因子、等；表面膜タンパク質、たとえば主要組織適合
性複合タン／４り質、成長因子受容体、外層膜タンパク
質；病原菌からのタンパク質、たとえばウィルス（たと
えば肝炎）、Ｉ、ＡＶ。

ネコ白血病ウィルス、ヘルパスウィルス；クラミジア（
Ｃｈｌａｍｙｄｉｍ）　、淋病（Ｎｅｉｇｓ＠ｒｉｍｇ
ｏｎｏｒｒｈｅａ）、エンテロバセルチアセアエ（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｅｅｒｔｉａｅｓａｅ）　；構造タン／４
り質、たとえばコラーゲン、ケラチン及び同様のもの；
及び対象の合成タンパク質を含む。

使用される糸状菌は、ネウロスポラ、Ｌ玉二上−二１１
　フサリウム、二五乞工１五（ｂエロ土■ｊ→又は同様
のものからである。この属の間の種は、Ｎ０色と！、Δ
、＝が−・Δ、ニジ　−ンス、Ａ。

アワモリ、旦、クリンダニウムーＦ、Ｌ之三ζ之、等を
含む。

以下余白 形質転換された宿主は、発現構成体のコビイ数、発現構
成体からの生成物の産生、又は商業的な開発のための対
象の他の因子に関して選択され得る。

従って、その形質転換体は、目的とするタンパク質生成
物の有効で経済的な発現及び分泌を可能にする対象の特
性に関してスクリーンされるであろうＯ いくつかの場合、発現構成体と増幅できる遺伝子、たと
えばＤＨＦＲ，ＴＫ又はメタロチオネイン遺伝子とを混
合することが所望される。組込まれたコピーの数は、目
的とする生成物の発現の量をさらに増大するために、形
質転換細胞をストレスすることによって、ひじように増
幅され得る。さらに、同時形質転換される構成体又は別
の構成体に、プロセシングシグナル（そのようなプロセ
シングシグナルが存在する場合）の切断のためにペゾチ
ダーゼをもたらす発現生成物を含むことが所望される。

この場合、増大されたレベルの分泌を可能にするために
、宿主の天然に存在するプロセシングシステムを圧倒的
に避けることができる。

次の例は例示的であって、限定するものではない。

実験 次の実験のために、ＤＮＡ操作は、良く知られている方
法、たとえばＭａｎｉａｔｉａ、　Ｔ、ｒなど、、″分
子クローニング、実験の手引（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ）　’、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ（１９８２）に記載さ
れている方法に従って行なわれ、そしてこれを引用によ
って本明細書に組入れた。

特にことわらないかぎシ、すべての酵素及びプラスミド
は、種々の市販源たとえばＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　
ｉ　ｏ　１ａｂｓ　、　Ｂ＊ｖｅ　ｒ　１ｙ＋　Ｍａｇ
ｓａ　ｅｈｕｓｓ　ｔｔｓ　：　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔ
ｉｖｅＲｅｓ＊ａｒｅｈ＋　Ｗａｌ　ｔｈａｍ＋　Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　；　Ｍｌ　ｌｅｇＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ＋Ｅ１ｋｈａｒｔｓ　Ｉｎｄｉａｎａ；
　ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＢｉｏｅｈｅｍｉｃａｌａ＋　
Ｉｎｓ、　＋　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｌｇ、　Ｉｎｄｉ
ａｎａ；及びＢｓｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｍｏｃｋｖｉｌｌｅ＋　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手でき
る。制限酵素による消化のための緩衝液及び反応条件は
、特にことわらないかぎシ、それぞれの材料の製造業者
によって供給される勧めに従って使用された。

すべての引用された出版物及び特許は、特に引用によっ
て本明細書に組入れる。

次の原液を使用した： １、　　ＫＭＰ＝０．７ＭノＫＣｔ１０．８Ｍ（７）ｖ
ｙ＝トール／２０ｍＭのＫＰＯ４，ｐＨ６，３゜ ２、　　ＫＭＰ　Ｃ＝　）ＣＭＰ　＋　５０　ｍ　Ｍの
ＣａＣ２２（Ｃａは使用のすぐ前に添加された）。

３、　　Ｈｅｐａｒｉｎ　＝　ヘパリン５　ｒｎＩ／″
ＫｙｉＰＣ１ｍ、それぞれの使用の前に新しく作られる
。

４、　　ＰＰＣ＝４０％ポリエチレングリコール（Ｓｉ
ｇｍａ３５００）７２０ｍＭのＫＰ　Ｏ４（ＰＩ（６，
３）１５０ｍ　ＭのＣａ　Ｃｔ２゜ ５、再生寒天 ２０×無機塩　　　　　　　５〇− トリプトン　　　　　　　　　５ｇ 酵母抽出物　　　　　　　　５ｇ グルコース　　　　　　　　１０ｇ マンニトール　　　　２３６．８６ｇ 水圧よＪ）ＩＡＩに調整され、マンニトールを溶解する
必要がある場合、加熱される。おのおのの１２５ゴ培地
がトルに、１．５１ｉの寒天及び上記溶液５０ｍ１＋を
添加した。

６、オーバーレイ寒天、１チベプトン及び０．７チ寒天
、５０ゴのアリコートに作られた。

７．２０Ｘ無機塩： ＮａＮ０５（硝酸ナトリウム）　　　　　１２０ｇＫｃ
ｔ　　　　　　　　　　　　　　　１０．４ｇＭｇＳＯ
４・７Ｈ２０１０，４ｇ ＫＨ２ＰＯ４３０，４，９ Ｖｏｇｅｌの微量元素　　　　　　２．０−説イオン水
　　　　　　　　　　１１にそれぞれの塩は、次のもの
を添加する前に、完全に溶解されるべきである。防腐剤
としてクロロホルム２−によシ室温で保存された。５０
鴫４で使用した。

８、　　Ｖｏｇｅｌの微量元素： 脱イオン水　　　　　　　　　　９５ｔｎｔクエン酸（
ナトリウム塩でない）５ｇ ＺｎＳＯ４−７Ｋ２０　　　　　　　　　　　５　ｇＦ
ｅ（ＮＩ（４）２（Ｓ０４）２・６Ｈ２６Ｈ２Ｏ１５Ｏ
４０，２５、ｊｉ’ Ｍｎ５Ｏ４）　Ｋ２０　　　　　　　　　　０．２５　
ｇＨ３ＢＯ３０，０５ｇ Ｎａ、、ＭｏＯ２・２Ｈ２００，０５，９おのおのの成
分は次のものを添加する前に溶解され、約４℃で保存さ
れ、そして培地１１当シ０．１−で使用される。

９、完全培地： ２０、Ｘ無機塩　　　　　　　　５〇−トリプトン　　
　　　　　　　　　　５ｇ酵母抽出物　　　　　　　　
　　５Ｉ グルコース　　　　　　　　　　１０９水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１１に１、　　ｐＮＥｏを
、Ｐｈａｒｍａｃｌａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｓｍｌｃａ
ｌｇから購入した（カタログ＄２７−４９２４）。

２、　　ｐＰＬｌ　：　ｐＪＲ２の２ｋｂの陸ＲＩ−シ
竪Ｈｌフラグメン）（Ｎ、クラサ見遺伝子の５′領域及
びコード配列＋３″非コード配列の一部（Ｊ、　Ｈ，Ｋ
ｉｎｎａｉｒｄａｎｄ’Ｊ、　Ｒ，Ｓ、　Ｆｉｎｃｈａ
ｒｎ’＋　”　Ｔｈｅ　Ｃ’ｏｍｐｌｓｔｅ　’ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄ−＠５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｂｓ＋　
７ｃｒａａｓａ　ａｍ　（ＮＡＤＰ特異性のグルタミン
酸デヒド〜２６０に従って番号をつけられ、そしてＪ・
Ｋ１ｎ５ｅｙ＋Ｕｎｉｖｅｒａｉｔｙ　ｏｆ　Ｋａｎｓ
ａｓ　ＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ＋　Ｋａｎｓａｓ　
Ｃ１ｔｙから得られたヌクレオチド１〜２０３４番目〕
を含む）を単離し、そしてｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨ１部位との間にクローン化した。

３、　　ｐＰＬｌ−Ｒ：　ｐＰＬｌをＣｏｍ１（Ｋｉｎ
ｎａｉｒｄ　ａｎｄＦｉｎ’ｅｈａｍ＋前記に従って番
号を付けられたヌクレオチド２８３で）によシ切断し、
そして付着端を、逆転写酵素及び４−デオキシリ？ヌク
レオチドトリホスフェートの混合物と共にインキ−ベー
トすることによってブランド末端化した。次に、そのプ
ラスミドを、合成のリン酸化ＥｃｏＲＩ　　リンカ−（
ＧＧＡＡＴＴＣＣ）と共にインキュベートし、ＥｃｏＲ
Ｉによシ切断し、そしてそのプラスミドを連結した。

４、　　ｐＵＴＸ２７　：　ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ
によシ切断し、ＤＮＡポリマラーゼのフレノウフラグメ
ントによシフイルインし、そして再閉環°した。これが
ＥｃｏＲ１部位を除去した。

５、　　ｐＥＶ　１　：　ｐＵＴＸ２７をＢａｍＨＴに
よシ切・断し、そしてホスファターゼ化した。これを、
ｐＰＬｌ−Ｒの約３００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメント（ａｍ遺伝子のプロモーター及び転写開始
部位を含む）及び＆ｍ遺伝子のポリ人付加部位をとシま
く配列を含む、ｐＪＲ２からの約６００ｂｐのＥｃｏＲ
１〜ＢａｍＨＩフラグメント（Ｋｉｎｎａｉｒｄ　ａｎ
ｄ　Ｆｉｎｃｈａｍ＋前記に従って番号を付けられたヌ
）レオチド２０３゜から２６４４番目）に連結した。そ
の得られたプラスミドは、二遺伝子の転写開始部位と転
写終結部との間にユニークＥｃｏＲ１部位を含む。

、６．ｐＲＲＮＥＯ’：ネオマイシンホスフォトランス
フェラーゼ■遺伝子のためのコード配列を含む、ｐＮＥ
ｏのＢａ１ｌ　ｌ〜Ａｖａ　ｌフラグメント（Ｅ、　Ｂ
ｅｃｋ＋Ｇ、　Ｌｕｄｗｉｇ＋　Ｅ、　Ａ、　Ａｕ５ｅ
ｒｖｒａｒｄ＋　Ｂ、　Ｒｅ１ｓｓ　ａｎｄ　Ｈ・５ｃ
ｈａｌｌｅ、　”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ　ａｎｄ　ｅｘａｃｔｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｇｆ
ｅｒａｓｅｇｏｎｅ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
　Ｔｎ５＋’　Ｇｅｎｅ（１９８２）１９　：　３２７
−３３６（Ｐ−ＬＢｉｏａｈｅｍｉｅａｌｇから入手で
きる）に従って番号を付けられたヌクレオチド１５１６
〜２５２０番目〕を、ＥｃｏＲＩリンカ−（８ｍａｒ）
に連結し、そしてｐＵＣ８のＥｅｏＲ１部位中にクロー
ン化した。

７、　　ｐＥＶｌ　ｎｅ　ｏ　（４ｄ　：　ｐＲＲＮＥ
ｏからのｌｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＥＶ１
０ＥｃｏＲ１部位にクローン化した。プラスミドの配向
は、民ｓ′−ＮｐＴｎ（ｓ−３）−幌３′である。この
プラスミドは、ＮＰＴＩ［遺伝子の主要翻訳開始部位に
向かって１６塩基の５′で読み枠外のＡＴＧを含む。

８、　　ｐＡＦｌ：　　フィルインされたＥｃｏＲＩ部
位を有するｐＵＣ８゜ ９、　　ｐＥＶ２ｎｅｏ　　：　ｐＥＶｌｎｅｏのＢａ
ｍＨＩフラグメントを、シラスミドｐＡＦ１のＢ　ａｍ
　Ｈ１部位にクローン化した。

１０、　　ＮＥＯｂａｌ−３：　ｐＮＥｏを旦り」によ
シ開環し、そしてシリ３１　　ヌクレアーゼによシ再切
断した。

ＥｅｏＲＩ！Ｊンカー（８ｍｅｒ）を付加し、そしてそ
のプラスミドを閉環した。その特異的シラスミドは、Ｎ
ＰＳＩ［遺伝子の５′領域においてヌクレオチド１５４
３（Ｂｅｃｋ＋など、、前記によって番号を付けられた
）にすぐ隣接する“、連結されたＥｃｏＲＩリンカ−を
含む。これが読み枠外のＡＴＧを除去する。

１１、　　ｐ４２−６−１　：　ｐＮＥＯｂａｌ−３を
ＡｖａｌＫよシ開環シ、ＤＮＡポリマラーゼのフレノウ
フラグメントによシフイルインし、そしてＥｃｏＲＩリ
ンカ−（８ｍａｒ）を、この部位で付加した。そのグラ
スミドをＥ　ｃｏＲ１によυ切断し、そしてその得られ
た約ｌｋｄのＥｃｏＲＩフラグメント（ＮＰＴ　ＩＩの
ためのコード配列を含む）を、ｐＵＣ８のＥｅｏＲＩ部
位にクローン化した。

１２、　　ｐＥＶ２ｎｅｏｂａｌ　：　ｐ４２−６−１
の旦ｃｏＲＩフラグメントを挿入し、ｐＥＶ２　ｎｅｏ
の旦叩ＲＩ７ラグメントを取シ換えた。その配列は懇ｓ
′−ＮＰＴ　ＩＩ　（５’−３’）−凹３′である。

１３、　　ｐＥＶ３ｎｅｏｂＩＬｌ　：　ｐＥＶ２ｎｅ
ｏｂａｌのＢａｍＨｌ　　フラグメントをｐＵｃ１８の
ＢａｍＨ１部位に挿入した。

１４、　　ｐＥＶ３ｎｅｏｂａｌφＸｈｏ　：　ｐＥＶ
３ｎｓｏｂａｌの３′懇配列におけるＸｈ　ｏ　、１部
位をフィルインした。

１５、　　ｐＧＡＮ二ＡＧＩＩＩからＱ、１０ｋｂの旦
すリ■　〜Ｘｂａｌフラグメント（グルコアミラーゼ遺
伝子を含む）を、ｐＥＶ３ｎｅｏｂａｌφＸｈｏのＨｌ
ｎｄ　ＩＩＩ及びＸｂａＩ部位の間にクローン化した。

Ａ、ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子の単離Ａ、　ニガ
ーＤＮＡ　（菌株ＡＴＣＣ１０１５からの）の５ａｕａ
Ａ一部分ライブラリィを、λファージＩｍＢＬ４　（Ａ
。

Ｍ、Ｆｒ１ｓ＋ｅｈａｕｆ＋　Ｈ，Ｌｅｈｒａｃｈ、　
Ａ、Ｐｏｕｓｔｒａ　ａｎｄＮ、Ｍｕｒｒａｙ−Ｌａｍ
ｂｄａ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＶｅｃｔｏｒｓＣａ
ｒｒｙｉｎｇ　Ｐｏ１ｙｌｉｎｋｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ”、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　７０　：　８２７〜８４２
（ＰｒｏｍｅｇＩＬから入手でき、る）〕中において構
成した。グルコアミラーゼ遺伝子を、２６ｍａｒのプロ
ーブ （ＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＣ
ＧＣ）によシゾラークをスクリーニングすることによっ
てこのライブラリィから単離した。そのプローブの配列
ヲ主、出版されたグルコアミラーゼ配列から取られた：
Ｊ。

Ｈ，Ｎｕｎｂｅ、ｒｇ＋　Ｊ、　Ｒ，Ｍｅａｄｅｙ　Ｃ
，Ｃｏ１ｅ、　Ｆ、　Ｃ。

Ｌａｗｙｅｒ＋　Ｐ、　ＭｃＣａｂｅ＋　Ｖ、　Ｓｃｈ
ｗｅｉｃｈａｒｔｔＲ，Ｔａｌ　＋Ｖ、　Ｐ、　Ｗｉ　
ｔｔｍａｎ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｆｌａｔｇａａｒｏｌ　＃
及びＭ、Ａ、。

Ｉｎｎｉｇｎ″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ−ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　
ｔｈｅ　Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｏｆｅ
ｒｇ　　　　ｕａ　　ａｗａｍｏ　　　　　　□Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ　　Ｂｌｏｌｏｇｙ　（１９８４）　４　：
　２３０６〜２３１５゜この実験に使用されるファージ
は、λＡＧＩＩＩと名付けられた。このファージは、１
９ｋｂの挿入体の部分として完全なグルコアミラーゼ遺
伝子を含む。

その制限地図は、Ａ、ニガー株ＢＵ−１及びΔ、７１７
％　！Ｊ（ＮＲＲＬ３１１２）からの遺伝子についての
出版された情報と一致する：　Ｅ、　Ｂｏｅｌ＋、　Ｍ
、　Ｔ、　Ｈａｎｓｅｎ＋　Ｉ。

Ｈｏｅｇｈ　ａｎｄ　Ｎ、Ｐ、　Ｆｉｉｌ、”Ｔｖｒｏ
　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓｏｆ　ｉｎｔｅｒｖ
ｅｎｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌ
ｕｅｏａｍ−ｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓ　
ｅｒｇｉｌｌｕｉ　ｎｉｇｅｒ＋　”ＴｈｅＥＭＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ　（１９８４）　３　：１５８１〜１５８
５：及びＪ、　Ｈ，Ｎｕｎｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｒ，Ｍｅ
ａｄｅ、　Ｇ、　Ｃｏ１ｅ、　Ｆ’、　Ｃ。

Ｌａｗｙｅｒ＋　Ｐ、　ＭｃＣａｂｅ　＊　Ｖ、　Ｓｃ
ｈｗｅ　ｉ　ｃｈａｒｔ＋　Ｒ，Ｔａｌ　＋Ｖ、　Ｐ、
　Ｗｉ　ｔｔｍａｎ、　Ｊ、　Ｅ、　ＦｌａｊｇａｌＬ
ｒｄ＋　ａｎｄ　Ｍ、　Ａ。

Ｉｎｎ１ａ＋　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ−ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
　　ｔｈｅ　Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｔｅ　Ｇｅｎｅ　ｏ
ｆ（上記参照のすべては、引用によってこの明細書に特
別に組込まれる。） ｐｌａｃ　２３９／３ＰＩ　：　７゜ロインシュリン三
景体は、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　挿入体に存在する
。このプラスミドは、５ｈｅｎ、　５−Ｈｅ　ｅ　Ｐｒ
ｏｃ＋　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８４）８１：　４６２７〜４６３１
に十分に記載されている。このプラスミドは、Ｄｒ、　
Ｓｈｉ　−Ｈｓｉａｎｇ　Ｓｈｅｎ（Ｃｏｎｎａｕｇｈ
ｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ｗｉ　１１ｏｗｄａｌｅ、　０ｎｔａｒｉｏ＋　Ｃａｎ
ａｄａ）によって供給された。

グルコアミラーゼ転写ターミネータ− １、ｐＫＦ１７　：　ｐＧＡＮを坦且ＩＫ、υ完全に消
化し、そしてＳａｌ　（によシ一部切断した。その付着
端を４種のｄＮＴＰの存在下で見：ｌ　９　ＤＮＡポリ
マラーゼＩのフレノウフラグメントと共にインキュベー
トすることによってフィルインした。そのグラスミドを
、プラント末端結合によって再閉環し、そして旦ミュ中
に形質転換した。目的とするグラスミド（制限地図によ
って同定された）は、グルコアミラーゼ遺伝子のコード
領域の３′末端（すなわち、人、−二にＤＮＡ挿入体の
シリ■部位の中間）で、Ｓａｌ　１部位へ向かって５′
を出発する及び元の２公−ニガーＤＮＡ挿入体に隣接し
たＢｉｎｄｕ［部位に向かって延びる欠失部位を含んだ
。（その欠失部位に隣接する旦１１１部位は破壊される
が、しかしその欠失部位の他の端に隣接する旦１ｎｄｌ
ｌＩ部位はフィルインされたＳａｌ　Ｉ部位への連結（
基づいて再形成される。） ２、　　ｐＫＦ２７　：　ｐＫＦ１７をユニーク旦匡ｄ
ｎＩ部位で切断し、その付着端をフィルインし、そして
合成の塩１■リンカ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を、その末
端に連結した。そのリンカ−の付着端を、Ｂｇｌｎによ
る切断によりて現し、そしてプラスミドを再連結した６
（Ｈｉｎｄｌｌ［部位は、この操作において失われる。

）グルコアミラーゼプロモーター＋リーダー配列１、　
　ｐＫＦ２０：ｐＧＡＮをＢｓ５ＨＩＩにょ多切断し〔
このＢｓ５Ｈ］ｌはリーダーペプチドと成熟グルコアミ
ラーゼ遺伝子ぐり質との間の接合部位をコードする配列
で該プラスミドを（並び、に成熟酵素をコードする領域
において１度及びネオマイシンホスフォトランスフェラ
ーゼ（ｎｐｔ　ＩＩ）遺伝子においてさらに１度）切断
する〕、そしてそのプラスミドを再連結し、そしてＥ、
コリ中に形質転換した。

目的のプラスミドは、リーダーペプチドでの　。

μｔｓＨ１［部位カラネオマイシンホスフォトランスフ
ェラーゼ遺伝子におけるＢｓｇＨＩＩ部位に延びた欠失
部位を有した。

２、　　ｐＫＦ　２　ｓ　：　ＰＫＦ　２０をユニーク
Ｂｓ５Ｈｌ［部位で切断し、その付着端をフィルインし
、合成りｇｌｌ［リンカ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を付加
した。（適切にフィルインされたＢｓ　ｓＨ１部位への
Ｂｇｌｌ［ｌＪンヵーの付加は、　ＢｓａＨＩＦ部位の
再形成をもたらす。）ブロモ−ター及びリーダーへのタ
ーミネータ−の連結 ｐＫＦ　２９−９　：　ｐＥＶ３　ｎｅｏｂａｌの大（
４，６ｋｂ）Ｘｂａ　Ｔ　−Ｈｉｎ　ｄｌｌＩフラグメ
ント（細菌超厚の複製、５ＵＮＴの選択マーカー及び菌
の選択マーカーを含む）を、ｐＫＦ２７の３．７ｋｂの
王すＩ−シリ■フラグメント（ターミネータ−７ラグメ
ントを含む）及びｐＫＦ　２５の４．３ｋｂの旦罰ｄｌ
す１■フラグメント（プロモーター及びリーダー配列を
含む）に連結した。連結する前、すべてのフラグメント
をｒル精製した。適切なプラスミドを制限地図によって
決定した。

このシラスミドが、リーダーペプチドをコードする配列
と転写終結配列との間に位置されるユニークＢｇｌ　１
部位を有することを注目すること。この配列での適切な
翻訳読み枠は、次の通りである：Ｂｓ５ＨＵ　　Ｂｇｌ
　ＩＩ ＡＡＧ　　ｃｃｃ　　ａｃＡ　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　′Ａ
ＧＣＴＣＧＡＣ・・・Ｌｙｓ　Ａｒｇ／Ａｌａ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　・・・（ｐＫＦ２９−９配列）Ｌｙｓ　Ａｒ
ｇ／Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　・”　（正常なグルコア
ミラーゼ配列） （＠／′は、正常な切断部位を示す） ゾロインシュリンの翻訳読み枠の調整 ＴＩＫＦ３１−１６：ゾラスミドｐｉ　ａｃ　２３９／
３　ＰＩをＥｃｏＲ■により切断しくプロインシュリン
配列の５′末端で）、その付着端をフィルインし、そし
て合成のＢｇｌ１１部位をＥｃｏＲ１部位に隣接して連
結した（正しいフィルイン及び連結はＥｅｏＲＩ部位の
再形成によって示された）。

最終構成 りＫＦ３４−１６：正しくされた翻訳読み枠を有するプ
ロインシュリン三量体を、Ｂｇｌ　ｌ　＋　ＢａｍＨＩ
によシ切断によってｐＫＦ３１−１６から切り出し、そ
してｐＫＦ　２９−９のＢｇｉ部位中に挿入した。その
プラスミドを、正しい配位で挿入されたプロインシュリ
ン三量体を含むプラスミドについて、制限地図を作るこ
とによってスクリーンした。

そのシラスミドは、本質的に、プロインシュリン三量体
のためのコード配列ど交換されたグルコアミラーゼのコ
ード領域を有するｐＧＡＮである。

プロインシーリンの分泌 プラスミドｐＫＦ　３４−１６を、次のようにして形質
転換によってＡ、二が一株（ＡＴＣＣ１０１５）Ｋ挿入
した： Ａ、ニが−を、３０℃で８〜１２日間、傾斜寒天（２％
グルコース、１％ペプトン、２％寒天から成る）上で増
殖せしめた。分生子を、０．００５％Ｎｏｎ１ｄｌｔ　
Ｐ−４０の溶液に懸濁した。その分生子懸濁液を、ガラ
スピーズを含む管内で振盪し、その分生子の鎖を分解し
、そして次に３０℃、２００ｒｐｍで２４時間の培養の
ためＫ、それを用いて、完全培地のフラスコ（溶液９．
）（５０μｌの三角フラスコにおいて１００ｍＪ）に接
種し、５〜１゜ＸＩＯ分生子／−の濃度にした。その後
、二重層のチーズ布上で濾過することによって、菌糸体
を収穫し、そしてＫＭＰ（溶液１）によシ、絞シ出され
たその過剰の液体によシ洗浄した。その菌糸体を、５０
ＷＬｌの■、５００■のＮｏｖｏｚｙｍ　２３４（Ｎｏ
ｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｗｉｌｔｏｎ、　
ＣＴＯ６８９７）を含む消毒された５００ゴフラスコに
添加し、そして３０℃ｗ　７０　ｒｐｍで一晩インキエ
ペートした＝菌糸体の細胞破壊物からスフェロプラスト
を分離するためＫ、その溶液を二重層のチーズ布及び円
錐形遠心管中のグラスウールを通して濾過し、次にその
炉液を、ペンチトップ遠心分離機の中で１５分間、１８
００ｒｐｍで遠心分離した。その上清液を除去し、そし
てスフェロプラストのペレットを、２度洗浄しく　Ｎｏ
ｖｏｚｙｍを除去するために）、ＫＭＰ中に再懸濁し、
そして再遠心分離した。

形質転換のために、０．ＯＩＭのＴｒｌｇ、　０．００
１ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の溶液２０′μｌ中Ｄ
ＮＡ　５〜５０μｓを、ヘパリン溶液６．２μｌ中に添
加し、そして約１０分間、室温でイキュペートした。再
遠心分離からのスフェロプラストのペレットを、ＫＭＰ
Ｃ中に再懸濁し、５　Ｘ　１０　／ｍ／にし、そしてそ
のスフェロプラスト溶液２００μｌを、ＰＰＣ５０μｌ
を含むＤＮＡに添加し、静かに混合し、そして３０分間
、氷上でインキユベートした。次に、ＰＰＣ１−を添加
し、そして形質転換混合物を、０、５　■（７）　Ｇ４
１８２４ａヲ含む再生寒天５０　ｍｌＫ　５０℃で添加
した。（２００■のＧ４１８２Ｎ原液の１２５μｌとし
て０４１８を、スフェロプラストを添加するちょうど前
に、添加した。）この混合物を振、す、そして４個のベ
トリ皿上に注ぎ、すげやく冷却し、次に３０℃で４時間
インキ−ベートした。次に、その皿に添加された再生寒
天混合物の重量に等しいｄ数でオーバーレイ寒天（約３
〜の０４１８／１ｎｌを含む）によりおおった。その皿
を３０℃でインキユベートし、そして形質転換体は３〜
７日で現われた。

形質転換体は、耐０４１８について選択することによっ
て検出された。１つの形質転換体（ＡＢＭ４７と名づけ
られた）を、さらに分析するために取得した。その株は
安定した形質転換体であり、そして生物の染色体ＤＮＡ
中にタンデムに挿入されたｐＫＦ３４−１６の複数コビ
イを得た。組込みの部位は、完全には決定されないが、
しかしサウザンハイプリダイゼーションは、そのプラス
ミドが正常なグルコアミラーゼ遺伝子座で組込まれなか
ったことを示した。正常なグルコアミラーゼ遺伝子座の
制限地図に変化は形成されなかった。

ＡＢＭ４７株を、７日までの間、２５０ゴ三角フラスコ
中において２５ｍ１の体積で３５℃、１５０ｒｐｍで増
殖せしめた。使用された培地は、炭素源としてグルコー
ス（２〜１０％）又は可溶性スターチ（２〜１０％）の
いづれかを含む完全培地（培地≠９）であった。培養か
ら１７時間〜５日間の範囲時で、サンプルをその形質転
換体から取り、そしてＲＮＡを調製し、そしてノージン
法にゆだねた。すべてのサンプルは、予期されるサイズ
のＲＮＡを含んだ。それを、ラベルされたプロインシュ
リンＤＮＡグローブによシフロスハイブリダイズした。

ＡＢＭ４７株を上記のようにして（炭素源として１０％
グルコース上で）、５日間、増殖せしめた。

その培養液体を濾過によシ集め、そして７５％アセトン
による沈殿化によシ濃縮し念。その濃縮された培養液体
を、ＳＤＳ含有の緩衝液に再懸濁し、そして８ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にゆだねた。グル上の隣
接レーンは、分子量標準を含んだ。電気泳動に従って、
グルを、クーマシーブリリアントブルーにより染色した
。タンノ＜？り質のバンド（およそＭｒ＝３０．０００
．そのサイズはプロインシュリン三量体のために予測さ
れた）が。

形質転換されたＡＢＭ４７株には観察されたが、しかし
対照の形質転換されていないＡ、ニガー株（ＡＴＣＣ１
０１５）　　には観察されなかった。推定上のプロイン
シュリン三量体の量は、培養炉液１１当りおよそ１■で
あった。

ＡＢＭ４７株からの培養液体を、ＳＤＳポリアクリルア
ミドｒル上でグル電気泳動にゆだね、そしてタンパク質
を、Ｔｏｖｒｂｉｎ、など、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９７９）７６
：　４３５０〜４３５４〕の方法によってニトロセルロ
ースニ移した。その得られたグルプロットを、ブタイン
シュリンに対して意図されたギニアブタ抗血清（、Ｍｉ
ｌｅ＠）によりプローブする。抗体反応の部位を、ホー
スラディシェベルオキシダーゼ接合の抗−キニアブタＩ
ｇＧ（Ｍｉｌ＠ｎ）により検出する。

Ｍｒ　＝　３０．０００のタンノＩり質は、抗体と交叉
反応する物のみであると予期される。

標準としてブタインシュリンを用いて（及びブタインシ
ュリン及びヒトプロインシュリンの異なった交叉関連性
を修正して）、上記抗体による培養液体のドツトプロッ
ト分析は、炭素源として１０％ダルコースを用いこの培
養の５日後、産生された少なくともｌ　ｍＡ　／　ｌの
プロインシュリン三量体を示す。

７５％アセトンによシ培養液体を沈殿せしめ、少量の緩
衝液中に４レツトを再懸濁し、そして５ｓｐｈａｄｅｘ
Ｇ　７５のカラムによるグル濾過によって他の培養液体
タン１＋り質（主にグルコアミラーゼ）からプロインシ
ュリンを分離することによって、プロインシ、す：ンを
培養液体から精製することができる。

ガス相シークエネーターによる。精製されたプロインシ
ュリンのアミノ殿配列の分析は、組換えタンノ臂り質の
適切な切断のために予期されるように、リーダー配列の
後、配列Ａｔａ　　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ５ｅｔ　Ｍ
ｅｔ　Ｐｈｅ・・・の存在を示す。プロインシュリンの
真正の第１アミノ酸（ｐｈｅ　）の前の接合へキサペゾ
チドは、　Ｓｈ＠ｎなど、、前記によって記載されてい
る条件に従って、臭化シアンによるそのイプチドの切断
によって除去され得る。

グルコアミラーゼブロモ−ター−ターミネータ及ｐＫＶ
３ｎｅｏｂａｌ　：選択マーカーの源（上記参照のこと
） ｐ４２−２−１　：λＡＧ　１１１から得られた３、　
４　ｋｂのＥｃ　ｏ　ＲＩ　　フラグメント（完全なグ
ルコアミラーゼ遺伝子を含む）を、ｐＵＣ８のμヨＲ１
部位にクローン化した。

ｐ５０−１−１６　：　Ｐ４２−２−１　　をＢａｍＨ
］Ｉによ多切断し、そしてＢａｌ　３１ヌクレアーゼに
より再切断した。Ｘｈｏｉリンカ−（ＣＣＴＣＧＡＧＧ
）を付加し、そしてそのプラスミドを閉環した。その特
異的なシラスミドは、ヌクレオチド−３７（＋１として
のグルコアミラーゼ遺伝子の正常な翻訳開始に対して番
号を付けられた）にすぐ隣接して結合されるＸｈｏｌリ
ンカ−を含む。

Ｐ５６−４−７：　ｐ５０−１−１６の４逓Ｒ１フラグ
メン）（Ｂａ１３１欠失のグルコアミラーゼ遺伝子を含
む）を、ｐＵＣ８ΔＳａｌのＥｅｏＲ１部位に移動した
。

Ｃ３１：Ｔ）ＵＯ３にクローン化されたクチナーゼｃ　
ＤＮＡ、このプラスミドは、５ｏｌｉｄａｙ、など、。

Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ＊　Ｓｏｌ、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、　（１９８４）８１：３９３９〜３９４３に十
分に記載されている。

以下余白 ターへの融合 １、　９５６−４−７−Ｂ　：　ｐ５６−４−７をＨｌ
ｎｄｌＩＩによ多切断しく挿入体の３′に位置するｐＵ
Ｃ８ポリリンカー配列内で）、その付着端をフィルイン
し、そしてＢｇｌ　ｌ［リンカ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ　
）を連結する。

そのＤＮＡをＢｇｌｌ［によ多切断し、付着端を表わし
、そしてそのプラスミドを再環化する。（このプラスミ
ドは、最終的に、クチナーゼ　リーダーにグルコアミラ
ーゼ　プロモーターを連結するであろう。） ２、　　ｐＵｃ１８［：　ｐＵｃ１８をＨｌｎｄｌｌＩ
によ多切断し、その付着端をフィルインし、そしてＸｈ
ｏｌリンカ−（０ＣＴＣＧＡＧＧ　）を連結した。その
ＤＮＡをＸｈｏｌによ多切断し、付着端を表わし、そし
てそのプラスミドを再環化する。

３、　　ｐＣＵＴ　：　ｐｃ３１をＮ１ａＩ［［によ多
切断し、そして７６６　ｂｐのフラグメン〔ヌクレオチ
ド＋４（＋１としての翻訳開始に対して番号をつけられ
た）でｍＲＮＡ同−性鎖上で出発する〕を精製し、そし
てｐＵｃ１８Ｉ（Ｘのｓｐｈ　１部位中にクローン化す
る。コード領域の５′末端が、゛シラスミドのＸｈｏＩ
部位に接近するように指図されたプラスミドを選択する
。

４、　　ｐＣＵＴ−Ｂ　：　ｐｃｕ’ｒを、酵素Ａｌｕ
ｌによる一部消化することによって線状にし、そしてＢ
ｇｌ　ｌリンカ−（ＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧ　）を連結す
る。そのＤＮＡをＢｇｌ　ｌ［によシ消化し、付着端を
現わし、そしてそのプラスミドを再現化する。適切なプ
ラスミド（制限地図及びＤＮＡ配列決定によシ選択され
た）は、クチナーゼのアミノ酸残基３０及び３１をコー
ドする配列の間を切断する７ｕｕ１部位で挿入されるＢ
ｇｌｌＩリンカ−を有する。

５、　　ｐＡＧＣＩ　：　ｉ、　　１）ＣＵＴ−ＢをＢ
ｇｌｌにより切断し、そしてクチナーゼ　リーダーをコ
ードする配列を含む１０６ｂｐフラグメントを精製する
。

ｉｉ、ｐ５６−４−７−Ｂを、ＢｇｌｌＩ＋Ｘｈｏｌに
よ多切断し、そして大フラグメント（ｐＵＣ８主鎖にお
いてグルコアミラーゼ　プロモーターを含む）を精製す
る。

ｉｉｉ、　　その精製されたフラグメント（ｉ＋ｉｉ）
を、−緒に連結する。これらのフラグメントの正しい接
合部は、クチナーゼ　リーダー配列にグルコアミラーゼ
　プロモーター５′を配置する。

６、　　ｐＵＣ８Ｂｇｌ　：　ｐｔｙｃ　８をＥｅｏＲ
Ｉにより切断し、その付着端をフィルインし、Ｂｇｌ　
Ｉｆリンカ−（ＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）を付加し、Ｅａ
ｏＲｌ　部位を破壊し、ＤＮＡをＢｇｌｌにより切断し
、そしてそのシラスミドを再現化する。

７、　　ｐＡＧ　４　：　ｐＫＦ　２５のＨｌｎｄ　Ｉ
ＩＩ　−Ｂｇｌ　ｌ［挿入部（グルコアミラーゼのプロ
モーター及びリーダー配列を含む）を、ｐＵＣ８Ｂｇｌ
のＨｌｎｄｌ［［部位とＢｇｌ　ｍ部位との間にクロー
イ化する。

８、　　ｐＡＧＣ２：　ｐＡＧ４を、完全にＢｇｌｌｌ
によ）消化しくグルコアミラーゼ　リーダーの３′末端
で）、そしてＥａｏＲｌ　によシ部分的に消化する（グ
ルコアミラーゼ　プロモーターの５／末端で切断するた
めに）。精製された１）ＡＧＣｉのＥｃｏＲ１−Ｂｇｌ
　Ｔｌフラグメントをこのシラスミドに挿入する。この
操作の結果は、グルコアミラーゼ　グロモーターークチ
ナーゼ　リーダーによシグルコアミラーゼプロモーター
ーリーダ」を交換することである。

上記のｐＫＦ　２９−９に類似する。）ｐＡＧＣ３：　
ｐＥＶ’３　ｎｅｏｂａｌの大（４，６’Ｋｂ　）　Ｘ
ｂａ　１−Ｈ１ｎｄｎＩフラグメント（細菌起源の複製
、細菌性選択マーカー及び菌性選択マーカーを含む）を
、ｐＫＦ２７の３．７　ＫｂのＸｂａ　ｌ　−Ｂｇｌ　
Ｕフラグメント（ターミネータ−フラグメントを含む）
及びｐＡＧＣ２の４．３ＫｂのＨｌｎｄ　ｍ　−Ｂｇｌ
　１１７ラグメント（プロモーター配列及びリーダー配
列を含む）に連結した。すべての７ラグメントを、連結
する前にグル精製した。適切なプラスミドを制限地図に
よって決定した。

このプラスミドが、リーダーペプチドをコードする配列
と転写ターミネータ−配列との間に配置されたユニーク
Ｂｇｌ　１１部位を有することを注目すること。この配
列での適切な翻訳読み枠は次の通りである： Ｂｇｌ　１１　　　　　　’ ＧＣＧ　ＣＧＣＣＡＧ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧ
ＣＴＣＧＡＣＡｌａ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌ＠ｕ／Ａｓｐ
　（ｐＡＧＣ３配列）Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ
／Ｇｌｙ　（正常なクチナーゼ！ｔｌ　）（“／は正常
な切断部位を表わす。）　　　　−Ｂｇｌ　Ｉｆ部位で
の翻訳読み枠はｐＫＦ　２９−９のための読み枠と同じ
である。

４、最終構成、゛（これは、グルコアミラーゼ　リーダ
ーを用いる、従来の構成に類似する。）ｐＡＧＣ／３Ｐ
　Ｉ　：修正された翻訳読み枠を有するプロインシュリ
ン三量体を、Ｂｇｌ　ｕ　＋　Ｂ＆ｍＨ１により切断す
ることによって切シ出し、そしてｐＡＧＣ３のＢｇｌ　
Ｉｆ部位中に挿入した。適切な配位で挿入されたプロイ
ンシュリン三量体を含むプラスミドについて、そのプラ
スミドを制限地図を作ることによってスクリーンした。

このプラスミドは、本質的に、プロインシュリン三量体
のためのコード配列に融合されたクチナーゼ　リーダー
によシ交換されたグルコアミラーゼコード領域を有する
ｐＧＡＮである。

プロインシュリンの分泌 グラスミドｐＡＧＣ７３Ｐ　Ｉを、形質転換によってＡ
、二が一株（ＡＴＣＣ１０１５）中に導入し、そしてイ
ンシェリン産生を上記のようにして実質的に試験する。

ｐ３５二Ｃ−１４：Ａ、　＝ガーの優性のＢｅｎｏｍｙ
ｌ耐性突然変異体からのβチエ−プリン遺伝子を、Ａ。

二ジェランスのクローンされたβチエ−プリン遺伝子（
Ｄｒ　、Ｎ、　Ｒ，Ｍｏｒｒｌｓ　、　Ｒｕｔｇｅｒｓ
゛Ｕｎｌｖｅｒ’ａｉｔｙによって提供された）にクロ
ス−ハイブリダイセージ、ンによってクローン化した。

ＢｅｎｏｙＨｙｌ’　　耐性（ＢｅｎＲ）遺伝子を含む
５ｋｂのｇｅｏＲｌフラグメントを、ｐＵＣ８のＥａｏ
Ｒ１部位中に挿入した。

ｐａＸＰ６−１０５　：　　ネズミ膵臓すがヌクレアー
ゼｃＤＮＡクローン。そのクローンは、ＭＢｃＤｏｎａ
ｌｄ　。

Ｒ，Ｊ、　、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９
８２）　２５７　：　１４５８２〜１４５８５に説明さ
れ、そしてＤｒ、Ｒａｙｍｏｎｄ　Ｊ。

ＭａｅＤｏｎａｌｄ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ＊Ｕｎｉｖ＠ｒｓｌｔｙ　　
ｏｆ　　Ｔｅｘａｓ　　Ｈｅａｌｔｈ　　５ｃｉｅｎｃ
ｅＣｅｎｔｅｒ、　Ｄａｌｌｍｓ、　ＴＸによって提供
された。

ｐ６２−Ｃ−１：　ｐａＸＰ−１０５のＥａｏＲＩ　−
Ｐｓ＋ｔ　Ｉフラグメント（ＲＮａｓ＠をコードする領
域を含む）を、ｐＵｃ１８　中にクローン化した。

ｐ８１−Ｃ−１３：　７°ラスミドｐ６２−Ｃ−１をＥ
ｃｏＲＩにより切断し、その付着端をフィルインし、そ
してＨ１ｎｄｌｌ！リンカ−を付加した。そのＤＮＡを
Ｈｌｎｄｌ［Ｉによシ消化し、そしてＲＮａ　ａ　＠　
コード領域を含むＨｌｎｄｌｌ［結合フラグメントを、
ｐＵＣ８のＨ１ｎｄｍ部位中にクローン化した。そのコ
ード領域の５／末端を有するその正しいプラスミドを、
ｐＵｃＢ＆リリンカーのＥ（ＩＯＲ１部位の方に向けた
。

ｐＫＦ４２　：　ｐ８１−Ｃ−１３のＳａｌ　Ｉ　−Ｓ
ｐｈ　１フラグメントをｐＵｃ１８の５ａｌｌ及びＳｐ
ｈ　１部の間にクローン化した。

−■−−畷■■瞬−窮■■■−−曙 ｐＫＦ４３　：　ｐＫＦ４２をＸｂａｌ　（完全な消化
）及びＨｌｎｆｌ（部分消化）によシ切断した。その付
着端をフィルインし、そして一部欠失された正しいプラ
スミド（ＲＮａｓｅ配列においてＸｂａ１部位から第二
Ｈｌ　ｎｆ　１部位に）を、ｒル精製し、そして再現化
した。付着端の正しいフィリインを、両Ｘｂａｌ及びＨ
ｌｎｆｌによるシラスミドの消化性によって確認した。

欠失部のまわシの配列は次の通シであった：ＢａｍＨＩ
　　Ｘｂａｌ　　ＨｌｎｆｌＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴ
Ａ　ＧＡＡ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　（ｐＫＦ４３の配列）Ａ
ｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　（ｐＫＦ４３のＢ　ａｍＷ　１部位がＢｇｌ１１部
位でｐＫＦ２９−９のゲルコアミラーぜ　リーダー領域
に融合される場合に産生されたＲＮａｓｅの配列）Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｂａｒ　Ｓｅｒ
　（ＲＮａｇｅの正常な配列） ｐＫＦ４４　：　Ｈｌ　ｎｄ　ｍ部位（ＲＮａｓｅ　コ
ード領域に対して３／）で付加されたＢｇｌＩ［ｌＪン
ヵーを有するｐＫＦ４３゜ ３、最終構成及び発現 ＲＮａｓｅコード配列を、ＢａｍＨＩ　＋　Ｂｇｌｌ［
による切断忙よってプラスミドｐＫＦ４４から切シ出し
、そしてそのＲＮ　ａ　ｓ　ｅをコードする配列を単離
した。このフラグメントを、ＢｇｌＩ［Ｋ：よシ切断さ
れたｐＫＦ２９−９中に挿入し、シラスミドｐ６８−Ｄ
−１２を得た。この構成は、グルコアミラーゼプロモー
ター−リーダー由来の膵臓り？ヌクレアーゼの分泌を可
能にする。（他方、グルコアミラーゼプロモーター−ク
チナーゼリーダー由来の分泌は、　Ｂｇｌｌ［によシ切
断されたｐＡＧＣ３中にＲＮａｓｅをコードする配列を
挿入することによって提供され得る。）Ａ、ニガーのプ
ラスミドｐ６８−Ｄ−１２による形質転換についての詳
細は次の通りであるニブラスミドｐ６８−Ｄ−１２を、
ｆラスミドル３５−Ｃ−１４による同時形質転換によっ
て人、＝！二株（ＡＴＣＣ１０１５”）中に導入し、選
択マーカーを得た。プラスミドｐ３５−Ｃ−１４は、ｐ
Ｕｃ１８のＥｃｏＲＩ部位中に挿入されたＡ、＝ｆｆ−
突然変異体からのＢｅｎｏｍｙｌ耐性β−チュープリン
遺伝子を含む５ｋｂのＥｃ　ｏＲＩフラグメントを有す
る。この形質転換法は、Ｇ４１８の選択のために記載さ
れたのと同じである。但し、形質転換体を、ＩＷ／１３
のＢｅｎｏｍｙｌに対する耐性について選択することに
よって検出した。初期の形質転換体を、ＲＮａｓａ−特
異的ゾロープを有する形質転換体から調製されたＤＮＡ
をサデン法にかけることによって、グルコアミラーゼー
リがヌクレアーゼ発現カセットの存在についてさらにス
クリーンした。発現構成体を含む形質転換体を、さらに
分析するために取った。これらの株は安定しておシ。

そして生物の染色体ＤＮＡ中にタンデムに挿入された目
的とするプラスミドの複数コピーを含んだ。

組込みの部位は完全には決定されなかったが、しかしサ
ザンハイプリダイゼーションは、そのプラスミドが正常
なグルコアミラーゼ遺伝子座で組込まれなかったことを
示した。その正常なグルコアミラーゼ遺伝子座の制限地
図は、これらの形質転換体中において不変であった。

形質転換された生物を、２５０ｍ１三角フラスコ中２５
ｍＡ’の体積で、３５℃、　１５０　ｒｐｍで７日まで
の間増殖せしめた。使用された培地は、炭素源として１
０チ可溶性スターチを含む培地であった。

サンプルを、培養の１７時間〜５日間の範囲時で、その
形質転換体から取り、そしてＲＮＡを調製し。

そしてノザン分析にかけた。すべてのサンプルは、予測
されるサイズのＲＮＡを含み、そして、これら。

はラベルされ九ＲＮａｓｅ−特異的ゾロープと交叉ハイ
ブリダイズしていた。形質転換されていない対照の培養
物から調製された対応するサンプルについては、交叉ハ
イブリダイゼーションは観察されなかった。この結果は
１発現構成体が形質転換される生物中において正確に転
写されることを例示する。

形質転換体の３日間培養物（上記のようにして増殖され
た）及び形質転換されていない対照の培養物から取られ
た培養液体を、標準方法によってリゾヌクレアーゼ活性
について検定した。形質転換された培養物から得られた
培養液体中和おけるすがヌクレアーゼのレベルは、２０
ｍｐ／Ｉｃウシ膵臓すｆヌクレアーゼ標準の活性に比べ
て）でありたが、形質転換されていない対照の培養物か
ら′。培養液体中、）や、、）Ｖイヤは□”９／ｌ？６
−ｚ次。

上記培養液体のアリコートを、緩衝液を含むＳ、ＤＳに
よシ希釈し、そして５ＤＳ−ポリアクリルアミドダル電
気泳動にかけた。ダル上の隣接レーンは、分子量積率及
びウシ膵臓リボヌクレアーゼを、含んだ。電気泳動の後
、そのダルを、カーマシーブリリアントプルにより染色
した。ウシ膵臓リゾヌクレアーゼよシもわずかに高’ｙ
Ｍｒに対応する移動度を有するタンパク質のバンドが、
形質転換された株において観察されたが、しかし形質転
換されていない対照のＡ、−ｙ−株（ＡＴＣＣ１０１５
）においては見られなかった。この染色されたタンパク
質の定量（ウシ膵臓リゾヌクレアーゼ活性に対して）は
、その濃度が培養Ｆ液の２０Ｍ９／Ｊであることを示し
た。

さらに同じ培養液体のアリコートを、５ｏμｇＡｔｌの
酵母ＲＮＡの存在下でキャストされた５ＤＳ−ポリアク
リルアミドダル上で分別した。電気泳動の後、１　ｑｂ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０，０１ＭのＴｒｉｍ　−Ｈ
Ｃｔ溶液（ｐＨ６，８）中に室温で１時間１次に０．Ｏ
ＩＭＯＴｒｉｍ−ＨＣ４溶液（ｐＨ６，８）中に室温で
２時間１次に０．ＯＩＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔ溶液（ｐＨ
６，８）中に３７℃で１時間、そのダルをソーキングす
ることによって、す？ヌクレアーゼ活性のために、その
ダルを活性染色にかけた。生物学的に活性のＩＪ　ｆヌ
クレアーゼによるＲＮＡ基質の加水分解は、２μｍ１／
ｙｎｌのエチジウムプロミド水溶液中に１０分間そのダ
ルをソーキングすることによって、そして過剰の染料を
除去した後、０．０１ＭのＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ中にお
よび１５分間ソーキングすることによって示され。

そして紫外線下でそのダルを調べる場合、螢光の局部欠
乏が観察された。この活性染色は、この培養液体忙おい
てタンノ４り質性バンドについて前に観察された同じ移
動度で移動した、形質転換された培養物の分別された培
養液体中における生物学的に活性なり、ｙヌクレアーゼ
の存在を示した。形質転換されていない対照の培養物の
分別された培養液のためには、この活性染色によってす
？ヌクレアーゼ活性は検出されなかった。

糸状菌は、広範囲の種類の内因性及び外因性タンパク質
の有効な産生のために使用され得ることが上記結果から
明らかである。その得られたタンパク質は良好な収率で
得られ、そしてそれらの生物学的且つ生理学的特性を保
持しながら、種々の目的のために使用され得る。その糸
状菌は増殖するのに容易であり、そしてたとえば注入で
きるものとしてそれらの使用忙有害な物質、たとえばエ
ンテロトキシン、外毒素、形質転換ＤＮＡ及び同様のも
のの実質的な不在によシ、哺乳類の処置のために使用さ
れ得るタンノヤク質の経済的産生を提供するために、既
知方法に従りて効果的に増殖され得る。

シラスミドｐ２７は、１９８６年５月３０日Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，に寄託され、そして寄託番号ｇ６７１２３号を
得た。

前述の発明は、明確忙理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども。

特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡ発現構成体であって、糸状菌細胞宿主におい
   て機能的な転写及び翻訳開始領域、糸状菌細胞によって
   分泌されるタンパク質をコードする構造遺伝子のシグナ
   ルリーダーのコドンの少なくとも６０％（個数）のフラ
   グメントを少なくとも含有する機能的なシグナルリーダ
   ー、該シグナルリーダーと正しく読み枠を合せて異種構
   造遺伝子を又は該シグナルリーダーと正しく読み粋を合
   せて天然の遺伝子よりも他の構造遺伝子を挿入するため
   の少なくとも１つの制限部位及び前記糸状菌細胞におい
   て機能的な終結領域を含んで成るＤＮＡ発現構成体。 ２、前記シグナルリーダーが糸状菌のグルコアミラーゼ
   遺伝子又はクチナーゼ遺伝子からである特許請求の範囲
   第１項記載のＤＮＡ発現構成体。 ３、前記糸状菌細胞において発現することができる優性
   選択マーカー遺伝子に連結される特許請求の範囲第１項
   記載のＤＮＡ発現構成体。 ４、ＤＮＡ発現構成体であって、糸状菌細胞宿主におい
   て機能的なグルコアミラーゼ転写及び翻訳開始領域、該
   グルコアミラーゼシグナルリーダーのコドンの少なくと
   も６０％（個数）のフラグメントを少なくとも含有する
   グルコアミラーゼシグナルリーダー、該シグナルリーダ
   ーと正しく読み枠を合せて異種構造遺伝子を又は該シグ
   ナルリーダーと正しく読み枠を合せてグルコアミラーゼ
   遺伝子よりも他の構造遺伝子を挿入するための少なくと
   も１つの制限部位及び前記糸状菌細胞において機能的な
   終結領域を含んで成るＤＮＡ発現構成体。 ５、選択切断部位をコードするＤＮＡ配列が前記シグナ
   ルリーダー及び前記構造遺伝子を分離する特許請求の範
   囲第４項記載のＤＮＡ発現構成体。 ６、ＤＮＡ発現構成体であって、糸状菌細胞宿主におい
   て機能的なクチナーゼ転写及び翻訳開始領域、該クチナ
   ーゼシグナルリーダーのコドンの少なくとも６０％（個
   数）のフラグメントを少なくとも含有するクチナーゼシ
   グナルリーダー、該シグナルリーダーと正しく読み枠を
   合せて異種構造遺伝子を又は該シグナルリーダーと正し
   く読み枠を合せてクチナーゼ遺伝子よりも他の構造遺伝
   子を挿入するための少なくとも１つの制御部位及び前記
   糸状菌細胞において機能的な終結領域を含んで成るＤＮ
   Ａ発現構成体。 ７、前記構造遺伝子を含むＤＮＡ発現構成体（糸状菌細
   胞宿主において機能的な転写及び翻訳開始領域、糸状菌
   細胞によって分泌されるタンパク質をコードする構造遺
   伝子のシグナルリーダーのコドンの少なくとも６０％（
   個数）のフラグメントを少なくとも含有する機能的なシ
   グナルリーダー、該シグナルリーダーと正しく読み枠を
   合せて異種構造遺伝子を又は該シグナルリーダーと正し
   く読み枠を合せて天然の遺伝子よりも他の構造遺伝子を
   挿入するための少なくとも１つの制限部位及び前記糸状
   菌細胞において機能的な終結領域を含んで成る）を包含
   するゲノム（該ゲノム中に少なくとも１度組込まれた該
   構成体）を含んで成る糸状菌細胞。 ８、前記構造遺伝子を含むＤＮＡ発現構成体（糸状菌細
   胞宿主において機能的なグルコアミラーゼ転写及び翻訳
   開始領域、該グルコアミラーゼシグナルリーダーのコド
   ンの少なくとも６０％（個数）のフラグメントを少なく
   とも含有するグルコアミラーゼシグナルリーダー、該シ
   グナルリーダーと正しく読み枠を合せて異種構造遺伝子
   を又は該シグナルリーダーと正しく読み枠を合せてグル
   コアミラーゼ遺伝子よりも他の構造遺伝子を挿入するた
   めの少なくとも１つの制限部位及び前記糸状菌細胞にお
   いて機能的な終結領域を含んで成るＤＮＡ発現構成体）
   を包含するゲノム（該ゲノム中に少なくとも１度組込ま
   れた該構成体）を含んで成る糸状菌細胞。 ９、前記構造遺伝子を含むＤＮＡ発現構成体（糸状菌細
   胞宿主において機能的なクチナーゼ転写及び翻訳開始領
   域、該クチナーゼシグナルリーダーのコドンの少なくと
   も６０％（個数）のフラグメントを少なくとも含有する
   クチナーゼシグナルリーダー、該シグナルリーダーと正
   しく読み枠を合せて異種構造遺伝子を又は該シグナルリ
   ーダーと正しく読み枠を合せてクチナーゼ遺伝子よりも
   他の構造遺伝子を挿入するための少なくとも１つの制限
   部位及び前記糸状菌細胞において機能的な終結領域を含
   んで成るＤＮＡ発現構成体）を包含するゲノム（該ゲノ
   ム中に少なくとも１度組込まれた該構成体）を含んで成
   る糸状菌細胞。 １０、前記構成体を、優性選択マーカーに連結する特許
   請求の範囲第７項記載の糸状菌細胞。 １１、前記構成体を、優性選択マーカーに連結する特許
   請求の範囲第８項記載の糸状菌細胞。 １２、前記構成体を、優性選択マーカーに連結する特許
   請求の範囲第９項記載の糸状菌細胞。 １３、前記構造遺伝子を含む特許請求の範囲第１項記載
   の構造体を包含するゲノム（該ゲノム中に少なくとも１
   度組込まれた該構成体）を含んで成る糸状菌細胞がアス
   ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌細胞である特
   許請求の範囲第７項記載の糸状菌細胞。 １４、前記構造遺伝子を含む特許請求の範囲第４項記載
   の構造体を包含するゲノム（該ゲノム中に少なくとも１
   度組込まれた該構成体）を含んで成る糸状菌細胞がアス
   ペルギルス菌細胞である特許請求の範囲第８項記載の糸
   状菌細胞。 １５、前記構造遺伝子を含む特許請求の範囲第６項記載
   の構造体を包含するゲノム（該ゲノム中に少なくとも１
   度組込まれた該構成体）を含んで成る糸状菌がアスペル
   ギルス菌細胞である特許請求の範囲第９項記載の糸状菌
   細胞。 １６、前記構造遺伝子がプロインシュリン遺伝子である
   特許請求の範囲第１３、１４又は１５項記載の糸状菌細
   胞。