JPS6344596A - 新規抑制因子ペプチド - Google Patents
新規抑制因子ペプチドInfo
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- JPS6344596A JPS6344596A JP62195442A JP19544287A JPS6344596A JP S6344596 A JPS6344596 A JP S6344596A JP 62195442 A JP62195442 A JP 62195442A JP 19544287 A JP19544287 A JP 19544287A JP S6344596 A JPS6344596 A JP S6344596A
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- Japan
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- peptide
- amino acid
- arg
- protein
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈発明の背景〉
本発明は新規ヘプチドに関する。更に詳細には、本発明
はミリストイル化酵素の抑制因子として有用な、６−８
個のアミノ酸残基を有する特異なヘプチドに関する、 真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知ら
れた工程であり、これは便宜上２つに分類することがで
きる。即ち、その１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴル
ゾ体において、バルミテー） （Ｃ１６）がエステル又
はチオエステル結合を介して膜蛋白質に結合する工、Ｓ
であり、他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階におい
てミｌ）ステート（Ｃ１４）がアミド結合を介して溶解
性の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリスト
イル蛋白質では、そのアシル化部位はアミン末端グリシ
ン残基であることが知られているＣ Ａｉｔｋｉｎら。
はミリストイル化酵素の抑制因子として有用な、６−８
個のアミノ酸残基を有する特異なヘプチドに関する、 真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知ら
れた工程であり、これは便宜上２つに分類することがで
きる。即ち、その１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴル
ゾ体において、バルミテー） （Ｃ１６）がエステル又
はチオエステル結合を介して膜蛋白質に結合する工、Ｓ
であり、他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階におい
てミｌ）ステート（Ｃ１４）がアミド結合を介して溶解
性の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリスト
イル蛋白質では、そのアシル化部位はアミン末端グリシ
ン残基であることが知られているＣ Ａｉｔｋｉｎら。
ＦＥＢＳＬｅｔｔ、１５０．３１４−３１８（１９８２
）；５ｃｈｕｌｔｚら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２７
ｅ ４２７−４２９（１９８５） ； Ｃａｒｒら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
）；５ｃｈｕｌｔｚら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２７
ｅ ４２７−４２９（１９８５） ； Ｃａｒｒら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ７９． ６１２８−６１３１ （１９８２）；
Ｏｚｏ １ ｓら、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５
９． １３３４９−１３３５４（１９８４）：及びＨｅ
ｎｄｅｒｓｏｎら。
Ｏｚｏ １ ｓら、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５
９． １３３４９−１３３５４（１９８４）：及びＨｅ
ｎｄｅｒｓｏｎら。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８
０ ＊ ３３ ９ −３４３（１９８３） 〕。
０ ＊ ３３ ９ −３４３（１９８３） 〕。
蛋白質のＮ−ミリストイル化については、今日、ようや
くその機能が認識され始めたところである。
くその機能が認識され始めたところである。
公知の４つのＮ−ミリストイル蛋白質として、ｐ６０５
ｒ０ｔ サイクリック尼０依存プロティンキナーゼの触
媒サブユニット、カルシノイリンＢ−サブユニット、ネ
ズミ白血病ウィル発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂｌａ合蛋白質
があり、これらはプロティンキナーゼ、あるいは細廊の
生合成経路を調節するホスホプロティンキナーゼの調節
因子のいずれかである。ｐ６ｇ’Ｖ−８ｒＣの場合、膜
との結合及びこの蛋白質の細肥形質転換能を発現するた
めにはミ’）ストイル化が必要であることが示されてい
るＣ Ｃｒｏｓｓら、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ４． １８３４−１８４２ （１９８４）
； Ｋａｍｐｓら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｒ０ｔ サイクリック尼０依存プロティンキナーゼの触
媒サブユニット、カルシノイリンＢ−サブユニット、ネ
ズミ白血病ウィル発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂｌａ合蛋白質
があり、これらはプロティンキナーゼ、あるいは細廊の
生合成経路を調節するホスホプロティンキナーゼの調節
因子のいずれかである。ｐ６ｇ’Ｖ−８ｒＣの場合、膜
との結合及びこの蛋白質の細肥形質転換能を発現するた
めにはミ’）ストイル化が必要であることが示されてい
るＣ Ｃｒｏｓｓら、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ４． １８３４−１８４２ （１９８４）
； Ｋａｍｐｓら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８２ ｅ ４６２５
−４６２８（１９８５））。
−４６２８（１９８５））。
ペプチド合成法によシ共有結合せしめて得られる比較的
短鎖の合成ペプチドの開発は、同定する際にまた酵素作
用による脂肪酸アシル化の調ｉを研究する上で非常に望
ましいものである。このようなペプチドによシ、酵母あ
るいは補乳動物細廊のミリストイル化酵素の合成基質を
提供することができる。またこのようなペプチドにより
、天然の基質に対して高置に特異的な競争抑制因子を提
供することも可能である。か（して、ミリストイル化酵
素の基質として提供することのできる新規合成ペプチド
が得られ、これらについては肌Ｓ。
短鎖の合成ペプチドの開発は、同定する際にまた酵素作
用による脂肪酸アシル化の調ｉを研究する上で非常に望
ましいものである。このようなペプチドによシ、酵母あ
るいは補乳動物細廊のミリストイル化酵素の合成基質を
提供することができる。またこのようなペプチドにより
、天然の基質に対して高置に特異的な競争抑制因子を提
供することも可能である。か（して、ミリストイル化酵
素の基質として提供することのできる新規合成ペプチド
が得られ、これらについては肌Ｓ。
ＰａｔｅｎｔＳｅｒ、／１６８９４．２３５（１９８６
年８月７日出ｄ）号明細書に記載されて２す、これら基
質の好ましい例として次のオクタペプチドがある。
年８月７日出ｄ）号明細書に記載されて２す、これら基
質の好ましい例として次のオクタペプチドがある。
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ −Ａｒｇミリストイル化反応について表わせば次
のようになる。
ｒｇ −Ａｒｇミリストイル化反応について表わせば次
のようになる。
〈発明の要旨〉
本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ
フ選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の押割因子ペプチド又はその生理学的許容し得るアミド
誘導体もしくは塩誘導体が提供される。
フ選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の押割因子ペプチド又はその生理学的許容し得るアミド
誘導体もしくは塩誘導体が提供される。
Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ 。
Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ
又は１日 Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ 。
又は１日 Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ 。
（式中、ＲはＬｅｕ 、 Ｐｈｅ 、 Ｔｙｒ又は
Ｖａｌを示す）これらペプチドのアミド誘導体としては
カルボキサミドが挙げられ、塩誘導体としてはＨＣｌ塩
が挙げられる。
Ｖａｌを示す）これらペプチドのアミド誘導体としては
カルボキサミドが挙げられ、塩誘導体としてはＨＣｌ塩
が挙げられる。
〈発明の詳細な記述〉
本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を適
当に採用することによって合成することができる。構成
アミノ酸をペプチド鎖に付加して行く一連の縮合反応に
よシ、目的とするペプチドを調製することができる。
当に採用することによって合成することができる。構成
アミノ酸をペプチド鎖に付加して行く一連の縮合反応に
よシ、目的とするペプチドを調製することができる。
各種の試粱即ち、カルボベンシルオキシ基、ｔ−ブチル
オキシカルボニル（ＢＯＣ）基などのＮ−保護基；ジシ
クロヘキシル力ルポゾイミド、カルボニルジイミダゾー
ルなどの縮合剤；Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化
エステル；トリフルオロ酢酸、 ＨＣノジオキサン浴液
、ボロントリス（トリフルオロアセテート）、シアノダ
ンプロマイトなどの開裂剤を使用することは、古典的ペ
プチド合成にはよく仰られた事項であり、またｍ液中で
の単離品との反応あるいは中間体の精製などもよく知ら
れている。
オキシカルボニル（ＢＯＣ）基などのＮ−保護基；ジシ
クロヘキシル力ルポゾイミド、カルボニルジイミダゾー
ルなどの縮合剤；Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化
エステル；トリフルオロ酢酸、 ＨＣノジオキサン浴液
、ボロントリス（トリフルオロアセテート）、シアノダ
ンプロマイトなどの開裂剤を使用することは、古典的ペ
プチド合成にはよく仰られた事項であり、またｍ液中で
の単離品との反応あるいは中間体の精製などもよく知ら
れている。
本発明のペプチドは、よく知られたＭ６ｒｒｉｆｉｅｌ
ｄの固相支持法［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ＊ Ｊ、 Ａ
ｍｅｒ、 Ｃｈｅｍ。
ｄの固相支持法［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ＊ Ｊ、 Ａ
ｍｅｒ、 Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、８５． ２１４９−５４（１９６３）：５ｃｉ
ｅｎｃｅ １５０ 、１７８−８５ （１９６５） 〕
によって好ましく調製することができる。この方法では
、古典的ペプチド合成に使用される反応を何回も繰り返
しまた保護基を何回も使用するが、この方法によれば、
通常、架橋ポリスチレン又はスチレンーゾビニルベンゼ
ンコボリマーなどの固相支持体上にそのカルボキシ末端
が固定された目的とするペプチド鎖が得られる。この方
法では、各工程での過剰な試薬を、単にポリマーを洗う
ことによって除去することができるため、多くの操作を
簡略化することが可能である。
ｅｎｃｅ １５０ 、１７８−８５ （１９６５） 〕
によって好ましく調製することができる。この方法では
、古典的ペプチド合成に使用される反応を何回も繰り返
しまた保護基を何回も使用するが、この方法によれば、
通常、架橋ポリスチレン又はスチレンーゾビニルベンゼ
ンコボリマーなどの固相支持体上にそのカルボキシ末端
が固定された目的とするペプチド鎖が得られる。この方
法では、各工程での過剰な試薬を、単にポリマーを洗う
ことによって除去することができるため、多くの操作を
簡略化することが可能である。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成法の一連の工ａｔ
示すと次のようになる。
示すと次のようになる。
工程）
（ＰＳはポリスチレンを示す。）
（ＣＨ３ＣＨ２）３Ｎ”ＨＣ／一
工程）
Ｒ２
Ｃ６Ｈ１，ＮＨＣＮＨＣ６Ｈ１工
工程Ｉに次いで、例えば２５％トリフルオロ酢酸のメチ
レンクロライド溶液でｔ −ＢＯＣを脱離せしめ、更に
過剰のトリエチルアミンを加えて遊離のＮ−アミノ末端
を得て、第２の保護されたアミノ酸（Ｒ２）の活性化エ
ステルとの反応を可能にせしめる。最終工程では、例え
ば無水ＨＦのアニソール溶液で処理して、目的とする完
成されたボリペゾチドｆｔｐｓ樹脂から脱離する。
レンクロライド溶液でｔ −ＢＯＣを脱離せしめ、更に
過剰のトリエチルアミンを加えて遊離のＮ−アミノ末端
を得て、第２の保護されたアミノ酸（Ｒ２）の活性化エ
ステルとの反応を可能にせしめる。最終工程では、例え
ば無水ＨＦのアニソール溶液で処理して、目的とする完
成されたボリペゾチドｆｔｐｓ樹脂から脱離する。
これらの固相支持法についての更に詳細な事項について
は、Ｓｔｅｗａｒｔ （！： Ｙｏｕｎｇの文献”固相
ペプ１９６９ ： Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの総説′″Ａ
ａｖａｎｃ６ｓ ｉｎＥｎＺ７ｍＯＩＯｇ７”３２．
ｐｌ）、２２１−２９６． Ｆ、Ｆ。
は、Ｓｔｅｗａｒｔ （！： Ｙｏｕｎｇの文献”固相
ペプ１９６９ ： Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの総説′″Ａ
ａｖａｎｃ６ｓ ｉｎＥｎＺ７ｍＯＩＯｇ７”３２．
ｐｌ）、２２１−２９６． Ｆ、Ｆ。
Ｎｏ１ｄ 、 Ｅｄ−＋ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、 ＮｅＷｙｏｒｋ、 １９
６９ ； Ｅｒ１ｃｋｓｏｎとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの
文献” Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ” Ｖｏｌ ２．
ｐ、：２５５ ｅｔ ｓｅｑ。
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、 ＮｅＷｙｏｒｋ、 １９
６９ ； Ｅｒ１ｃｋｓｏｎとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの
文献” Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ” Ｖｏｌ ２．
ｐ、：２５５ ｅｔ ｓｅｑ。
（ｅｄ、 ＮｅｕｒａｔｈとＨｌｌｌ ） ｅ Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 １９
７６などが参考とされる。
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 １９
７６などが参考とされる。
本発明の好ましい抑制因子ペプチドとしては欠のオクタ
ペプチドが挙げられる。
ペプチドが挙げられる。
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｔｙｒ −Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ本発明のへキナペ
ゾチド、ヘプタペプチド抑制因子としては、上記したそ
れぞれのオクタペプチドのカルボキシ末端の１つ又は２
つのアルヤニンが欠失したヘキサペプチド、ヘプタへゾ
チドが好ましいものとして挙げられる。アミノ酸配列の
２番目の位置に、疎水性基を有するペプチドが好ましい
。かかるペプチドはミリストイル化酵素の基Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇのミリストイル化を抑制する。チロシンを含有するオ
クタペプチドは３．１５ ｍの見掛けＫｉ値を有する。
Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｔｙｒ −Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ本発明のへキナペ
ゾチド、ヘプタペプチド抑制因子としては、上記したそ
れぞれのオクタペプチドのカルボキシ末端の１つ又は２
つのアルヤニンが欠失したヘキサペプチド、ヘプタへゾ
チドが好ましいものとして挙げられる。アミノ酸配列の
２番目の位置に、疎水性基を有するペプチドが好ましい
。かかるペプチドはミリストイル化酵素の基Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇのミリストイル化を抑制する。チロシンを含有するオ
クタペプチドは３．１５ ｍの見掛けＫｉ値を有する。
アミノ酸配列の２番目の位置にロイシン又はバリン残基
を有するオクタペプチドは基質として機能するが、それ
ぞれ３．３ ｍＭ、 ３．７ ｍＭの大きな見掛けＫ
つ値を有しており、また基質 Ｇｌｙ−Ａｓ ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ａｒｇに対して小さな最大速度（■ｍａｘ）
含有する。これらのオクタペプチドはいずれも、Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ａｒｇのミリストイル化を抑制する。ロイシン含有オク
タペプチドは、０．０６ ｍＭ ＣＤ Ｋ０値を有し、
競争的に抑制する。
を有するオクタペプチドは基質として機能するが、それ
ぞれ３．３ ｍＭ、 ３．７ ｍＭの大きな見掛けＫ
つ値を有しており、また基質 Ｇｌｙ−Ａｓ ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ａｒｇに対して小さな最大速度（■ｍａｘ）
含有する。これらのオクタペプチドはいずれも、Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ａｒｇのミリストイル化を抑制する。ロイシン含有オク
タペプチドは、０．０６ ｍＭ ＣＤ Ｋ０値を有し、
競争的に抑制する。
本発明の好ましいオクタペプチドは、２＃ｒ目の位置の
アスパラギンの代わりにロイシン、フェニルアラニン、
トリジシン又はバリンが置換した以外は、牛心筋のＣＡ
ＭＰ依存プロティンキナーゼのＮ末端側の６個のアミノ
酸残基と同じ配列を有し、それに続いて２つのアルヤニ
ン残基を有する。このアルヤニン残基は、ｃａｒｒらに
よって報告された（ Ｐｒｏｃ −Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 ５Ｃ１−ＵＳＡ ７９ ＋ ６１２８−６１３１
（１９８２）ＩＮ末端へブタペプチド配列のりシン残
基に代わる残基に相当する。ｃａｒｒのへブタペプチド
は、もとの蛋白質のシアノ）ｆ７ブロマイド開裂断片が
加水分解を受けて生じた、ブロックされたトリプシン断
片として得られたものである。内在性の蛋白質はすでに
ミリストイル化を受けているので、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
のアシル化アクセプターとして使用することはできない
。
アスパラギンの代わりにロイシン、フェニルアラニン、
トリジシン又はバリンが置換した以外は、牛心筋のＣＡ
ＭＰ依存プロティンキナーゼのＮ末端側の６個のアミノ
酸残基と同じ配列を有し、それに続いて２つのアルヤニ
ン残基を有する。このアルヤニン残基は、ｃａｒｒらに
よって報告された（ Ｐｒｏｃ −Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 ５Ｃ１−ＵＳＡ ７９ ＋ ６１２８−６１３１
（１９８２）ＩＮ末端へブタペプチド配列のりシン残
基に代わる残基に相当する。ｃａｒｒのへブタペプチド
は、もとの蛋白質のシアノ）ｆ７ブロマイド開裂断片が
加水分解を受けて生じた、ブロックされたトリプシン断
片として得られたものである。内在性の蛋白質はすでに
ミリストイル化を受けているので、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
のアシル化アクセプターとして使用することはできない
。
合成オクタペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｒ ｇ −Ａｒ ｇ金柑いて、ユ
ニークな酵素活性の確認、即ちミリスチンばをこのヘプ
チドあるいは他のぺする新規ヘプチドの抑制活性は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅのＮ
−ミリストイルグリシンペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミ
リストイルトランスフェラーゼ）を用いて証明すること
ができる。かかる酵素活性は、〔３Ｈ〕−ミリスチン酸
のアクセプターペプチドへの移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで
アッセイすることにより測定した。移動反応は、アデノ
シントリホスフェ−） （ＡＴＰ ）及びコエンデイム
Ａ（ＣＯＡ）に依存している。次いで、得られるミリス
トイル化酵素生成物を、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）を用いて化学的に合成したミリストイル化ペ
プチド標準物質を一緒に溶出せしめて同定した。酵素反
応生成物と化学的に合成した標準物質とが同一でありそ
れらのグリシン残基にミリステートが共有結合している
ことを証明するために、ＨＰＬＣ槓製標準物質と酵素反
応生成物とをプロナーゼで消化し、逆相ＨＰＬＣで分析
した。これによフ、両者にはＭ−ミリストイル化グリシ
ン残基が含まれていることが判った。
Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｒ ｇ −Ａｒ ｇ金柑いて、ユ
ニークな酵素活性の確認、即ちミリスチンばをこのヘプ
チドあるいは他のぺする新規ヘプチドの抑制活性は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅのＮ
−ミリストイルグリシンペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミ
リストイルトランスフェラーゼ）を用いて証明すること
ができる。かかる酵素活性は、〔３Ｈ〕−ミリスチン酸
のアクセプターペプチドへの移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで
アッセイすることにより測定した。移動反応は、アデノ
シントリホスフェ−） （ＡＴＰ ）及びコエンデイム
Ａ（ＣＯＡ）に依存している。次いで、得られるミリス
トイル化酵素生成物を、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）を用いて化学的に合成したミリストイル化ペ
プチド標準物質を一緒に溶出せしめて同定した。酵素反
応生成物と化学的に合成した標準物質とが同一でありそ
れらのグリシン残基にミリステートが共有結合している
ことを証明するために、ＨＰＬＣ槓製標準物質と酵素反
応生成物とをプロナーゼで消化し、逆相ＨＰＬＣで分析
した。これによフ、両者にはＭ−ミリストイル化グリシ
ン残基が含まれていることが判った。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
プロテアーゼ欠損株Ｊ Ｒ１５３（ＨｅＨｅｍｍ１ａら
、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
プロテアーゼ欠損株Ｊ Ｒ１５３（ＨｅＨｅｍｍ１ａら
、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７８＊ ４３５−４３
９ （１９８１））をＮ−ミリストイルグリシンペプチ
ドシンセターゼの原料として用いて、オクタペプチドの
アシル化を証明した。この酵母を〔３Ｈ〕ミリスチンば
でラヘル化し、細ｋｌ ｆｅ浴屏し次いでドデシル硫酸
す。
９ （１９８１））をＮ−ミリストイルグリシンペプチ
ドシンセターゼの原料として用いて、オクタペプチドの
アシル化を証明した。この酵母を〔３Ｈ〕ミリスチンば
でラヘル化し、細ｋｌ ｆｅ浴屏し次いでドデシル硫酸
す。
トリウムポリアクリルアミドデル電気泳動（５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ ）で細胞蛋白質を分析したところ、この株には
内在性のＮ−ミリストイル化蛋白質が含まれていること
が判った。Ｎ −（”Ｈ）ミリストイルグリシンは、ラ
ベル化内在性アシル化蛋白質をプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分離し分析することにより単離することが
出来る。
ＡＧＥ ）で細胞蛋白質を分析したところ、この株には
内在性のＮ−ミリストイル化蛋白質が含まれていること
が判った。Ｎ −（”Ｈ）ミリストイルグリシンは、ラ
ベル化内在性アシル化蛋白質をプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分離し分析することにより単離することが
出来る。
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
不明ａ畳に記述するすべてのペプチドは、ミリストイル
化酵素の基質であるペプチドの合成に用いた以下の合成
法に本質的に従って調製した。
化酵素の基質であるペプチドの合成に用いた以下の合成
法に本質的に従って調製した。
Ａ、 Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｌｆｉ
ｅｌｄ 、 Ｊ、 Ａｍ。
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｌｆｉ
ｅｌｄ 、 Ｊ、 Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、 ８ｏｃ、、 ８５． ２１４９−２１５
４ （１９６３）：１に従い、樹脂１１当り０−３５
ｍｍｏｌのアミノ基の置換基を有するｐ−メチルベンゾ
ルヒドリルアミン樹脂上に、ペプチドを合成した。ＢＯ
Ｃ保護アミノ酸（４当量）を用い、ＢＯＣ保護アミノ酸
とジシクロへキシルアミドを２：１でジクロロメタン中
で１５分間混合して、対称性無水物を得た。溶媒を減圧
下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに再溶解し
、樹脂と混合し次いで１時間激しく攪拌した。アスパラ
ギンとの反応では（グルタミン、アルヤーンの場合でも
）、等モルｔｈｔ（アミノ酸に対して〕のヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。５０％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ ）のジクロロメタン＃液を用い
てＢＯＣ保護基を脱離せしめ、アミノ酸と縮合する前に
１０％０％ジイソプロビルエチルアミジメチルホルムア
ミド溶液を加えて樹脂を中和した。
４ （１９６３）：１に従い、樹脂１１当り０−３５
ｍｍｏｌのアミノ基の置換基を有するｐ−メチルベンゾ
ルヒドリルアミン樹脂上に、ペプチドを合成した。ＢＯ
Ｃ保護アミノ酸（４当量）を用い、ＢＯＣ保護アミノ酸
とジシクロへキシルアミドを２：１でジクロロメタン中
で１５分間混合して、対称性無水物を得た。溶媒を減圧
下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに再溶解し
、樹脂と混合し次いで１時間激しく攪拌した。アスパラ
ギンとの反応では（グルタミン、アルヤーンの場合でも
）、等モルｔｈｔ（アミノ酸に対して〕のヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。５０％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ ）のジクロロメタン＃液を用い
てＢＯＣ保護基を脱離せしめ、アミノ酸と縮合する前に
１０％０％ジイソプロビルエチルアミジメチルホルムア
ミド溶液を加えて樹脂を中和した。
ペプチドを樹脂から除去し、液体ＨＦ／アニソール（９
： １． Ｖ／Ｖ ）を用いて０℃で１時間で脱保護せ
しめた。５０％酢酸水浴液で樹脂から粗ペゾチドを抽出
し、次いで凍結乾燥した。
： １． Ｖ／Ｖ ）を用いて０℃で１時間で脱保護せ
しめた。５０％酢酸水浴液で樹脂から粗ペゾチドを抽出
し、次いで凍結乾燥した。
Ｂ、精製
粗ペプチドを水に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ μｍＢｏｎｄ
ａｐａｋＣ工。カラム（１９關Ｘ１５０ｊ１１）＆て杓
し、〇−１５％アセトニトリル（０，０５％ＴＦＡ ）
水（０，０５％ＴＦＡ ）溶液勾配を用いて、流速９ゴ
／分で１５分間溶出せしめた。生成物を含む画分金集め
て凍結乾燥した。ペプチドの純度及び同定は、ＨＰＬＣ
分析及びアミノ酸分析により確認した。
ａｐａｋＣ工。カラム（１９關Ｘ１５０ｊ１１）＆て杓
し、〇−１５％アセトニトリル（０，０５％ＴＦＡ ）
水（０，０５％ＴＦＡ ）溶液勾配を用いて、流速９ゴ
／分で１５分間溶出せしめた。生成物を含む画分金集め
て凍結乾燥した。ペプチドの純度及び同定は、ＨＰＬＣ
分析及びアミノ酸分析により確認した。
実施例２
電気泳動分析のだめの酵母蛋臼實のラベル化及び抽出
酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３，接合
型ａｌｐｈａ、 ｔ、ｒｐｌ、 Ｐｒｂｌ 、
Ｐｒｃｌ 、 ｐｅｐ ４−３ ）を、回転攪拌機中
のＹＰＤ培地（１％酵母佃出物、２％バクトペゾトン及
び２（７ｏデキストロース蒸留水溶液〕で６０℃で生育
せしめて６６０ ｎｍでの光学密度が１−６とした。〔
３Ｈ〕脂肪酸１．ｎｃｉのエタノール浴液１０μｌ’ｚ
加えて同定条件下で３０分間処理して、酵母の培養液の
１５−アリコート金ラベル化した。ラベル化反応の最後
に、培養液を氷で５分間冷却し、次いで７６００ＸＮで
１０分間遠心して４℃で細胞をペレット化した。次いで
細胞を、Ｉ Ｑ ｍＭ ＮａＮ３の１４０ ｍＭ Ｎａ
（Ｊ ／ １Ｑ！１１Ｍホスフェート溶液（ｐＨ７，２
）１ｄに再懸濁し、次いでポリプロピレン製の円錐形遠
心チューブ１．５−に移して、４°Ｃで上記と同様にし
て遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を５ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７−４）ｔ ３ ｍＭゾチオスレイ
トール。
型ａｌｐｈａ、 ｔ、ｒｐｌ、 Ｐｒｂｌ 、
Ｐｒｃｌ 、 ｐｅｐ ４−３ ）を、回転攪拌機中
のＹＰＤ培地（１％酵母佃出物、２％バクトペゾトン及
び２（７ｏデキストロース蒸留水溶液〕で６０℃で生育
せしめて６６０ ｎｍでの光学密度が１−６とした。〔
３Ｈ〕脂肪酸１．ｎｃｉのエタノール浴液１０μｌ’ｚ
加えて同定条件下で３０分間処理して、酵母の培養液の
１５−アリコート金ラベル化した。ラベル化反応の最後
に、培養液を氷で５分間冷却し、次いで７６００ＸＮで
１０分間遠心して４℃で細胞をペレット化した。次いで
細胞を、Ｉ Ｑ ｍＭ ＮａＮ３の１４０ ｍＭ Ｎａ
（Ｊ ／ １Ｑ！１１Ｍホスフェート溶液（ｐＨ７，２
）１ｄに再懸濁し、次いでポリプロピレン製の円錐形遠
心チューブ１．５−に移して、４°Ｃで上記と同様にし
て遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を５ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７−４）ｔ ３ ｍＭゾチオスレイ
トール。
１％ＳＤＳ及び１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフル
オライドを含む液１００μｌに再懸濁し、氷で冷却しな
がら６０秒間の激しい渦動を６回繰り返し、細胞１個と
等容量の０．５ｍｍガラスピーズで細胞を破壊した。次
いでテイデルトップエンペンドルフ（ｔａｂｌｅｔｏｐ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ）遠心分離機で８０００）ｌで
６０秒間遠心して、細胞の破片を除いた。次いで上溝液
を、８ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ （Ｐ）１８．０）１２５μ
ｊ中で’ｌ ＱｍＭヨードアセトアミドで室ア 温下１時間処理してアルキル化した。２０μ１．ｆリコ
ートを用いて、慣用的ＳＤＳ −ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５９． ５３
６４−５３６７（１９８４）に記載されたフルオログラ
フィー法によシ分析した。
オライドを含む液１００μｌに再懸濁し、氷で冷却しな
がら６０秒間の激しい渦動を６回繰り返し、細胞１個と
等容量の０．５ｍｍガラスピーズで細胞を破壊した。次
いでテイデルトップエンペンドルフ（ｔａｂｌｅｔｏｐ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ）遠心分離機で８０００）ｌで
６０秒間遠心して、細胞の破片を除いた。次いで上溝液
を、８ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ （Ｐ）１８．０）１２５μ
ｊ中で’ｌ ＱｍＭヨードアセトアミドで室ア 温下１時間処理してアルキル化した。２０μ１．ｆリコ
ートを用いて、慣用的ＳＤＳ −ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５９． ５３
６４−５３６７（１９８４）に記載されたフルオログラ
フィー法によシ分析した。
〔３Ｈ〕脂肪酸の蛋白質結合分析
還元及びアルキル化された〔３Ｈ〕脂肪酸ラベル化酵母
蛋白質２０μノを、新たに調製した４Ｍヒドロキシルア
ミン／ ２ Ｑ ｍ Ｍグリシン（’ｐＨ１０）７μ！
で処理した。２６°Ｃで４時間処理後、電気泳動及びフ
ルオログラフィー用にサンプルを調製した□ ＪＲＩ ５３の２０．０００ダルトンのアシル化蛋白質
への〔噌〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定化結
合を測定するため、脂肪酸を添加する前に酵母脂肪酸合
成の抑制因′子として知られ、ＪＲＩ−５３での特異的
アシル蛋白質のラベル化を数倍に促進するセルレニン２
μｇ／ｍｌで細胞を１５分間処理した以外は、上記した
と同様にして培養液をラベル化した。次いで細胞の蛋白
質を調製し、ＳＤＳ １２％ポリアクリルアミドデル電
気泳動で分離した。この際サンプルレーンのす＜−隣、
り ｔＤ ｖ −ンに、あらかじめ発色せしめた分子量
標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電気泳動後、未
乾燥サンプルデルレーンの分子！ ２０，０００ダルト
ンの領域から、デルスライス２．Ｗｌｌを切シ出した。
蛋白質２０μノを、新たに調製した４Ｍヒドロキシルア
ミン／ ２ Ｑ ｍ Ｍグリシン（’ｐＨ１０）７μ！
で処理した。２６°Ｃで４時間処理後、電気泳動及びフ
ルオログラフィー用にサンプルを調製した□ ＪＲＩ ５３の２０．０００ダルトンのアシル化蛋白質
への〔噌〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定化結
合を測定するため、脂肪酸を添加する前に酵母脂肪酸合
成の抑制因′子として知られ、ＪＲＩ−５３での特異的
アシル蛋白質のラベル化を数倍に促進するセルレニン２
μｇ／ｍｌで細胞を１５分間処理した以外は、上記した
と同様にして培養液をラベル化した。次いで細胞の蛋白
質を調製し、ＳＤＳ １２％ポリアクリルアミドデル電
気泳動で分離した。この際サンプルレーンのす＜−隣、
り ｔＤ ｖ −ンに、あらかじめ発色せしめた分子量
標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電気泳動後、未
乾燥サンプルデルレーンの分子！ ２０，０００ダルト
ンの領域から、デルスライス２．Ｗｌｌを切シ出した。
ゲルスライスを１０％メタノール水溶液０．５４でリン
スし、次Ａで５ Ｑ ｍ Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ
７，９） １ ａｔ中で、３７°Ｃで７２時間、Ｌａｂ
ｑｕａｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＋
Ｂｅｒｋｅｌｅｙｔ ７Ａ）で混合しながらプロナーゼ
Ｅ （Ｓｉｇｍａ、 ８ｔ、 Ｌｏｕｉａ、ＭＯ）１〜
でそれぞれ消化した。消化処理１検体幽９１μｌのトル
エンを加えて微生物の生育を抑えた。
スし、次Ａで５ Ｑ ｍ Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ
７，９） １ ａｔ中で、３７°Ｃで７２時間、Ｌａｂ
ｑｕａｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＋
Ｂｅｒｋｅｌｅｙｔ ７Ａ）で混合しながらプロナーゼ
Ｅ （Ｓｉｇｍａ、 ８ｔ、 Ｌｏｕｉａ、ＭＯ）１〜
でそれぞれ消化した。消化処理１検体幽９１μｌのトル
エンを加えて微生物の生育を抑えた。
２４時間目に新たなプロナーゼｇ１９を加えた。
消化後、それぞれの消化液のアリコートについて放射活
性の存在を測定した。放射活性を有するスライスから消
化液を除き、ゲルスライスを０．１％ＳＤＳ ５００μ
！でリンスし、消化液とリンス液を合わせて６Ｎ ＨＣ
Ｉ ４０μｌでｐＨ１−２に調整した。
性の存在を測定した。放射活性を有するスライスから消
化液を除き、ゲルスライスを０．１％ＳＤＳ ５００μ
！でリンスし、消化液とリンス液を合わせて６Ｎ ＨＣ
Ｉ ４０μｌでｐＨ１−２に調整した。
かくして得たは性溶液をクロロホルム−メタノール（２
：１．Ｖ／Ｖ）１．５ゴで２回抽出した。有機層を集め
、クロロホルム−メタノール−〇、０１ Ｎ５ｃｔ （
１： １０ ： １０ 、 ｖ／ｖ／ｖ ） １ ｄで
１回洗浄し、有機層を窒素気流で乾燥した。得られる残
渣ｔ−５０％メタノール−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ
（これについては後述する）に再浴解した。抽出操作後
、もとの蛋白質消化液の放射活性の９７％が回収された
。Ｗａｔｅｒｓ μｍ Ｂｏｎｄａｐａｋ ｃｌＢカラ
ムを用い、バッファーＡとして０．１％トリフルオロ酢
酸１０．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢ
として０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
を用いて、流速１ゴ／分の逆相ＨＰＬＣに、サンプルを
付し、１分画＃）１％上昇するアセトニトリル匂配で溶
出せしめた６１分間の画分を集めて、その放射活性を液
体シンチレーションカウンターによプ測定した。ミリス
トイル化〔３Ｈ〕グリシン標準物質は、’ｒｏｗｌｅｒ
とＧｌａｓｅｒ 。
：１．Ｖ／Ｖ）１．５ゴで２回抽出した。有機層を集め
、クロロホルム−メタノール−〇、０１ Ｎ５ｃｔ （
１： １０ ： １０ 、 ｖ／ｖ／ｖ ） １ ｄで
１回洗浄し、有機層を窒素気流で乾燥した。得られる残
渣ｔ−５０％メタノール−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ
（これについては後述する）に再浴解した。抽出操作後
、もとの蛋白質消化液の放射活性の９７％が回収された
。Ｗａｔｅｒｓ μｍ Ｂｏｎｄａｐａｋ ｃｌＢカラ
ムを用い、バッファーＡとして０．１％トリフルオロ酢
酸１０．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢ
として０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
を用いて、流速１ゴ／分の逆相ＨＰＬＣに、サンプルを
付し、１分画＃）１％上昇するアセトニトリル匂配で溶
出せしめた６１分間の画分を集めて、その放射活性を液
体シンチレーションカウンターによプ測定した。ミリス
トイル化〔３Ｈ〕グリシン標準物質は、’ｒｏｗｌｅｒ
とＧｌａｓｅｒ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５ｓ ８７８−８８４
（１９８６）に記載されたのと本質的に同様にして合成
し、ＨＰＬＵにより分析した〇 脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有す
る対称性のミリスチン醗無水物又はパルミチン酸無水物
とＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒ ｇＡｒ
ｇとをピリジン中で反応せしめることによジアシル化
ペプチド標準物質の合成を実施した。
（１９８６）に記載されたのと本質的に同様にして合成
し、ＨＰＬＵにより分析した〇 脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有す
る対称性のミリスチン醗無水物又はパルミチン酸無水物
とＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒ ｇＡｒ
ｇとをピリジン中で反応せしめることによジアシル化
ペプチド標準物質の合成を実施した。
１ＱＱｍＣｉの〔３Ｈ〕脂肪酸を、それぞれの脂肪酸ア
シルクロライげ４μｊで処理し、次いで、それぞれの非
放射活性脂肪酸４．８〜を含むピリシン１５０μｇに再
懸濁せしめた。２３°Ｃで６０分間反応分進行させた。
シルクロライげ４μｊで処理し、次いで、それぞれの非
放射活性脂肪酸４．８〜を含むピリシン１５０μｇに再
懸濁せしめた。２３°Ｃで６０分間反応分進行させた。
次いでこの反応溶液６５μｌをＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌ
ａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ ４００ ５００Ａｇに加
えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサーで攪拌しながら一晩反
応を進行させた。次いで減圧下にピリシンを留去し、得
られる残渣を石油エーテル０．６４で２回抽出し、欠い
て５０％メタノール水浴１４００μＩＶｃ再浴解せしめ
た。反応生成物を精製し、前記した如くシて逆相ＨＰＬ
Ｃで分析した。化学的【合成した標準物質と酵素生成物
とを共にプロナーゼＥで消化し、前記したと同様にして
２０，０００ダルトンのアシル化蛋白質について逆相Ｈ
ＰＬＣで分析した。徂し、この場合にはプロテアーゼ２
００ｐ９で完全な消化を行なうことが出来た。
ａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ ４００ ５００Ａｇに加
えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサーで攪拌しながら一晩反
応を進行させた。次いで減圧下にピリシンを留去し、得
られる残渣を石油エーテル０．６４で２回抽出し、欠い
て５０％メタノール水浴１４００μＩＶｃ再浴解せしめ
た。反応生成物を精製し、前記した如くシて逆相ＨＰＬ
Ｃで分析した。化学的【合成した標準物質と酵素生成物
とを共にプロナーゼＥで消化し、前記したと同様にして
２０，０００ダルトンのアシル化蛋白質について逆相Ｈ
ＰＬＣで分析した。徂し、この場合にはプロテアーゼ２
００ｐ９で完全な消化を行なうことが出来た。
前記した如くして、６６０ｎｍでのＯ，Ｄ、が１−乙に
なるまで酵母培養物を生育せしめた。培養液４０ゴを４
℃で７６００Ｘ、！９で１０分間遠心して細胞を集めた
。上清液をデカンテーションし、冷却した１ ０ ｍ
Ｍ ＴｒｉＳ （ｐＨ７−４） １ ｍｌｖｃＭ胞ペレ
ットをピペットで移して再懸濁せしめ、次いで１．５コ
の円椎形のポリプロピレン遠心チューブに移し、４°Ｃ
で７６００）ｌで１０分間遠心して細胞を再びベレット
化した。細胞をピペットでコールドアッセイ溶解バッフ
ァーＣ１０ｍＭＴｒｉｓ （ｐ）Ｉ７．４）、１ｒｎＭ
ジチオスレイトールｙＤ、１ｍＭｚテンンクリコールー
ビス（β−アミノエチルエーテル） Ｎ 、 Ｎ 、
Ｎ’ 、 Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ ）、 １０Ａｇ
／Ｒ１アプロチニン〕４００μノに移して再懸濁せしめ
た。（Ｊ、５＋ａｍガラスぎ一ズ約４００μＥを細肥悪
濁液に加え、前記した＠き放射標識化細胞全溶解したの
と同様にして渦動せしめて細１Ｉ８ｔ−崩壊して溶解せ
しめた。ビーズが静止した後、溶解物を集め、４°Ｃで
１ｏｏｏｘｙで１０分間遠心して細胞破片を除いた。次
いで上溝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ７５ Ｔｉ Ｉ：Ｉ−タ
ーで４°Ｃで４５．００ Ｏｒｐｍで３０分間遠心した
。上清液を除き、得られる粗膜ペレットをコールドアッ
セイ溶解バッファー４００μｊにピペットで移して再懸
濁せしめた。３つの細胞フラクションのアリコートヲ、
すぐにアッセイに定であった。蛋白質はＰｅｔｅｒｓｏ
ｎの方法ＣＡｎａｌ。
なるまで酵母培養物を生育せしめた。培養液４０ゴを４
℃で７６００Ｘ、！９で１０分間遠心して細胞を集めた
。上清液をデカンテーションし、冷却した１ ０ ｍ
Ｍ ＴｒｉＳ （ｐＨ７−４） １ ｍｌｖｃＭ胞ペレ
ットをピペットで移して再懸濁せしめ、次いで１．５コ
の円椎形のポリプロピレン遠心チューブに移し、４°Ｃ
で７６００）ｌで１０分間遠心して細胞を再びベレット
化した。細胞をピペットでコールドアッセイ溶解バッフ
ァーＣ１０ｍＭＴｒｉｓ （ｐ）Ｉ７．４）、１ｒｎＭ
ジチオスレイトールｙＤ、１ｍＭｚテンンクリコールー
ビス（β−アミノエチルエーテル） Ｎ 、 Ｎ 、
Ｎ’ 、 Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ ）、 １０Ａｇ
／Ｒ１アプロチニン〕４００μノに移して再懸濁せしめ
た。（Ｊ、５＋ａｍガラスぎ一ズ約４００μＥを細肥悪
濁液に加え、前記した＠き放射標識化細胞全溶解したの
と同様にして渦動せしめて細１Ｉ８ｔ−崩壊して溶解せ
しめた。ビーズが静止した後、溶解物を集め、４°Ｃで
１ｏｏｏｘｙで１０分間遠心して細胞破片を除いた。次
いで上溝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ７５ Ｔｉ Ｉ：Ｉ−タ
ーで４°Ｃで４５．００ Ｏｒｐｍで３０分間遠心した
。上清液を除き、得られる粗膜ペレットをコールドアッ
セイ溶解バッファー４００μｊにピペットで移して再懸
濁せしめた。３つの細胞フラクションのアリコートヲ、
すぐにアッセイに定であった。蛋白質はＰｅｔｅｒｓｏ
ｎの方法ＣＡｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８３ 、 ３４６−３５６ （１９
７７） ］によって測定した。
７７） ］によって測定した。
以下に記載した如き方法により、Ｃ”Ｈ〕脂肪酸アシル
ＣｏＡ ｆ、酵素的＆て合成し、インキュベーションに
付した。
ＣｏＡ ｆ、酵素的＆て合成し、インキュベーションに
付した。
アシルＣＯＡシンセターゼ反応は次の如き構成（１つの
アッセイチューブ当シ）で行なわれた。
アッセイチューブ当シ）で行なわれた。
即ち、〔３Ｈ〕ミリスチン酸０．５μＣ１；２Ｘ７：、
／−１＝イバツファ−（２０ｍＭＴｒｉｓ （ｐ）１７
．４ ）ｔ ２＋ｉＭゾチオスレイ トール、 １
０ｍＭＭｇＣｊ２ｙ Ｏ，２ｍＭＥＧＴＡ ） ２５
μｚ；ｓｏｍＭＡＴＰ蒸留水溶液５μｌ（ＮａＯＨでｐ
）Ｉ ７．０に調整した）；２０ＦＩＭリチウムＣｏＡ
蒸留水溶液２．５μｌ ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｆｌａｓ
７ シＡ／ＣＯＡシンセターゼ（シグマ社）ｌｒｎＵ
／μＡ！の５０ｍＭＮ−２−とドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ｐ）ｌ ７．３ ）
溶液１５μｌ；及び蒸留水２．５μ！である。３０’Ｃ
で２ｏ分間反応を進行せしめた。典型的には、〔３Ｈ〕
脂肪鍍の４０％−５０％を、この方法によりそのＣｏＡ
エステルに変換した。ＣＯＡエステルへの変換度は、Ｈ
ｏ５ａｋａらの方法ＣＭｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、
７１ 、 ３２５−３３３（１９８１）〕の変法に従い
、６ ＮＨ（ｊでｐＨ２，０に酸性化し、５倍容のヘプ
トンで６回抽出後、反応液に残存する放射活性を測定す
ることによシ決定した。この反応液５ｏμｌを、アッセ
イ抽出バッファー（上記参照）４０μＺ及び１ ｍ Ｍ
ＧＩＹＡＳｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ
１０ μｌｌを含むチューブて加えた。チューブ１個当
シ、酵母細胞佃出物（典型的には蛋白質５０μ＆）１０
μｇを加え、次いで３０℃で１０分間インキュベーショ
ンしてアッセイを開始した。チューブ１個轟り、メタノ
ール１１０μｌ及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）
１０μｊを加えてアッセイを終止し、次いで氷で１０分
間冷却した。沈澱し７！ｉ１１．ｆ白質を、ティプルト
ップＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で８０００Ｘ、ｌｉ
’で３分間遠心して除いた。（この条件下では、合成〔
３Ｈ〕ミリストイル化ペプチド又は〔３Ｈ〕バルミトイ
ル化ペプチドは、アッセイ混合物に加えた時には溶解し
ていた。〕上溝ｇ５ｏμｊをメタノール７５μノ及びＨ
ＰＬＣバッハファーＡ７５μｌと混合し、同様のＨＰＬ
Ｃバッファーを用い、３０ｃｍｗａｔｅｒｓ Ａ −Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ ｃ１８カラムの３．９＋ｉでの逆相Ｈ
ＰＬＣによる分析を行なった。浴出は６５％アセトニト
リルでスタートし、次いで１分間当り１％上昇するアセ
トニトリル勾配で行なった。１分間の画分を渠め、それ
ぞれの両分について、液体シンチレーションカウンター
で放射活性を測定した。〔３Ｈ〕−ミリストイル−Ｇ１
７ＡＳｎＡｌａＡｌａＡ１ａＡｌａＡｒ ｇＡｒ ｇは
２４分’ｉＫ溶出Ｌ、（ｓＨ］ −／（’Ａ／ ミドイ
ル−ＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒ
ｇは３ｏ分後に溶出した。
／−１＝イバツファ−（２０ｍＭＴｒｉｓ （ｐ）１７
．４ ）ｔ ２＋ｉＭゾチオスレイ トール、 １
０ｍＭＭｇＣｊ２ｙ Ｏ，２ｍＭＥＧＴＡ ） ２５
μｚ；ｓｏｍＭＡＴＰ蒸留水溶液５μｌ（ＮａＯＨでｐ
）Ｉ ７．０に調整した）；２０ＦＩＭリチウムＣｏＡ
蒸留水溶液２．５μｌ ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｆｌａｓ
７ シＡ／ＣＯＡシンセターゼ（シグマ社）ｌｒｎＵ
／μＡ！の５０ｍＭＮ−２−とドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ｐ）ｌ ７．３ ）
溶液１５μｌ；及び蒸留水２．５μ！である。３０’Ｃ
で２ｏ分間反応を進行せしめた。典型的には、〔３Ｈ〕
脂肪鍍の４０％−５０％を、この方法によりそのＣｏＡ
エステルに変換した。ＣＯＡエステルへの変換度は、Ｈ
ｏ５ａｋａらの方法ＣＭｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、
７１ 、 ３２５−３３３（１９８１）〕の変法に従い
、６ ＮＨ（ｊでｐＨ２，０に酸性化し、５倍容のヘプ
トンで６回抽出後、反応液に残存する放射活性を測定す
ることによシ決定した。この反応液５ｏμｌを、アッセ
イ抽出バッファー（上記参照）４０μＺ及び１ ｍ Ｍ
ＧＩＹＡＳｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ
１０ μｌｌを含むチューブて加えた。チューブ１個当
シ、酵母細胞佃出物（典型的には蛋白質５０μ＆）１０
μｇを加え、次いで３０℃で１０分間インキュベーショ
ンしてアッセイを開始した。チューブ１個轟り、メタノ
ール１１０μｌ及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）
１０μｊを加えてアッセイを終止し、次いで氷で１０分
間冷却した。沈澱し７！ｉ１１．ｆ白質を、ティプルト
ップＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で８０００Ｘ、ｌｉ
’で３分間遠心して除いた。（この条件下では、合成〔
３Ｈ〕ミリストイル化ペプチド又は〔３Ｈ〕バルミトイ
ル化ペプチドは、アッセイ混合物に加えた時には溶解し
ていた。〕上溝ｇ５ｏμｊをメタノール７５μノ及びＨ
ＰＬＣバッハファーＡ７５μｌと混合し、同様のＨＰＬ
Ｃバッファーを用い、３０ｃｍｗａｔｅｒｓ Ａ −Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ ｃ１８カラムの３．９＋ｉでの逆相Ｈ
ＰＬＣによる分析を行なった。浴出は６５％アセトニト
リルでスタートし、次いで１分間当り１％上昇するアセ
トニトリル勾配で行なった。１分間の画分を渠め、それ
ぞれの両分について、液体シンチレーションカウンター
で放射活性を測定した。〔３Ｈ〕−ミリストイル−Ｇ１
７ＡＳｎＡｌａＡｌａＡ１ａＡｌａＡｒ ｇＡｒ ｇは
２４分’ｉＫ溶出Ｌ、（ｓＨ］ −／（’Ａ／ ミドイ
ル−ＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒ
ｇは３ｏ分後に溶出した。
結果
前記した如くにして調製した、（”Ｈ）−ミリストイル
化グリシルペプチド及び〔３Ｆｉ〕バルミトイル化グリ
シルペプチドの化学合成標準物質は、試料を分析したの
と同じ条件下で逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９
％、６５％アセトニトリルでの溶出のときに浴出した。
化グリシルペプチド及び〔３Ｆｉ〕バルミトイル化グリ
シルペプチドの化学合成標準物質は、試料を分析したの
と同じ条件下で逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９
％、６５％アセトニトリルでの溶出のときに浴出した。
細胞溶解物質を調良しそれを分別して得た粗膜フラクシ
ョン及び溶解フラクションのいずれにおいても、Ｎ−ミ
リストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性が検出さ
れた。セして全比活性、溶解フラクション比活性及び粗
膜フラクション比活性は、それぞれ１４１０゜１３２０
．２２６０ｄｐｍ／μＦ蛋白寅／１分間アッセイであっ
た。最初の反応速度から判断して、活性の６５％は粗膜
フラクションに存在すると考えられる。
ョン及び溶解フラクションのいずれにおいても、Ｎ−ミ
リストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性が検出さ
れた。セして全比活性、溶解フラクション比活性及び粗
膜フラクション比活性は、それぞれ１４１０゜１３２０
．２２６０ｄｐｍ／μＦ蛋白寅／１分間アッセイであっ
た。最初の反応速度から判断して、活性の６５％は粗膜
フラクションに存在すると考えられる。
酵素反応生成物と化学合成標準物質（３Ｈ］ −ミリス
トイル化ペプチドは、前記した逆相ＨＰＬＣ分析によ勺
、両者は同じであシまたグリシン残基に共有結合したミ
リステートを含んでいることが証明された。
トイル化ペプチドは、前記した逆相ＨＰＬＣ分析によ勺
、両者は同じであシまたグリシン残基に共有結合したミ
リステートを含んでいることが証明された。
ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシルペプチ
ドシンセターゼの特異性を証明するため、他のグリシル
ペプチドについて、そのＧ１７ＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌ
ａＡｌａＡｒｇＡｒｇアシル化の競争的阻止能を調べた
。下記表１のテストロから明らかなように、１ｍＭゾペ
プチド、１ｍＭテトラペプチド及び１ ｍＭデカペプチ
ドはいずれも１８μＭペプチド基質のミリストイル化に
対して何んら効果を示さなかった（約九のＫＩｎ）。従
って、Ｎ −ミリストイルグリシルペプチドシンセター
ゼは、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。
ドシンセターゼの特異性を証明するため、他のグリシル
ペプチドについて、そのＧ１７ＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌ
ａＡｌａＡｒｇＡｒｇアシル化の競争的阻止能を調べた
。下記表１のテストロから明らかなように、１ｍＭゾペ
プチド、１ｍＭテトラペプチド及び１ ｍＭデカペプチ
ドはいずれも１８μＭペプチド基質のミリストイル化に
対して何んら効果を示さなかった（約九のＫＩｎ）。従
って、Ｎ −ミリストイルグリシルペプチドシンセター
ゼは、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。
表 １
１ コントロール １１１−Ａ
ＴＰ ９−ＣＯＡ
１２ コントロール
８３６ コントロール
２６．７＋１ α（）Ｎ
２８ 、０＋ ｉ ｆｆ、Ｍ Ｃ）
ＰＲＰ ２５．６＋ １ｎＬＭＧ
Ｓ８ＫＳＰＫＤＰＳ ２７ 、４酵母から
得た粗膜フラクションを用いて表１に示した如く種々の
条件下で前記した如くにしてアッセイを実施した。テス
ト１では、アッセイのＡＴＰ 、 ＣｏＡ依存性を外
因性の脂肪酸ＣＯＡ ＩＪガーゼの非存在下でテストし
た。テスト２により、酵母の酵素は熱に不安定であるこ
とが証明され、テストロにより、Ｎ−末端グリシンを含
む他のペプチドを添加しても反応は抑制されないことが
証明された。テストロでは、可能な抑制効果を最大限に
発渾させるために、通常の９０μＭではなく１８μＭの
ペプチド基質を用いて測定した。
ＴＰ ９−ＣＯＡ
１２ コントロール
８３６ コントロール
２６．７＋１ α（）Ｎ
２８ 、０＋ ｉ ｆｆ、Ｍ Ｃ）
ＰＲＰ ２５．６＋ １ｎＬＭＧ
Ｓ８ＫＳＰＫＤＰＳ ２７ 、４酵母から
得た粗膜フラクションを用いて表１に示した如く種々の
条件下で前記した如くにしてアッセイを実施した。テス
ト１では、アッセイのＡＴＰ 、 ＣｏＡ依存性を外
因性の脂肪酸ＣＯＡ ＩＪガーゼの非存在下でテストし
た。テスト２により、酵母の酵素は熱に不安定であるこ
とが証明され、テストロにより、Ｎ−末端グリシンを含
む他のペプチドを添加しても反応は抑制されないことが
証明された。テストロでは、可能な抑制効果を最大限に
発渾させるために、通常の９０μＭではなく１８μＭの
ペプチド基質を用いて測定した。
実施例６
不明ＭＪｉ曹で例示したいくつかのオクタペプチド金、
実施例１と本質的に同様にして固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ法によシ合成し、次いで酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ株ＪＲ１５３）から得たミリストイル化酵素の基質
としてのあるいは抑制因子としての活性をテストした。
実施例１と本質的に同様にして固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ法によシ合成し、次いで酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ株ＪＲ１５３）から得たミリストイル化酵素の基質
としてのあるいは抑制因子としての活性をテストした。
オクタペプチド基質の酵素特異性を、アッセイチューブ
１個当り１μＣ１の〔３Ｈ〕−ミリスチン酸を用いる以
外は実施例２のアッセイ条件と同様にしてテストした。
１個当り１μＣ１の〔３Ｈ〕−ミリスチン酸を用いる以
外は実施例２のアッセイ条件と同様にしてテストした。
本実施例に用いた酵母の酵素は、堵養酵母細肥の粗ホモ
ジエネートｔ−５ｌ−７０％（ＮＨ４） ２３０４で分
別し次いでＤＥ式−セ７アロース■ＣＬ−６Ｂ（ファル
マシア社製）ｅ用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー及びＣｏＡ−アガロースアフイニテイーマトリック
ス（ファルマシア社製）を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより部分精製した。オクタペプチドは、
下記表Ｈに示した動力学的データ（Ｋｍ＊ ”’ｍａｘ
及びＫｉ）によシ特徴付けを行なった。
ジエネートｔ−５ｌ−７０％（ＮＨ４） ２３０４で分
別し次いでＤＥ式−セ７アロース■ＣＬ−６Ｂ（ファル
マシア社製）ｅ用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー及びＣｏＡ−アガロースアフイニテイーマトリック
ス（ファルマシア社製）を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより部分精製した。オクタペプチドは、
下記表Ｈに示した動力学的データ（Ｋｍ＊ ”’ｍａｘ
及びＫｉ）によシ特徴付けを行なった。
＊：このオクタペプチド基質のｖ、：、ａ、Ｘば、部分
精製酵母酵素１〜での１分間当りの生成ミリストイル化
ペプチド２８４０ ｐｍｏｌであった。
精製酵母酵素１〜での１分間当りの生成ミリストイル化
ペプチド２８４０ ｐｍｏｌであった。
上記の結果は、アミン末端グリシンから２番目の位置に
チロシンあるいはフェニルアラニンヲ有するオクタペプ
チドが、いずれの速度に２いてもアシル化アクセプター
として作用しないにもかかわらず、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ基質の
ミリストイル化を競争的に抑制し得ることを示唆してお
り従ってミリストイル化酵素に結合することを示してお
り、これらの結果は予期せぬことであり篇くべきことで
ある。２査目の位置にロイシンあるいはバリン残基金有
するオクタペプチドも上記基質のミリストイル化を抑制
する。
チロシンあるいはフェニルアラニンヲ有するオクタペプ
チドが、いずれの速度に２いてもアシル化アクセプター
として作用しないにもかかわらず、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ基質の
ミリストイル化を競争的に抑制し得ることを示唆してお
り従ってミリストイル化酵素に結合することを示してお
り、これらの結果は予期せぬことであり篇くべきことで
ある。２査目の位置にロイシンあるいはバリン残基金有
するオクタペプチドも上記基質のミリストイル化を抑制
する。
カルボキシ末端の１つまたは２つのアルギニンを除いた
オクタペプチドの場合でも、実質的に同様の結果が得ら
れる。
オクタペプチドの場合でも、実質的に同様の結果が得ら
れる。
本明細書に示したペプチドのアミノ酸配列を同定するた
めには、以下に示したアミノ酸の略号が使用される。
めには、以下に示したアミノ酸の略号が使用される。
Ｌ−アラニン Ａｌａ又はＡＬ−アルギニ
ン Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン
Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸 Ａｓｐ
又はＤＬ−グルタミン Ｇｌｎ又ｄＱＬ−グ
リシン Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン
Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン Ｌｙ
ｓ又はＫＬ−プロリン Ｐｒｏ又はＰＬ−
セリン Ｅ３ｅｒ又はＳＬ−チロシン
Ｔｙｒ又はＹＬ−バリン
Ｖａｌ又は７本明細書の記載から、本発明の精神及び範
囲内の他の各種の例が当業者によっては明らかであろう
。そしてそのような他の例も本明細書の特ｒ！ｆ請求の
範囲内のものである。
ン Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン
Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸 Ａｓｐ
又はＤＬ−グルタミン Ｇｌｎ又ｄＱＬ−グ
リシン Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン
Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン Ｌｙ
ｓ又はＫＬ−プロリン Ｐｒｏ又はＰＬ−
セリン Ｅ３ｅｒ又はＳＬ−チロシン
Ｔｙｒ又はＹＬ−バリン
Ｖａｌ又は７本明細書の記載から、本発明の精神及び範
囲内の他の各種の例が当業者によっては明らかであろう
。そしてそのような他の例も本明細書の特ｒ！ｆ請求の
範囲内のものである。
しかして、ペプチドの各々のアミノ酸及び／又は長さは
、ミリストイル化酵素に対する抑制因子としての生物活
性に不利なあるいは決定な影響を与えない限シ、種々変
えることができ、それらはいずれも本明細書の特許請求
の範囲内のものである０
、ミリストイル化酵素に対する抑制因子としての生物活
性に不利なあるいは決定な影響を与えない限シ、種々変
えることができ、それらはいずれも本明細書の特許請求
の範囲内のものである０
Claims (3)
- （１）以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれた
アミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の抑制因子
ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体も
しくは塩誘導体。 【アミノ酸配列があります】又は 【アミノ酸配列があります】 （式中、ＲはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＶａｌを示す
。） - （２）ＲがＴｙｒである特許請求の範囲第１項記載のオ
クタペプチド。 - （３）ＲがＰｈｅである特許請求の範囲第１項記載のオ
クタペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/894,185 US4709012A (en) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | Novel inhibitor peptides |
| US894185 | 1986-08-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6344596A true JPS6344596A (ja) | 1988-02-25 |
| JP2584783B2 JP2584783B2 (ja) | 1997-02-26 |
Family
ID=25402724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62195442A Expired - Lifetime JP2584783B2 (ja) | 1986-08-07 | 1987-08-06 | 新規抑制因子ペプチド |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4709012A (ja) |
| EP (1) | EP0255995B1 (ja) |
| JP (1) | JP2584783B2 (ja) |
| AT (1) | ATE82984T1 (ja) |
| AU (1) | AU589289B2 (ja) |
| CA (1) | CA1305287C (ja) |
| DE (1) | DE3782880T2 (ja) |
| ZA (1) | ZA875817B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4740588A (en) * | 1986-08-07 | 1988-04-26 | Washington University | Novel substrate peptides |
| DE3881321T2 (de) * | 1987-09-30 | 1993-12-16 | Univ St Louis | Octapeptide als Hemmer myristoylierender Enzyme. |
| EP0327523B1 (en) * | 1988-02-03 | 1992-06-17 | Washington University | Novel fatty acid analog enzyme substrates |
| US5073571A (en) * | 1988-06-16 | 1991-12-17 | Washington University | Method of inhibiting virus |
| US5571689A (en) * | 1988-06-16 | 1996-11-05 | Washington University | Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid |
| CA1333777C (en) | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| JPH06245775A (ja) * | 1990-02-26 | 1994-09-06 | Washington Univ | 蛋白質ｎ−ミリストイル化方法 |
| US8168592B2 (en) * | 2005-10-21 | 2012-05-01 | Amgen Inc. | CGRP peptide antagonists and conjugates |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4740588A (en) * | 1986-08-07 | 1988-04-26 | Washington University | Novel substrate peptides |
-
1986
- 1986-08-07 US US06/894,185 patent/US4709012A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-06 CA CA000543905A patent/CA1305287C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-06 AU AU76622/87A patent/AU589289B2/en not_active Ceased
- 1987-08-06 JP JP62195442A patent/JP2584783B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-06 ZA ZA875817A patent/ZA875817B/xx unknown
- 1987-08-06 AT AT87870110T patent/ATE82984T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-06 DE DE8787870110T patent/DE3782880T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-08-06 EP EP87870110A patent/EP0255995B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1305287C (en) | 1992-07-14 |
| ATE82984T1 (de) | 1992-12-15 |
| EP0255995A2 (en) | 1988-02-17 |
| AU7662287A (en) | 1988-02-11 |
| DE3782880D1 (de) | 1993-01-14 |
| US4709012A (en) | 1987-11-24 |
| EP0255995A3 (en) | 1989-10-11 |
| EP0255995B1 (en) | 1992-12-02 |
| ZA875817B (en) | 1988-04-27 |
| DE3782880T2 (de) | 1993-06-17 |
| AU589289B2 (en) | 1989-10-05 |
| JP2584783B2 (ja) | 1997-02-26 |
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