JPS6338163A - 抗原の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原に対する抗体が存在する試料中の該抗原の
簡便な測定方法に関する。

〔従来の技術〕

血清などの体液中の各種の抗原及びハプテン？測定する
ことは、疾患の診断を行う臨床検査上重要である。しか
し、血清などの体液中には、該抗原又はハプテンに対す
る抗体がしばしば存在し、該抗原及び該ハプテンの測定
を困稚にしている。該抗原に対する抗体が存在する体液
中の抗原の測定法として抗インスリン抗体が存在する体
液中の総インスリン量の測定が報告さねている。これに
は従来２つの方法がある。その１つは、拭インスリン抗
体を含む体液からインスリンを酸性アルコールにより抽
出して測定するものである［Ｇ、Ｍ、グロドスキー（Ｇ
、　Ｍ、　Ｇｒｏｄ−ｓｋｙ　）、Ｐ、　Ｈ，フォルジ
ャム（Ｐ、　Ｈ，Ｆｏｒｓｈａｍ　）、ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インヴエスティゲーション（Ｊ、、Ｃ
１１ｎ、工ｎｖｅｓｔ、　）、第３９巻第１０７０頁（
１９６０）、Ｌ、Ｃ１，ヘディング（Ｌ。

Ｇ、ＨｅｃＬｉｎｇ　）、ディアベトロギア（Ｄｉ、ａ
ｂｅｔｏｌｏ−ｇｉａ　）、第８巻ｍ　２６０頁（１９
７２）１０他の１つは、体液試料を酸性処理後、抗イン
スリン抗体を中和と共にポリエチレングリコールにより
沈殿除去した佼に、インスリン？測定する方法である（
酸／ポリエチレングリコール処理）ＣＳ、ナカガワ（Ｓ
、Ｎａｋａｇａｗａ　）　　ら、ディアベテス（Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ　）、第２２巻第５９０頁（１９７３）、Ｈ
，クズヤ（Ｈ，ＫｕＺｕ７ａ　）　　ら、ディアベテス
、第２６巻第２２頁（１９７７）］。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらの方法には欠点がある。

第１にこれらの２つの方法は共に操作が複雑である。酸
性アルコールによる抽出も、ポリエチレングリコールに
よる沈殿も複雑である。第２に、酸性アルコールで抽出
できる抗原の種類は限られており、また、ポリエチレン
グリコールで沈殿しない抗原の才１類も限られている。

本発明の目的は、前記の事情）てかんがみて、従来法に
比べて、簡便でかつ、多くの！１類の抗原及び・・ブテ
ンの測定して応用可能な抗体存在下における抗原及びハ
プテンの測定方法全提供することにある。

〔間５′八点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は抗体存在下における抗原
又はハプテンの６１す定方法に関する発明であって、下
記の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）ＣＡ）抗原又はハプ
テンとその抗体を含有する被検液に酸を添加し、抗原性
は損わないが該抗原又はハプテンの免疫学的測定に影響
を及ぼす抗体を酸性条件下で失活させる工程 （Ｂ）該被検液を中和する工程 （Ｃ）　　該被検液中の抗卓又はハプテンｆＪ　（、免
疫学的に測定する工程 を包含することを特徴とする。

本発明方法により測定可能な被検液の例としては血清、
血漿、髄液、唾液、尿等の体液が挙げられる。

本発明の（Ａ）工程において使用される酸には特に限定
は々く、塩酸、硝酸、硫敲、過塩素酸等が使用される。

また、抗原性は損わ々いが該抗原又ｊｄハブテンの免疫
学的測定に影響を及ぼす抗体全失活さ亡る酸性条件は抗
原及びハプテンの種類により一定でないが、抗原がイン
スリン、成長ホルモ：／　、甲状腺刺激ホルモン、アル
ファ・フェトプロティンなどの場合、ｐＨ１５以下、好
ましくは約ｐＨ１，数十時間、４℃〜５０℃の条件で目
的が達せられる。

本発明の（Ｂ）工程における中和において使用される塩
基には特に制限はなく、水酸化す）　ＩＪウム、水酸化
カリウム、水酸化アンモニウム等が使用される。

本発明の（Ｃ）工程における抗原又はハプテンの測定法
としては、従来よく知られた種々の免疫学的測定法が用
いられる。

以下、本発明（でよる抗原測定法を詳細に説明する。

まず、被検液にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略
記する）含何リン酸緩衝生理食塩水全添加し、これに塩
酸を加えｐＨをおよそ１とした後、室温で約６０分放置
する。これ（て水酸化ナトリウムを加えて中和し、史に
ＢＳＡとＮａＮ１　　全含むリン酸緩衝生理食塩水を加
える。

このようにして調整したサンプル中の抗原量を以下の方
法によって測定する。すなわち、抗体ＩｇＧ又はＦ　（
ａ　ｂ’）ｔ　　５ｒ：不溶化したプラスチック製マイ
クロタイタープレート、プラスチック裂ボール、プラス
チック製チューブ等の固相担体を上記サンプルと４℃〜
３７℃で４時間〜２４時間、好ましくけ５７Ｃで４時間
反応させ、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、これ？酵素
標識した抗体工ｇＧ又はそのＦ（ａｂ’）１、好ましく
はそのＦａｂ’　　と４℃〜３７℃で４時間〜１２時間
、好ましくけ２０℃で４時間反応させた後、リン酸緩衝
生理食塩水で洗浄後、固相に結合した酵素活性を測定し
た。標識用酵素としてはアルカリホスファターゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等があり、ペ
ルオキシダーゼが適している。また、酵素の暴′ｔ１と
してはりＩＪ　、’＜。

ばペルオキシダーゼの場合、基１イのＨ！０！と共Ｖこ
５−アミノサリチル酸、０−フェニレンジアミン等の発
色基質、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
等の蛍光基質、ルミノール等の発光基質等が用いられ、
中でも蛍光基質が適している。

また、抗体を不溶化した固相担体、抗原、酵素標識抗体
Ｆａｂ’　　を同時に反応させて測定を行う一段法を行
うことも可能である。

本発明によるハプテン測定法の場合も、上記と同様に行
うことができるが、ハブテンの場合は、本発明による（
Ｃ）工程において、従来知られている免疫学的測定法、
例えば競争結合免疫測定法を使用すればよい。

〔実施例〕

以下、本発明を実施列により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実殉例１　インスリンの測定 ！（々のヒト血清α００５ｄにα１１５ｄの緩衝液（Ｃ
１ｍｏｌ／ｌ　　ＮａＣ２と１ｒ／ｚＥｓＡを含む１０
ｍｍｏ１／ｌ　リン［Ｎａ％ｐＨ７，０）　ｆ添加し、
これにα０１−の３　ｍｏ１／ｌ　ＨＯＬを加えてＰＨ
ｆおよそ１に合せた後、室温で６０分放置した。これＶ
こα０１−の２．９−５　ｍｏｌ／１）ＪａＯＨを加え
て中）口し、史にα０１−の緩衝液（１，８ｍｏｌ／７
　　ＮａＣ６と５ｒ／ｌ　　ＢＥＩＡと１５ｙ／１Ｎａ
Ｎ１　　ｆ含む１１１０３ｍ０１／ｌリンｐ　Ｎａ　、
　　ｐＨ７，０）を加えた。このようにして調整したサ
ンプル［Ｃ１５−中のインスリンを公知のサンドインチ
酵素免疫測定法により測定した（Ｋ　−ｈ、ルアン（ｘ
−ｈ％Ｒｕａｎ　）　　ら、クリ二カ・中ミカ・アクタ
（Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　）　　第１４７巻第
１６７頁（１９８５）］。つまり、］サンプルα１５−
全抗インスリン抗体結合ポリスチレンボーとまぜ、３７
℃４時間反応させた。なお、抗インスリン抗体結合ポリ
スチレンボールは以下のようにして作成した。

抗インスリン抗体はモルモット由来抗インスリン抗血清
（医学生物学研究所、名古屋）をＮａ１ＳＯ４で塩析し
ＤＢＡＭ−セルロースカラムクロマトグラフィーにより
精製し、抗インスリン抗体工ｇＧ　ｋ得た（　Ｋ、石川
（Ｌ工ｓｈｉｋａｗａ　）　　らジャーナル・オブ・イ
ムノアッセイ（Ｊ、工ｍｍｕｎｏ　−ａｓｓａｙ　）第
４巻第２０９頁（１９８３）］。この抗インスリン抗体
工ｇＧヲポリスチレンボール〔直径Ｘ　２　ｍ　（プレ
シジョン・プラスチック・ボール社、シカゴ）〕に物理
的に吸着させ不溶化させた［　Ｋ、石川及びに、加Ｍ　
（Ｋ、　ＫａｔＯ）、　スカンジナビアン・ジャーナル
・オブーイムノロジ−（５ｃａｎｄ、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ
ｌ、　）、第８巻（補遺７）第４３頁（１９７８）］。

上記サンプルと反応させた抗インスリン抗体結合ポリス
チレンボールをＣ１ｍｏｌ／１ＮａＣ２ｆ含む１０　ｍ
ｍｏｌ／ｌ　　リン６ｘｑａｇ（ｐＨｙ、　ｏ　）　２
−で洗浄後、５　ｎｆ　のアフィニティーｆ＃裏抗イン
スリンＦａｂ’−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合体
液（１１５ｍト２０℃　４時間反応させた。ベルオキシ
グーゼ標識抗インスリンＦａｂ’は以下のようにして作
成した。

すなわち、上記のごとく作成されたモルモット由来抗イ
ンスリン抗体工ｇＧからＦ　（ａ　ｂ５ｋ、　次いでＦ
ａｂ’　５ｒ：　調Ｍしく前記Ｅ０石川ら、ジャーナル
・オプ・イムノアッセイ参照）、これを西洋ワサビ由来
ペルオキシダーゼ（グレード！、ベーリンガーｅマンハ
イム社、マンハイム）Ｋ、Ｎ−スクシンイミジＡ、−６
−マレイミドヘキサノエート（同位化学研究所、熊本）
を用いて結合した後〔Ｓ、橋田（Ｓ、　Ｉ（ａｓｈｉｄ
ａ　）ら、ジャーナル・オプ・アプライド・バイオケミ
ストリ＝（Ｊ。

Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、第６巻第５６頁（
１９８４）、］、メルカプトスクシニル化インスリンを
活性化チオールセファローズ４Ｂ（ファーマシア　ファ
イン　ケミカルス　ＡＢ、ウプサラ）にカップリングさ
せたインスリン−セファローズ４Ｂアフイニテイーカラ
ムクロマトグラフイーにより桔製し、更にウルトロゲル
Ａ（！Ａ４４（ＬＫＢ。

ストックホルム）によりｆＲ製し、ペルオキシダーゼ標
識抗インスリンｔａｂ’を得た（前記に−ｈルアンらク
リニカ・キミ力・アクタ参照）。なお、酵素標識抗体の
インキュベーションに用いた緩衝液はＣＬ　１　ｍｏｌ
／Ａ　　ＮａＣ６とα１％Ｂ８Ａｉ含む１０　ｍｍｏｌ
／ｊ　　リン酸Ｎａ液（ｐＨ７，０）である。

上記のごとくインキュベートしたポリスチレンボールを
上記洗浄用緩衝液２−で洗浄後、ポリスチレンボールに
吸着したペルオキシダーゼ活性を測定した。

ペルオキシダーゼ活性は基質としてＨ２Ｃ，と３−（ｐ
−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（アルドリッチ　
ケミカル　カンパニー　インコーホレーテッド、ミルウ
オーキー）ヲ用い３０℃で測定した〔今用ら、アナリテ
ィカル・レターズ（ＡｎａＬ　Ｌｅｔｔ、　）、第１６
巻第１５０９頁（１９８３）］。蛍光強度？′１１岬キ
ニン全１ｔのＩＩＯ５ｍｏ１／ｌ　　Ｈ２ＢＯ３Ｋ溶解
した液に対する相対強度として表し、励起波長３２０ｎ
ｍ、蛍光波長ａ　０５　ｎｍ　で島津スペクトロフルオ
ロメーター（Ｒ’Ｆ−５１０島津製作所、京都）を用い
て測定し、標準インスリンを用いた検ｆｆｋ線から試料
中のインスリン量に求めた。１５種の血清サンプルの測
定結果を表１に示す。すｉわち表１は本発明方法と従来
法（酸／ポリエチレングリコール処理）更に前処理なし
で測定した場合の測定結果の比較を、抗インスリン抗体
存在血清と非存在血清とで示したものである。

表　　１ ｌ−）−９０１５５１２９ ２＋　　４９　１０９　１００ ５　　＋　　１１７　２０６　２００ ５＋　　９７　１８５　１８５ ６　　＋　　１６８　２３６　２２１ ７　　＋　　１１３　２４０　２２１ ９＋６５１６７１５１ １０　　＋　　４７　６３　６０ １１　　　　ノーマル　　　　７．５　　　　７．０　
　　　　６，１１２　　　ノーマル　　　　１３　　　
　１５　　　　　１１３　　　ノーマル　　　　１２　
　　　１３　　　　　１３１４　　　ノーマル　　　　
１３　　　　１５　　　　　１３１５　　　ノーマル　
　　　９．１　　　　９．１　　　　　　ａ２比較列１ 従来法である酸処理とポリエチレングリコール法を組合
せた方法でインスリ／の測定を行った。すなわち種々の
ヒト血清（１０５−を０．０１ｄの１　ｍｏ１／１Ｈｏ
ｔ　　と混合し、室温に６０分放置した後、ａｏ　７＋
ｄの２５０？／ｌポリエチレングリコールと混合し、α
０１−の１　ｍｏｌ／１ＮａＯＩ（を加えた後、１５０
０’ＡＰで４５分遠心分離した（前記Ｓ、ナカガワら、
ディアベテス参照）。

この上清α０１＠／を（１１４−の緩衝液（α４２ｍｏ
ｌ／１ＮａＣ４，１，Ｉ　Ｐ／　ｌ　　ＢＳＡ、　　１
．１　ｒ／ｚＮａＮ１　　を含む１０　ｍｍｏｌ／ｌリ
ンｐ　Ｎａ　　ｐＨ７，０）と混合した後上記のように
インスリンを測定した。結果を表１の酸／ポリエチレン
グリコール処理のカラムに示す。

表１から明らかなよって、実施列１で行った本発明によ
る測定法は、従来法同様の結果を、従来法と比べ非常に
簡便にうろことができる。

比Ｉｉｙ！２例２ 血清サンプルの前処理なしで単に実施り１１で示した酵
素免疫測定法によってインスリンを測定した。結果を表
１の前処理なしのカラムに示す。この結果より血清サン
プル中に抗インスリン抗体が存在しない場合は実施例１
、比較例１と同様の結果が得られるが、抗インスリン抗
体存在下においては全サンプルにおいて実施例１、比較
列１に比べ明らかに低値を示し、抗体存在下においては
正確に抗原量を測定できないことが示される。

以上、実施例１、比較列１及び比較列２の結果より、実
施列１で行った本発明方法によって従来法より簡便に、
抗体？含む試料中Ｖこおいてでさえも抗原を正確番で測
定できることが示される。

実施例２　インスリンの測定 種々のヒト血清サンプル５０μｔに１２．５μｔのα５
　ｍｏｌＡＨＯｔを加えｐＨ６ｘｓとした後、２５μｔ
のデキストラン−チャコール！！テ濁ｉｔ添加し、遊離
インスリンを吸着させた。この混合ｃｌＪｒｃ　５分間
、かくはんしながら反応させ、ｊ２．５ｔｉＬのＱ、　
３８　ｍｏｌ／１ＮａＯＨｆ加え中和し１５００８ｒ　
１５分間遠心分ｉｔ行い、この上清を同様にもう一度遠
心分ｍを行った。この上清の一部７０μｔに２μ工Ｕイ
ンスリンを含む３５ａｔの１　ｆ／　Ｌ　ＮａＮ１．１
．Ｏｒ／　Ｌ　　ＢＳＡ、ａ、　１ｍｏ１／ｚ　　Ｎａ
（！を含有１０　ｍｍｏｌ／ｌリン酸Ｎａ（ｐＨ７，０
）を加え４℃で２４時間反応させた。

この反応液の一部１５μｔに１０５μｔの１２／ｌ　　
ＢＳＡ、　α１　ｍｏｌ／１Ｎａ（’を含有１０　ｍｍ
ｏｌ／ｌリン酸Ｎａ　（ｐＨ７，０）　ｋ加えた。この
ようＫして調製したサンプル中のインスリンを実施例１
１と同様に本発明方法により測定した。１５種類の血清
サンプルの測定結果及び添加インスリンの回収率を表２
に示す（本発明方法）。

捷た、本発明方法におけるような酸処理を行わない種々
のサンプルを測定した結果を表２の前処理なしのカラム
に示す。

表２から明らかなように、血清サンプル中に抗インスリ
ン抗体が存在しない場合は、本発明方法と前処理なしの
方法とは同様の回収率が得られた。しかし、抗インスリ
ン抗体の存在するサンプルにおいては本発明方法と比べ
、前処理なしの方法は回収率の低いものが認められる。

すなわち、本発明方法によって測定した場合は９４〜１
０２％と良好な回収率を示すが、前処理なしで測定した
場合、回収率は３９〜１０４係となり、抗体存在下にお
いては正確な抗原量を測定できないことが示される。

以上の結果より、本発明方法によって、抗体を含む試料
中において抗原を正確に測定できることが示される。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明方法によれば、従来
法に比べ、非常（（簡便に、多くの種類の抗原及びハブ
テン量が、抗体存在下において測定可能となった。

手　続　補　正　書　（自９．） 昭和６１年９月５日 特許庁長官　　黒　ＩＢ　　明　雄　殿１、事件の表示
　　昭和６１年特許頒第１８１９５５号λ発明の名称　
　抗原の酵１定方法 五補正をする者 事件との関係　　特許出呵人 住　所　　　宮崎県宮崎市大塚台西３丁目２４番の１氏
　　名　　　　　　石　　　川　　　栄　　　治西新橋
中央ビル３０２号 電話（４３７）−３４６７ 氏　　名　　　弁理士（７８５０）　　　中　　本　　
　　　宏（ほか２名） ｉ補正命令の日付　　　自発補正　　　　　　　　　　
　ｉ＆補正の対象　　　　　　　　　　　　　パ−、−
′（１）明細書の発明の詳細な説明の（閑、；　　　　
′、−，ｔ□い− ２補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄を下記のとおシ補正する
。

＋１１　　明細書第５頁４行の「数十時間」を「数分〜
数十時間」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ） （Ａ）抗原又はハプテンとその抗体を含有する被検液に
   酸を添加し、抗原性は損わないが 該抗原又はハプテンの免疫学的測定に影響 を及ぼす抗体を酸性条件下で失活させる工 程 （Ｂ）該被検液を中和する工程 （Ｃ）該被検液中の抗原又はハプテン量を免疫学的に測
   定する工程 を包含することを特徴とする抗原又はハプテンの測定方
   法。