JPS6332493A - 酵素法による光学活性α―ヒドロキシ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、ペニシリン系やセファロスポリ系抗生物質又
はエフェドリン等の交感神経作用薬等の医薬品の原料も
しくは合成中間体として有用なα一ヒドロキ役雇を一光
学活性体一一一一書牲１号 α−ヒドロキシ酸〕（以下、単に劫棲≠α−ヒドロ；キ
シ酸という）を酵素を利用して工業的に有利に製造する
方法に関するものである。

〔従来技術〕

光学活性α−ヒドロキシ酸の製造法としては、ラセミ体
の分別結晶による光学分割法、クロマトグラフィーによ
る光学分割法、有機化学的な不斉合成法等が知られてい
るが、これらの方法は、操作が煩雑であるとか、収率が
低い、生成物の光学純度が低い等の欠点を有している。

一方、α−ケト酸を原料とし、酵素や微生物を用いて不
斉還元して、対応する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造
する方法も提案されている。例えば、Ｈｕｍｍｅｌらは
、ラクトバチルス属細菌から得られるＤ−２−ヒドロキ
シイソカプロン酸脱水素酸素が２−ケトイソカプロン酸
以外にも各種の２−ケト酸（α−ケト酸）を還元するこ
とを報告している（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｙ、２１
．７−１５（１９８５））。しかしながら、彼らの報文
では、少数の例を除い２生成物“め旋免度を測定してい
ないため光学純度が明らかでなく、またその菌による当
該酵素の生産量は低く（１リツトルの培養物中に約１０
００）、工業的に実用性のあるものではない。また市販
されているＤ−乳酸脱水素酵素を利用する報告もあるが
（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５，４５３
（１９８０）；Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓａｃ、　、　１０４．４４５８（１９８２））、本発
明で用いるα−ケト酸と乳酸とでは化学的構造が相当に
異なるため反応速度の大巾な低下が避けられず、やはり
実用性のあるものではない。

〔目　　的〕

以上のような状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果
、ストレプトコックス属細菌培養物中から得られるベン
ゾイルギ酸還元酵素が、ベンゾイルギ酸以外にも各種の
α−ケト酸を還元して光学純度１００％で圧型の絶対配
置を有するα−ヒドロキシ酸を生成することを見出し、
本発明を完成するに至った。

〔構　　成〕

即ち、本発明によれば、ストレプトコックス属細菌の菌
体から抽トＣた１ベンゾイルギ酸還元酵素の存在下、還
元型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを用
いて一般式 ％式％ （式中、Ｒは炭素２〜４のアルキル基、クロロメチル基
、ブロモメチル基又はベンジル基を表わす）で表わされ
るα−ケト酸を還元し、対応するα−ヒドロキシ酸の左
旋性光学活性体を得ることを特徴とする光学活性α−ヒ
ドロキシ酸の製造法が提供される。

本発明で原料として用いる前記一般式で示されるα−ケ
ト酸において、Ｒを示すアルキル基としては、ＣＨ，Ｃ
Ｈ，−１ＣＨ３ＣＨ，ＣＨ，−１（１，Ｈ３ＣＨ２ＣＨ
２Ｃ）Ｉ、−１（ＣＨ３）、Ｃ）ｌ−、（ＣＨ３）、Ｃ
ＨＣＨ２−等が挙げられる。また、本発明で用いるα−
ケト酸は、塩の形で使用することができ、このような塩
としては、リチウム。

ナトリウム、カリウム、アンモニウム等の１価の陽イオ
ンとの塩の他、カルシウム、バリウム等の２価の陽イオ
ンとの塩が挙げられる。

本発明によれば、α−ケト酸は不斉還元され、光学活性
な＾−０−ヒドロキシ酸を得ることができる。

ＲＣＯＣＯＯＨ→ＲＣ（Ｈ）ＯＨＣＯＯＨ本発明を実施
するにあたっては次の３点について考慮しなければなら
ない。

（１）ベンゾイルギ酸還元酵素、（２）　ＮＡＤＨ再生
システム、及び（３）反応の実施条件の３つである。

まず（１）のベンゾイルギ酸還元酵素はストレプトコッ
クス属の細菌の菌体を破壊し抽出することによって調製
する。このために用いる菌株として。

例えばストレプトコックスファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）が挙げられる。培
地及び培養条件としては菌体の増殖が良く、目的の酵素
活性が高いのであればどのようなものでもよく、例えば
、トマトジュース培地を用いて３０℃で１５〜２５時間
振どう培養するなどの方法が挙げられる。

集菌した菌体の破壊には超音波処理など通常の方法を用
いればよく、このようにして可溶化された目的酵素を精
製するためには、アフィニティークロマトグラフィーや
イオン交換クロマトグラフィーなど通常の方法を用いれ
ばよい。この精製は、必らずしも目的酵素を単一メ土質
として単離するほどに行うことを必要としない。普通に
は、菌体に由来する低分子成分、多糖類、核酸及びプロ
テアーゼやＮＡＤＨオキシダーゼなどの妨害作用をなす
酵素を除いて、比活性を１０００／ｍｇ程度に上昇させ
たものでも十分である。このためには例えば色素結合樹
脂によるアフィニティクロマトグラフィーが効果的であ
る。しかし本発明は、これらの記述によって何ら限定さ
れるものではない。次に（２）のＮＡＤＨ再生システム
は、原料α−ケト酸に対するＮＡＤＨの使用量が等モル
又はそれ以上である場合には必要ない。しかし、ＮＡＤ
Ｈのコストの点からそのような使用法は実際にはありえ
ず、反応産物の酸化型ＮＡＤ（ＮＡＤ”）をその場で還
元してＮＡＤＨに再生するようにして使用しなければな
らない。このためにＮＡＤＨ再生システムが必要である
。このようなシステムとしては、亜ニチオン酸ナトリウ
ムによる化学的な還元システム、電解還元を利用するシ
ステム、アルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素
又はギ酸脱水素酵素などの脱水素酵素を利用するシステ
ムを凄尋あり、場合に応じて適当なシステムを使用すれ
ばよい。最後に、（３）の実施条件について説明する。

まず緩衝液を選定するが、中性付近で通常用いられるも
のならどのようなものでもよく、例えばリン酸緩衝液や
トリス・塩酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は
数ｍＭから２〜３００ｍＭの範囲で適当に選べばよい。

これよりも高濃度であってもさしつかえない、　ｐＨは
４から８の間の適当な値とする。どの値にするかは、実
施にあたって要求される反応速度と酵素の安定性及びＮ
ＡＤＩＩ再生システムのそのＰＨに対する適合性を考慮
して決定する。本発明に用いるベンゾイルギ酸還元酵素
の至適ｐＨは４．５付近であり、また加熱に対して最も
安定となるｐＨは５．８〜６．０である。しかしＮＡＤ
Ｈが酸性において不安定であることを考えると、あまり
ｐＨを低くすることは好ましくない、この緩衝液にα−
ケト酸をナトリウム塩やカリウム塩など適当な塩の形と
して溶解させる。その濃度は、ミカエリス定数（３０℃
、ｐＨ７，５でα−ケトイソカプロン酸に対して０．７
ｍＭ、フェニルピルビン酸に対各７ンデ、２ｍ阿）の１
０倍程度（約７０〜７０１）から１００倍程度（約７０
〜５００ｍＭ）とすることが実際的である。

もちろんこの範囲以上でも以下でもさしつかえない、　
ＮＡＤＨ（又はＮＡＤ”）の濃度は使用するＮＡＤ）ｌ
再生システムの活性強度や安定性及び全反応速度として
要求される反応速度等を考慮して適当に決定すればよい
が、普通には、ベンゾイルギ酸還元酵素におけるミカエ
リス定数（３０℃、ＰＨ７，５で３５μＭ）の１０〜１
００倍程度の濃程度すれば十分である。もちろんこれよ
りもはるかに低い値にして１回転数（ターンオーバーナ
ンバー）を向上させることもさしつかえない０次にＮＡ
ＤＨ再生システムに必要な試薬又は基質を反応液に添加
する。例えばアルコール説水素酵素を再生システムに使
用する場合には。

その酵素の基質であるエタノールを添加する。濃度とし
ては、原料のα−ケト酸の濃度以上であって、かつ再生
反応が円滑に進行するような濃度とする。なお、α−ケ
ト酸と再生反応用基質を反応液に添加するにあたっては
、反応開始前に一度に全量を添加してもよく、また反応
の進行に伴って逐次回分添加するように−Ｇ￥耐よい。

このようにして原料のα−ケト酸、ＮＡＤＨ（又はＮＡ
Ｄ”）及び再生反応用の試薬又は基質を溶解させた反応
液の準備ができたら、酵素を添加して反応を開始する。

その前に安定化剤として０．１〜２ｍＭ程度のメルカプ
トエタノール及び／又は０．０５％程度の牛血清やアル
ブミンを添加しておくことが望ましい場合がある。

またメルカプトエタノールの代りにジチオスレイトール
を用いてもよい。ベンゾイルギ酸還元酵素及び再生反応
を酵素法で行う場合のその酵素のそれぞれの使用量は、
要求される反応速度に応じて適当に決めればよい。なお
、基質、酵素の混合順序は上の通りである必要はなく、
場合に応じて適当に行えばよい。反応温度の上限は４０
℃付近とする。これより高温だとベンゾイルギ酸還元酵
素の失活がすみやかである。通常は３０℃前後で反応を
行うとよい。反応が完結するまでに要する時間は用いた
酵素量によって違ってくることは当然である。反応終了
後生成物のα−ヒドロキシ酸を単雛するのには、有機溶
媒抽出など通常の方法を応用（ｌ’、、　（−−ｉ すればよい−例：えは、反応液を希塩酸や希硫酸などで
ＰＨ２〜ｌの酸性とし、次で食塩などの塩を飽和濃度に
まで溶かしこんだ酢酸エチルやエーテルなどで抽出を行
うと、反応液中のα−ヒドロキシ酸はほぼ定量的に回収
される。有機層を分は取り、溶媒を留出した残渣を熱し
たベンゼンなどに溶解させ、必要があれば活性炭処理を
施した上で熱濾過を行い、濾液を冷却すれば１通常、結
晶を与える。（リーα−ヒドロキシ醋酸や（Ｒ）−α−
ヒドロキシバレリアン酸の場合には遊離酸は結晶になり
にくいのでそのような場合は適当な塩の形として結晶化
を行う０例えば、有機溶媒抽出物を濃縮後、残渣を少量
の水にとかし、Ｂａ　（ＯＨ）ｚ水溶液で中和する。不
溶分を濾別し、アセトンなどを加えて放置すれば結晶化
する。

〔効　　果〕

次に１本発明の特徴を以下に別記する。

（１）光学分割法とは異なって、理論的に１００％の収
率が期待できる。

（２）反応操作は水溶液中で原料、酵素及びその他であ
り、特別な装置・操作を必要としない。

（３）触媒のベンゾイルギ酸還元酵素はグルコースやト
マトしぼり汁など安価な原料を用いて容易に培養できる
ストレプトコックス属細菌の培養物から簡＋３−に取得
される。

（４）上記の培養にあたって最適な条件を適用すれば、
酵素は培養物の１リツトルあたり３９０００〜４６００
Ｕを得ることができる。この活性単位の測定にはベンゾ
イルギ酸を基質としているが、各種のα−ケト酸に対す
る最大速度の相対値から概算すると、ベンゾイルギ酸以
外のα−ケト酸を基質とする場合にも培養物１リツトル
あたり通常１００００以上を得ることができる。中でも
α−ケトイソカプロン酸が基質の場合には培養物ＩＱあ
たり５ｓｏｏ’ｕと計算され、前記Ｈｕｍ＋ｍｅｌらの
値の５５倍である。従って、本発明は、公知の酵素より
も、より安価に供給される酵素を利用することを特徴と
するものである。

（５）本発明に関する酵素のエナンチオ選択性は極めて
高く、請求の範囲に記載したα−ヒドロキシ酸に関して
は’４６６ｘ　ｈ光学純度で尺−型のエナンチオマーを
生成する。

（６）本発明によれば、培養物から抽出され純化された
酵素を使用して反応を行うため代謝による基質や生成物
の消費がないから反応収率は非常に高く、結晶生成物の
収率として通常８０％以上であり。

９０％以上に達することもある。

（７）上項と同じ理由により、菌体成分や培地成分によ
る生成物の汚染がないから、クロマトグラフィー等の特
別な精製操作を行わなくても容易に高純度の製品が得ら
れる。

以上に述べたように、ストレプトコックス属細菌のベン
ゾイルギ酸還元酵素を応用する本発明の光学活性α−ヒ
ドロキシ酸及びその塩の製造法は、安価に取得される酵
素を用いて水溶液中で反応させるという簡単な操作で、
光学純度１０（１％のＲ−エナンチオマーを高収率で生
産するというすぐれた方法である。

〔実施例〕

次に実施例について本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ストレプトコックスファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｕＳ ｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ１２９６４）をトマトジュー
ス・麦芽エキス・ＣｏＳＯ４の培地で通気撹拌培養した
。３０℃で２４時間培養後、集菌し、菌体を超音波処理
してベンゾイルギ酸還元酵素を抽出した。これをＭａｔ
ｒｅｘ　ＲｅｄＡ樹脂を充填したカラムによるアフィニ
ティクロマトグラフィーと、ＤＥＡＥ−セファローズカ
ラムによるイオン交換クロマトグラフィーを順次行って
比活性９１１Ｕ／ｍｇの標品を得た。このものの一部（
３８Ｕ）をとり、０．５％の牛血清アルブミンと２ｍＭ
のメルカプトエタノールを含む１５鱈リン酸緩衝液（ｐ
ｌ（６，３）の７ｍＭに溶解させておいた。一方、０．
８ｇのα−ケトイソカプロン酸ナトリウム塩を、　０．
２Ｍのギ酸ナトリウム、０．０５％の牛血清アルブミン
、及び２ｍＭのメルカプトエタノールを含む０．１Ｍリ
ン酸Ｉｔ１衝液（ＰＨ７，５）の１１０１１ＩＱに溶解
させた。これに、ＮＡＤＨの１７０ｍｇ、ギ酸脱水素酵
素の３３Ｕ（ベーリンガー社製。

０．５■ＱのｐＨ６，３リン′ｆｌＫ！！衝液に溶解）
及び上記の酵素液を添加した。トルエン０．６＋ｓＱを
加え密栓して３０℃に２３時間保温した。ｐＨ２以下に
なるまで６ＮＨＣＱを加え、次で塩化ナトリウムを飽和
になるまで溶解さセタ。コｈ　ｔｔ　２００ｒｍ　Ｑ、
２００ｍ　Ｑ　及び１００ｍＱ（７）酢酸エチルで３回
抽出し、有機層を合せ、硫酸ナトリウム上で乾燥した。

硫酸ナトリウムを濾別し。

溶媒を減圧留去して得られたシロップ状の残渣をエーテ
ル／ヘキサンの加温した混合液に溶がし、活性炭処理後
、濾過してから冷却すると、結晶化した。かくして、総
計５０６ｍｇの針状結晶を得た（収率８２％）、　ｍｐ
（７８〜７９℃）とＩＲスペクトルは、市販の（Ｓ）−
（−）−α−ヒドロキシイソカプロン酸の純品（シグマ
社製；１Ｉ１２７８〜７９℃；（ａ　号’　＝　−ｕ、
ｓｏ、ｃ＝５．２０．水）と完全に一致した。一方、比
旋光度は（ｃｚ　］”　＝　＋　１１，６°（Ｃ＝５．
１７．　水）Ｑ　アリ、ｖＡ＄品ノ比旋光度と比べて符
号が逆であって絶対値が一致したことから、この酵素反
応による還元産物はＲの絶対配置を有する（幻−（＋）
−α−ヒドロキシイソカプロン酸であって、その光学純
度は１００％であることが確認された。

実施例２ ０．８ｇのα−ケトカプロン酸ナトリウム塩を、０．２
阿のギ酸ナトリウム、Ｏ，ＯＳ％の牛血清アルブミン及
び２ｍＭのメルカプトエタノールを含み、０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）の１００！Ｉ　ｎに溶かした。

これにＮＡＤＨの１６０ｍｇ、ギ酸脱水素酵素３３υ（
０，５ｍｕ溶液）及びベンゾイルギ酸還元酵素５１Ｕ（
３ｍ　Ｑ溶液）を加えて混合した。トルエン０．５＋ｎ
Ｑを加えてから密栓し、３０℃に２３時間保温した。６
ＮＨＣＱをｐｉ（２以上になるまで加え、次で食塩を飽
和になるまで溶解させた。

酢酸エチルの１００＋ａ　Ｑ、１００ｍＱ及び５０ｍ　
Ｑで３回抽出し、有機層を合してＮａ２ＳＯ４で乾燥し
た。溶媒を留去し、シロップ状の残渣をエーテル／ヘキ
サンの混液から結晶させて、（Ｒ）−（＋）−α−ヒド
ロキシカプロ酸の６４７ｍｇを微細針状晶として得た（
収貿９３％）。

ｍｐ５９〜６０℃、〔α〕；５＝＋０．９４″（Ｃニア
、０、水）。融点は計エナンチオマーについての文献値
（５７〜５９℃；日化誌、７７（２）、２９０（昭和３
１年））にほぼ一致し、ＭＳ及びＰＭＲスペクトルはα
−ヒドロキシカプロン酸の構造に一致した。−比旋光度
は文献値（［α］：’＝十３．８”　（水）：Ｊ、Ａｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、７８．２４２３（１９５６）
）より小さかったが、実測値、文献値共に比旋光度の絶
対値が小さいので、光学純度を精密に決定するために以
下の実験を行った。酵素反応産物の少量をジアゾメタン
でメチル化し１次で（Ｒ）−（＋）−α−メトキシ−α
−トリフルオロメチルフェニル酢酸クロリドと反応させ
ジアステレオメリックなエステルに導いた。これをガス
クロマトグラフィーで分析したところ、α−ヒドロキシ
カプロン酸の旦−エナンチオマーに帰属されるピークは
検出されず。

尺−エナンチオマーによるピークのみが検出された。

従って、エナンチオマー純度、すなわち光学純度はｒ体
が１００％と結論された。ガスクロマトグラフィーの条
件二カラム、化学結合型ｏｖ−ｉキャピラリーカラム、
０．２５＋ｍ＋ｓＸ２５ｍ：キャリャーガス、ヘリウム
、入口圧１．４ｋｇ／ａｌｔ、入口流速８０ｍ　Ｑ　／
＋ｉｎ；カラム温度、１３５℃；保持時間２８．８１分
（計エナンチオマー）及び３１．７０分（計エナンチオ
マー）。

実施例３ ０．８ｇのフェニルビールビン酸ナトリウム塩を、５１
Ｕのベンゾイルギ酸還元酵素、　１４０ｍｇのＮＡＤ）
Ｉ及び３３Ｕのギ酸脱水素酵素を用いて実施例１と同様
にして反応させ、生成物の酢酸エチルで抽出した。抽出
物を濃縮し、沸とうベンゼンから結晶化させて（わ−（
＋）−３−フェニル乳酸の５６９ｍｇを微細針状晶とし
て得た（収率８０％）。融点（１２４〜１２５℃）とＩ
Ｒスペクトルは市販の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳
酸の純品（Ｓｉｇｍａ社製、ｍｐ１２４〜１２５℃；（
ａ　）も’　＝−２０，３°（Ｃ＝２．３３、水））と
完全に一致した。一方、比旋光度は〔α）”＝＋２０．
９°（Ｃ＝２．２９、水）であり、標準品の比遊光度に
比べて符号が逆であり、その光学純度は１００％である
ことが確認された。

実施例４ １．１ｇのα−ケトイソバレリアン酸ナトリウム塩を実
施例１と同様にして反応させ、生成物を酢酸エチルで抽
出後、ベンゼン／エーテル／ヘキサンの混合液から結晶
化させて（Ｒ）−（−）−α−ヒドロキシイインレリア
ン酸の７８８ｍｇを板状晶として得た（収率８４％）。

ｍｐ６３〜６５℃、（α）：’　＝−１６，９°（Ｃ＝
１．３４、ｃｎｃａ、）（文献［４ｍ”；６Ｓ’＝６６
℃、〔α）”＝−２１，２゜（Ｃ＝１．２．Ｃ）ＩＣＱ
　３）；Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９４９ｍ１０２５
）、　ＭＳ及びＰＭＲスペクトルは上記の構造に合致し
た。光学純度を実施例２と同様にして精密に測定したと
ころ、１００％の計エナンチオマーから成ることが確認
された。ガスクロマトグラフィーの保持時間＝１６゜５
４分（旦−エナンチオマー）及び１８．１３分（計エナ
ンチオマー）；分析条件は実施例２の場合と同じ）。

実施例５ １．３ｇのα−ケトバレリアン酸ナトリウム塩を実施例
１と同様にして反応させ、生成物を酢酸エチルで抽出し
た。有機層をとり、溶媒を留去後、残渣を約１０ｍ１２
の水にとがし、次いでＢａ（ＯＨ）ｚの飽和水溶液をｐ
Ｈ７，０になるまで少しづつ加えた。中和された後、不
溶分を濾別し、濾液をエバポレーターで約５ｍＱに濃縮
した。加温しつつアセトンを全体が白濁するまで加え、
次で室温に放置すると総計 １．７ｇのリン片状結晶を与えた（収率９１％）。〔α
〕Ｖ＝＋１０．５＠（Ｃ＝４．０４、水）（（Ｒ）−ｃ
ｚ−１：：ドロキシバレ７．２’　（水）　；Ｊ、Ａｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、　７８．２７２３（１９５６
））。ＰＭＲスペクトルはα−ヒドロキシバレリアン酸
の構造に合致した。バリウム塩の一部をとり、塩酸酸性
の食塩飽和の条件でエーテルで抽出した。この抽出物に
ついて託スペクトルを測定したところ、ｍ／ｚ：１１８
に分子イオンピークを示した。また、この抽出物につい
て実施例２に記載したのと同様の方法で光学純度を精密
に測定したところ、計エナンチオマーは全く含まれてお
らず、光学純度は旦一体について１００％であることが
わかった。ガスクロマトグラフィーの保持時間：１９．
２０分惟−エナンチオマー）、２０．９８分（計エナン
チオマー）：分析条件は前記と同じ。

実施例６ ０．５５ｇのα−ケト酪酸を実施例１に述べた反応用リ
ン酸緩衝液（０，２Ｍギ酸ナトリウムを含む）の１０８
ｍｇに溶解させ、６　Ｎ　Ｎ　ａ　ＯＨでＰＨ７，５に
なるよう調整した。これにＮＡＯＨＯ１７０ｇ、ギ酸脱
水素酸素４０Ｌｌ、及びベンゾイルギ酸還元酵素２４０
を溶解させ、次で少量のトルエンを加えて密栓し、：３
０℃で４５時間反応させた。常法に従って酢酸エチルで
抽出し、溶媒を留出して得た残渣を実施例５と同じよう
にしてＢａ塩とし、水／アセトンから結晶させ、５１９
ｍｇのリン片状結晶ヲ得た（収率５７％）　−（ａ　）
ｐ’　＝＋　８−６°（Ｃ＝４．８３、水）；（旦）−
α−ヒドロキシ酪酸についての文献値は〔α〕ｔ＠＝＋
８．８°（水）（Ｊ、Ａｎ＋、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、　、
７Ｅ！。

２４２３（１９５６））。ＰＭＲスペクトルはα−ヒド
ロキシ酪酸の構造に合致した。バリウム塩の一部をとり
、塩酸酸性・食塩飽和の条件でエーテルで抽出した。

の抽出物（シロップ状）についてＭＳスペクトルを測定
したところ、！ＩＩ／ｚ：１０４に分子イオンピークを
示した。また、この抽出物について実施例２に記載した
のと同様の方法で光学純度を精密に測定したところ、針
エナンチオマーは全く含まれておらず、光学純度は計体
について１００％であることが示された。ガスクロマト
グラフィーの保持時間：１３．６９分（旦−エナンチオ
マー）、１４．７１分（計エナンチオマー）；分析条件
は前記と同じ。

実施例７ １ｇの３−クロロｌｅ’、ｗビン酸を１．５ｇのギ酸と
共に。

２ｍＭのメルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５）の約３０ｒｍ　Ｑにとかした。　Ｍ
ａｉｌ（を少しずつ加えて中和した。これに、ベンゾイ
ルギ酸還元酸素の６７Ｕの他生血清アルブミンを０．５
％とメルカプトエタノールを２＋＋＋Ｈの濃度で含む１
５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ６，３）の１５＋ａ　Ｑを加
えた。さらに、ＮＡＤＨの２００ｍｇとギ酸脱水素酵素
の８０Ｕを加え、最後に上記ｐＨ７，５のリン酸緩衝液
を加えて全液量を１６３ｍ　Ｑとした。これにトルエン
を０．８ｍｆｌ加え密栓して３０６で２日間放置した。

塩酸酸性・食塩飽和の条件で酢酸エチルで抽出を行い、
有機層を集めて濃縮した。

シロップ状の残渣を加温しながらベンゼンとトルエンの
約９：１の混合液に溶かした。活性炭を少量加え、熱時
に濾過し、濾液を室温に放置しておく１０４．４４５８
（１９８２））。ＭＳ及びＰＭＲスペクトルはβ−クロ
ロ乳酸の構造に一致した。また、実施例２に記載したの
と同様の方法で光学純度を精密に測定したところ、Ｓ−
エナ゛ジ゛チ゛二芽マーは全く含まれておらず、光学純
度は尺体について１００％であることが示された。ガス
クロマトグラフィーの保持時間＝２２゜５８分（計エナ
ンチオマー）、　２３．２６分（針エナンチオマー）。

特許出願人　工業技術院長　　　飯　塚　幸　三官庁出
願 手続ネ甫正書（方式） ％式％ ｌ、事件の表示　　　昭和６１年特許願第１７７３４８
号２、発明の名称　　　酵素法による光学活性α−ヒド
ロキシ酸の製造法３、補正をする者 ４、指定代理人 ６、補正により増加する発明の数　　な　し別紙 本願明細書中において次の通り補正を行います。

Ｏ発明の名称を次の通り訂正します。

「酵素法による光学活性α−ヒドロキシ酸の製造法」

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトコックス属細菌の菌体から抽出したベ
   ンゾイルギ酸還元酵素の存在下、還元型のニコチンアミ
   ド・アデニン・ジヌクレオチドを用いて一般式 ＲＣＯＣＯＯＨ （式中、Ｒは炭素２〜４のアルキル基、クロロメチル基
   、ブロモメチル基又はベンジル基を表わす）で表わされ
   るα−ケト酸を還元し、対応するα−ヒドロキシ酸の光
   学活性体を得ることを特 徴とする光学活性α−ヒドロキシ酸の製造法。