JPS6332145B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒトじゆう毛性性腺刺激ホルモン
〔human chorionic gonadotropin（hCG）〕の新
規な測定法に関する。 hCGは糖蛋白であり、妊娠とともに胎盤より分
泌され、妊娠の維持に重要な役割を果している性
ホルモンである。このhCGを定性または定量する
ことにより妊娠の有無、異所性妊娠、じゆう毛性
性癌などの早期発見並びに診断が可能となる。し
かしながら、性腺刺激ホルモンには黄体形成ホル
モン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）やCGな
どがあり、それらの分子構造は類似しており、糖
蛋白であり、しかもα鎖、β鎖の２種のサブユニ
ツトからなり、特にそのα鎖においては各々のα
鎖を交換しても活性に変化がない程分子構造的に
類似しているものである。またβ鎖は各々の性腺
刺激ホルモンにより特異的であるが、LHのβ鎖
とCGのβ鎖とは類似している。 このような性腺刺激ホルモンにおいて、特に
hCGの測定に関して、ラジオイミユノアツセイ、
エンザイムイミユノアツセイ、血球凝集阻止反
応、血球凝集反応、ラテツクス凝集反応などを利
用して特にLHと交叉性の少ない信頼性の高い測
定系が種々検討されている。また特にエンザイム
イミユノアツセイにおけるhCGの測定系において
は、測定のための酵素標識体に用いられるhCGま
たはそのフラグメントによつて測定系の感度も不
満足なものであつた。 本発明者は、全く意外にも、このhCGのエンザ
イムイミユノアツセイにおいて、hCGの分子中に
結合しているシアリン酸（sialic acid）を脱離せ
しめてなる脱シアリン酸化hCG（ds―hCG）と酵
素との結合体をその酵素標識体として用いること
により、著しく感度よく測定し得ることを見い出
した。 本発明は上記の知見に基いが完成されたもの
で、hCGのエンザイムミミユノアツセイにおい
て、ds―hCG―酵素結合体を酵素標識体として用
いることを特徴とするhCGの測定法である。 まず本発明に用いられるエンザイムイミユノア
ツセイの手法としては、ds―hCG―酵素結合体と
被検液とをその抗体に対して競争反応せしめ、次
いでds―hCG―酵素結合体と抗体との免疫結合体
と、未反応のds―hCG―酵素結合体とを分離せし
め、その後そのいずれか一方または両方の酵素活
性を測定することにより被検液中のhCGの測定を
行なう競争反応に基く方法が簡便な手法として例
示される。さらにこの競争反応に基く方法は、好
ましくはds―hCG―酵素結合体と抗体との免疫結
合体と、未反応のds―hCG―酵素結合体との分離
の際に、その抗体に対する抗体であるいわゆる第
２抗体を用いる方法や、その抗体を不溶化せしめ
た不溶化抗体として用いる方法にて実施される。 まず本発明のds―hCG―酵素結合体を得るに用
いられるds―hCGとしては、hCGの分子内のシア
リン酸分子を弱酸などによる化学的加水分解や、
酵素による加水分解にてシアリン酸をhCG分子よ
り脱離せしめればよい。例えばhCGを含有する
0.05M酢酸緩衝液に、ニユラミニダーゼ
（neuraminidase；シグマ社製）を加えて37℃に
て１時間以上反応せしめて加水分解後、次いで一
夜透析後、クロマトグラフイーにて精製して目的
とするds―hCG分画を回収すればよい。さらにds
―hCG―酵素結合体を得るに用いられる酵素とし
ては、酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵素、
リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼが適宜使用さ
れるもので、例えばラクテートデヒドロゲナー
ゼ、マレイトデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、マルトースデヒドロゲナーゼ、ペル
オキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、マレイ
トオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コリ
ンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カ
タラーゼ、α―アミラーゼ、β―ガラクトシダー
ゼ、リゾチーム、リパーゼ、アルカルホスフアタ
ーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン、パパイ
ン、α―キモトリプシン、アミダーゼ、ヘキソキ
ナーダ、グリセロキナーゼなどが挙られる。さら
にこれらの酵素やds―hCGは、あらかじめ任意の
スペーサー導入を行なつてもよく、例えばスクシ
ンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポアル
デヒドなどのジアルデヒド、ω―アミノ酸の酸ク
ロライドやスクシンイミドエステルなどの反応性
誘導体、ジカルボン酸の反応性誘導体、ヘキサメ
チレンジアミン、デカメチレンジアミンなどのジ
アミン、Ｓ―アセチルメルカプトサクシニツク・
アンハイドライド、ジアルデヒドと２―アミノエ
タンチオールなどのスペーサー試薬を一種または
２種以上用いて新たにアルデヒド基、アミノ基、
チオール基、カルボキシル基をスペーサー導入せ
しめてもよい。次いでこのようなds―hCGと酵素
とを結合せしめるのであるが、ds―hCG、酵素の
有するアミノ基、水酸基、チオール基、カルボキ
シル基などや、さらに導入したアルデヒド基、ア
ミノ基、チオール基やカルボキシル基などに基い
て両者を結合せしめればよい。結合に当つては、
両者を直接または結合剤を用いて間接的に結合せ
しめてもよい。両者を直接結合せしめるに当つて
は、例えばds―hCGの分子内アミノ基と酵素の分
子内カルボキシル基とを水溶性カルボジイミドの
存在下反応せしめればよい。また結合剤を用いて
反応せしめるに当つては公知の種々の多官能性化
合物、例えばヘキサメチレンジイソシアナート、
２，４―トルエンジイソシアナートなどのジイソ
シアナート化合物、ヘキサメチレンジイソチオシ
アナートなどのジイソチオシアナート、ジアルデ
ヒド、Ｎ，N′―エチレンビスマレイミド、Ｎ，
N′―ｏ―フエニレンジマレイミド、メタマレイ
ミドベンゾイル・Ｎ―オキシスクシンイミドエス
テル、ビスジアゾベンジジン、Ｎ，N′―ポリメ
チレンビスヨードアセトアミド、ジエチルマロン
イミデート、ジメチルアジピンイミデート、３―
（2′―ベンゾチアゾリル―ジチオ）プロピオン酸、
３―（2′―ピリジル―Ｎ―オキシド―ジチオ）プ
ロピオン酸、６―Ｎ〔３―（2′―ベンゾチアゾリ
ル―ジチオ）プロピオニル〕カプロン酸などのス
ルフイドカルボン酸またはそのスクシンイミドエ
ステル、ｐ―ニトロフエニルエステル、酸クロラ
イドやイミデードなどの反応性誘導体、マレイミ
ド安息香酸、マレイミドフエニル酢酸、マレイミ
ドフエニルプロピオン酸などのマレイミドカルボ
ン酸またはその反応性誘導体などを用いればよ
い。またds―hCG―酵素結合体を得るに当つて
は、通常PH６〜８の緩衝液中メタノール、エタノ
ール、アセトン、ジオキサン、テトラビドロフラ
ン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミ
ドなどの有機溶媒の存在下、または有機溶媒中、
０〜40℃にて、例えばds―hCGと多官能性化合物
を反応せしめ、次いで酵素を加えてさらに反応せ
しめる。反応後、必要に応じて精製すればよく、
好ましくはクロマトグラフイーやゲル過手段を
用いればよい。さらにds―hCG―酵素結合体を得
るに当つて、結合の際、介在物質を１種または２
種以上介して両者を結合せしめてもよい。即ちds
―hCG―〔介在物質〕―酵素結合体となして得て
もよいものである。この介在物質としては、ds―
hCGの分子量より大きく、また用いる酵素の分子
量より小さく、通常ds―hCGの分子量の５〜９倍
程度であればよく、またアフイニテイ―クロマト
グラフイーにて特異的吸着を示すものが好まし
い。この介在物質の使用目的としては、まずds―
hCGと介在物質とを、前記の如くの多官能性化合
物にて結合せしめてds―hCG―介在物質結合体と
なし、この際未反応のds―hCG、介在物質などを
その分子量の差異によりゲル過にて分子篩せし
め、さらに介在物質の特異的吸着によりアフイニ
テイ―クロマトグラフイーにて精製し、さらに必
要に応じて別の介在物質を結合せしめて同様に精
製し、次いで目的とする酵素を結合せしめて精製
してなるもので、介在物質の分子量および特異的
吸着性に基いて精製することにより、目的とする
ds―hCG―〔介在物質〕―酵素結合体の結合性の
良好なものが得られる。特にds―hCGに対して用
いる酵素の分子量が著しく大きい場合、例えば分
子量約50万のβ―ガラクトシダーゼの場合には、
ds―hCG―β―ガラクトシダーゼ結合体と未反応
のβ―ガラクトシダーゼとの分離は著しく困難で
あるに対し、介在物質として、例えばコンカナバ
リンＡに対して特異的吸着性を示すペルオキシダ
ーゼを用いれば、ds―hCG―ペルオキシダーゼ結
合体を得るに当つて、ゲル過およびコンカナバ
リンＡによるアフイニテイ―クロマトグラフイー
にて精製し得、さらにこれを用いて目的とするds
―hCG―〔ペルオキシダーゼ〕―酵素結合体を得
るに当つて同様に精製することにより良好に精製
し得るものである。 また本発明に用いられる抗体を得るに当つて
は、好ましくはhCGのβ鎖またはそのＣ末端フラ
グメント、例えば後述参考例に示すhCGのβ鎖の
127―145のＣ末端フラグメント（hCG〔127―145〕
と略す）、hCG〔118―145〕や種々のβ鎖のＣ末端
フラグメントが用いられる。 特に、hCG〔127―145〕、hCG〔118―145〕とし
ては、下記式〔〕 （ただし式中、ＲはＨ、または 基を示す）にて表わされるペプチドである。 まずこのβ鎖またはそのＣ末端フラグメント
は、高分子蛋白質、例えば牛血清アルブミン
（BSA）やラビツト血清アルブミン（RSA）、ま
たはそれらのアルカリ処理もしくはゾジウムラウ
リルサルフエートとメルカプトエタノール処理に
よる分子内ジスルフイド基を開裂せしめた処理物
に、高分子蛋白質１分子当り、前記の多官能性化
合物を用いて、５〜30分子程度結合せしめた結合
体となすか、または水溶性カルボジイミドやグル
タルアルデヒドなどのジアルデヒドを用いてβ鎖
またはそのＣ末端フラグメントの重合体となす。
次いでこれを種々の哺乳動物、例えばβ鎖または
そのＣ末端フラグメントと高分子蛋白質との結合
体、またはβ鎖またはそのＣ末端フラグメントの
重合体をフロイント・コンプリート・アジユバン
トに乳化せしめ、ラビツト、ラツト、モルモツト
やマウスなどの適宜選択した哺乳動物に皮下注射
せしめ、１〜２週間間隔にて数回投与するか、ま
たは１回多量投与して感作せしめればよく、感作
後適当な時期にてその哺乳動物より採血し、その
抗体力価を測定し、抗体産生が良好な時期にその
動物より採血し、これを常法により遠心処理など
を行なつてその抗血清を得ればよい。またこの抗
血清は十分高濃度の目的たる抗体を含有してなる
もので、適宜そのまま保存してもよく、また使用
時に必要に応じて希釈して用いればよい。さらに
この抗血清は、塩析、等電点沈澱、透析、クロマ
トグラフイー、ゲル過手段などの抗体の常法に
よる精製手段により、その抗体を得てもよい。 さらにこの精製された抗体は、不溶性担体と結
合せしめて不溶化抗体となすことにより、不溶化
抗体を用いる競争反応に基く方法に利用される。
まずこの不溶化抗体となすに用いられる不溶性担
体としては、例えばグルタルアルデヒドなどにて
処理してなるアルブミンやゼラチンなどの不溶性
蛋白質担体、アガロース、セルロースやデキスト
リンなどのエピクロルヒドリン処理または臭化シ
アン処理、さらにそれらのアミノ基導入のための
アミノ化試薬処理してなる不溶性半合成高分子担
体、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸
エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エス
テル、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレ
ン、アミノスチレン、ジビニルベンゼン、アクリ
ルアミド、エチレン、無水マレイン酸、クロトン
酸などのポリマーまたはコポリマー、さらにそれ
らのアミノ化試薬処理してなる不溶性合成高分子
担体、その他アミノ化試薬処理してなるシラン化
合物などの不溶性無機担体などが挙られる。また
これら不溶性担体にアミノ基を導入するためのア
ミノ化試薬処理としては、例えばニトリル基の還
元によるアミノ化のための試薬、水酸基をγ―ア
ミノプロピルトリエトキシシランの反応によるア
ミノアルキル基の導入のための試薬、ヒドロキシ
メチル基の過ヨウ素酸酸化にてアルデヒド基に変
換せしめ、次いでこのアルデヒド基にジアミンを
反応せしめてなるアミノ基導入のための試薬など
が適宜用いられ、さらに多糖類水酸基の臭化シア
ン反応によるイミドカルボナート基への変換、ア
ミド基のハロゲン化リン化合物によるイミノハロ
ゲニド基への変換、さらにこれらの官能基は公知
の種々の手段により新たな官能基を導入してもよ
い。またこのような不溶性担体と前記抗体とを結
合せしめて不溶化抗体を得るに当つては、通常水
性媒体、例えば緩衝液中にて、抗体の有する官能
基、不溶性担体の有する官能基に基いて、適宜選
択した前記多官能性化合物を用いて、０〜40℃に
て反応せしめればよい。 さらに第２抗体を用いる競争反応に基く方法を
実施するに当つては、前記抗体を得るに用いた哺
乳動物種の免疫グロブリンを、別種の哺乳動物に
投与して感作せしめればよい。この別種の哺乳動
物への投与、感作に当つては、前記の抗体を得る
方法と同様にして行なえばよく、さらに感作後、
採血し、抗血清を、さらに必要に応じて抗体を採
取すればよく、これを本発明の第２抗体として使
用するものである。 次いで本発明を実施するに当つて例示すれば、
例えば適宜希釈した抗体含有液、通常抗血清
200μ、被検液50μ、PH7.2〜7.4の緩衝液、通
常0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）100μ、および
ds―hCG―酵素結合体、例えばds―hCG―β―ガ
ラクトシダーゼ結合体含有液50μを４℃にて一
夜インキユベイトし、次いでこれに抗血清を得た
哺乳動物種の免疫グロブリン含有液100μおよ
び第２抗体含有液100μを加えて４℃、一夜イ
ンキユベイトした後これを遠心分離する。次いで
その上澄液と沈澱物とを分離し、これをその酵素
活性測定用媒体に加えて、その上澄液または沈澱
物の酵素活性を測定する。例えばds―hCG―酵素
結合体の酵素がβ―ガラクトシダーゼの場合に
は、ｏ―ニトロフエノール―β―Ｄ―ガラクトピ
ラノシドの0.1％程度の基質溶液を用いて、37℃
にて15分〜一夜反応せしめて後反応を停止し、次
いで反応によつて生じた呈色を420nmの波長にて
吸光度を測定すればよい。また不溶化抗体を用い
る場合には、例えば被検液50μ、緩衝液300μ
、不溶化抗体のビース状物１〜２粒、ds―hCG
―酵素結合体含有液50μを、同時または順次イ
ンキユベイトせしめ、その後そのビース状物と液
層とを分離し、以下そのいずれか一方または両方
の酵素活性を測定すればよい。またこの際に用い
れる不溶化抗体はビーズ状物に限られるものでな
く、免疫反応のために用いる試験管壁の面をもつ
て不溶化したものであつてもよく、適宜種々の形
状にて用いられるものである。さらに酵素活性を
測定するに当つては、用いる酵素に従つて公知の
酵素活性測定法により活性を測定すればよく、通
常紫外線吸収、螢光反応、呈色反応、発光反応、
酸素電極、過酸化水素電極などの電気的反応等に
基いて測定される。 次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具
体的に述べるが、本発明はこれらによつて何んら
限定されるものではない。 実施例 (1) 抗体作成について (イ) hCG（127―145）の３mg含有水溶液0.25mlに、
75mgの水溶性カルボジイミド（WSCD）水溶
液0.25mlを加えた。次いでそのPHを5.5に調整
した後、室温にて20時間反応せしめた。反応
後、これを、セフアデツクスＧ―150のカラム
にチヤージして、hCG（127―145）の重合体分
画を得、凍結乾燥した。 (ロ) 上記のhCG（127―145）の代りにhCG（118―
145）の３mgを用い、以下上記方法と同様にし
て、hCG（118―145）の重合体を得た。 (ハ) ２mgのBSA含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に、2.5％グルタルアルデヒド溶液0.2mlを加え
て室温にて18時間反応せしめた。反応後、セフ
アデツクスＧ―25のカラムにチヤージしてその
流出分画を得、これに、１mgのhCG（118―145）
含有生理食塩水１mlを加え、さらに1M炭酸ナ
トリウム水溶液（PH9.5）0.1mlを加えて、４℃
にて24時間反応せしめ、反応後セフアデツクス
Ｇ―100のカラムにチヤージして、BSA―hCG
（118―145）結合体の分画を得た。 (ニ) 0.7mgのhCG（118―145）含有250μ水溶液
に、2.5mgのRSA含有2.50μ水溶液を加え、こ
れに75mgの水溶性カルボジイミド（WSCD）
含有500μ水溶液を加えて、そのPHを５〜5.5
と調整した後、室温にて20時間反応せしめ、次
いでこれを、セフアデツクスＧ―100のカラム
にチヤージして、RSA―hCG（118―145）結合
体の分画を得た。 (ホ) 前記(ハ)のhCG（118―145）の代りにhCGのβ
鎖５mgを用い、以下同様にして、BSA―hCGβ
鎖結合体を得た。 (ヘ) 前記の如くして得られたhCG（127―145）の
重合体、hCG（118―145）の重合体、BSA―
hCG（118―145）結合体、RSA―hCG（118―
145）結合体、BSA―hCGβ鎖結合体を用いて、
これを等量のフロイント・コンプリート・アジ
ユバントと混和混合して乳化物となし、この
0.5mlづつをラビツト背部皮下に注射して感作
せしめ、その後採血し、遠心分離してその抗血
清を得た。 なお、hCG（127―145）重合体を用いてなる感
作に当つて、感作後４週間にて320U／mlを示し
た。またhCG（118―145）重合体を用いた場合に
は感作後５週間にて320U／mlを示した。さらに
BSA―hCG（118―145）結合体を用いた場合には
感作後５週間後40U／ml、７週間後80U／mlであ
つた。またBSA―hCGβ鎖結合体を用いた場合に
は感作後５週間で320U／ml、６週間で1280U／
mlであつた。 (2) ds―hCGの調整について 9.5mgの精製されたhCGを含有する0.05M酢酸
緩衝液（PH4.6；2mM CaCl₂および0.2ｍ Ｍの
EDTA含有）0.75mlに６mgのニユラミニダーゼ
（シグマ社製）を加えて37℃にて２時間反応せし
めた。反応後上記と同一緩衝液に対して37℃にて
一夜透析せしめた。次いでこれをDEAE―セルロ
ースによるカラムクロマトグラフイーを行なつて
ds―hCG分画（収量4.7mg）を得た。 (3) ds―hCG―β―ガラクトシダーゼ結合体など
について (イ) 0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）の0.25mlに0.5
mgのds―hCGを加え、これに無水テトラヒドロ
フランに溶解したメタマレイミド・ベンゾイ
ル・Ｎ―オキシスクシンイミドエステルのほぼ
等モル量を有する溶液20μを加えて30℃にて
30分間反応せしめ、次いでこれに1Mのクエン
酸緩衝液0.25mlを加え、セフアデツクスＧ―25
のカラムにチヤージして未反応試薬の除去をし
た。次いでその流出区分に、１mgのβ―ガラク
トシダーゼ含有1Mリン酸緩衝液（PH7.0）0.5
mlを加えて、室温にて２時間反応せしめ、その
後これに10^-5Mメルカプトエタノールの50μ
溶液を加えて反応を停止せしめた。次いでこれ
を、コンカナバリンＡ―セフアロース4Bにて
アフイニテイ―クロマトグラフイーを行ない、
さらにウルトロゲルAcA44のカラムにてゲル
過して、ds―hCG―β―ガラクトシダーゼ結
合体分画を得た。 (ロ) 上記ds―hCGの代りに、hCGを用いて、以下
同様に行なつて、hCG―β―ガラクトシダーゼ
結合体を得た。 (ハ) 上記ds―hCGの代りに、hCGのβ鎖を用い
て、以下同様に行なつて、hCGβ鎖―β―ガラ
クトシダーゼ結合体を得た。 (ニ) 0.5mgのds―hCG含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）0.5mlに、5mMのEDTAおよび３―（2′―
ベンゾチアゾリル―ジチオ）プロピオン酸スク
シンイミドエステルのほぼ等モル量を含有する
ジメチルアセトアミド溶液0.1mlを加えて、０
℃にて60分間反応せしめた。反応後、反応液
6μを分取し、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）500μおよびβ―ガラクトシ
ダーゼ1.3mgを加え、０℃、30分間反応せしめ
た。反応後、これをゲル過して、ds―hCG―
β―ガラクトシダーゼ結合体を得た。 (4) hCGの測定について (イ) 前記のBSA―hCGβ鎖結合体を用いて得られ
た抗血清を用いて、hCGの各種濃度（100〜
16000mIU／ml）に対するエンザイムイミユノ
アツセイにおける各種酵素標識体による差異を
求めた。なお酵素標識体としては、ds―hCG―
β―ガラクトシダーゼ結合体〔３項(イ)に記載の
方法で得られたもの；第１図中、○―○にて示
される場合である〕、hCG―β―ガラクトシダ
ーゼ結合体〔３項(ロ)に記載の方法で得られたも
の；第１図中、△―△にて示される場合であ
る〕、hCGβ鎖―β―ガラクトシダーゼ結合体
〔３項(ハ)に記載の方法で得られたもの；第１図
中、×―×にて示される場合である〕の各々を
用い、その測定結果は第１図に示す通りであ
る。 (ロ) 前記のhCG（127―145）重合体を用いて得ら
れた抗血清を用いて、hCGの各種濃度（200〜
32000mIU／ml）に対するエンザイムイミユノ
アツセイにおける各種酵素標識体による差異を
求めた。なお酵素標識体としては、ds―hCG―
β―ガラクトシダーゼ結合体〔３項(イ)に記載の
方法で得られたもの；第２図中、○―○にて示
される場合である〕、hCG―β―ガラクトシダ
ーゼ結合体〔３項(ロ)に記載の方法にて得られた
もの；第２図中、△…△にて示される場合であ
る〕の各々を用い、その測定結果は第２図に示
す通りであり、その結果、hCG（127―145）重
合体の如くのhCGのＣ末端フラグメントを用い
る抗体または抗血清の場合には、特にds―hCG
の酵素標識体との結合性が良好であることが明
らかである。 なお、このエンザイムイミユノアツセイに用い
た測定法は、以下の通りである。 まず200μの抗血清、50μのhCGの各種濃度
の被検液、100μの0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）
および酵素標識体含有液50μを４℃にて一夜イ
ンキユベイトし、次いでこれにラビツトの正常血
清の希釈液100μおよび第２抗体含有液（ラビ
ツトの免疫グラブリンに対する抗体を含有する抗
血清）100μを加えて、４℃にて一夜インキユ
ベイトした。次いでこれを遠心分離し、その沈澱
物を回収し、これを、0.1％のｏ―ニトロフエノ
ール―β―Ｄ―ガラクトシドの0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.2）の500μに加え、37℃にて一夜イン
キユベイトし、その後反応を停止せしめ、次いで
その呈色を420nmの波長にて吸光度測定した。 以上の通り、本発明のds―hCG―酵素結合体
は、hCGβ鎖を用いて得られる抗体に対してもそ
の結合性は良好であり、特にhCGβ鎖のＣ末端フ
ラグメントを用いて得られる抗体に対して極めて
良好な結合性を示すものであつた。 (5) 検量線について 前記のBSA―hCGβ鎖結合体を用いて得られた
抗血清（8000倍希釈）を用い、ds―hCG―β―ガ
ラクトシダーゼ結合体によるhCGの検量線を求め
た。その結果、第３図に示す通りであつた。 なお、本発明に用いられる式〔〕で表わされ
るペプチドを得るに当つては、その式〔〕で示
されるアミノ酸順序に個々のアミノ酸または低級
ペプチドを縮合して構成せしめ、縮合反応の最終
段階で側鎖の官能基の保護基を脱離することによ
り得られる。縮合反応自体はペプチド合成のため
の常法手段に従つて、保護基の着脱、縮合反応を
繰り返すことにより行なわれる。即ち、本目的化
合物の原料ならびにすべての中間体の製造におい
て使用される各種保護基はペプチド合成で既知な
もの、従つて加水分解、酸分解、還元、アミノリ
シスまたはヒドラジノリシスのような既知手段に
よつて容易に脱離することのできる保護基が用い
られる。例えば、アミノ基に使用する保護基とし
ては、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、フ
タロイル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ―トルエ
ンスルホニル基、ｏ―ニトロフエニルスルフエニ
ル基、２，４―ジニトロフエニルスルフエニル
基、２，４―ジニトロフエニルスルフエニル基な
どのアシル基、ベンジル基、ジフエニルメチル
基、トリフエニルメチル基（これらの基は場合に
よつてはｏ―メトキシ基、ｐ―メトキシ基などの
低級アルコキシ基によつて置換されている）など
のアラルキル基、ベンジルオキシカルボニル基、
ｏ―ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｐ―ブ
ロモベンジルオキシカルボニル基、ｏ―クロロベ
ンジルオキシカルボニル基、ｐ―クロロベンジル
オキシカルボニル基、ｐ―ニトロベンジルオキシ
カルボニル基、ｐ―メトキシベンジルオキシカル
ボニル基、ｐ―フエニルアゾ―ベンジルオキシカ
ルボニル基、ｐ―（p′―メトキシフエニルアゾ）
―ベンジルオキシカルボニル基などのベンジルオ
キシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボ
ニル基、トリクロロエチルオキシカルボニル基、
ｔ―アミルオキシカルボニル基、ｔ―ブトキシカ
ルボニル基、ジイソプロピルメトキシカルボニル
基などの脂肪族オキシカルボニル基、２―フエニ
ル―イソプロポキシカルボニル基、２―トリル―
イソプロポキシカルボニル基、２―ｐ―ジフエニ
ル―イソプロポキシカルボニル基などのアラルキ
ルオキシカルボニル基などがある。またこれらア
ミノ基をベンゾイルアセトン、アセチルアセト
ン、ジメドンなどの１，３―ジケトンと反応させ
ることによつて得られるエナミンの形成により保
護することができる。 カルボキシル基は、アミド形成、ヒドラチド形
成またはエステル化によつて保護される。すなわ
ちアミド基は３，４―ジメトキシベンジル基、ビ
ス―（ｐ―メトキシフエニル）メチル基などによ
つて置換される。ヒドラチド基はベンジルオキシ
カルボニル基、トリクロロエチルオキシカルボニ
ル基、トリフルオロアセチル基、ｔ―ブトキシカ
ルボニル基、トリチル基、２―ｐ―ジフエニル―
イソプロポキシカルボニル基などによつて置換さ
れる。エステル基はメタノール、エタノール、ｔ
―ブタノール、シアノメチルアルコールなどのア
ルカノール、ベンジルアルコール、ｐ―プロモベ
ンジルアルコール、ｐ―クロロベンジルアルコー
ル、２，６―ジクロロベンジルアルコール、ｐ―
メトキシベンジルアルコール、ｐ―ニトロベンジ
ルアルコール、２，４，６―トリメチルベンジル
アルコール、ベンズヒドリルアルコール、ベンゾ
イルメチルアルコール、ｐ―ブロモベンゾイルメ
チルアルコール、ｐ―クロロベンゾイルメチルア
ルコールなどのアラルカノール、２，４，６―ト
リクロロフエノール、２，４，５―トリクロロフ
エノール、ペンタクロロフエノール、ｐ―ニトロ
フエノール、２，４―ジニトロフエノール、ｐ―
シアノフエノール、ｐ―メタンスルホニルフエノ
ールなどのフエノール、チオフエノール、チオク
レゾール、ｐ―ニトロチオフエノールなどのチオ
フエノールなどによつて置換される。 前記セリン、スレオニンおよびチロシンの水酸
基は、例えばエステル化またはエーテル化によつ
て保護することができる。このエステル化に適す
る基としては例えばアセチル基などの低級アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニ
ル基などの炭酸から誘導される基である。またエ
ーテル化に適する基としては、例えばベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ｔ―ブチル基など
である。これら水酸基の保護には２，２，２―ト
リフルオロ―１―ｔ―ブチルオキシカルボニルア
ミノエチル基、２，２，２―トリフルオロ―１―
ベンジルオキシカルボニルアミノエチル基も適す
る。 しかしながら、これら水酸基を必ずしも保護す
る必要はない。 前記アルギニンのグアニジノ基中のアミノ基を
保護するのに使用する基としては例えばニトロ
基、トシル基、ベンジルオキシカルボニル基、な
どであるが、このグアニジノ基を必ずしも保護す
る必要はない。 前記ヒスチジンのイミノ基を保護するのに使用
する基としては、例えばベンジル基、トリチル
基、ベンジルオキシカルボニル基、トシル基、ア
ダマンチルオキシカルボニル基、２，２，２―ト
リフルオロ―１―ｔ―ブチルオキシカルボニルア
ミノエチル基、２，２，２―トリフルオロ―１―
ベンジルオキシカルボニルアミノエチル基などで
あるが、このイミノ基を必ずしも保護する必要は
ない。 システインのメルカプト基を保護するのに使用
する基としては、ベンジル基、ｐ―メトキシベン
ジル基、ｐ―ニトロベンジル基、トリチル基、ベ
ンジルチオメチル基、エチルカルバモイル基、ア
セトアミドメチル基などである。 本目的化合物〔〕の合成においては、個々の
アミノ酸もしくは低級ペプチドの縮合は、例え
ば、保護されたα―アミノ基および活性化末端カ
ルボキシル基をもつアミノ酸またはペプチドと遊
離α―アミノ基および保護された末端カルボキシ
ル基をもつアミノ酸またはペプチドとを反応させ
るか、あるいは活性化α―アミノ基および保護さ
れた末端カルボキシル基をもつアミノ酸またはペ
プチドと遊離の末端カルボキシル基および保護さ
れたα―アミノ基をもつアミノ酸またはペプチド
を反応させることにより実施することができる。 この場合カルボキシル基は、アジド、酸無水
物、酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えば
シアノメチルエステル、チオフエニルエステル、
ｐ―ニトロチオフエニルエステル、ｐ―メタンス
ルホニルフエニルエステル、チオジルエステル、
ｐ―ニトロフエニルエステル、２，４―ジニトロ
フエニルエステル、２，４，５―トリクロロフエ
ニルエステル、２，４，６―トリクロロフエニル
エステル、ペンタクロロフエニルエステル、Ｎ―
ヒドロキシコハク酸イミドエステル、Ｎ―ヒドロ
キサフタル酸イミドエステル、８―ヒドロキシキ
ノリンエステルまたはＮ―ヒドロキシピペリジン
エステルなどに変換することによつて、あるいは
カルボジイミド、Ｎ，N′―カルボニル―ジイミ
ダゾールまたはイソオキゾリウム塩、例えばウツ
ドワード反応剤などを使用して反応させることに
よつて活性化することができる。 本発明において好ましい縮合方法は、カルボジ
イミド法、アジド法、活性エステル法および無水
物法である。縮合の各段階では、ラセミ化が起ら
ない方法またはラセミル化が最小になる方法を用
いるのが望ましく、好ましくはアジド法、活性エ
ステル法、Wu¨nsch法〔Z.Naturforsch.，21b，
426（1966）〕またはGeiger法〔Chem.Ber.，103，
788（1970）〕、とりわけ縮合剤としてＮ―エチル―
N′―３―ジメチルアミノプロピル―カルボジイ
ミド（WSCI）を用いる変法などを用いる。 縮合順序は式〔〕で示されるアミノ酸順序で
あれば、如何なる順序からも合成し得るがＣ―末
端側から合成するのが有利である。 保護されたhCG〔127―145〕は、Ｃ―末端フラ
グメント132―145とＮ―末端フラグメント127―
131をWSCIを用いるGeiger変法による方法で縮
合するのが好ましい。Ｃ―末端フラグメント132
―145はフラグメント132―137とフラグメント138
―144をWSCIを用いるGeiger変法による方法で
縮合するのが好ましい。Ｎ―末端フラグメント
127―131はフラグメント127―129とフラグメント
130―131をWSCIを用いるGeiger変法による方法
で縮合するのが好ましい。 保護されたhCG〔118―145〕は、Ｃ―末端フラ
グメント127―145、即ち保護されたhCG〔127―
145〕とＮ―末端フラグメント118―126をWSCI
を用いるGeiger変法による方法で縮合するのが
好ましい。Ｃ―末端フラグメント118―126はフラ
グメント118―121とフラグメント122―126をアジ
ド法により縮合するのが好ましい。 保護されたhCG〔105―145〕は、Ｃ―末端フラ
グメント112―145とＮ―末端フラグメント105―
111をWSCIを用いるGeiger変法による方法で縮
合するのが好ましい。Ｃ―末端フラグメント112
―145は保護されたhCG〔118―145〕にフラグメン
ト116―117、フラグメント113―115および第112
番目のアミノ酸を活性エステル法により順次縮合
して連絡するのが好ましい。Ｎ―末端フラグメン
ト105―111はフラグメント110―111とフラグメン
ト105―109をアジド法により縮合するのが好まし
い。 保護されたhCG〔100―145〕は、Ｃ―末端フラ
グメント112―145とＮ―末端フラグメント100―
111を活性エステル法により縮合するのが好まし
い。Ｎ―末端フラグメント100―111はフラグメン
ト100―104とフラグメント105―111をアジド法に
より縮合するのが好ましい。 保護された〔Tyr¹⁰⁰〕−hCG〔100―145〕は、Ｃ
―末端フラグメント112―145とＮ―末端フラグメ
ント100―111を活性エステル法により縮合するの
が好ましい。Ｎ―末端フラグメント100―111はフ
ラグメント100―104とフラグメント105―111をア
ジド法により縮合するのが好ましい。 上記のペプチドの合成に際して、その末端カル
ボキシル基は、これを必らずしも保護しなければ
ならないわけではない。例えば、アジド法、活性
エステル法によつて縮合させる場合には、保護し
なくてもよい。 しかしながら、これらの基を前記で述べたよう
なエステル化によつて、例えばメチルエステル、
エチルエステル、ベンジルエステルなどで保護す
ることもできる。また、これらのエステル基は、
例えばメチルエステル基はこれを希薄な水酸化ナ
トリウム水溶液で分裂し、またはヒドラチドに変
え、またベンジルエステル基は無水沸化水素また
は水素添加分解によつて分裂することができる。 これらペプチドのα―アミノ基は、これらを通
常の保護基、例えばベンジルオキシカルボニル
基、ｔ―ブトキシカルボニル基、ｔ―アミルオキ
シカルボニル基で保護されるが、ベンジルオキシ
カルボニル基は水素添加分解によつて脱離され、
ｔ―ブトキシカルボニル基、ｔ―アミルオキシカ
ルボニル基はトリフルオロ酢酸で脱離される。 セリンおよびスレオニンの水酸基はベンジル基
で、チロシンの水酸基は２，６―ジクロロベンジ
ル基で、リジンのε―アミノ基はｏ―クロロベン
ジルオキシカルボニル基で、アルギニンのグアニ
ジノ基中のアミノ基はトシル基で、システインの
メルカプト基はｐ―メトキシベンジル基で保護す
るのが適する。これらの保護基は無水沸化水素で
脱離される。システインのメルカプト基の保護基
としてアセトアミドメチル基を使用することがで
きる。この基は無水沸化水素に対して安定である
ため、他の全ての保護基が脱離された時点でPH４
において酢酸水銀で脱離される。 こうして保護されたhCG〔127―145〕、保護され
たhCG〔118―145〕、保護されたhCG〔105―145〕、
保護されたhCG〔100―145〕、保護された
〔Tyr¹⁰⁰〕―hCG〔100―145〕が得られる。これら
の保護基は、好ましくは、酸分解、例えば無水沸
化水素の処理による方法によつて一段階で脱離さ
れ、式〔〕の目的化合物が得られる。第110番
目および／または第100番のシステインのメルカ
プト基の保護基としてアセトアミドメチル基を使
用した場合、無水沸化水素処理により他の全ての
保護基が脱離した後に、PH４において酢酸第二水
銀により脱離してもよい。 上記の目的化合物〔〕は、公知のペプチドを
精製する手段により精製することができる。例え
ばセフアデツクスLH―20、セフアデツクスＧ―
50、Dowex1、カルボキシメチルセルロース等の
担体を用いるカラムクロマトグラフイーにより行
うことができる。 本発明のペプチド〔〕は、その方法の条件に
より塩基またはその塩の形で得られる。通常は酢
酸の如き有機酸との塩の形で保存され得る。 次いで、本発明に用いられるペプチド〔〕の
合成例について挙げるが、何んら本発明を限定す
るものではない。 なお、本明細書に記載の各記号は、次の意味を
有する。 Gln；Ｌ―グルタミン Pro；Ｌ―プロリン Leu；Ｌ―ロイシン Ile；Ｌ―イソロイシン Thr；Ｌ―スレオニン Asp；Ｌ―アスパラギン酸 Ser；Ｌ―セリン Gly；グリシン Arg；Ｌ―アルギニン Ala；Ｌ―アラニン Lys；Ｌ―リジン Phe；Ｌ―フエニルアラニン Cys；Ｌ―システイン His；Ｌ―ヒスチジン Tyr；Ｌ―チロシン BOC；ｔ―ブチルオキシカルボニル AOC；ｔ―アミルオキシカルボニル Ｚ；ベンジルオキシカルボニル Ｚ―Cl；Ｏ―クロロベンジルオキシカルボニル Bzl；ベンジル MBzl；ｐ―メトキシベンジル Bzl―Cl₂；２，６―ジクロロベンジル Acm；アセトアミドメチル Tos；トシル OMe；メチルエステル OEt；エチルエステル OBzl；ベンジルエステル OSU；Ｎ―ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル ONP；ｐ―ニトロフエニルエステル TFA；トリフルオロ酢酸 TEA；トリエチルアミン TBA；トリベンジルアミン DCHA；ジシクロヘキシルアミン NMM；N′―メチルモルホリン THF；テトラヒドロフラン DMF；ジメチルホルムアミド WSCI；Ｎ―エチル，N′―３―ジメチルアミノ
プロピル―カルボジイミド HOBT；１―ヒドロキシベンゾトリアゾール また、本明細書中で使用した薄層クロマトグラ
フイー（TLC）の担体および溶媒系は、次の通
りである。 担体；シリカゲルＧ 溶媒系； １ クロロホルム―メタノール―酢酸（95：５：
３） ２ クロロホルム―メタノール―酢酸（85：15：
５） ３ クロロホルム―メタノール―酢酸（85：10：
５） ４ クロロホルム―メタノール―酢酸（80：25：
２） ５ クロロホルム―メタノール―酢酸（24：６：
１） ６ クロロホルム―エタノール―酢酸エチル
（５：２：５） ７ 酢酸エチル ８ 酢酸エチル―メタノール（10：１） ９ 酢酸エチル―ベンゼン（１：１） 10 ブタノール―酢酸―水（３：１：１） 担体；メルク社製セルロース 溶媒系； 11 ブタノール―ピリジン―酢酸―水（15：10：
３：12） 参考例 １ hCG〔127―145〕；Ｈ―Ser―Leu―Pro―Ser―
Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Gly―Pro―Ser
―Asp―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―
OH １ Ｐ（143―144）；BOC―Leu―Pro―OBzl〔１〕 BOC―Leu―OH.H₂O149.59ｇ（0.6M）に
THF300mlを加え、これにHOBT81.06ｇ
（0.6M）、THF150ml、DMF100mlを加えて溶液
とする。次いでＨ―Pro―OBzl152.28ｇ
（0.63M）を加え、−10℃に冷却下WSCI120.8ml
（0.66M）を滴下した後、DMF100mlを追加し、
室温で一夜撹拌する。 反応後、減圧下で溶媒を留去し、残渣に酢酸エ
チル600mlを加え、５％重曹水（３回）、1N塩酸
（２回）、水（２回）の順に洗浄する。酢酸エチル
層を無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。油状物を
ベンゼン１に溶かし、減圧濃縮して油状の
〔１〕を得る。 TLC；Rf₁＝0.89 ２ Ｐ（142―144）；BOC―Ile―Leu―Pro―
OBzl〔２〕 〔１〕192mMを塩化メチレン100mlに溶かし、
これにTFA300mlを加え、室温で30分間撹拌す
る。TFAを減圧下留去し、残渣にヘキサンを加
え、減圧留去する。残渣の油状物をTHF200mlに
溶かし、これに氷冷下NMM56.1mlでPH７に中和
した後、BOC―Ile―OH・H₂O38.33ｇ
（159.5mM）およびHOBT21.55ｇ（159.5mM）
を加える。次いでDMF100mlを加えて溶かし、氷
冷下WSCI34.1mlを滴下する。 滴下後、室温で一夜撹拌する。 反応後、減圧下で溶媒を留去し、残渣に酢酸エ
チル500mlを加え、５％重曹水（３回）、飽和食塩
水（１回）、1N塩酸（２回）、飽和食塩水（２
回）、水（１回）の順に洗浄し、無水芒硝で乾燥
後、減圧濃縮する。残渣にヘキサンを加え、沈澱
物をデカンテーシヨンにより採取する。酢酸エチ
ル―ヘキサンより再結晶を行う。過中に融ける
ので一部過し、残りはベンゼンに溶解して凍結
乾燥して〔２〕76.98ｇ（収率90.9％）を得る。 融点；60〜64℃ 〔α〕²⁴ _D；−66.34゜（Ｃ＝１，DMF） TLC；Rf₁＝0.63 ３ Ｐ（142―144）；BOC―Ile―Leu―Pro―OH
〔３〕 〔２〕76.98ｇ（145mM）にｎ―ブタノール20
ml、エタノール300mlを加えて溶かし、これに５
％Pd／C15ｇを加え、３時間水素添加する。触媒
を去し、母液を減圧濃縮する。残渣にジエチル
エーテル（エーテル）300mlを加え、５％重曹水
500ml、200mlで各１回づつ抽出する。抽出液を氷
冷下1N塩酸でPH４に調節すると、生成物がダン
ゴ状となり析出する。酢酸エチルで抽出し、酢酸
エチル層を水で２回洗浄する。無水芒硝で乾燥
後、減圧濃縮する。残渣をエーテル―ヘキサンで
固化する。酢酸エチル―エーテル―ヘキサンから
再結晶して〔３〕60.32ｇ（収率94.2％）を得る。 融点；114〜119℃ 〔α〕²⁴ _D；−61.98゜（Ｃ＝１，DMF） TLC；Rf₁＝0.53、Rf₆＝0.47 元素分析〔C₂₂H₃₉O₆N₃として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 59.82 9.42 9.56 計算値 59.84 8.90 39.52 ４ Ｐ（142―145）；BOC―Ile―Leu―Pro―Gln
―OBzl〔４〕 BOC―Gln―OBzl36.41ｇ（108mM）を塩化メ
チレン100mlに溶かし、これにTFA150mlを加え、
室温で30分間撹拌する。反応後、減圧下でTFA
を留去し、残渣をTHF100mlに溶かし、寒剤で冷
却下NMM40mlでPH７とした後、〔３〕47.69ｇ
（108mM）のTHF100ml溶液およびHOBT14.59
ｇ（108mM）のDMF溶液を加える。この溶液に
寒剤で冷却下WSCI19.76ml（108mM）を10分間
で滴下した後、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチ
ル500mlを加え、５％重曹水で洗浄する。水層を
酢酸エチル300mlで抽出し、先の酢酸エチル層と
合わせて５％重曹水（１回）、飽和食塩水（１
回）、1N塩酸（２回）、飽和食塩水（２回）、水
（１回）の順に洗浄する。無水芒硝で乾燥し、減
圧濃縮する。残渣にエーテル―ヘキサンを加えて
固化し、集める。酢酸エチル400mlで再結晶して
〔４〕56.98ｇ（収率80.0％）を得る。 融点；141〜143℃ 元素分析〔C₃₄H₅₃O₈N₅として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 61.76 8.41 10.84 計算値 61.89 8.10 10.61 ５ Ｐ（140―141）；BOC―Thr（Bzl）―Pro―
OBzl〔５〕 BOC―Thr（Bzl）―OH32.88ｇ（0.15M）を
THF100mlに溶かし、これにHOBT20.94ｇ
（0.155M）およびＨ―Pro―OBzl・HCl37.47ｇ
（0.155M）を加え、DMF200mlを加えて溶液とす
る。次いで寒剤で冷却下WSCI28.37ml（0.155M）
を10分間で滴下した後、室温で一夜撹拌する。反
応後、減圧下で溶媒を留去し、残渣に酢酸エチル
500mlを加え、５％重曹水（２回）、飽和食塩水
（１回）、1N塩酸（２回）、飽和食塩水（２回）、
水（１回）の順に洗浄する。無水芒硝で乾燥した
後、減圧濃縮して油状の〔５〕57.41ｇ（収率
77.1）を得る。 TLC；Rf₆＝0.85、Rf₁＝0.63 ６ Ｐ（140―141）；BOC―Thr（Bzl）―Pro―
OH〔６〕 〔５〕52.78ｇ（106.29mM）をメタノール300
mlに溶かし、氷冷下1N―NaOH150ml（1.4倍Ｍ）
を20分間で加えた後、室温で１時間半撹拌する。
反応後、氷冷下1N塩酸43.71ml（0.4倍Ｍ）を加え
てPH７に調節し、減圧下でメタノールを留去す
る。得られた水溶液をエーテル150mlで洗浄し、
水層を氷冷下1N塩酸110mlでPH３に調節する。酢
酸エチル300ml、150mlで２回抽出し、抽出液を食
塩水（２回）、水（１回）の順に洗浄する。酢酸
エチル層を無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。残
渣にエーテルとヘキサンを加え、生じた沈澱物を
得る。この操作を２回行なつた後、酢酸エチルに
溶かし、減圧乾固して発泡固化した〔６〕32.27
ｇ（収率77.75％）を得る。 融点；50〜55℃ 〔α〕²⁴ _D；−36.64゜（Ｃ＝１，DMF） TLC；Rf₆＝0.34 元素分析〔C₂₁H₃₀O₅N₂・H₂Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 61.12 7.62 6.67 計算値 61.75 7.90 6.86 ７ Ｐ（140―145）；BOC―Thr（Bzl）―Pro―Ile
―Leu―Pro―Gln―OBzl〔７〕 〔６〕54.77ｇ（83mM）を塩化メチレン80ml
に加え、これに氷冷下TFA240mlを加え、室温で
25分間撹拌する。反応後、減圧下０℃でTFAを
留去し、残渣にエーテルを加える。生じた沈澱物
を取し、液を減圧濃縮する。濃縮物にエーテ
ルを加え、さらに生じた沈澱物を得、先の沈澱物
と合せてアルカリデシケータ中で一夜減圧乾燥す
る。この沈澱物をDMF200mlに溶かし、これに寒
剤で冷却下NMM（9.5ml）でPH７とした後、
HOBT11.21ｇ（83mM）およびBOC―Thr（Bzl）
―Pro―OH32.27ｇ（83mM）を加え、DMF40ml
を追加して溶液とする。これに寒剤で冷却下
WSCI15.19ml（83mM）を10分間で滴下し、２時
間後、室温で一夜撹拌する。反応後、減圧下で
DMFを留去し、残渣に５％重曹水300mlを加え、
酢酸エチル800mlおよび300mlで２回抽出する。酢
酸エチル層を５％重曹水（２回）、飽和食塩水
（１回）、1N塩酸（２回）、飽和食塩水（２回）、
水（１回）の順に洗浄する。無水芒硝で乾燥した
後、減圧濃縮する。放置により沈澱物が析出した
ら、エーテルを加えて沈澱物を分離する。酢酸エ
チルから再結晶化し、エーテルを加えて取して
〔７〕63.98ｇ（収率81.3％）を得る。 融点；101〜103℃ 〔α〕²⁴ _D；−61.78゜（Ｃ＝１，DMF） 元素分析〔C₅₀H₇₂O₁₁N₇・H₂Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 62.21 7.89 10.03 計算値 62.16 7.82 10.15 アミノ酸分析〔1.330mg／塩酸0.3ml、酢酸0.3
ml、アニソール0.1ml、105℃、24時間〕；
Thr0.84(1)、Pro2、Ile0.97(1)、Leu1.00(1)、
Gln0.98(1) ８ Ｐ（139―145）；BOC―Asp（Bzl）―Thr
（Bzl）―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―OBzl
〔８〕 〔７〕63.98ｇ（67.48mM）に塩化メチレン150
mlを加え、これに氷冷下TFA300mlを加えた後、
室温で30分間撹拌する。反応後、減圧下０℃で
TFAを留去し、残渣にエーテルを加える。生じ
た沈澱物を取し、母液より生じた二次結晶と合
せてアルカリデシケーター中で一夜減圧乾燥す
る。収量67.19ｇ。この沈澱物をDMF350mlに溶
かし、これに寒剤で冷却下NMM7.42mlでPH７に
調節した後、BOC―Asp（OBzl）―OH29.77ｇ
（87.72mM）およびHOBT11.85ｇ（87.72mM）
を加える。次いで寒剤で冷却下WSCI16.05ml
（87.72mM）を滴下し、２時間後、室温に戻し一
夜撹拌する。反応後、減圧下で溶媒を留去し、残
渣に水を加え、生じた沈澱物を氷冷下デカンテー
シヨンにより水層と分離する。沈澱物を酢酸エチ
ル1.5に溶かし、５％重曹水（２回）、飽和食塩
水（１回）、1N塩酸（１回）、飽和食塩水（２
回）、水（１回）の順に洗浄する。無水芒硝で乾
燥後、減圧濃縮する。濃縮液を放置して、生じた
沈澱物を取する。酢酸エチル―エーテル２回再
結晶を行い、〔８〕73.78ｇ（収率94.8％）を得
る。 融点；99〜103℃ 〔α〕²⁴ _D；−82.44゜（Ｃ＝１，DMF） TLC；Rf₃＝0.62、Rf₂＝0.79 元素分析〔C₆H₈₄O₁₄N₈として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 63.38 7.56 9.80 計算値 63.52 7.34 9.72 ９ Ｐ（138―145）；BOC―Ser（Bzl）―Asp
（OBzl）―Thr（Bzl）―Pro―Ile―Leu―Pro
―Gln―OBzl

〔９〕 〔８〕73.78ｇ（63.97mM）に塩化メチレン100
mlを加え、これに氷冷下TFA300mlを加えた後、
室温で30分間撹拌する。反応後、減圧下０℃で
TFAを留去し、残渣にエーテルを加え、生じた
沈澱物を取した後、カセイカリデシケーター中
で一夜減圧乾燥する。この沈澱物をDMF200mlに
溶かし、寒剤で冷却下NMM5mlでPH７に調節し
た後、BOC―Ser（Bzl）―OH24.56ｇ
（83.16mM）、HOBT11.23ｇ（83.16mM）および
DMF50mlを加える。さらに寒剤で冷却下
WSCI15.22mlを滴下した後、NMM2.03mlを追加
してPH６に調節する。２時間後、室温に戻し、一
夜撹拌する。反応後、減圧下でDMFを留去し、
残渣を冷水２中に注入する。生じた沈澱物を
取する。次いでこの沈澱物にCHCl₃5旺５％重
曹水２を加え抽出する。CHCl₃層を５％重曹
水、飽和食塩水、1N塩酸、飽和食塩水、水の順
に洗浄した後、無水芒硝で乾燥する。減圧乾固
し、残渣に酢酸エチル―エーテル―ヘキサンを加
える。生じた沈澱物をクロロホルム300mlに溶か
し、酢酸エチル１を加えた後、減圧下クロロホ
ルムを留去する。得られた懸濁液にエーテル―ヘ
キサンを加え沈澱物を得る。同様の操作で再結晶
を行つて

〔９〕80.95ｇ（収率95.1％）を得る。 融点；120〜122℃ TLC；Rf₂＝0.70 元素分析〔C₇₁H₉₅O₁₆N₉として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 63.87 7.38 9.62 計算値 64.09 7.20 9.47 10 Ｐ（136―137）；BOC―Gly―Pro―OBzl〔10〕 BOC―Gly―OH26.28ｇ（0.15M）にTHF100
ml、DMF100mlおよびHOBT20.94ｇ0.115Mを加
え、これにＨ―Pro―OBzl・Ｈ Cl37.47ｇ
（0.155M）のDMF20mlの溶液を加え、−10℃に冷
却下、WSCI28.37ml（0.155M）を10分間で滴下
する。DMF30mlを加え、室温で一夜撹拌する。
反応後、減圧下で溶媒を留去し、残渣に酢酸エチ
ル500mlを加え、５％重曹水（２回）、飽和食塩水
（１回）、1N塩酸（２回）、飽和食塩水（２回）、
水（１回）の順に洗浄する。酢酸エチル層を無水
芒硝で乾燥し、減圧濃縮して油状物67ｇを得る。
これをベンゼン100mlに溶かし、ベンゼンで充填
したシリカゲル500ｇのカラム（７×33cm）にチ
ヤージし、ベンゼン300mlを流す。次いでベンゼ
ン―酢酸エチル（10：１→５：１→２：１→１：
１）〜酢酸エチルで溶出する。TLCでRf₁＝0.86
付近のフラクシヨンを集め減圧乾固して油状の

〔９〕46.16ｇを得る。さらに残りのフラクシヨン
を減圧濃縮し、シリカゲル100ｇのカラム（4.5×
16cm）のカラムにチヤージし、前記と同様にカラ
ムクロマトグラフイーを行い、油状の〔10〕8.78
ｇを得る。 全量54.94ｇ TLC；Rf₁＝0.86 11 Ｐ（134―135）；BOC―Leu―Pro―OH〔11〕 BOC―Leu―Pro―OBzl82.76ｇ（0.252M）を
メタノール600mlに溶かし、これに氷冷下1N―
NaOH327.6ml（1.3倍Ｍ）を滴下した後、室温で
１時間撹拌する。反応液に氷冷下1N塩酸の６ml
を加えた後、減圧下メタノールを留去する。水層
をベンゼン、酢酸エチルの順に洗浄した後、氷冷
下1N塩酸260mlを加えると油状物が生じる。酢酸
エチルで抽出し、飽和食塩水、水の順に洗浄した
後、無水芒硝で乾燥する。減圧乾固し、残渣をベ
ンゼンに溶かし、凍結乾燥して〔11〕58.57ｇ
（収率70.8％）を得る。 融点；63〜67℃ 〔α〕²⁴ _D；−66.42゜（Ｃ＝１，DMF） 元素分析〔C₁₆H₂₈O₅N₂として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 58.29 8.87 8.59 計算値 58.52 8.59 8.53 12 Ｐ（134―137）；BOC―Leu―Pro―Gly―Pro
―OBzl〔12〕 〔10〕54.36ｇ（0.15M）に塩化メチレン100
ml、TFA200mlを加え、室温で25分間撹拌する。
反応後、減圧下TFAを留去し、残渣をカセイカ
リデシケーター中で減圧乾燥する。次いで、
THF100mlに溶かし、−10℃に冷却下トリエチル
アミン48mlを加えてPH７とした後、〔11〕49.26ｇ
（0.15M）のTHF100ml溶液とHOBT20.27ｇ
（0.15M）を加える。さらにTHF50mlを追加して
溶液とし、これに−10℃に冷却下WSCI27.45mlを
10分間で滴下する。２時間後、室温に戻し、一夜
撹拌を続ける。反応後、減圧下溶媒を留去し、残
渣に酢酸エチル700mlを加え、５％重曹水500mlで
洗浄する。水層をさらに酢酸エチル300mlで抽出
し、抽出液を先の酢酸エチル層と合わせ、５％重
曹水（１回）、飽和食塩水（１回）、1N塩酸（２
回）、飽和食塩水（２回）、水１回の順で洗浄す
る。無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮し、残渣にベン
ゼンを加えて減圧濃縮する。濃縮液をベンゼンで
充填したシリカゲル300ｇのカラム（6.5×20cm）
にチヤージし、ベンゼン→ベンゼン―酢酸エチル
（３：１→２：１）→酢酸エチルで溶出する。
TLCでRf₁＝0.57付近のフラクシヨンを集め、減
圧乾固する。残渣を酢酸エチルに溶かし、減圧乾
固すると発泡して固化して〔12〕45.73ｇを得る。
残りのフラクシヨンを集め、減圧濃縮し、前記と
同様にカラムクロマトグラフイーを行い〔12〕18
ｇを得る。さらにその残りのフラクシヨンを減圧
濃縮し、シリカゲル100ｇのカラム（4.5×15cm）
にチヤージし、前記と同様に溶出して〔12〕7.11
ｇを得る。全量70.84ｇ（収率82.46％） 融点；65〜69℃ 〔α〕²⁴ _D；−93.64゜（C₂₁，DMF） TLC；Rf₁＝0.57、Rf₆＝0.54 元素分析〔C₃₀H₄₄O₇N₄として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 62.98 7.94 10.07 計算値 62.92 7.74 9.78 13 Ｐ（133―137）；BOC―Arg（Tos）―Leu―
Pro―Gly―Pro―OBzl〔12〕 〔12〕68.72ｇ（120mM）を塩化メチレン100
mlに溶かし、これにTFA220mlを加え、室温で20
分間撹拌する。反応後、減圧下０℃でTFAを留
去し、残渣にヘキサンを加えて減圧乾固する。残
渣をカセイカリゲシケーター中で減圧乾燥した
後、DMF200mlに溶かし、−10℃で冷却下
NMM59.4mlを加えてPH６に調節する。これに
BOC―Arg（Tos）―OH53ｇ（123mM）の
DMF50ml溶液、HOBT16.89ｇ（125mM）を加
えて溶解した後、−10℃に冷却下WSCI22.86ml
（125mM）を10分間で滴下する。２時間後、室温
で一夜撹拌する。次いで、反応液に−10℃に冷却
下WSCI3.66ml（0.2mM）を追加し、室温で４時
間撹拌する。反応後、減圧下DMFを留去し、残
渣に５％重曹水600mlを加える。得られた沈澱物
を酢酸エチル500mlで２回抽出し、抽出液を５％
重曹水（１回）、飽和食塩水（１回）、1N塩酸
（２回）、飽和食塩水（３回）、水（１回）の順に
洗浄する。無水芒硝で乾燥し、減圧濃縮する。残
渣にエーテル―ヘキサンを加え、生じた沈澱物を
取する。酢酸エチル―エーテル―ヘキサンから
再結晶して〔13〕100.77ｇ（収率95.1％）を得
る。 融点；107〜112℃（分解） 〔α〕²⁴ _D；−64.84゜（Ｃ＝１，DMF） TLC；Rf₁＝0.19 アミノ酸分析〔0.709mg／塩酸0.3ml、酢酸0.3
ml、アニソール0.1ml、10.5℃、24時間）；
Pro(2)、Gly0.95(1)、Leu1.01(1)、Arg0.90
(1) 14 Ｐ（132―137）；BOC―Ser（Bzl）―Arg
（Tos）―Leu―Pro―Gly―Pro―OBzl〔14〕 〔13〕100.77ｇ（114mM）に塩化メチレン100
ml、TFA400mlを加え、室温で35分間撹拌する。
反応後、減圧下０℃でTFAを留去し、残渣にエ
ーテルを加え、生じた沈澱物を取する。母液を
減圧濃縮して二次沈澱物を得る。両方合わせ、カ
セイカリデシケーター中で一夜減圧乾燥する。こ
れをDMF200mlに溶かし、−10℃に冷却下
NMM10mlを加えてPH８とした後、HOBF16.9ｇ
（125.4mM）およびBOC―Ser（Bzl）―OH37.03
ｇ（125.4mM）を加える。次いで、氷冷下
WSCI22.95ml（125.4mM）を滴下し（PH５）、２
時間後、室温で一夜撹拌する。反応後、減圧下
DMFを留去し、残渣を氷水1.5に注ぎ入れ、沈
澱物を得る。これを酢酸エチル１、500mlで２
回抽出し、酢酸エチル層を1N塩酸（１回）、飽和
食塩水（１回）、1N―NaOH水溶液（２回）、飽
和食塩水（２回）、水１回の順に洗浄する。無水
芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。残渣にエーテルを
加え、生じた沈澱物を取する。酢酸エチル―エ
ーテルから２回再結晶して〔14〕107.34ｇ（収率
87.0％）を得る。 融点；101〜105℃ TLC；Rf₆＝0.71、Rf₃＝0.49 アミノ酸分析〔1.818mg／塩酸0.3ml、酢酸0.3
ml、アニソール0.1ml、105℃、24時間〕；
Ser0.72(1)、Arg0.95(1)、Leu1.03(1)、Pro
(2) 15 Ｐ（132―137）；BOC―Ser（Bzl）―Arg
（Tos）―Leu―Pro―Gly―Pro―OH〔15〕 〔14〕105.44ｇ（97.43mM）をメタノール350
mlに溶かし、これに氷冷下、1N―NaOH水溶液
125.36ml（1.3倍Ｍ）を滴下した後、室温で２時
間半撹拌する。反応液に氷冷下さらに1N―
NaOH水溶液20mlを追加し、室温で１時間半撹
拌する。反応液に氷冷下1N塩酸49mlを加えPH６
とし、減圧下メタノールを留去する。水溶液に水
50mlを加え、エーテル100mlで洗浄する。次いで
水層に氷冷下1N塩酸50mlを滴下すると、生じた
粘性沈澱物のため撹拌不能となつたため、酢酸エ
チル300mlを加えた後、1N塩酸60mlを滴下して水
層のPHを２とする。酢酸エチル１、500mlで２
回抽出し、酢酸エチル層を飽和食塩水（２回）、
水の順に洗浄する。無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮
し、得られた油状物にエーテルを加えて固化す
る。酢酸エチル―エーテルから再結晶して〔15〕
95.12ｇ（収率100％）を得る。 TLC；Rf₂＝0.10、Rf₄＝0.32 16 Ｐ（132―145）；BOC―Ser（Bzl）―Arg
（Tos）―Leu―Pro―Gly―Pro―Ser（Bzl）―
Asp（OBzl）―Thr（Bzl）―Pro―Ile―Leu―
Pro―Gln―OBzl〔16〕

〔９〕49.66ｇ（37.32mM）を塩化メチレン130
mlに溶かし、これに氷冷下TFA220mlを加え、室
温で45分間撹拌する。反応後、減圧濃縮し、残渣
にエーテルを加える。生じた沈澱物を取し、ア
ルカリデシケーター中で一夜減圧乾燥する。これ
をDMF220mlに溶かし、−10℃に冷却下
NMM4.10mlでPH７に調節した後、〔15〕43.72ｇ
（44.79mM）、HOBT6.56ｇ（48.52mM）を加え
る。溶解後、−10℃に冷却下WSCI8.88ml
（48.52mM）を滴下し、室温で２日間撹拌する。
反応後、減圧下DMFを留去し、残渣を氷水２
に注ぎ入れる。得られた沈澱物を取し、水に懸
濁、洗浄して取する。この操作を５回行なつた
後（PH６）、デシケーター中で減圧乾燥して固形
物109ｇを得る。これをメタノールに溶解後、減
圧濃縮し、さらにベンゼンを加えて共沸により残
留する水分を除去する。この操作を３回行つた
後、酢酸エチル―エーテルから再結晶する。
90.09ｇこれをクロロホルム270mlに溶かし、クロ
ロホルムで充填したシリカゲル600ｇのカラムに
チヤージし、クロロホルム―メタノール（20：
１）で溶出する。TLCで１スポツトのフラクシ
ヨンのみを集めて減圧乾固して〔15〕を得る。残
りのフラクシヨンは減圧濃縮してシリカゲル220
ｇのカラムにチヤージし、前記と同様に溶出して
TLCで１スポツトのフラクシヨンのみを集めて
減圧乾固する。このような再クロマトグラフイー
操作を４回行い、〔16〕を得る。全量64.26ｇ（収
率78.9％） TLC；Rf₃＝0.40、Rf₂＝0.60 融点；120〜125℃ 元素分析〔C₁₂H₁₅₂O₂₅N₁₈S・2H₂Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 60.66 7.20 11.50 計算値 60.63 7.09 11.36 〔α〕²² _D；−63.3゜（Ｃ＝１，DMF） 17 Ｐ（130―131）；BOC―Ser（Bzl）―Pro―
OBzl〔17〕 BOC―Ser（Bzl）―OH35.4ｇ（0.12M）に
THF100ml、Ｈ―Pro―OBzl・HCl31.5ｇ
（0.13M）、HOBT17.5ｇ（0.13M）を加え、さら
にDMF50mlを加えて溶液とする。これに０℃に
冷却下WSCI24.8mlを滴下し、０℃で１時間、室
温で一夜撹拌する。反応後、減圧下で溶媒を留去
し、残渣にベンゼン加え、５％重曹水（３回）、
1N塩酸（３回）、水（３回）の順に洗浄する。無
水芒硝で乾燥後、減圧乾固して油状の〔17〕58ｇ
（収率100％）を得る。 TLC；Rf₁＝0.68 18 Ｐ（127―129）；BOC―Ser（Bzl）―Leu―
Pro―OBzl〔18〕 BOC―Leu―Pro―OBzl71.27ｇ（156mM）に
塩化メチレン30mlを加え、これに０℃に冷却下
TFA350mlを加えた後、室温で30分間撹拌する。
反応後、減圧下でTFAを留去し、得られた油状
物をカセイカリゲシケーター中で３時間減圧乾燥
する。この油状物をDMF170mlに溶かし、これに
０℃に冷却下NMM60mlを加えて中和した後、
BOC―Ser（Bzl）―OH46.0ｇ（156mM）、
HOBT21.1ｇ（156mM）を加えて溶液とする。
これに０℃に冷却下WSCI28.6ml（156mM）を滴
下し、０℃で１時間、室温で一夜撹拌する。反応
後、減圧下でDMFを留去し、残渣に酢酸エチル
500mlを加え、５％重曹水（３回）、1N塩酸（３
回）、水（３回）の順に洗浄する。酢酸エチル層
を無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。油状物をで
きるだけ少量のベンゼンに溶かし、ベンゼンで充
填したシリカゲル500ｇのカラムにチヤージし、
ベンゼン１、ベンゼン―酢酸エチル（10：１）
２、ベンゼン―酢酸エチル（５：１）１、ベ
ンゼン―酢酸エチル（１：１）２の順で溶出す
る。TLCにより相当するフラクシヨンのみを減
圧濃縮し、残渣をベンゼンに溶かして、凍結乾燥
して〔18〕81ｇ（収率87.0％）を得る。 TLC；Rf₁＝0.81 元素分析〔C₃₃H₄₅O₇N₃として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 66.34 7.81 6.80 計算値 66.53 7.61 7.05 19 Ｐ（127―129）；BOC―Ser（Bzl）―Leu―
Pro―OH〔19〕 〔18〕81ｇ（135.5mM）をエタノール300mlに
溶かし、これに０℃に冷却下1N―NaOH水溶液
176.15ml（1.3倍Ｍ）を30分間で滴下した後、室
温で３時間撹拌する。反応後、０℃に冷却下1N
塩酸で中和し、減圧下でエタノールを留去する。
水層に水300mlを加え、エーテルで２回洗浄した
後、０℃に冷却下1N塩酸150mlを加え、酢酸エチ
ル400mlで抽出する。酢酸エチル層を水洗し、無
水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮する。得
られた油状物をデシケーター中で減圧乾燥する。
得られた粉末をエーテルヘキサンで再沈澱して
〔19〕65.0ｇ（収率94.5％）を得る。 融点；56〜63℃ TLC；Rf₁＝0.58 〔α〕²² _D；−47.1゜（Ｃ＝１，DMF） 元素分析〔C₂₆H₃₉O₇N₃として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 61.52 7.71 8.50 計算値 61.76 7.78 8.31 20 Ｐ（127―131）；BOC―Ser（Bzl）―Leu―
Pro―Ser（Bzl）―Pro―OBzl〔20〕 〔17〕58ｇ（0.12M）に塩化メチレン30mlを加
え、０℃に冷却下TFA350mlを加えた後、室温で
30分間撹拌する。反応後、減圧下でTFAを留去
し、残渣をDMF150mlに溶かす。これを０℃に冷
却下NMM50mlで中和し、〔19〕61.1ｇ（0.12M）、
HOBT16.2ｇ（0.12M）を加え、次いで０℃に冷
却下WSCI22ml（0.12M）を滴下する。０℃で１
時間、室温で一夜撹拌する。反応後、減圧下で
DMFを留去し、残渣に酢酸エチル400mlを加え
る。５％重曹水（３回）、1N塩酸（３回）、水
（３回）の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥後、減圧濃縮する。得られた油状物をできる
だけ少量のベンゼンに溶かし、ベンゼンで充填し
たシリカゲル500ｇのカラムにチヤージする。ベ
ンゼン500ml、ベンゼン―酢酸エチル（10：１）
２、ベンゼン―酢酸エチル（10：１）２、ベ
ンゼン―酢酸エチル（３：１）２、ベンゼン―
酢酸エチル（１：１）４、酢酸エチル３の順
で溶出し、TLCで相当するフラクシヨンを集め
て減圧乾固して〔20〕84.07ｇ（収率80.8％）を
得る。 融点；58〜65℃ TLC；Rf₁＝0.51 〔α〕_D；−63.7゜（Ｃ＝１、DMF） 元素分析〔C₄₈H₆₃O₁₀N₅として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 66.31 7.25 8.09 計算値 66.26 7.30 8.05 アミノ酸分析；Ser1.42(2)、Pro(2)、Leu1.01(2) 21 Ｐ（127―131）；BOC―Ser（Bzl）―Leu―
Pro―Ser（Bzl）―Pro―OH〔21〕 〔20〕74.4ｇ（85.4mM）をメタノール30mlに
溶かし、これに０℃に冷却下1N―NaOH水溶液
110ml（1.3倍Ｍ）を滴下した後、室温で３時間撹
拌する。反応後、０℃に冷却下1N塩酸26mlを加
えて中和し、減圧下でメタノールを留去する。水
溶液をエーテルで２回洗浄し、０℃に冷却下1N
塩酸86mlを加え、酢酸エチルで抽出する。酢酸エ
チル層を２回水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、減圧濃縮する。残渣にヘキサンを加える。
生じた沈澱物を取し、できるだけ少量のクロロ
ホルムに溶かし、クロロホルムで充填したシリカ
ゲルのカラムにチヤージする。クロロホルム、ク
ロロホルム―酢酸エチル（１：１）、クロロホル
ム―エタノール―酢酸エチル（５：１：５）の順
で溶出する。TLCで相当するフラクシヨンを集
め減圧乾固して〔21〕53.75ｇ（収率81％）を得
る。 TLC；Rf₁＝0.34 〔α〕_D；−66.4゜（Ｃ＝１、DMF） 元素分析〔C₄₁H₅₇O₁₀N₁₀として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 63.11 7.66 8.85 計算値 63.14 7.37 8.98 アミノ酸分析〔0.779mg／6N塩酸0.3ml、105℃、
20時間〕；Ser1.84(2)、Pro2.06(2)、Leu(1) 22 Ｐ（127―145）；BOC―Ser（Bzl）―Leu―
Pro―Ser（Bzl）―Pro―Ser（Bzl）―Arg
（Tos）―Leu―Pro―Gly―Pro―Ser（Bzl）―
Asp（OBzl）―Thr（Bzl）―Pro―Ile―Leu―
Pro―Gln―OBzl〔22〕 〔16〕63.66ｇ（29.17mM）に塩化メチレンを
加え、これに０℃に冷却下TFA260mlを加えた
後、室温で40分間撹拌する。反応後、減圧下で
TFAを留去し、残渣にエーテルを加える。生じ
た沈澱物を取し、カセイカリデシケーター中で
一夜減圧乾燥する。67.6ｇ。これをDMF200mlに
溶かし（PH４）、−10℃に冷却下NMM4.21mlを加
えてPH７に調節する。次いでHOBT4.73ｇ
（35mM）、〔21〕27.30ｇ（35mM）および
DMF100mlを加え、これに−10℃に冷却下
WSCI6.41ml（35mM）を滴下した後、−10℃で２
時間、室温で一夜撹拌する。反応後、減圧下で溶
媒を留去し、残渣を氷冷水1.5に注ぐ。生じた
沈澱を水に懸濁し、取する。この懸濁、取の
操作を５回繰り返す（PH６）。沈澱物を２日間減
圧乾燥した後、メタノール500mlに溶かし、減圧
濃縮する。残渣にベンゼンを加え、減圧濃縮す
る。このベンゼン処理を２回行い、濃縮物にエー
テルを加え、生じた沈澱物を取する。前記のメ
タノール処理からエーテル処理までを８回繰り返
し、〔22〕79.85ｇ（収率96.2％）を得る。 融点；127〜130℃ TLC；Rf₂＝0.61 〔α〕²² _D；−67.58゜（Ｃ＝１、DMF） 元素分析〔C₁₄₈H₂₀₇O₃₆N₂₃Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 61.05 6.96 11.03 計算値 60.95 7.15 11.05 アミノ酸分析〔1.893mg／6N塩酸0.5ml、105℃、
21時間〕；Asp0.99(1)、Thr0.96(1)、Ser3.74
(4)、Glu1.04(1)、Pro6.00(6)、Gly0.98(1)、
Ile0.95(1)、Leu(3)、Arg0.94(1) 23 hCG〔127―145〕 〔22〕１ｇ（0.34mM）にアニソール５mlを加
え、これに０℃に冷却下無水弗化水素（HF）30
mlを加え、１時間撹拌する。反応後、減圧下で
HFを速やかに留去し、得られた残渣にエーテル
100mlと0.1N酢酸水50mlを加えて振盪する。水層
をDowex １（酢酸型）のカラム（3.3×18cm）に
チヤージし、0.1N酢酸水で流出する。流出液と
洗液を合わせて凍結乾燥して粗生成物660mgを得
る。これを8M尿素水溶液30mlに溶かし、アンモ
ニア水でPH９に調節した後、セフアデツクスLH
―20のカラム（4.5×120cm）にチヤージし、0.1N
酢酸水で溶出する。溶出液を10mlづつ分画し、58
〜64本目の区分を集めて凍結乾燥して540mgを得
る。これを0.1N酢酸水30mlに溶かし、カルボキ
シメチルセルロースのカラム（５×13cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）
で洗浄後、酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）
0.01Mと0.1Mの各400mlの間で直線濃度勾配をか
けて溶出する。溶出液を６mlづつ分画し、79〜86
本目の区分を集め、凍結乾燥して180mgを得る。
これを0.1N酢酸水に溶かし、セフアデツクスLH
―20のカラム（３×17cm）にチヤージし、0.1N
酢酸水で溶出する。溶出液は10.5mlづつ分画し、
25〜30本目の区分を集めて凍結乾燥してhCG〔127
―145〕136.4mgを得る。 融点；215〜225℃ 〔α〕²⁸ _D；＋65゜ （Ｃ＝0.1，0.1N酢酸水） TLC；Rf₁₁＝0.71 アミノ酸分析；Asp1.05(1)、Thr0.97(1)、
Ser3.44（４）、Glu1.10(1)、Pro6.50(6)、
Gly1.04(1)、Ile0.89(1)、Leu3(3)、Arg1.02
(1) 参考例 ２ hCG〔118―145〕；Ｈ―Ser―Ser―Ser―Ser―
Lys―Ala―Pro―Pro―Pro―Ser―Leu―Pro
―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Gly―
Pro―Ser―Asp―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro
―Gln―OH １ Ｐ（118―145）；BOC―Ser（Bzl）―Ser（Bzl）
―Ser（Bzl）―Ser（Bzl）―Lys（Ｚ―Cl）―
Ala―Pro―Pro―Pro―Ser（Bzl）―Leu―Pro
―Ser（Bzl）―Pro―Ser（Bzl）―Arg（Tos）
―Leu―Pro―Gly―Pro―Ser（Bzl）―Asp
（OBzl）―Thr（Bzl）―Pro―Ile―Leu―Pro
―Gln―OBzl〔34〕 参考例１記載の〔22〕79ｇ（28mM）に塩化メ
チレン200mlを加え、これに０℃に冷却下
TFA400mlを加えた後、室温で50分間撹拌する。
反応後、減圧下でTFAを留去し、残渣にエーテ
ルを加え、生じた沈澱物を取した後、カセイカ
リデシケーター中で一夜減圧乾燥する。85.35ｇ。
この生成物をDMF270mlに溶かし（PH３）、−10℃
に冷却下NMM4.58mlでPH６に調節する。次いで
これに、Ｐ（118―126）〔BOC―Ser（Bzl）―Ser
（Bzl）―Ser（Bzl）―Ser（Bzl）―Lys（Ｚ―Cl）
―Ala―Pro―Pro―Pro―OH、融点；125〜135
℃、〔α〕_D；−56.4゜（Ｃ＝１、DMF）、TLC；Rf₆
＝原点付近、Rf₅＝0.45、アミノ酸分析；Ser3.23
（４）、Pro3(3)、Ala0.98(1)、Lys0.97(1)〕49.93ｇ
（33.6mM）を加え、さらにDMF100mlを追加し
て溶液とする。これに−10℃で冷却下WSCI6.20
mlを滴下した（PH５）後、−10℃で２時間、室温
で２時間撹拌する。反応後、減圧下で溶媒を留去
し、残渣を冷水1.5に注ぎ入れる。生じた沈澱
物を得、水に懸濁して洗浄を繰り返した後、デシ
ケーター中で２日間減圧乾燥する。130ｇ。次い
でメタノールを加えて減圧濃縮し、残渣にベンゼ
ンを加えて減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて
再結晶化する操作を12回行なう。さらにメタノー
ルを加えて減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて
再結晶化して〔34〕108.43ｇ（収率91.9％）を得
る。 融点；129〜131℃ 〔α〕²⁴ _D；−72.76゜（Ｃ＝１、DMF） TLC；Rf₂＝0.56 元素分析〔C₂₂₀H₂₉₄O₅₁N₃₃SClとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 61.49 7.07 11.02 計算値 61.67 6.92 10.79 アミノ酸分析〔0.978mg／6N塩酸0.5ml、105℃、
21時間〕；Asp1.00(1)、Thr0.96(1)、Ser6.87
(8)、Glu1.05(1)、Pro9.63(9)、Gly1.03(1)、
Ala1.09(1)、Ile0.94(1)、Leu3(3)、Lys1.09
(1)、Arg0.97(1) ２ hCG〔118―145〕 〔34〕3.0ｇ（0.71mM）にアニソール10mlを加
え、これに無水弗化水素（HF）80mlを導入し、
０℃で１時間撹拌する。反応後、減圧下でHFを
留去する。残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物
を取する。この粉末を0.1N酢酸水50mlに溶解
し、Dowex １（酢酸型）のカラム（3.5×35cm）
にチヤージし、0.1N酢酸水で洗う。流出液と洗
液を合わせ、凍結乾燥して1.46ｇを得る。これを
8M尿素水溶液30mlで溶解し、０℃でアンモニア
水にてPH９に調節し、セフアデツクスLH―20の
カラム（4.5×120cm）にチヤージし、0.1N酢酸水
で溶出する。溶出液を７mlづつ分画し、55〜83本
目の区分を集め、凍結乾燥して990mgを得る。こ
れを0.1N酢酸水30mlで溶解し、カルボキシメチ
ルセルロースのカラム（５×14cm）にチヤージす
る。0.01M酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）200
mlで洗浄後、酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）
0.01Mと0.1Mの各400mlの間で直線濃度勾配をか
けて溶出を行う。溶出液を６mlづつ分画し、85〜
115本目の区分を集め、凍結乾燥して850mgを得
る。これを0.1N酢酸水で溶解し、セフアデツク
スLH―20のカラム（４×120cm）にチヤージし、
0.1N酢酸水で溶出する。溶出液を10.5mlづつ分画
し、35〜43本目の区分を集め、凍結乾燥して650
mgを得る。これを0.1N酢酸水30mlで溶解し、再
度カルボキシメチルセルロースのカラム（５×15
cm）にチヤージする。0.01M酢酸アンモニウム緩
衝液（PH4.5）200mlで洗い、次いで酢酸アンモニ
ウム緩衝液（PH4.5）0.01Mと0.1Mの各400mlの間
で直線濃度勾配をかけて溶出を行う。溶出液を
6.5mlづつ分画し、100〜111本目の区分を集め、
凍結乾燥して480mgを得る。これを0.1N酢酸水で
溶解し、セフアデツクスLH―20のカラム（３×
117cm）にチヤージし、0.1N酢酸水で溶出する。
溶出液を10.5mlづつ分画し、24〜30本目の区分を
集め、凍結乾燥して、hCG〔118―145〕320mgを得
る。 融点；220℃以上で分解 TLC；Rf₁₁＝0.57 アミノ酸分析；Asp1.07(1)、Thr0.97(1)、
Ser5.23（８）、Glu1.13(1)、Pro9.86(9)、
Gly1.07(1)、Ala1.06(1)、Ile0.89(1)、Leu3
(3)、Lys1.08(1)、Arg1.07(1)

【図面の簡単な説明】

第１図は、BSA―hCGβ鎖を用いて得られた抗
血清を用いる測定結果を示し、第２図は、hCG
（127―145）重合体を用いて得られた抗血清を用
いる測定結果を示し、第３図は検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトじゆう毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の
   エンザイムイミユノアツセイにおいて、脱シアリ
   ン酸化hCG―酵素結合体を酵素標識体として用い
   ることを特徴とするhCGの測定法。 ２ エンザイムイミユノアツセイが、競争反応に
   基く方法である特許請求の範囲第１項記載のhCG
   の測定法。 ３ 競争反応に基く方法が、第２抗体を用いる競
   争反応に基く方法である特許請求の範囲第２項記
   載のhCGの測定法。 ４ 競争反応に基く方法が、不溶化抗体を用いる
   競争反応に基く方法である特許請求の範囲第２項
   記載のhCGの測定法。 ５ 酵素が、β―ガラクトシダーゼである特許請
   求の範囲第１項，第２項，第３項または第４項記
   載のhCGの測定法。