JPS6330886B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はメソトレキセイト（methotrexate）
と、ジビニルエーテルと無水マレイン酸の環状コ
ポリマーとの反応生成物を有効成分とする抗腫瘍
剤に関する。 １：２のモル比のジビニルエーテルと無水マレ
イン酸から造られるコポリマーは従来技術におい
て知られており、米国特許3224943号には腫瘍の
成長遅延に、米国特許3749771号には口蹄疫の防
止に、米国特許3859433号にはヘルペス・ウイー
ルスによる感染の防止に有効であることが記載さ
れている。米国特許3794622号には狭い分子量範
囲の効適コポリマーが記載されている。 このコポリマーのこれまでの薬学的研究は毒
性，抗腫瘍活性，免疫増強効果がポリマーの分子
量および分子量分布に依存することを確立してい
る。さらに、ジビニルエーテル・無水マレイン酸
コポリマーは、メソトレキセイトに対して部分的
耐性を有するルイス肺癌，腺癌（アデノカルチノ
ーマ）755などの実験動物における種々の移植可
能の腫瘍に対して活性を示した。 メソトレキセイトは癌に対して有効な化学療法
剤で なる化学式を有する。メソトレキセイト、すなわ
ち、Ｎ（ｐ−〔２，４−ジアミノ−６−プテリジニ
ルメチル〕−メチルアミノベンゾイル）グルタミ
ン酸は多年種々の悪性腫瘍ならびに非新生物性疾
患に臨床的に使用されてきた。メソトレキセイト
は単独使用または他の薬剤との組み合せ使用にお
いて、繊毛膜癌，急性小児白血病，バーキツト．
リンパ腫の治療に相当な効果をあげてきた。然し
ながら、広範囲の臨床的使用にかかわらず、その
使用に関連して重大な問題があつた。正常組織、
特に骨髄と小腸に対する毒性はしばしば生命をお
びやかした。最初の使用後に耐性の発生がしばし
ば見られた。メソトレキセイトは動物において、
ルイス肺癌のような充実性腫瘍に対して不満足な
活性を示す。強い免疫抑制作用を示し、それは抗
代謝性細胞毒薬剤において典型的に観察される。
メソトレキセイトの低分子量の構造的類似物質
が、近年多数合成され研究されたが、それらの誘
導体の何れもメソトレキセイトに優る治療指数
（therapeuticindex，毒性に対する相対的抗腫瘍
活性）を示さなかつた。 メソトレキセイトのアミン基とジビニルエーテ
ル・無水マレイン酸（１：２モル）コポリマーの
酸基との間にアミド結合を形成させて得た反応生
成物およびその生理的に許容される塩は、メソト
レキセイト自体よりも毒性が低く、かつ両化合物
の混合物よりも高い抗腫瘍活性を示すことがわか
つた。 メソトレキセイトと、ジビニルエーテルと無水
マレイン酸のコポリマーの反応は不活性の共溶媒
中で、最も好適には、無水型コポリマーの過剰量
に対してメソトレキセイトをゆつくりと加えるこ
とによつて実施される。この製法において有用な
不活性共溶媒はジメチルスルホキシド，ジメチル
ホルムアミド，アセトン，スルホラン，テトラヒ
ドロフラン等である。上述のように最も好ましく
は、過剰量のコポリマー、すなわち、少くともメ
ソトレキセイトに対して1.2：１比の酸無水物基
が維持される。この反応に対して時間と温度は決
定的ではなく、当業者には自明の問題である。一
般に反応は０℃以上で遂行され、完了には数時間
を要する。反応生成物におけるメソトレキセイト
対コポリマーの比はコポリマーの酸無水物基含有
量と反応時間によつて変化する。使用されるコポ
リマーが殆んど100％の酸無水物基を含有する時、
比較的高い量のメソトレキセイトがコポリマーに
結合できる。本発明の反応生成物の精製は、常
法、即ち例えば、溶媒抽出及びもしくは溶媒から
の沈殿によつて遂行される。メソトレキセイトの
コポリマーに対する結合はプテリジン
（pteridine）環の２−もしくは４−アミノ基の何
れかで起ると信ぜられている。何となれば、それ
らの間では化学的反応性の差は、あるとしても極
めて小さいからである。メソトレキセイトがコポ
リマー中に存在する異なつたタイプの酸無水物基
にランダムに反応することもありうることであ
る。然しながら、メソトレキセイトの両アミノ基
の反応に基づく架橋は、本発明の反応生成物の合
成中には観察されていない。 メソトレキセイトと、ジビニルエーテル・無水
マレイン酸コポリマーの反応生成物は、メソトレ
キセイトおよび該コポリマーのそれぞれによつて
治療されるすべての腫瘍の治療に有用である。実
際、本発明の反応生成物の抗腫瘍活性の研究は、
該反応生成物がメソトレキセイトもしくは該コポ
リマー単独または両者のの混合物より大なる活性
を有することを示した。 本発明において有用である反応生成物の生理的
に許容できる塩の例は、例えばナトリウム，カリ
ウム等のようなアルカリ金属の水溶性塩，アンモ
ニウム塩、メチルアミン，ジメチルアミン，トリ
メチルアミン，エチルアミン，ジエチルアミン，
テトラエチルアンモニウム，ブチルアミン，メト
キシアミン，ピペリジン，モルホリン等のアミン
の塩，アンモニアと他のアミンを含む混合塩等で
ある。 本反応生成物は径口もしくは非経口的投与され
るとき、有効性を示すが、非経口的投与による治
療が通常好まれよう。本反応生成物は水溶液また
は生理的食塩水に溶解した形で使用される。さら
に、活性物質ならびに液体または固体の希釈剤を
含む製剤に有利に配合することができる。即時希
釈用の固体製剤は、処方物に所望の薬学的性質を
付与するために種々の緩衝剤ならびに局所麻酔
剤，催眠剤，鎮痛剤等の他の薬剤、無機塩等を使
用して調合することができる。 本反応生成物は動物および人間の腫瘍の阻止の
ために、投与の方法，治療の継続によつて異なる
が、およそ0.5〜80mg／Kg／日の程度で投与する
のが望ましい。本反応生成物は安定で、広範囲の
物質と共存可能であるので、水，プロピレングリ
コール，ジエチルカルボナート，グリセロール，
または落花生油，ゴマ油，オリーブ油等の油を含
む種々の薬学的に許容される賦形剤中の溶液もし
くは懸濁液の形で投与することができる。 常用の経口，筋肉内，皮下，静脈内，腹腔内投
与に加えて、本反応生成物は、腫瘍部位が治療の
ために主循環系から独立させられるかん注法
（profusion）と組み合せて使用可能である。 ある場合には、本反応生成物を１種以上の他の
静癌剤と組み合せて使用することが望ましいこと
もある。この目的のためには、および10〜90％の
本反応生成物を含む組成物が有用である。そのよ
うな組み合せにおいて使用できる静癌剤は当業者
には周知である。 次の実施例は本発明の説明のために例示するも
のである。これらの実施例において使用されたメ
ソトレキセイトはメリーランド州ベセスダの
National Cancer Instituteの薬剤開発部（Drug
Development Branch）から入手したものであ
る。試料は約10％の水分を含んでおり、それは暗
黒真空中50℃でP₂O₅上で長時間乾燥して除去し
た。別段に記されていない場合、使用したジビニ
ルエーテル・無水マレイン酸コポリマーは米国特
許3224943号及び3794622号記載の方法で合成した
ものである。 実施例 １ この実施例はメソトレキセイトとジビニルエー
テル・無水マレイン酸コポリマーの典型的反応生
成物の製造を例示する。 反応容器に10.3部の無水マレイン酸と200部の
乾燥ベンゼンと7.45部の四塩化炭素を入れた。無
水マレイン酸が溶解したら、チツ素でスパージ
し、3.7部のあらたに蒸留したジビニルエーテル
を60部のベンゼンに溶解して加えた。反応容器を
80℃に加熱し、5.6部のベンゼンに溶解した0.073
部の過酸化ベンゾイルを撹拌しながら加えた。80
〜90℃で４時間反応を維持した。得られたスラリ
ーを25〜30℃に冷却し、膨潤したコポリマーを分
離した。生成物は7.5部のベンゼンと10部のヘキ
サンの混合物で繰り返し抽出し、別し、真空乾
燥した。 得られた生成物は無水マレイン酸とジビニルエ
ーテルの２：１のコポリマーであり、固有粘度
1.65、数平均分子量約36000、M_W／M_o比約７で
あつた。 上記のコポリマー２部をあらたに蒸留したジメ
チルホルムアミド20部に溶解し、16部のジメチル
ホルムアミドに溶解した１部のメソトレキセイト
の二ナトリウム塩を20℃の前記溶液に加えた。反
応混合物は室温で24時間撹拌してから50℃に３時
間加熱した。生成物は500部の塩化メチレンを溶
液に加え、別回収し、真空下で20時間乾燥し
た。生成物は加水分解生成物の膜透析によつて精
製した。生成物は400部の0.05NのNaOH溶液に
溶解し、45Psi（3.16Kg／cm²）で分子量約1000の膜
に対して透析してサイズをそろえた。毎回２部の
0.05NのNaOH溶液を加えた後４回前記の処理を
繰り返し、その後では液中の痕跡量のメソトレ
キセイトしか検出されなかつた。生成物は該苛性
ソーダ液を過剰量のアセトン中に加えることによ
り回収され、沈殿を別し、真空下で40℃で乾燥
した。2.2部の生成物が得られた。紫外分光分析
によりメソトレキセイト含有量は11％であつた。 実施例 ２ この実施例はメソトレキセイトとジビニルエー
テル・無水マレイン酸の反応生成物の他の典型的
な製法を例示する。 重合容器を3.2部の無水マレイン酸を入れ、チ
ツ素でスパージし、26.2部の乾燥アセトンと1.67
部のあらたに蒸留した乾燥テトラヒドロフランを
加えた。（溶媒はチツ素でスパージしてチツ素雰
囲気中に貯えておいた。）無水マレイン酸の溶解
後、1.14部の1.58部のアセトンに溶解した1.14部
のジビニルエーテルを加えた。反応容器を45℃に
熱し、0.48部のアセトンに溶解した0.080部のア
ゾビス（イソブチロニトリル）を撹拌しながら加
えた。45℃で8.75時間反応を維持した。得られた
透明の溶液を過し、27.0部のヘキサンを加えて
コポリマーを沈殿させ、これを分離し、9.4部の
ベンゼンと2.84部のヘキサンの混合物で繰り返し
抽出し、真空乾燥した。 得られた生成物は無水マレイン酸とジビニルエ
ーテルの２：１のコポリマーで、その固有粘度
1.32、M_W／M_o比約２であつた。 上述のように製造されたコポリマー２部をあら
たに蒸留したアセトン40部に溶解した。30部のジ
メチルスルホキシドに溶解した１部のメソトレキ
セイトの溶液を前記の溶液に20℃でゆつくり加え
た。透明な赤色の反応混合物を45℃に４時間加熱
し、20℃まで放冷した後に72時間撹拌した。この
溶液を600部の塩化メチレンに加えることによつ
て生成物を沈殿させ、アセトンに再溶解し、二塩
化メチレンから再沈殿させた。生成物はソクスレ
ー抽出器中で800部の塩化メチレンで２回抽出し
た。生成物はさらにアセトンに溶解して３回再沈
殿し、塩化メチレンに加え、その後の沈殿溶媒中
には遊離のメソトレキセイトは検出されなかつ
た。元素分析は44.36％Ｃ，4.78％Ｈ，5.01％Ｎを
示した。紫外分光試験によるメソトレキセイト含
量は25.2％であつた。生成物は水，アセトン，メ
タノール，ジメチルホルムアミド，ジメチルスル
ホキシドに可溶であつた。塩化メチレン，ジエチ
ルエーテルには不溶であつた。 実施例 ３〜５ これらの実施例はメソトレキセイトとジビニル
エーテル・無水マレイン酸コポリマーの反応生成
物の典型的製造法を例示する。 典型的な実施において、１部のジビニルエーテ
ル・無水マレイン酸コポリマーを10部の新らたに
蒸留したジメチルホルムアミド10部に溶解し、８
部のジメチルホルムアミドに溶解した約0.5部の
メソトレキセイトを室温で撹拌しながら滴下して
加えた。反応混合物は室温で24〜48時間撹拌し、
最後に50℃に３時間加熱した。各回、生成物を
250部の塩化メチレン中で沈殿させ過し、メタ
ノールで洗い、真空中で一夜乾燥した。粗生成物
はポリカルボキシラートに加水分解し、200mlで
透析し、ついで100mlの0.05MのNaOHで４回透
析した。（BM10枚膜，西独，チユービンゲン，
Berghof，エクスクルージヨン・サイズ1000）
液中には痕跡量のメソトレキセイトしか検出され
なかつた。反応生成物は150mlのアセトン中で沈
殿させ、アセトンで洗い、P₂O₅で真空中で乾燥
した。反応生成物の赤外スペクトルは1640と1775
cm^-1にアミドと酸無水物の振動を示した。反応生
成物中のメソトレキセイトの分光分析には303nm
の紫外スペクトル最大値を利用した。反応に使用
されたコポリマーの分子量と酸無水物量，コポリ
マー対メソトレキセイトのモル比，反応時間，反
応生成物のメソトレキセイト含有量は第１表に示
されている。

【表】 ＊ メソトレキセイト／（コポリマー・メソトレキセ
イト反応生成物）に基づくモル％
実施例 ６ この実施例は反応において溶媒としてジメチル
ホルムアミドの代りにジメチルスルホキシドを使
用した以外は実施例３〜５と同じである。反応に
使用したコポリマーはM_N15500，M_W30000で理論
量で82％の酸無水物を含んでいた。コポリマーは
メソトレキセイトと3.5：１のモル比で24時間反
応させられた。反応生成物は6.1％のメソトレキ
セイトを含んでおり、元素分析の結果はＣ：
37.1，Ｈ：4.0，Ｎ：1.7であつた。 実施例 ７〜12 この実施例もメソトレキセイトとジビニルエー
テル・無水マレイン酸コポリマーの反応生成物の
典型的製法を示す。 一つの典型的実施において、１部のジビニルエ
ーテルを20部のアセトンに溶解し、15部のジメチ
ルスルホキシドに溶解した約0.55部のメソトレキ
セイトを、室温で撹拌しながら滴下して加えた。
最初45℃において４時間加熱した後で、透明な橙
赤色の反応混合物は室温で96時間撹拌した。反応
生成物は300部のCH₂Cl₂中で沈殿させられ、過
され、さらに300部のCH₂Cl₂中で再沈殿させられ
た。そしてソクスレー抽出器で400部のCH₂Cl₂で
２回48時間抽出した。これを３回、70部のアセト
ンに溶解してアセトン不溶物を除き、CH₂Cl₂中
で再沈殿することによつて最終精製物を得た。最
終生成物はニンヒドリンを発色剤とする薄層クロ
マトグラフ法で遊離のメソトレキセイトの存在を
示さなかつた。生成物はポリカルボキシラートへ
の加水分解の後に水、アセトン、ジメチルホルム
アミドおよびジメチルスルホキシドに可溶で、
CH₂Cl₂およびエーテルに不溶である。反応生成
物中のメソトレキセイト含有量を測定するのに紫
外スペクトルの最大値303mmを使用した。反応に
使用されたコポリマーの分子量と酸無水物含有
量、コポリマー対メソトレキセイトのモル比、反
応生成物のメソトレキセイト含有量は第２表に示
されている。

【表】 腫瘍の移植と化学療法の実施例 次の実施例では、実施例９に記載した反応生成
物およびコポリマーを使用した。 ６〜８週の週齢の、20〜25ｇのCD2F₁雄マウス
（BALB／Ｃ雌×DBA／２雄）が白血病L1210に
対する研究と他の生体内実験に使用された。ルイ
ス肺癌に対する化学療法の実験には20〜25ｇの
B6D2F₁雄マウス（C56BL／６×DBA／２）が
使用された。 L1210白血病は連続的に腹腔内に継代接種さ
れ、１ml中に生育可能に成熟した細胞10⁶個を含
む腹水0.1mlの腹腔内注入により接種した。１群
10匹づつの治療が腫瘍接種24時間開始された。薬
剤は体重１ｇあたり0.01mgを２％NaHCO₃溶液に
混じて腹腔内に投与した。抗腫瘍活性は被治療群
（Ｔ）の生存時間中央値を対照群のそれと比較し、
寿命中央値の増加百分率（ILS）、100（Ｔ／Ｃ−１） として表現される。 ルイス肺癌はNationel Cancer Instituteの
Drug Research and Development Programの
標準規定に従つてC57BL／６雄マウスの皮下に
継代接種され、10⁶個の生育可能に成熟した細胞
がB6D2F₁マウスの右ももに皮下に移植された。
治療群は１群８匹、対照群は少くとも16匹のマウ
スが各実験において使用された。腫瘍の成長はヴ
アーニアー付キヤリバーで腫瘍の垂直直径を測定
して決定した。腫瘍の測定は約50mgの触知可能の
腫張の発達後２日目ごとになされた。腫瘍の重量
（mg）は、単位重量を仮定し、偏楕円体の体積の
式mm大直径×（mm小直径）²×1/2を使用して算定し
た。 L1210白血病細胞は、上述のように維持された
CD2F₁マウスの腫瘍によつて開始された。L1210
細胞は成育されフアルコン倍養フラスコ
（Falcon Plastics Ltd.，Oxnard，Canada）中
で10％のウシ胎児血静で強化されたRMPI1630培
地（Grand Island Bioloqicl Co.，Grand
Island.，N.Y.）中で生物検定された。培養物中
の細胞の数はクールター・カウンタ−（Coulter
Electronics Inc.，Florida）で、培養フラスコか
ら0.5mlづつとつて、測定した基培養物は数えら
れ、各フラスコ中で全量10mlで10⁵個の生育可能
（トリバン・ブルー）細胞を含む濃度に希釈され
た。薬剤は各実験の直前に滅菌２％NaHCO₃溶
液に溶解しストツク溶液とした。細胞培養物にお
ける最終NaHCO₃濃度が１％をこえないように
培地で希釈された。細胞は種々の濃度の薬剤にさ
らされ、48時間に数えられた。各薬剤の成長阻止
効果は少くとも２回、各濃度について３回行い、
結果は非治療対照動物と比較した阻止百分率の平
均±S.E.として表現される。 生体内における白血病L1210に対する研究の結
果は第３表に示されている。試験管内における白
血病L1210に対する研究の結果は第４表に示され
ている。生体内におけるルイス肺癌に対する研究
結果は第５表に示されている。

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ メソトレキセイトを過剰の酸無水物型のジビ
   ニルエーテルと無水マレイン酸との１：２モル比
   のコポリマーと不活性共溶媒中で０℃よりも高い
   温度で反応させることによりメソトレキセイトの
   アミン基とコポリマーの酸基との間にアミド結合
   を形成させて得た反応生成物または生理的に許容
   されるその塩を有効成分とする抗腫瘍剤。