JPS63258575A

JPS63258575A - 昆虫細胞中でつくられる組換えｈｉｖエンベロープタンパク

Info

Publication number: JPS63258575A
Application number: JP62314314A
Authority: JP
Inventors: ジェイムス　ルッシュ; デブラ　リン; ヘレン　カルソン; スコット　プットニイ; シンディ　ロウ　ジェリス
Original assignee: Repligen Corp
Current assignee: Repligen Corp
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1988-10-26
Also published as: EP0272858A2; EP0272858A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は昆虫細胞中でつくられる組換えＨＩＶエンベロ
ープ蛋白質類に間する。

［従来の技術］ヒトＴｍ胞白血病■型ウィルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　）
、リンパ節障害間連ウィルス（ＬＡＶ）、又はＡＩＤＳ
ＩＤ５間口レトロウィルスＶ）は、後天性免疫不全症（
＾１０Ｓ）の原因として確認された［ボボビツク・エム
（Ｐｏ−ｐｏｖｉｃ、　Ｍ、）、サルンガドハラン・エ
ム・ジー（Ｓａ−ｒｎ８ａｄｈａｒａｎ、　Ｍ、Ｇ、）
、リート・イー（Ｒｅａｄ、　Ｅ、）、及びガロ・アー
ル・シー（Ｇａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，）［：１９８４年］
５ｃｉｅｎｃｅ　２２４巻４９７−５００頁］。現在受
け入れられている呼称はＩＩＩＶ（ヒト免疫不全ウィル
ス）である。

従って、以下、本開示を通じてＨＩＶが使用される。

は゛とんどのエイズ患者とエイズ関連複合症候群（ＡＲ
Ｃ）患者、及び同ウィルスに感染した無症状の人々［サ
ルンガドハラン・エム・ジー、ボボビツク・エム、ブラ
ツチ・エル（Ｂｒｕｃｈ、　Ｌ、）、シャブバッチ・ジ
エイ（Ｓｃｈｕｐｂａｃｈ、　Ｊ）、及びガロ中アール
・シー［１９８４年１Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻５０６
−５０８頁］の血清中の旧ｖＮ白質に対する抗原は、こ
れらの抗原に対する抗体を検出するための免疫学を基盤
とする試験の開発を可能にした。これらの試験は、ウィ
ルスに感染した人々の血液試料を調べることによって、
輸血によるＨＩＶの伝播を抑えるために使用される。現
在市販されている診断試験は、抗原として不活性化ウィ
ルスの蛋白質を使用する。

診断への新しい手がかりとなるほか、組換えＤＮＡは細
菌とウィルス双方に対するワクチンの開発にとって大き
な有望性をもっている［ウィルソン・ティー（Ｗｉｌｓ
ｏｎ、　Ｔ、）［１９８４年］　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　２巻２９−３９頁］。組換えワクチンをつく
るのに最も広範囲に使用される生物は、大腸ｉ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）、Ｓ。

セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び培養哺
乳類細胞であった。

解決しなければならない最も急を要する問題の一つは、
ＨＩＶ感染を防ぐワクチンができるかどうかである。こ
の点で考慮される重要な蛋白質はウィルスエンベロープ
と関連する蛋白質類である。

これらは前駆体ｇｐｔ６ｏから誘導され、これを蛋白質
分解的に開裂すると、外部エンベロープの糖蛋白質ｇｐ
１２０と膜を通過する（ｔｒａｎｓｍｅｎ＋ｂｒａｎｅ
）エンベロープの糖蛋白質ｇｐ４１を生ずる。エンベロ
ープ蛋白質が、ウィルス生活周期に関係する重要な生物
学的過程に関与していること、及びこれらの蛋白質に基
づくサブユニットワクチンが可能でありうるという意見
は、幾つかの系統の証拠によって支持されている。

（１）　ＨＩＶ惑染を中和する抗体は、エイズやＡＲＣ
（エイズ関連複合症候群）にかかった人々の血清中に、
またこのウィルスに感染した無症吠の人々の血清中に発
見された。抗体は、精製、ｇｐ１２０に結合するような
血清中に存在する。

（２）精製ｇｐ１２０は、哺乳類細胞中でつくられるｇ
ｐ１２０の大きな断片と同様に、中和抗体の生産を生じ
させる。

（３）　Ｔ４受容体へのｇｐ１２０の直接の結合が立証
され、ウィルス受容体のあるエピトープを認識するモノ
クローナル抗体が、ウィルス感染を防ぐ。

Ｃ発明が解決しようとする問題点］これまで、ｇｐ１６０はすでに述べたように、ｇｐ１６
０をコードした遺伝子の発現がｇｐ１２０とｇｐ’ｌ　
１へのその蛋白質分解的開裂をもたらすため、組換え手
段ではつくられなかった。従って、ｇｐ１６０を発現さ
せ、この蛋白質を精製するための先行技術の既知組換え
手順は存在しない。更に、ｇｐ１６０＞月＋１Ｖ中和抗
体のもとどなる免疫原として使用できることを示唆する
ような既知の先行技術はない。

ｇｐ１６０は先行技術で精製されておらず、ウィルスと
ウィルスに感染した細胞のポリアクリルアミドゲル電気
泳動で観察されるだけであった。このようなゲル上に存
在する時は、ｇｐ１６０は汚染細胞蛋白質と一緒に移動
するので不純である。これらのゲルからの、ｇｐ１６０
バンドの溶離は、純粋な蛋白質を生じない。本開示は、
組換えｇｐ１６０をその本質的に純粋な形でつくる方法
を提供している。ｇｐ１６０のこのような調製物は、ウ
ィルス又はウィルス感染細胞全体の一部としての未精１
！ｇｐ１６０とは対照的に、ワクチンとして有用である
。なぜならば、Ｗ　１１ｇｐｔｆ３ｏによって、はるか
に強力な免疫応答が引き出されるからである。そのほか
、ウィルスによるワクチン化は、ウィルス感染の可能性
があるため、望ましいものではない。

［問題点を解決する手段］本発明は、多量のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０
及びｇｐ１２０をつくるための、組換えＤＮＡ技術によ
る手段を提供している。更に詳しくは、ｇｐ１６０とｇ
ｐ１２０は、組換えＤＮＡ手順を用いて、昆虫細胞中で
つくられ、そこから精製される。昆虫細胞中の無傷のｇ
ｐ１６０が処理されてｇｐ１２０とｇｐ４１にならない
のは驚異的であり、それは以下の理由による。

周知のように、（１）　ｇｐ１６０は、哺乳類細胞系統
ＨｅＬａ、　Ｂ５Ｃ−４０及びＨ９細胞中で処理される
［シャクラパルティ・ニス（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、
　Ｓ、）、ロバート＝グロフーｘム（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇ
ｕｒｏｆｆ、　Ｍ、）、ウォン＝スタール・エフ、ガロ
中アール・シー及びモス・ビー（Ｍｏｓｓ、　Ｂ、）［
１９８６年］　Ｎａｔｕｒｅ　３２０巻５３５−５３７
頁；ジー・ニス・エル（）Ｉｕ、　５−Ｌ−）％コソウ
スキ・ニス・ジー（Ｋｏｓｏｗｓｋｉ、　Ｓ、Ｇ、）及
びダリリンブル・シエイーＸム（Ｄａｌｙｒｙｍｐｌｅ
、　Ｊ、Ｍ、）［１９８６年］　Ｎａｔｕｒｅ　３２０
巻５３７−５４０頁］。また、（２）昆虫細胞は、ＩＬ
−２のような他の哺乳類遺伝子からの分泌信号を正確に
処理できる［スミス・ジー・イー（Ｓｍｉｔｈ、　Ｇ、
Ｅ、＞、ジューφジー（Ｊｕ、　Ｇ、）、エリクソンΦ
ビー・エル（Ｅｒｉｃｓｏｎ、　Ｂ、Ｌ、）、モジエラ
・ジェイ（Ｍｏｓｃｈｅｒａ　。

Ｊ、）、ラームφエッチφダブリ：Ｌ−（Ｌａｈｍ、　
Ｈ，Ｗ、）、シゾナイト・アール（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔ
ｅ、　Ｒ，）及びサマーズーｘム・ディー（Ｓｕａｍｅ
ｒｓ、　Ｍ、Ｄ、）［１９８５年コＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　８２巻８
４０４−８４０８頁］。従って、昆虫細胞がｇｐ１６０
を処理することも予期されよう。

昆虫細胞から無傷のｇｐ１６０が得られるという予想外
の結果により、試験用やＨＩＶ抗体を生じさせる免疫原
としての用途に多量のｇｐ１６０生産が可能となった。

Ｊｐ１６０は、生産が困難なため、このような用途で試
験されたことがない。本発明は、この問題に対する最初
の知られた解答である。

本発明方法でｇｐ１６０をつくるには、ｇｐ１６０が精
製ｇｐ１６０で免疫化されたヤギ中で体液及び細胞の免
疫を生ずることが、ここでも予想外かつ有利に発見され
た。最も有利な点は、昆虫細胞中でつくられるｇｐ１６
０がもたらすＨＩＶ中和中和抗体価定値天然ｇｐ１２０
で生ずる抗体滴定値より５倍も高いとわかったことであ
る。また、ｇｐ１６０がもたらす中和滴定値は、ヒトエ
イズ及び＾ＲＣ患者からの中和抗体滴定値より７倍も高
い。

これは、体液と細胞双方の免疫を与えるＩＩＩＶ組換え
エンベロープ蛋白質についての、最初の実証である。

ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０はウィルス感染細
胞から精製され、中和抗体と細胞免疫をもたらす［ロベ
イ・ダブリュー・ジー（Ｒｏｂｅｙ、　Ｗ、Ｇ、）、ア
ーリー・エル・オー（Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、０）、マシ
ューズ・ティー・ジエイ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、Ｊ
、）、ラングロイス・エイ（Ｌａｎｇｌｏｉｓ、　Ａ、
）、コープランド・ティー・ディー（Ｃｏｐｅｌａｎｄ
、　Ｔ、Ｄ、）、ジーシュ・エヌ・ダブリュー　（Ｌｅ
ｒｃｈｅ、　Ｎ、Ｗ、）、オロズラン・ニス（Ｏｒｏｓ
ｚｌａｎ、　Ｓ、）、ポロネジ；ディー・ビー（Ｂｏｌ
ｏ−ｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、）、ギルデン・アール・ヴイ
−（Ｇｉ　１ｄｅｎ。

Ｒ，Ｖ、）及びフィッシンジャー・ビー・ジエイ（Ｆｉ
ｓ−ｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、）［１９８６年］　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ　８３年７０２３−７０２７頁］。本明細書に
記載の組換えｇｐ１６０はｇｐ１２０より５倍高い中和
抗体滴定値をもたらす、昆虫細胞中にｇｐ１２０を発現
させることによって、蛋白質は中和抗体をもたらす上で
、昆虫細胞からのｇｐ１６０と本質的に同じ増加した抗
原性状をもちうる。、ｇｐ１２０は、組換えバクロウィ
ルスクローンＨＴａ中のｇｐ１２０遺伝子（アミノ酸番
号５１１）の末端に停止コドンを導入することによって
、昆虫細胞中で発現できる。

エンベロープ蛋白質ｇｐ１６０とｇｐ１２０をエイズの
ワクチン、診断薬及び治療剤として使用できる。ｇｐ１
６０は、ＨＩＶ感染細胞のＨＩＶを媒介とする細胞融合
を予防できるような抗体を生じさせる。更に、ｇｐ１６
０はＨＩＶに感染したヒトにおいて、リンパ球増殖応答
を刺激するために使用できる。これが次にこのようなヒ
トの免疫系に刺激を与え、ＨＩＶに応答させることにな
る。従って、ｇｐｌｆｌｉｏは予防になるとともに治療
価値もある。昆虫細胞中に発現されるｇｐ１２０は、ｇ
ｌｌ１６０に対してつくった抗血清に免疫反応性があり
、昆虫細胞からのｇｐ１６０と本質的に同じ抗ＨＩＶ免
疫性状もつはずである。

本発明はまた、ｇｐ１６０とｇｐ１２０の変異型にも間
する。これらの変異型は昆虫細胞中での発現のために構
築される。つくられる蛋白質は、親蛋白質に対して本明
細書に記述されたものと同じ方法で有用である。

以下の寄託が、（６１６０４）合衆国イリノイ州ビオリ
ア、ノース・ユニパーシティ優ストリート１８１５の北
部研究センター、農業研究サービス特許培養基保存施設
（ＮＲＲＬ）になされた。

ｔ　　　　　　　　　Ｌ玉ｌ且−−１玉且月大腸菌Ｊ旧
０３（ｐＳＰ６４）ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１５０１９８６
年１２月４日／／　　ＨＢ１０Ｉ（ｐＡｃＨＴ３）ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１８１５２１９８６年１２月４日／／　　Ｊ
　Ｍ　１０３　（ρＡｃ６１０）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８
１５１１９８６年１２月４日ｎ　　ＪＭ１０３（ｐＡｃ
ＨＴ？）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４８１９８７年８月７
日本培養基が寄託された際の条件は、３７ＣＦＲ１，１
４及び３５　ＵＳＣＩ２２の下で権限を与えられた特許
商標庁長官により決定された者が、本特許出願の係属中
に、培養基へのアクセスを利用できることを保証してい
る０本出願又はその子孫の対応特許出願が提出されてい
る国々の外国特許法で要求されるとおりに、寄託物は入
手できる。しかし、寄託物が入手できるからといって、
政府措置によって許可された特許権を侵害してまで本発
明を実施できるという実施許諾を構成するものではない
ことを理解すべきである。

更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に利用できる。すな
わち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請求後少な
くとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日から少なく
とも３０年間か、又は培養基の開示を公布する特許の実
施期間中、これらの寄託物は、生育可能で汚染されてい
ない状態に保つために必要なあらゆる配慮をもって゛保
存されよう。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態の
ために試料を供給できない場合には、寄託者は寄託物を
補充する義務を認めるものである。本培養基寄託物の一
般利用に間するすべての制限は、これらを開示した特許
の授与に際して決定的に取り除かれよう。

昆虫細胞系統Ｓｆ９＜スポドプテラ・フルギペルダ）（
寄託番号ＡＴＴＣＣＲＬ　１７＋１）はアメリカ標準培
養基保存施設（アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン）［（２０８５２）合衆国メリーランド州ロックビル
、パークローンドライブ＋２３０１］から人手できる。

バクロウィルスのオートグラファ・カリフォルニカ核ポ
リヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、テキサス・エ
イ争アンド・エム大学テキサス農業試験所［（７７８４
３）テキサス州カレッジステーション］から人手でき、
スミス・ジー（Ｓｍｉｔｈ、　Ｇ、）及びサマーズ争エ
ム・ディー（１９７８年）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８９年５
１７−５２７頁；及び（１９７９年）　Ｊ、　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ３０巻８２８−８３８頁に記述された。

開示された制限酵素は、ベテスダ研究所（メリーランド
州ゲイサーズバーグ）又はニューイングランドΦバイオ
ラボ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入できる。

酵素類は、供給者側から提供された指示に従って使用さ
れる。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法は、この技術において周クロである。これら
の手順はすべて、マニアティス・チー／−（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｔ、）、フリッチ・イーーｘフ（Ｆｒｉ−ｔｓ
ｃｈ、　Ｅ、Ｆ、）及びサムプルツク・ジエイ（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ　。

Ｊ、）（１９８２年）、モレキュラー　クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ア・ラボラト
リ−マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ）コールドスプリングハーバ−研究所、ニューヨー
ク、に記述されている。このように、ＤＮＡを微生物細
胞から抽出し、制限酵素による消化を行ない、ＤＮＡ断
片を電気泳動にかけ、プラスミドをテーリングとアニー
リングにかけ、ＤＮＡを挿入し、ＤＮＡを再結合させ、
細胞、例えば大腸菌細胞を形質転換し、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、蛋白質を電気泳動にかけ、ＤＮＡの配列決
定をするのは、当業者の技術範囲内にある。

スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ　ＭＮＰＶ）、コリ
ストネウラ・フミフエラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒ
ａ　ｆｕｍｉ−ｆｅｒａｎａＸＣｆ　ＭＮＰＶ）［スミ
ス・ジー及びサマーズ・エム・ディー（１９８１年）Ｊ
、■１ｒｏ１．３９巻＋２５−１３７頁コ、又はスボド
ブテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｕｔｅｒａ　１ｉｔ
ｔｏｒａｌｉｓ）（５１ＮＰＶ）［ハラツブ・ケイ・エ
イ（Ｈａｒｒａｐ。

に、Ａ、）、ペイン拳シー・シー（Ｐａｙｎｅ、　Ｃ，
Ｃ，）及びロバートソンφジエイ・ニス（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｏｎ、　Ｊ、５−）（１９７７年）Ｖ　ｉ　ｒｏ　ｌ
　ｏｇｙ７９巻１４−３１頁］のような他の核ポリヘド
ロシスウイルスく世界保健機構技術報告Ｎｏ、　５３１
を参照）を、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶの
代わりに使用できる。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
ｆ９）の代わりに他の昆虫細胞系統、例えばトリコブル
シア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）［ボルフ
マン会エル・イー（Ｖｏｔｋａｎ、　Ｌ、Ｅ、）及びサ
マーズ・エム舎ディー　（１９７５年）　Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、　１６巻１６３０−１６３７頁］、スボドブテラ
ーｘクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）、
コリストネウラ・フミフエラナ（Ｃｈｏｒｉ−ｓｔｏｎ
ｅｕｒａ　ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）［スミス・ジー及び
サマーズ・エム・ディー（１９８１年）　Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、　３９巻１２５−１３７頁］及びスボドブテラ・
リトラリス［ハラツブ・ケイ・エイ（）ｌａｒｒａｐ、
　Ｋ、Ａ、）ら、（１９７７年）　Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ
７９巻１４−３１頁］も使用できる。

バクロウィルス発現ベクターを使用して、我々はＨＩＶ
エンベロープ基本翻訳生成物ｇｐ１６０を発現させた。

これはポリへドロン遺伝子プロモーターと５′未翻訳領
域とＨＩＶエンベロープ分泌信号配列（第１図）を用い
て発現される。蛋白質生成物は１６０　ｋＤの蛋白質と
して変性ポリアクリルアミドゲル上を移動する。蛋白質
が極端にグリコジル化されていることは、炭水化物特異
的染料の過塩素酸でｇｐ１６０を染色することによって
実証される。エンドグリコシダーゼ、例えばＮ−ＧＬＹ
ＣＡＮＡＳＥＴ”　（ジエンザイム・コープ、マサチュ
ーセッツ州ボストン）で処理後、蛋白質は９６　ｋＤで
変性ポリアクリルアミドゲル上を移動し、全エンベロー
ブボリペブチドに予測される大きさよりやや大きい。組
換えエンベロープ蛋白質は感染昆虫細胞の細胞表面に局
在化されており、細胞膜中の分泌と挿入を示している。

ｇｐ１６０に対する免疫血清を得るために、ヤギを純粋
なｇｐ１６０によって、又はＨＩＶ組換えバクロウィル
スで感染させた丸ごとの昆虫細胞で免疫化した。

助剤は完全なフロイント助剤であった。免疫化用の純粋
なｇｐ１６０蛋白質は、分離用変性ポリアクリルアミド
ゲルから得られた。純粋なｇｐ１６０又はｇｐ１６０を
発現させる昆虫細胞で免疫化したヤギからの血清は、ウ
ェスタンプロット上でｇｐ１６０、ｇｐ１２０、及びｇ
ｐ４１を特異的に結合させる。従って、組換えｇｐ１６
０で免疫化された動物は、ＨＩＶの天然ウィルスエンベ
ロープに対し免疫認識を現わす。

本発明のＨＩＶ蛋白質を使用する免疫化学的検定は、種
々の形態を取りうる。好ましいタイプは固体相免疫検定
である。このタイプの検定では、ＨＩＶ蛋白質は固体相
に固定されて、抗原〜免疫吸着剤を形成する。免疫吸着
剤は、試験しようとする試料と一緒に培養される。適当
な培養朋間後、免疫吸着剤を試料から分離し、標識つき
抗（ヒトＩｇＧ）抗体を使用して、免疫吸着剤に結合さ
れたヒトの抗ＨＩＶ抗体を検出する。免疫吸着剤と結び
ついた標識の量を陽性・陰性の対照群と比較すると、抗
）１１Ｖ抗体が存在するか不存在かについて評価できる
。

免疫吸着剤は、精製ＨＩＶ蛋白質を固体相に吸着又は結
合させることによってつくられる。固体相は、ガラス、
ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、又は他
の材料で形成されたビーズなど、種々のものを使用でき
る。他の適した固体相は、これらの材料からつくられる
か、これらで被覆された管又はプレートを包含する。

ＨＩＶ蛋白質は、アミドやエステル結合経由の共有結合
のような技術や吸着によって、共有又は非共有的に固体
相へ結合できる。ＨＩＶ蛋白質が固体相へ固定された後
、固体相を動物蛋白質、例えζ１３ｚ魚ゼラチンで後被
覆できる。これは免疫吸着剤表面への蛋白質の非特異的
吸着を減少させるような封鎖蛋白質を提供している。

次に免疫吸着剤を、抗ＨＩＶ抗体について試験しようと
する試料と一緒に培養する。血液検査では血漿又は血清
を使用する。血漿又は血清を正常な動物の血漿又は血清
で希釈する。希釈血漿は、抗（ヒト　（ｇＧ＞抗体源で
あ丙同じ動物種に由来して１１）る、好ましい抗（ヒト
１ｇＧ）抗体はヤギの抗（ヒトＩｇＧ）抗体である。こ
のように、好ましい態様では、希釈剤はヤギの血清か血
漿である。

培養条件、例えばｐＨと温度、また培養期間は臨界的な
ものではない。これらのパラメータは定常的な実験によ
って最適化できる。概して、培養はｐＨ７−８の緩衝液
中で約４５℃、１２時間行なわれる。

培養後、免疫吸着剤と試料を分離する。分離は、沈降又
は遠心分離のような慣用の分離技術によって実施できる
。次に干渉物質を排除するために、免疫吸着剤を洗って
試料を含まないようにすることができる。

免疫吸着剤に結合されたヒト抗体を検出するには、免疫
吸着剤を標識つき抗（ヒト　ＩｇＧ）抗体（トレーサー
）と−緒に培養する。一般に、抗（ヒトＩｇＧ）抗体源
として働く動物種の少ｆｆ１（約１％）の血清又は血漿
を含有する標識つき抗（ヒト　ＩｇＧ）抗体溶液と一緒
に免疫吸着剤を培養する。抗（ヒト　ＩｇＧ）抗体は任
意の動物源から得られる。しかし、ヤギの抗（ヒト　Ｉ
ｇＧ）抗体が好ましい。抗（ヒト　ＩｇＧ）抗体は、ヒ
トＩｇＧのＦｃ断片に対する抗体、例えばヤギ抗（ヒト
　ＩｇＧ）Ｆｃ抗体でありうる。

抗（ヒトＩｇＧ）抗体又は抗（ヒト　ＩｇＧ）Ｆｃ抗体
を、放射性物質、例えばヨウ素１２５　（、＋２５１）
で；蛍光材料のような光学的標識で；又はワサビダイコ
ンペルオキシダーゼのような酵素で標識をつけることが
できる。抗ヒト抗体をバイオタイニレートして、標識つ
きアビジンを用いて免疫吸着剤へのその結合を検出する
こともできる。

Ｗ識つき抗体と共に培養後、免疫吸着剤を溶液から分離
し、免疫吸着剤と結びついた標識を評価する。標識の選
択にもよるが、評価は種々の方法で行なうことができる
。標識が放射性ガンマ放出体である場合はガンマカウン
ターで、蛍光材料の場合は蛍光計で、標識を検出できる
。酵素の場合には、標識検出は酵素用基質を使用して、
比色法で行なうことができる。

抗ＨＩＶ抗体の存在を決定するためには、免疫吸着剤に
結びついた標識量を陽性及び陰性対照群と比較する。対
照群は、一般に試験試料と同時に処理される。陽性対照
は抗ＨＩＶ抗体を含有する血清である。陰性対照は、抗
ＨＩＶ抗体を含有しない健序な人々からの血清である。

便宜上と標準化のため、免疫検定実施用の試薬を検定キ
ットにまとめることができる。血液検査キットは、例え
ば以下を、包含する。

（ａ）免疫吸着剤、例えばＨＩＶ蛋白質で被覆されたポ
リスチレンビーズ；（ｂ）血清又は血漿試料用の希釈剤、例えば正常なヤギ
血清又は血漿：（Ｃ）抗（ヒト　ＩｇＧ）抗体、例えば約Ｈのヤギ血清
又は血漿を含有する緩衝水溶液中のヤギ抗　（ヒトＩｇ
Ｇ）抗体；（ｄ）陽性対照、例えば新規なＨＩＶ蛋白質の少なくと
も一つに対する抗体を含有する血清；及び（ｅ）陰性対
照、例えば新規なＨＩＶ蛋白質の少なくとも一つに対す
る抗体を含有しない健康な人々からの保存血清。

標識が酵素の場合は、キットの追加分は酵素用基質であ
りうる。

もう一つのタイプの抗ＨＩＶ抗体検定は抗原サンドイッ
チ検定である。この検定では、抗（ヒトＩｇＧ）抗体の
代わりに標識つき］［１ｖ蛋白質を使用して、免疫吸着
剤に結合された抗ＨＩＶ抗体を検出する。

この検定は、原則として抗体分子の二価性に基づいてい
る。抗体の一つの結合位置が、固体相に固定された抗原
と結びつく。第二位置は標識つき抗原を結合させるのに
利用できる。検定手順は免疫検定で述べたものと本質的
に同じであるが、但し試料と一緒に培養後、免疫吸着剤
を標識ＨＩＶ蛋白質溶液と一緒に培養する。このタイプ
の検定のため、ＩＩ　Ｉ　Ｖ蛋白質放射性同位元素、酵
素等で標識をつけることができる。

第三の形式では、抗原−抗体の相互作用に干渉せずにｌ
、ｇＧ分子のＦｃ断片に結合する細菌蛋白質の蛋白質Ａ
を標識つきトレーサーとして使用して、免疫吸着剤に吸
着された抗ＨＩＶ抗体を検出できる。

蛋白質Ａに、放射性同位元素、酵素又は他の検出可能な
種で容易に標識をつけることができる。

ＨＩＶ蛋白質を使用する免疫化学的検定は、丸ごとの（
又は破砕した）ウィルスを使用するものより幾つかの利
点をもっている。ＨＩＶ蛋白質に基づく検定は、増殖す
る多量の感染性ウィルスや細胞培養とウィルス生産に関
連する固有の多様性に対する懸念を軽減しよう。更に、
検定は病院や診療所、血液銀行で試験を行なう技能者が
もつエイズら患の現実的ないしは感覚的恐れを緩和する
助けになるだろう。

本明細書に明らかにされたＨＩＶ蛋白質の一つ以上、及
び抗原性をもつその変異型を含むワクチンは、この技術
で周知の手順によってつくることができる。例えば、こ
のようなワクチンを注６１液、例えば液体溶液や懸濁液
として調製できる。注射に先立って液体中の溶液又は懸
Ｓ液とするための固体型もＩＷｆＪｌできる。任意に製
剤を乳化することもできる。活性抗原成分を、活性成分
と相溶性のある薬学的に受け入れられる賦形剤と混合で
きる。

適当な賦形剤の例は水、食塩水、デキストロース、グリ
セロール、エタノール等、及びそれらの組合わせである
。更に所望により、ワクチンは少量の湿潤剤や乳化剤、
ｐＨｍ衝剤のような補助的物質やワクチンの有効性を強
化する水酸化アルミニウムやムラミルジペプチドのよう
な助剤を含有できる。

このような助剤は、水酸化アルミニウム、スレオニル−
ムラミルジペプチド［アリソン・エイ・シー（Ａｌｌｉ
ｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，）ら、「免疫助剤−その効力と安全
条件」アール・ジエイ・ナービグら編、Ａｄｖ、１ｎＣ
ａｒｒｉｅｒｓ　ａｎｄ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｆｏｒ
　　Ｖｅｔ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ。

アイオワ州立大学出版局（１９８６年）］、又は免疫刺
激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）［モレイン・ビー（Ｍｏｒｅ
ｉｎ、Ｂ、）ら、（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ　３０８
巻４５７−４６０頁コを包含する。ワクチンを注射で、
例えば皮下又は筋肉内に非経口投与するのが好都合であ
る。他の投与方式に適した追加の処方剤は、座薬、また
ある場合には経口処方剤である。座薬には、伝統的な結
合剤及び担体、は例えばポリアルキレングリコール又は
トリグリセリド類を包含する。座薬は、約０．５Ｘない
し約ｌＯχ、好ましくは約１％ないし約２ｚの範囲の活
性成分を含有する混合物から形成できる。経口処方剤は
、例えば製薬等級のマニトール、乳糖、澱粉、ステアリ
ン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース
、炭酸マグネシウム等のような通密使用される賦形剤を
包含できる。これらの組成物は溶液、懸ｉｉｉ液、錠剤
、丸薬、カプセル剤、持続放出処方剤、又は散剤の形を
取り、約１０χないし約９５％、好ましくは約２５２な
いし約７０χの活性成分を含有できる。

蛋白質を中性型又は塩型としてワクチンに処方できる。

薬学的に受け入れられる塩類は、（ペプチドの遊離アミ
ノ基で形成される＞ｒｍ付加塩類と、例えば塩酸や燐酸
のような無機酸、又は酢酸、修酸、酒石酸、マンデル酸
等のような有機酸によるものを包含する。遊離カルボキ
シル基で生成する塩類は、例えば水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム
、又は水酸化第二鉄のような無機塩基から、及びイソプ
ロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエ
タノール、ヒスチジン、プロ力イン等のような有機塩基
からも誘導できる。

ワクチンは適量処方剤と両立できる形で、また治療上有
効で免疫原性であるような量で投与される。投与量は処
置を受ける被験者、抗体を合成する被験者の免疫系の能
力、及び望んでいる保護程度に左右される。投与される
活性成分の正確な必要量は実施者の判断に依存しており
、各個人に特有である。しかし、適した適量範囲は、−
人当たり活性成分数百マイクログラムのオーダである。

最初の投与と追加投与量に適した投薬量は可変であるが
、典型的には最初の投与に続いて１週間ないし２Ｒ間の
間隔で二度目以降の投与を行なう。

ＨＩＶはエンベロープ遺伝子内ｉこおいて、アミノ酸配
列の変動を受けることが知られている［スターシッチ・
ビー・アール（Ｓｔａｒｃｉｃｈ、　Ｂ、Ｒ，）（１９
８６年）Ｃｅｌｌ　４５巻６３７−６４８頁；バーン・
ビー拳エッチ（Ｈａｈｎ、　Ｂ、ｌ（、）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　２３２巻１５４８−１５５３頁１．　１００以上の
変異型が分子クローン化及び制限酵素認識分析によって
分析され、またこれらの幾つかはヌクレオチド配列決定
によって分析された。これらの幾つかはＲＦ［ボボビッ
ク・エム（Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ、）ら、（１９８４年
）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻４９７−５００頁コ、ＷＭ
Ｊ−１［バーン・ビー舎エッチ（Ｈａｈｎ、　Ｂ、Ｈ，
）ら、（１９８６年）Ｓｃｉ−ｅｎｃｅ　２３２巻１５
４８−１５５３頁］、ＬＡＶ　［ウニイン＝ホブソン・
ニス（Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、　Ｓ、）ら、（１９８
５年）Ｃｅｌｌ　４０巻９−１７頁］及びＡＲＶ−２［
サンチェス＝ペス、カドル・アール（Ｓａｎｃｈｅｚ−
Ｐｅｓｃａｄｏｒ、　Ｒ，）ら、（１９８５年）Ｓｃ　
ｉ　−ｅｎｃｅ　２２７巻４８４−４９２頁］として知
られるＨＩＶ分離体である０本発明は一つのＨＩＶ分離
体、２変異型、及び２変異型間の１ハイブリツド型ポリ
ペプチドについて記述しているが、本明細書に記述され
た手順を使用して、任意のＨＩＶ分離体の適当なエンベ
ロープ領域をつくることができる。異なるウィルス分離
体からのＨＩＶ蛋白質を、上で明らかにされたようにワ
クチン製剤に使用して、異なるＨＩＶ分離体による感染
を防ぐことができる。更に、一つ以上のＨＩＶ分離体を
用いてワクチン製剤をつくると、エイズに対する免疫が
提供され、いっそうすぐれた予防となる。

本発明のＨＩＶ蛋白質は、ＢＯＣやＦＭＯＣのような固
体相ペプチド合成技術によって化学的に合成できる［メ
リフィールド・アール・ビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、
　Ｒ。

Ｂ、）（１９６３年）Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　
Ｓｏｃ、　８５巻２１４９頁；チャン・シー（Ｃｈａｐ
、　Ｃ，）及びマイエンホーファーψジェイ（Ｍｅｉｅ
ｎｈｏｆｅｒ、　Ｊ、）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、１１巻２４６頁］。

この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列は、Ｄ
ＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝暗号
の重剰性のため、すなわち蛋白質をつくるのに使用され
るアミノ酸のほとんどに対して一つ以上のコードするヌ
クレオチドトリプレット（コドン）を使用できるため、
異なるヌクレオチド配列が一つの特定アミノ酸に対して
コードできる。このため、遺伝暗号を次のように描くこ
とができる。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴＫロイシン（Ｌ
ｅｕ　）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（Ｉｌｅ
）　　　　　ＡＴＭメチオニン（Ｎｅｔ）　　　　　　
ＡＴＧバリン（Ｖａ　Ｉ　）　　　　　　　　　ＧＴＬ
セリン（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳプロリン（
Ｐｒｏ）　　　　　　　　ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）
　　　　　　ＡＣＬアラニン（Ａｌａ）　　　　　　　
ＧＣＬチロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　’　　ＴＡＫヒ
スチジン０１ｉｓ）　　　　　　ＣＡＫグルタミン（Ｇ
ｌｎ）　　　　　　ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ）　　
　　　ＡＡＫリジン（Ｌｙｓ）　　　　　　　　　ＡＡ
Ｊアスパラギン酸（Ａｓｎ）　　　　ＧＡＫグルタミン
酸（Ｇｌｕ）　　　　　ＣＡＪシスティン（Ｃｙｓ）　
　　　　　ＴＧＫトリプトファン（Ｔｒρ）ＴＧＧアルギニン（Ａｒｇ）　　　　　　ＩＩＩＧＺグリシン
（Ｇｌｙ）　　　　　　　　ＧＧＬ終結信号　　　　　
　　　　ＴＡＪ終結信号　　　　　　　　　ＴＧＡ解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ絹は、
左側に５′末端、右側に３′末端をもつ伝令ＲＮＡのト
リヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｍＲＮＡの
配列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである０文字はデ
オキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジ
ン塩基を示す。

Ａ＝アデニン６＝グアニンＣ＝シトシンＴ＝チミンＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ１ＹがＣまたは
Ｔの場合は、Ｘ＝Ｃ。

ＸがＣ（７）場合は、Ｙ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。

ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ。

２がＡ又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はＡ。

ＺがＣ又はＴの場合は、ｔｙ＝ｃ。

ＶがＣ（７）場合は、Ｚ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。

−がへの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ。

ＳがＡ、　Ｇ、　Ｃ又はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ，又は
その変わりにＳがＴ又はＣの場合は、ＱＲ＝ＡＧ。

Ｊ＝Ａ又はＧに＝Ｔ又はＣＬ＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ又はＧ。

門＝Ａ、　Ｃ又はＴ。

上記は、本発明のＨＩＶタンパクの新規なアミノ酸配列
が、本明細書で明らかにされたもの以外のヌクレオチド
配列によって調製できることを示す。

これらのＨＩＶタンパク、又はＨＩＶの抗原活性又は免
疫原活性又は治療活性をもつその断片、の新規なアミノ
酸配列をコードした機能的に同等なヌクレオチド配列を
、既知合成手順によってつくることができる。従って、
本発明はこのような機能的に同等なヌクレオチド配列を
包含する。

このように、本発明の範囲は本明細書に記述された特定
的なヌクレオチド配列のみならず、実質的に同じＨＩＶ
抗原活性又は免疫原活性又は治療活性をもつ分子をコー
ドしたすべての同等なヌクレオチド配列をも包含してい
る。

更に、本発明の範囲は明らかにされた特定的なアミノ酸
配列を含むだけでなく、特異的なＨＩＶ抗体類の形成を
誘発し、これらに結びつく相当な能力をもつタンパク又
はタンパク断片をコードした′類似の配列をも含める意
図がある。

「均等」という用語は、通常の特許用語としての用法の
とおりであって、本質的に同じ種類のホスト中で、実質
的に同じＨＩＶ抗原活性又は免疫原活性又は治療活性を
もった分子をつくることについて、本明細書で確認され
ているヌクレオチド配列のように実質的に役目を果たす
ようなヌクレオチド配列を指すのに用いられている。こ
の定義の範囲には、ＨＩＶの抗原活性又は免疫原活性又
は治療活性をもった二次断片も含まれる。

上で明らかにされたように、微生物的な方法によってＨ
ＩＶタンパクをつくるために、本発明のＨＩＶの抗原活
性又は免疫原活性又は治療活性をコートしたヌクレオチ
ド配列を使用することは、遺伝子工学の当業者に周知で
ある。発現ベクターへ配列を融合し、真核生物（酵母又
は哺乳類細胞）か原核生物（細菌細胞）のホストへの形
質転換ないしトランスフェクションを行なわせるのは、
他の周知のタンパク類、例えばインスリン、インターフ
ェロン、ヒト成長ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ−２等をつ
くるのに使用される標準手順である。本発明に従って、
微生物手段又は、ａｍ培養技術によって（１１■タンパ
クをつくるために、同様な手順又はその明白な変法を使
用できる。

本明細書で明らかにされたヌクレオチド配列は、この技
術で周知の手順により、°“遺伝子機械”によってつく
ることができる。これは、ヌクレオチド配列の開示のゆ
えに可能である。

以下は最良の態様を含めて本発明を例示するための実施
例である。これらの実施例は限定的に考えられてはなら
ない。他に注意がなければ、溶媒混合物の割合はすべて
容量による。

昆虫細胞からのｇｐｔｅ０の生産についての開示は次の
五つの部分を包含している。

（１）　ｇｐｔｅ０をコードしたプラスミドｐＡｃＨＴ
３の構築；（２）　５ｆ９（スポドプテラ・フルギペル
ダ）昆虫細胞へのこのプラスミドのトランスフェクショ
ン；り３）組換えバクロウィルスの単離；（４）感染と感染細胞の生育；及び（５）組換えｇｐｔｅ０の精製。

実施例１　プラスミド構築ｇｐｔｅ０をコードしたプラスミドの構築を第１図ｔこ
示す、この構築の出発プラスミドζよｐＳＰ６４であり
、これは北部研究センター〇ＡＲ５特許培養基保存施設
［（６１６０４）合衆国イリノイ州ビオ瞥ノア、ユニノ
て一シティ・ストリート１８１５］ζビ寄託されて０た
。

この寄託物に受託施設から指定された呼出し番号はＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１８１５０であり、寄託期日は１８６４年１
２月４日であった。構築を次のように行なった。

１、　　ｇｐｔｅ０のカルボキシル末端の切片をコード
しりＤＮＡ断片は、ｐＳＰ６４をＨｇ１Ａｌ及びＸｈｏ
ｌテｔＦ１（ヒさせることによって単離された。生ずる
２２７９塩基文１（ｂｐ）の断片はエンベロープ遺伝子
内部力）らｇｐｔｅ。

翻訳終結コドンの先まで伸びており、これを標準手順に
よってアガロースゲルから単離した。その代わりに、こ
の遺伝子を合成することもできる。

配列は以下の文献に列挙されている。ラトナー・エル（
Ｒａｔｎｅｒ、　Ｌ、）ら、（１９８５年）Ｎａｔｕｒ
ｅ　３１３巻２７７−２８４巻；スターシッチφビー・
アール（１９８ａ年）　Ｃｅ１１４５巻６３７−６４８
頁；バーンΦビーφエッチ（Ｈａｈｎ。

Ｂ、Ｈ，）ら（１９８６年）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２
巻１５４８−１５５３頁；ウェイン＝ホブソン会ニスら
、（１９８５年）　Ｃｅ１ｌ　４０巻９−１７頁：及び
サンチェス＝ペスカドル・アールら、（１９８５年）　
５ｃｉｅｎｃｅ　２２７巻４８４−４９２頁。

２、　　ｇｐｔｅ０のアミノ末端領域をコードしたＤＮ
Ａは、ｐＳＰ６４をＨｚｉＡＩとＳｓｐ　ｌで消化させ
、生ずる４５７　ｂｐの断片を精製することによって単
離された。この断片を次にＭｂｏ　ＩＩで消化させると
、エンベロープ出発コドンからすぐ上流が開裂する。　
４０３　ｂｐの断片を標準手順によってゲル精製した。

３４　　次の合成二本鎖オリゴヌクレオチドは、６鎖を
独立に合成し、これらを１２１ポリアクリルアミドゲル
から精製することによって構築された。

１００℃に加熱し、氷水での急速冷却によって、鎖をア
ニールした［ロッジら、（１９８２年）Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ。

２５７巻９２２６−９２２９頁］。

４、手１１［［１−３から得られた二本鎖ＤＮＡの３断
片の全量を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再結
合させた。混合物をＥｃｏＲＩとＸｈｏｌで消化させ、
生ずる２６９８　ｂｐの断片を標準手順によってゲル精
製した。

５、プラスミドｐＵｃ１９にニューイングランド・バイ
オラボ、マサチューセッツ州ビバリー）をＥｃｏＲｌと
５ａｌｌで消化させ、２．７　ｋＢの大きな断片を上の
ようにゲル精製した。　ＥｃｏＲＩと５ａｌｌ部位を含
んているρＢＲ３２２のような任意の大腸菌プラスミド
クローン化ベクターを使用できる。

６、上の４と５からの断片を再結合し、混合物を大腸菌
ＪＭ１０３の形質転換に使用した。大腸菌Ｊ旧０３の代
わりに、ニューイングランド−バイオラボから入手でき
る他の大腸菌ホストを使用できる。アンピシリン耐性コ
ロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを標準手順によって
単離し、適当な制限パターンを２６９８　ｂｐの断片挿
入によって確認した。

７、　このプラスミド（ｐＥｃ１６０）をＥｃｏＲｔ、
Ｐｓｔ　ｌ及び８４＋１の組合わせで消化し、生ずる２
、７　ｋＢ断片を標準手順によってゲル単離した。

８、　プラスミドρＡｃ６１０（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１
５１）をＥｃｏＲｌとＰｓｔｌとで消化し、３、ｐＡｃ
ＨＴ６、ｐＡｃＨＴ７、２００　ｂρの断片を上のよう
にゲル単離した。

９、上の手順７と８から生ずる断片を再結合し、大腸菌
Ｊ旧０３のコンピテント細胞の形質転換に使用した。他
の大腸菌ホストも使用できる。

＋０．　１）ＡｃＨＴ３と指定されるこのプラスミドの
身元を確認するために、制限酵素による消化を行ない、
既知の塩化セシウム勾配遠心分離を用いて、このプラス
ミド数百マイクログラムを精製した。

実施例２　　ｐＡｃＨＴ３によるＳｆ９毘虫線虫細胞ラ
ンスフェクション以下の手順は、昆虫細胞株Ｓｆ９を使用し、またバクロ
ウィルスのオートグラファ・カリフォルニカ核ポリヘド
ロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用する方法である。

この細胞系とこのウィルスを生育させ、仕上げるための
標準プロトコルは、「バクロウィルスベクタ一方法と昆
虫培養基手順マニュアル」エム・ディー・サマーズ及び
ジー・イー・スミス、テキサス農業試験所報告Ｎｏ、１
５５５　（テキサス州カレッジステーション、１９８６
年）に記述されている。

１、　５ｆ９４Ｉ胞を２５　ｃｍ２フラスコに、フラス
コ当たり２．５ｘ１０６個の密度で植え付け、フラスコ
表面に付着させた。このときＨＥＢＳ／ＣＴ及びＣａＣ
Ｉ　２溶液を室温まで暖めた。ＨＥ８Ｓ／ＣＴの１０Ｘ
原液１００　ｍｌを次のように予め用意した。

１．３７Ｍ　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　８．０３０
．０６Ｍ　Ｄ（１）グルコース　　　　１．０８１　ｇ
ｏ、０５Ｍ　ＫＣＩ　　　　　　　　　　　０．３７３
　ｇｏ、００７Ｍ　　ＮａｚＨＰＯ＋４Ｈ２０１，１Ｂ
Ｈｇｏ、２Ｍ　ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロ　　　　
４．７６６　ｇキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ＣａＣ１２ｍ液は２．５Ｍであった。

２、培地をフラスコから除き、ブレース・アンセラエア
培地（ギブス・ラボラトリーズ、ニューヨーク州グラン
ドアイランド）に１０Ｘ生胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物
質（ジエンタマイシン５０μｇ／ｍｌとアンフォテリシ
ンＢ　［ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ、イー−７−）Ｌ、−スキ
ップ・アンド・サンズ社、ニューシャーシー州プリンス
トン］）を加えたもの２１と置き換えた。

次にこれらのフラスコを室温で保存した。

３、　　ＡｃＮＰＶ−Ｅ２　ＤＮＡＩμｇとｐＡｃＨ７
３Ｍ換えプラスミドＤＮＡ２μｇを管内で混合した。

４、　１Ｘ　ＨＥＢＳ／ＣＴ液９５０μ８をＤＮＡ管に
加え、渦状に振った。

５、　　ＤＮＡ／ＨＥＢＳ／ＣＴ混合物に２．５Ｍ　Ｃ
ＣａＣｌ２５０Ｊｉを加え、再び渦状に撮り、室温で３
０分培養した。

６、　　ＤＮＡ／■εＢＳ／ＣＴ液を細胞培養基フラス
コ中のブレース培地に添加した。

７、　フラスコを２７℃で４時間培養した。

８、次に培地をパスツールピペットでフラスコから除い
た。新しいブレース培地に１０χＦＭＳと抗生物質を加
えたものでフラスコを注意深くゆすいでから、ＴＮＭ−
ＦＨ（ブレース培地に４リツトル当たり１３゜３２８の
ＴＣイーストレート［ディフコ、ミシガン州デトロイト
］と４リツトル当たり１３．３２　ｇのラクトアルブミ
ン加水分解生成物［ディフコ］、それに１０χＦＢＳと
抗生物質を加えたもの）５　ｍｌに１０％ＦＢＳと抗生
物質を加えたものを添加した。

９、次に培地を２７℃で４−６日間培養し、インバーテ
ツド顕微鏡によって感染の兆候を求めて細胞を定期的に
検査した。

実施例３　　ｇｐ１６０をコードした組換えウィルスの
、ＤＮＡハイブリッド形成による単離と確認１、平底の
９６穴微量滴定プレートにＳｆ９細胞１００μ！を１当
たり１．５ｘ１０５個（ｌ大当たり１．５Ｘ１０４個）
の密度で植え付けた。

２、　５ｆ９細胞を湿気条件下に２７℃で２−３日間培
養した。

３、培地を別の９６穴プレートに取り出し、４℃で保存
又は−２０℃で冷凍した。

４、　０．５Ｎ　Ｎａ１ｌ　２００μＩを添加し混合す
ることによって、細胞を穴の中で溶かした。

５、　１ｌＭ酢酸アンモニウム２０μｍを添加し混合す
ることによって、溶液を中和した。

６、次に溶解物をドツトプロット（バイオラド研究所、
カリフォルニア州すッチモンド）中でニトロセルロース
フィルター上に次のようにスポットした。

（ａ）ニトロセルロースの一片とワットマン３ＭＭ紙（
ワットマン・ラボラトリ−・プロダクツ社、ニューシャ
ーシ−Ｈりリフトン）を−ｔの大きさに切り、ニトロセ
ルロースを熱湯で湿潤させ、両方を団酢酸アンモニウム
と０．０２Ｍ　ＮａＯＨで平衡化した。

（ｂ）プロッティング装置を、そのメーカーの指示どお
りに絹み立てた。ニトロセルロースをワットマンろ紙で
下から支えた。

（Ｃ）穴を１Ｍ酢酸アンモニウムでゆすいだ。穴はいず
れも液をろ過せねばならない。

（ｄ）溶解物をマニホルドに適用した。

（ｅ）穴を１Ｍ酢酸アンモニウムでゆすいだ。

（ｆ）　ニー　）　０−１＝／ＬＯ−１ヲ除イテ、４Ｘ
　５ＳＣ（ＩＸ　５ＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、　Ｑ
、０１５Ｍ　＜えん＠Ｎａ、　ｐＨ７，０）中で短時間
（２分間）洗った。

７、フィルターを空気乾燥し、真空下に８０℃で２時間
項いた。

８、　　ｇｐ１６０をコードした遺伝子のＪｔＡＩから
Ｘｈｏ１位置までの３２ｐで標識したＤＮＡ断片と、こ
の材料とをハイブリッド形成させた。

９、　　ｇｐ１６０遺伝子を含有した候補ウィルスを標
準手順によって確認した。

１０、　　純粋なりローンを確保するために、出発物と
して元の陽性穴の上澄み液を用いて、上の組換えウィル
ス確認法をくり返し、ウィルスを１０７及び１０６の希
釈度で穴に適用した。

Ｉｌ、　　ｇｐ１６０をコードした純粋なウィルスを１
′４るために、必要に応じて上の段階をもう一度くり返
した。このウィルスをＨＴ３と指定した。ウィルス滴定
値は前掲スミスとサマーズに記述されたとおりに決定さ
れた。

実施例４　　）ＩＴ３による感染と培養昆虫細胞の生育
１、　　ｍ胞を数えて、ｌ０ＸＦＢＳと抗生物質を適当
な密度で加えたＴＮＭ−Ｆ）Ｉ培地を含有するフラスコ
又はプレートへ接種し、３０分ないし１時間フラスコ又
はプレートへ付着させた。

２、細胞を付着させた後、培地を除き、ウィルスを３の
感染多重度（ＭＯ１）で添加した。

３、細胞を２７℃で１時間培養した。

４、接種材料を除き、上の培地でゆすぎ（任意付加的）
、新しい完全な培地（ＴＮＭ−ＦＨ＋　１０χＦＢＳ　
＋抗生物質）を加えた。

５、培養基を２７℃で２−４日閏培養し、毎日検査した
。

６、細胞ペレットをｇｐ１６０の精製に使用した。

実施例５　組換えｇｐ１６０の回収とその本質的に純粋
な形への精製１、培地中の細胞３００　ｍｌを遠心分離（３，０００
ｘｇ。

ｌＯ′）にかけ、燐酸で緩衝された食塩水２０１で１回
洗い、細胞を遠心分離で集めた。

２、　　ＣＭＳＴ緩衝液［０，０３Ｍ　トリスｐＨ７，
５，０，ＯＩＭ酢ｍＭｇ、　ｌＸＮ０ＮＩＤＥＴ　Ｐ−
４０［シｒル（テキｆス州ヒユーストン）からの非イオ
ン性表面活性剤］２０１中に細胞をピペット操作と渦形
成によって再懸濁した。

３、　　ｍ胞を３，０００　ｒｐｍで５分間にペレット
化した。

４、細胞を５分間の渦形成によって８Ｍユリア緩衝ｉα
２０１に再ｔｌ！濁した（８Ｍユリア、２０ｍＭ　トリ
スｐＨ７，５，１５ｍＭ　２−メルカプトエタノールＩ
ｌ：ＢＭＥコ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴ
Ａ］、Ｉｎ＋Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル［ＰＭ
ＳＦ］）。

５、細胞を８，０００　ｒｐｍで５分間遠心分離した。

６、上澄み液を傾斜させ、ペレットをＯ，ｌＸドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）４　ｍｌ中に再懸濁した。

３、ｐＡｃＨＴ６、ｐＡｃＨＴ７、　　２Ｘ　ＳＯ５負
荷緩衝液の同量を加え、５分間沸騰させ、７．５＄５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（１８ｘ１６　ｘ　Ｏ，３
ｍｎ１）上で（７５ａ＋Ａで約５−６時間又は２０ｍＡ
で一夜）操作した。

８、　　ｇｐ１６０タンパクを視覚化するために：ａ）
ゲルを氷冷した０、２５ＭにＣ１中のプレート上に１５
分装いた（冷蔵庫又はできれば冷凍庫）。

ｂ）ゲルを取り出し、５ＡＲＡＮラツプ〈ダウケミカル
社、ミシガン州ミツドランド）で包み、４℃で一夜放置
した。

Ｃ）タンパク帯が白く現われ、ｇｐ１６０が約１６０　
ｋＤで移動した。

９、　　ｇｐ１６０帯をゲルから切出す。

１０、　　ゲルを２０ｍＭ　）リスｐＨ７，５，０，団
ＮａＣｌ、及び０．１ＸＳＤＳ中に浸すことによって、
ｇｐｌＧｏをゲルから溶離すると、本質的に純粋なｇｐ
１６０タンパクが得られる。

実施例６　クローンｐＡｃＨＴ７、すなわちＨＩＶ変異
型ＲＦのｇｐｔｅ。

変異型ＲＦからのｇｐｌＧｏのクローニング［ボボビッ
ク・エムら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻
４９７−５００頁］は、出発点として実施例１、Ｎｏ、
７に記述されたプラスミド（１）ＥＣ１６０）を使用し
て容易に得られた。

このプラスミドは、実施例！、Ｎｏ、８−１０に述べた
ように、バクロウィルス発現ベクターｐＡｃ６１０への
二次クローニング用に必要な結合位置を既にもっている
。ＲＦからのｇｐ１６０配列を挿入するために、二遺伝
子内の特異な制限酵素位置を下記のように使用した。

プラスミドｐＥｃ１６０をＯｒａｍとＡｖａ　Ｉで消化
させ、２断片の大きい方、３６００　ｂｐ、を標準手順
によってアガロースゲルから単離した。この断片はｐＵ
ｃ１９配列の全部、並びにＤｒａｎ１位置までのｇｐｌ
ＧｏのＮ末端アミノ酸とＡｖａ　Ｉの先のＣ末端アミノ
酸を含んでいる。ｇｐ１６０遺伝子の主要部分は、ＨＩ
Ｖ変異型ＲＦのゲノムクローンの消化によって得られた
。ＲＦエンベロープ遺伝子からの１８２８　ｂｐ断片を
Ｄｒａｍ　／Ａｖａ　１消化及び標準アガロースゲル手
法によってつくった。この断片はエンベロープ遺伝子の
主要部分を含有し、ＲＦの変異型アミノ酸のＢＨχをも
っている。

これらの断片を一緒に再結合し、混合物を使用して大腸
菌Ｊ旧０３を形質転換させた。アンピシリン耐性コロニ
ーを選択し、プラスミドＤＮＡを標準手順によって単離
した。

１８２８　ｂｐ断片の挿入は、適当な制限酵素による消
化で確認された。このプラスミドｐＨＴ７を実施例！、
Ｎｏ、７、゛の記述のとおりに消化し、実施例１のＮｏ
。

８．９及び１０の記述のとおりにｐＡｃ（３１０へクロ
ーン化した。このプラスミドはｐＡｃＨＴ７と指定され
る。このプラスミドで発現されるＨＩＶタンパクのアミ
ノ酸配列を第１表に示す。このタンパクをコードした口
ＮＡ配列を第２表に示す。

実施例７　クローンｐＡｃｌｌＴ６、すなわちＨＩＶ変
異型０Ｈ１０とＲＦとからのハイブリッド型ｇｐ１６０
ＨＩＶ変異型ＢＨ１０とＲＦからのハイブリッド型エン
ベロープ遺伝子のクローニングを次のように行なった。

プラスミドｐＥｃ１６０を出発クローンとして使用して
、バクロウィルスベクターρＡｃ６１０への二次クロー
ニングに必要な連鎖と、ＨＩＶ変異型ＢＨ１０からのエ
ンベロープ配列とを得た。　ｐＥｃ１６０は二つのＢｇ
Ｉｎ位置をもち、いずれもｇｐ１６０遺伝子内にある。

ｐｌＪｃ１９の全部と１．ｇｐｔｅ０の全コード配列の
最初と最後の１／３を含んだ大きい方の断片４８００　
ｂｐを、標準手順によってアガロースゲルから単離した
。

ＲＦゲノムクローンのエンベローブ二次クローンをＢｇ
Ｉｎで同様に消化させ、エンベロープ遺伝子の中心から
の５６５　ｂｐの断片を標準手法によって単離した。こ
の断片を上記のρＥｃｌ１３０８ｇＩ　ＩＩ　４８００
　ｂｐの断片に再結合させ、混合物を大腸菌Ｊ旧０３の
形質転換に使用した。アンピシリン耐性コロニーを選択
し、プラスミドＤＮＡを標準手順によって単離した。ｐ
ＡｃＨＴ７をＲＦ配列の給源として使用できる。

正確な方向づけによる５６５ｂρ断片の挿入は、適当な
制限酵素での消化によって確証された。このプラスミド
ｐＨ７６を実施例１、Ｎｏ、７、の記述のとおりに消化
し、実施例１のＮｏ、８．９及びｌＯの記述のとおりに
ｐＡｃ６１０へクローン化した。このプラスミドはｐＡ
ｃＨＴ６と指定され、昆虫細胞中でハイブリッド型ｇｐ
１６０を発現させるのに適している。このプラスミドで
発現されるＨＩＶタンパクのアミノ酸配列を第３表に示
す。このタンパクをコードしたＤＮＡ配列を第４表に示
す。

ｐＡｃＨＴ６とｐＡｃＨＴ７によるＳｆ９毘虫線虫細胞
ランスフェクションを、ｐＡｃＨＴ３について記述した
とおりに行なった０組換えウィルスを単離し、培養され
た昆虫細胞を感染・生育させることに間するその後の段
階もｐＡｃＨＴ３について記述したとおりである。

［変異型の特徴］クローンｐＡｃＨＴ６とｐＡｃＨＴ７からつくられるｇ
ｐｔｅ。

は、ＳＤＳ　ＰＡＧεでのその分子量が、ｐＡｃＨＴ３
からのｇｐ１６０と同様であり、昆虫細胞でつくられる
これらのタンパクの量は、三つの場合に全部同じである
。

ＨＴ６とＨＴ７をＨＴ３から、また相互に区別するもの
は、それらの免疫学的特徴と抗原性である。変異型から
のｇｐ＋ｅｏクローンは異なるエピトープを示し、これ
を診断並びにワクチン開発に使用できる。キメラ型タン
パクはこれらの双方の応用に使用できる特異なエピトー
プをつくりうる。

［ＨＴ６と）ＩＴ７の免疫学］ｐＡｃＨＴ６からつくられるｇｐ１６０は、エンベロー
プの中心部分がＨＩＶ変異型ＲＦからのものであり、残
りが関係の遠い変異型ＢＨ１０からのものである点て独
特である。このハイブリッド型タンパクはヤギに免疫原
性があることが示され、ＨＴ６に対してつくった抗血清
を、ウィルス中和検定と細胞融合阻止検定によって分析
した。結果は、このハイブリッド型タンパクがＲＦとＢ
Ｈ１０変異型に対する検定に有効であることを示してい
る。

実施例８　昆虫細胞での発現用組換えｇｐ１２０の構築
変異型ＢＨ１０からのｇｐ１２０のクローニングは、プ
ラスミドｌｌＡｃ１１Ｔ３のｇｐ１２０遺伝子の末端（
アミノ酸番号５１１）に終結コドンを導入することによ
って達成された。クローニング戦略の詳細は以下のとお
りである。

［オリゴヌクレオチドの設計］合成りＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶエンベロープ
コドン５０４−５１０に相同で、かつコドン５１０から
下流の３０２塩基の相同性を拾い上げるように設計され
た。ｇｐｌ（ｉｏ遺伝子とオリゴヌクレオチドとの間の
相同の再現を直ちに開始するヌクレオチＦはＴＧＡであ
り、ｇｐ１２０の品後のコドンの後の枠内に停止コドン
を生ずる。特異な制限酵素位置Ｂｓｍ　Ｉは、所望の変
異型の強力な選択を可能とする後段階で重要な、３０２
ｂｐの領域内に生ずる。この実験用にコンピユータ化Ｄ
ＮＡ合成機で合成されるオリゴヌクレオチドの配列は以
下のとおりである。

５′３′ ＧＡＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＴＴＴ
ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡ［オリゴヌクレオチド
の精製とキナーゼ処理１今成サイクルが完成したら、オ
リゴを同量の水酸化アンモニウムにより５５℃で一夜脱
封鎖し、乾燥まで急速真空処理した。最終ペレットをｄ
Ｈ２０（１００μｍ）中に再懸濁し、全量の１１５を８
ｚアクリルアミド／ユリアゲル上で、ブロムフェノール
ブルー　（ＢＰＢ）とキシレンシアツールＦＦ（ＸＣＦ
Ｆ）染料をマーカーとして精製した。ＢＰＢが全行程の
３７４を移動するまで、ゲルを７０ワツトで操作した。

オリゴヌクレオチド帯をＴＬＣプレートと短波Ｕ、Ｖ、
で視覚化した。ゲルからのオリゴの溶離は、ゲルスライ
スを微細な小片に切断し、０．５Ｍ酢酸アンモニウムと
１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）の２倍量を加え、管
を振とうしながら一夜３７℃で培養することによって達
成された。オリゴヌクレオチドをエタノール（ＥＴＯＨ
）で沈殿させ、波長２６０　ｒｖでの吸光度によって分
析した。

オリゴ２００　ｐｍｏｌｅをＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ２単位及び０．０５ｍＭ　ＡＴＰ（最終濃度）との
４０μｍ反応でキナーゼ処理した。

［鋳型調製用の消化物コプラスミドｐＥｃ１６０を、Ｘｎ＋ｎ　Ｉで線状化した
。この酵素は、挿入されたエンベロープ遺伝子から離れ
たｐｌＪｃ１９配列内で切断する。　ｐＥｃ１６０の第
二の消化を制限酵素５ｔｕＩとＢａＩＩＨＩで行なった
。これらはそれぞれ、ｇｐ１６０遺伝子内でプラスミド
を１回切断する。５ｔｕｌはｇｐ１２０／ｇｐ４１の開
裂点から上流であり、Ｂａａ旧はこの地点から下流にあ
る。２断片の大きい方の３７６６　ｂｐは、標準的なア
ガロースゲル手法によって、小さい方の１６３２　ｂｐ
断片から分離精製された。

［鋳型の！ｉｌｌ製］上記のＸｍｎ　Ｉで線状化されたｐＥｃ１６０と３７６
６　ｂｐの断片を使用するヘテロデュプレックス形成は
、Ｓｔｕ１位置とＢａ−旧位置との間のＤＮＡ領域が一
本鎖ＤＮＡとして露出された輪状ＤＮＡ分子をもたらす
。一本鎖ＤＮＡのこのギャップは、ｇｐ１６０遺伝子内
のアミノ酸番号５１１の位置に停止コドンを置くように
設計されたオリゴのハイブリッド形成用鋳型としての役
目を果たす、変異形成実験の詳細は以下のとおりである
。

■、ヘテロデュプレックスの形成Ａ、　Ｘｍｎ１で線状化されたｐＥｃ１６０　（０，４
μｇ＞Ｓｔｕ　Ｉ　／Ｂａｎ＋ＨＩゲル単離された３７
６６　ｂｐの断片０．３５μｓキナーゼ処理されたオリゴヌクレオチド０・２５μｇ１０Ｘポリメラーゼ緩衝液６μｍｄＨ２０最終容量３５μｍまでＢ、上の成分をよく混合し、８μｍアリコートを除去す
る（試料ｌ）。

Ｃ１残り（７）２７μ＋を１００℃に５分、３７℃＋、
ｍ２０分、４℃に２０分加熱し、水浴に移す。第二の８
μｍアリコート（試料２）を除く。

■８重合反応Ａ、残り１９μｍに各０．２５ｍＭの最終濃度のｄｌｌ
ＴＰ類；０．２５１１Ｍの最終濃度のＡＴＰ　；クレノ
フボリメラーゼにューイングランド・バイオラボ、マサ
チューセッツ州ビバリー）１μｍ；Ｔ４リガーゼにュー
イングランド・バイオラボ）１μｍ；及び３２μｍの最
終容量までのｄＨｚＯを添加する。　１６℃で一夜培養
する。各８μｍの２アリコートを除去する（試料３及び
４）。

Ｂ、ポリメラーゼとりガーゼを不活性化する。

削除しようとしている３０２　ｂｐの領域に存在する、
プラスミドに特異的な制限酵素で消化させる。これらの
残りの８μｉずつの２アリコートは試料５と６である。

■、評価Ａ、試料ｌと２を０．８＄アガロースゲル上で操作する
。高分子量ＤＮＡのへテロデュプレックスが存在する場
合は、手順を進める。

Ｂ、試料３と５を０．８χアガロースゲル上で操作する
。ヘテロデュプレックスでアニールされない、Ｘｍｎ　
Ｉで線状化されたＤＮＡを、Ｂｓｍ　Ｉ酵素で２小断片
へ開裂すべきである。変異原性オリゴをアニールさせず
に、ギャップ越しに重合化されるヘテロデュプレックス
ＤＮＡも、Ｂｓｍ　Ｉで線状化される。理論上、変異原
性オリゴを取り入れて正確に形成されたヘテロデュプレ
ックスのみは、Ｏｓｓ　Ｉ酵素用の基質ではない、とい
うのは、この分子上では一本鎖ルーブ中に位置が存在す
るからである。

Ｃ０試料４と６を用いて、大腸菌Ｊ旧０３を形質転換さ
せた。アンピシリン耐性コロニーを両方の形質転換プレ
ートから数えた。試料４からのコロニー数は、試料６か
らのそれより５〜ｌＯ倍多くあるはずである０次に試料
６からのコロニーをアンピシリンに対して選択し、プラ
スミドＤＮＡを標準手順によってつくった。

ＩＶ、ｐ）ＩＴ５の選抜と単離Ａ、同じ細胞内に野性型と変異型ＤＮＡを明瞭に示す制
限酵素位置を選択した。これは、ヘテロデュプレックス
分子の複製が一貫してループアウトした断片（ｌｏｏｐ
ｅｄ−ｏｕｔ　ｓｅｇｍｅｎｔ）の修復に先立って起こ
るためである。３０２塩基削除の選択には、削除領域に
接する制限酵素位置５ｔｕｌとＨｉｎｄｍを選択した。

野性型と変異型双方に予測されるパターンは、単コロニ
ー分離体からのミニＤＮＡに明白である。

Ｂ、上の陽性コロニーからＳ　［ｌＮＡを使用して、標
準手順によって単離された大腸菌Ｊ旧０５とミニＤＮＡ
を形質転換した。Ｓｔｕ　Ｉ　／Ｈｉｎｄｍ消化パター
ンの分析は純粋な野性型クローンと純粋な変異型クロー
ンを確認した。上記のオリゴヌクレオチド変異誘発から
生ずるクローンをｐＨ７５と指定する。

実施例９　昆虫細胞での発現に適したベクターへのｇｐ
１２０遺伝子の移転このｐＵｃクローンのｐＨ７５を実施例１．　Ｎｏ、７
、の記述のとおりに消化し、実施例ＩのＮ０１８．９．
１０の記述のとおりにｐＡｃ６１０へクローン化した。

このプラスミドはｐＡｃＨＴ５と指定され、培養昆虫細
胞中で変異型ＢＨ１０からのｇｐ１２０を発現させるの
に適している。　ｐＡｃＨＴ５によるＳｆ９昆虫細胞の
トランスフェクションを、ｐＡｃＨＴ３及び変異型ｇｐ
１６０クローンについて記述されたとおりにおこなった
０組換えｇｐ１２０ウィルスの単離と、培養昆虫細胞の
感染及び生育といったそれ以後の段階も、ｐ　Ａ　ｃ　
ｔｌ　Ｔ　３について記述されたとおりである。ｇｐ１
２０の精製のため生育物を取り入れる上でのｇｐ１６０
との相違は、ｇｐ１２０タンパクの大部分が培地中に放
出されることである。

実施例１０　　ｇｐ１２０の精製昆虫細胞培養基からのｇｐ１２０の精製は、標準手法に
よる透析と培地濃縮に続いて、エイズ関連複合体（ＡＲ
Ｃ）をもつ人の血清からつくったカラムを使用する親和
性クロマトグラフィによって達成された。それ以上の精
製は、実施例５、Ｎｏ、７．８．９、の記述のとおりに
７．５χ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で溶出液を
走らせることによって達成された（注：移動は１６０　
ｋＤよりも１２０　ｋＤに対応する位置にあった）。こ
の材料はｇｐ１６０に対してつくった抗血清に免疫反応
性があり、ウィルス中和に関して、昆虫細胞からのｇｐ
１６０と本質的に同じ抗ＨＩＶ免疫性状をもつはずであ
る。

実施例１１　　細胞融合の阻止Ｔ４陽性Ｔ細胞によるＨＩＶ感染細胞の生体外融合を免
疫血清の存在下及び不在下に測定する。これは周知の検
定法である［ブトニー（Ｐｕｔｎｅｙ）ら、（１９８６
年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４巻１３９２−１３９５頁］
。

慢性的に感染した細胞と未感染細胞とを混合しく１：１
５）、２４時間培養した。融合細胞〈巨大細胞）の焦点
を数える（通常約６０）。細胞を混合するときに、免疫
血清、例えば全ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）に対
する血清の希釈物を加える。２４時間後の巨大細胞の９
０χ減少は、免疫血清が融合を阻止できることを示して
いる。この検定は、種々のウィルス株で感染させた細胞
で実施できる。ＨＩＶｌｌｌｌｌ・、ＨＩＶＲＦ・、及
びＨＩＶｌｌｌ／ＩＦハイブリッドの例を第６表に示す
。

組換えバクロウィルス）ＩＴ３による昆虫細胞の感染か
ら得られるｇｐ１６０で二匹のヤギを免疫化し、このヤ
ギ２匹の抗血清からの結果を第５表に示す。

両ヤギの免疫前血清での対照群（両方の平均を示す）は
、１／ｌＯ及びｌ／３０の希釈度での免疫血清値とは対
照的に、巨大細胞数が６０半ばから７０強と予期された
数を示している。

ＡＲＣ患者からの希釈度１／３０のヒト血清と比べて、
組換えｇｐ１６０に対するヤギ抗血清は細胞融合を阻止
するのに、いフそう有効である。ＨＩＶ＋＋＋ｓウィル
スから単離されたｇｐ１２０をヤギの免疫化用抗原とし
て使用したときは、生体外で細胞融合を阻止する能力は
４８時間後に明らかでなかった。１２時間の初期にわず
かな阻害の証拠が多少あった。

ＨＩＶｅｒとＨＩＶ＋＋＋５ｌＲＦバイブＩ）　ッＦ　
ｇｐ１６０（Ｄ　’ＮＩＢ　胞融合検定の例を第６表に
示す、クローンρＡｃ）ＩＴ７からのＨＩＶｔｒ　ｇｐ
１６０は、ヤギに注射されると、ウィルスで誘発される
細胞融合を阻止できる抗血清をつくる（ヤギ１０１３）
。旧νｆＦとＨＩＶＩＩＩＢクローンからのｇｐ１６０
でヤギ１０１４°を共免疫化して得られる血清は、両度
異型ＨＩＶ＋ｕｅ及びＨＩＶｔｐから誘導される細胞融
合を効果的に阻止できる。この結果は多価ワクチンのへ
の道を支持している。興味あることに、りａ　−ンｐＡ
ｃＨＴ６からのＨＩＶＩＩ＋８／ｌＦハイブリッドｇｐ
１６０で免疫化されたヤギ１０２１は、ＨＩＶＲＦに対
する強力な活性を示すが、ＨＩＶ目１８感染細胞融合に
対しても弱いが有意の活性を示す。これは、ハイブリッ
ト型ｇｐ１６０遺伝子の創製が新規な免疫性状をもたら
すこと、及び重要なエピトープがＨＩＶ変異型の間で移
転できるという考えを支持している。

生体外中和検定では、ｌ−１１Ｖの細胞感染能力を中和
しようとする抗血清の能力を、逆転写酵素水準の減少に
よって測定するが、これも行なった。これらの検定から
の結果は、細胞融合阻止検定の結果と関連し合っている
。

λ　　−）−＜ｌ；　　　（Ｌ　　　ＬＪ　　　ｌ−Ｉ
　　　Ｌ）　　　（１）　　　−−−口　　し　　”　
　　Ｃ＜Ｌ　　　ヒ　　し　　し　　り第」Ｌ表挿血日　　　各血清希釈度で抗血清　　　（免疫化後ヤギ抗「１６０ヤギ抗ｒ１６０免疫前ヤギ　　　　　　　、６３　　７２　　６４ヒト
０４２８１慢性惑染ＣＥＭ細胞（ＨＩＶａｎ＠）、未感染ＣＥＭ細
胞及び指定の血清希釈物を３７℃で培養した。巨大細胞
焦点数を４８時間後に測定した。

第」Ｌ表採血日ｒｇｐ１６０　　　（免疫化１０１３　　ＨＩＶＩＩＦ　　　　１回目　６　　３８
　　　４１　　０２回目９　　未検　　未検　０１０１４　　ＨＩＶＲＦ＋　　　１回目　６１５１０Ｈ
ＩＶ＋＋＋ａ　　　２回目　９　　２　　　未検　０１
０２１　　ＨＩＶＩＩＩＩＩ／ＲＦ　１回目　６３４１
０ハイフ“リッド　　　２回目　９　　　２４　　　　
　　未検　　頓血清なし　　　　　検定１　　　４６　
　　４０４２

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＡｃＨＴ３の構築を表す図面である。出願人　レブリゲン　コーポレーション第１已：　　Ｐ
ＡＣＩ−１丁３　リ　オ為−１トー、Ａ山Ｔ３

Claims

【特許請求の範囲】１、組換えＤＮＡによるＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ
１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型ないしハイブリ
ッド型蛋白質の製法であって、（ａ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型又は
ハイブリッド型蛋白質をコードしたＤＮＡを含有する組
換えバクロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）で、昆
虫細胞を感染させ；かつ（ｂ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型又は
ハイブリッド型蛋白質を、そこから回収する；という段階からなる製法。２、組換えバクロウイルスがオートグラファ・カリフォ
ルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）の核ポリヘドロシスウイルスであり、昆虫細胞がス
ポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞である、特許請求の範囲
第１項による方法。３、組換えＤＮＡによるＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ
１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型ないしハイブリ
ッド型蛋白質の製法であって、（ａ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型ない
しハイブリッド型蛋白質のＤＮＡを含むＤＮＡ運搬ベク
トルを構築し；（ｂ）（ａ）のベクトルをバクロウイルスと共に昆虫細
胞にトランスフエクシヨンさせ；（ｃ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型ない
しハイブリッド型蛋白質をコードした組換えバクロウイ
ルスを単離し；（ｄ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０又はその変異型ないし
ハイブリッド型蛋白質をコードしたＤＮＡを含有する組
換えバクロウイルスで、昆虫細胞を感染させ；（ｅ）（
ｄ）の感染ずみ昆虫細胞を適当な媒体中で生育させ；か
つ（ｆ）ｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型ない
しハイブリッド型蛋白質を回収し、その本質的に純粋な
形まで精製することからなる製法。４、（ａ）のＤＮＡ運搬ベクトルが細菌プラスミドであ
る、特許請求の範囲第３項による方法。５、プラスミドがｐＡｃＨＴ３と指定される、特許請求
の範囲第４項による方法。６、プラスミドがｐＡｃＨＴ６と指定される、特許請求
の範囲第４項による方法。７、プラスミドがｐＡｃＨＴ７と指定される、特許請求
の範囲第４項による方法。８、プラスミドがｐＡｃＨＴ５と指定される、特許請求
の範囲第４項による方法。９、昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞で
ある、特許請求の範囲第３項による方法。１０、バクロウイルスがオートグラフファ・カリフォル
ニカ核ポリヘドロシスウイルスである、特許請求の範囲
第３項による方法。１１、ｇｐ１６０をコードした組換えバクロウイルスが
ＨＴ３と指定される、特許請求の範囲第３項による方法
。１２、ｇｐ１６０変異型をコードした組換えバクロウイ
ルスがＨＴ７と指定される、特許請求の範囲第３項によ
る方法。１３、ｇｐ１６０変異型をコードした組換えバクロウイ
ルスがＨＴ６と指定される、特許請求の範囲３項による
方法。１４、ｇｐ１２０変異型をコードした組換えバクロウイ
ルスがＨＴ５と指定される、特許請求の範囲第３項によ
る方法。１５、ｐＡｃＨＴ３、ｐＡｃＨＴ６、ｐＡｃＨＴ７、及
びｐＡｃＨＴ５からなる群から選ばれるプラスミド。１６、特許請求の範囲１５項によるプラスミドｐＡｃＨ
Ｔ３。１７、特許請求の範囲１５項によるプラスミドｐＡｃＨ
Ｔ６。１８、特許請求の範囲１５項によるプラスミドｐＡｃＨ
Ｔ７。１９、特許請求の範囲１５項によるプラスミドｐＡｃＨ
Ｔ５。２０、ＨＴ３、ＨＴ６、ＨＴ７、及びＨＴ５からなる群
から選ばれる組換えバクロウイルス。２１、特許請求の範囲第２０項による組換えバクロウイ
ルスＨＴ３。２２、特許請求の範囲第２０項による組換えバクロウイ
ルスＨＴ８。２３、特許請求の範囲第２０項による組換えバクロウイ
ルスＨＴ７。２４、特許請求の範囲第２０項による組換えバクロウイ
ルスＨＴ５。２５、特許請求の範囲第３項、（ａ）部のＤＮＡ運搬ベ
クトルによって形質転換される細菌宿主。２６、特許請求の範囲第３項、（ａ）部のＤＮＡ運搬ベ
クトルによるトランスフエクシヨンを受ける昆虫細胞。２７、特許請求の範囲第３項、（ｄ）部の組換えバクロ
ウイルスの感染を受ける昆虫細胞。２８、特許請求の範囲第２５項によるホスト大腸菌ＪＭ
１０３。２９、特許請求の範囲第２６又は２７項による昆虫細胞
のスポドプテラ・フルギペルダ。３０、特許請求の範囲第３項の方法でつくられるＨＩＶ
エンベロープ蛋白質ｇｐ１６０Ｎ又はその変異型ないし
ハイブリッド型蛋白質。３１、特許請求の範囲第３０項によるＨＩＶ変異型ＲＦ
のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０。３２、特許請求の範囲第３０項によるＨＩＶ変異型ＢＨ
１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエンベロープ
蛋白質ｇｐ１６０。３３、特許請求の範囲３項の方法でつくられるＨＩＶエ
ンベロープ蛋白質ｇｐ１２０、又はその変異型ないしハ
イブリッド型蛋白質。３４、特許請求の範囲第３３項によるＨＩＶ変異型ＢＨ
１０のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０。３５、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１
２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質を使
用して体液中のＨＩＶに対する抗体を検出又は定量化す
るための免疫化学的検定法。３８、生体体液中のＨＩＶに対する抗体を検出する方法
であって、（ａ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１
２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質を結
合させた固体相であって、試験しようとする生体体液試
料を含むものからなる免疫吸着剤を、試料中の抗ＨＩＶ
抗体がこの免疫吸着剤に結合するような条件下に培養し
；（ｂ）免疫吸着剤を試料から分離し；かつ（ｃ）試料中の抗ＨＩＶの指示として、抗体が免疫吸着
剤に結合されたかどうかを決定する；という段階を含む方法。３７、抗体が免疫吸着剤に結合されたかどうかを決定す
る段階が、生体体液の由来する種の抗原に対する標識つ
き抗体と一緒に免疫吸着剤を培養し；次に培養期間後に
標識抗体から免疫吸着剤を分離し；かつ免疫吸着剤と結
びついた標識を検出することからなる、特許請求の範囲
第３６項の方法。３８、抗体が免疫吸着剤に結合されたかどうかを決定す
る段階が、標識つきＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６
０又はｇｐ１２０、又はその変異型ないしハイブリッド
型蛋白質と一緒に免疫吸着剤を培養し；免疫吸着剤を標
識つきＨＩＶ蛋白質から分離し；かつ免疫吸着剤と結び
ついた標識を検出することからなる、特許請求の範囲第
３６項の方法。３９、抗体が免疫吸着剤に結合されたかどうかを決定す
る段階が、免疫吸着剤を標識つき蛋白質Ａと一緒に培養
し；免疫吸着剤を標識つき蛋白質Ａから分離し；かつ免
疫吸着剤と結びついた標識を検出することからなる、特
許請求の範囲第３６項の方法。４０、ヒトの血清や血漿試料中のＨＩＶ抗体を検出する
方法であって、（ａ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１
２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質で被
覆された１個のビーズからなる免疫吸着剤を提供し；（ｂ）試料中の抗ＨＩＶ抗体が免疫吸着剤と結合するよ
うな条件下に、免疫吸着剤を血清又は血しょう試料と一
緒に培養し；（ｃ）免疫吸着剤と試料を分離し；（ｄ）抗（ヒトＩｇＧ）抗体が、免疫吸着剤に結合され
たヒト抗ＨＩＶ抗体と結合するような条件下に、免疫吸
着剤を標識つき抗（ヒトＩｇＧ）抗体と一緒に培養し；（ｅ）未結合の抗（ヒトＩｇＧ）抗体から免疫吸着剤を
分離し；かつ（ｆ）試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在する指示として、免
疫吸着剤に結びついた標識を評価する；という段階からなる方法。４１、免疫吸着剤が更に動物蛋白質の後被覆を含む、特
許請求の範囲第４０項の方法。４２、標識つき抗（ヒトＩｇＧ）抗体が動物抗体であり
、血清又は血漿試料が同じ種の動物の正常な血清で希釈
される、特許請求の範囲第４０項の方法。４３、抗（ヒトＩｇＧ）抗体がヤギの抗体であり、血清
又は血漿試料が正常なヤギの血清で希釈される、特許請
求の範囲第４２項の方法。４４、抗（ヒトＩｇＧ）抗体が放射性同位元素、酵素又
は蛍光化合物で標識される、特許請求の範囲第４０項の
方法。４５、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１
２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質を結
合させた固体相からなる、抗ＨＩＶ抗体用の固体相免疫
化学的検定法に使用される免疫吸着剤。４６、固体相がガラス又はプラスチックのビーズ、微量
滴定プレートの穴、又は試験管である、特許請求の範囲
第４５項の免疫吸着剤。４７、更に動物蛋白質の後被覆を含む、特許請求の範囲
第４５項の免疫吸着剤。４８、薬理学的に受け入れられる担体中のｇｐ１６０又
はｇｐ１２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋
白質の抗原性状をもった一つ以上のＨＩＶ蛋白質を含む
ワクチン組成物。４９、ＨＩＶで生ずるエイズ（ＡＩＤＳ）の保護用ワク
チンであって、免疫応答をつくりだすのに有効な量の一
つ以上のｇｐ１６０又はｇｐ１２０、又はその変異型な
いしハイブリッド型蛋白質と、生理学的に受け入れられ
る担体とを含むワクチン。５０、リンパ球増殖応答の刺激を必要としているヒトを
、組換えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ
１２０、又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質で
処置することからなる、ヒトのリンパ球増殖応答を刺激
する方法。５１、生体体液中の抗ＨＩＶ抗体を検出するのに使用さ
れるキットであって、（ａ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１
２０又はその変異型ないしハイブリッド型蛋白質を結合
させた固体相からなり、試料中の抗ＨＩＶ抗体が免疫吸
着剤に結合するような条件下の、試験しようとする生体
体液試料を有する免疫吸着剤；（ｂ）標識つきＨＩＶ抗
体；及び（ｃ）免疫吸着剤に結びついた標識の検出手段；を含む
キット。５２、抗ＨＩＶ抗体が、検出可能な標識として抗（ヒト
ＩｇＧ）抗体で標識されている、特許請求の範囲第５１
項のキット。５３、（ａ）本質的に純粋な組換えＨＩＶエンベロープ
蛋白質ｇｐ１６０又はｇｐ１２０；（ｂ）変異型ＲＦの組換えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇ
ｐ１６０；（ｃ）ＨＩＶ変異型ＢＨ１０及びＲＦからの組換えハイ
ブリッドＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０；及び（
ｄ）ＨＩＶ変異型ＢＨ１０からの組換えＨＩＶエンベロ
ープ蛋白質ｇｐ１２０；から選択される化合物。５４、特許請求の範囲第５３項による本質的に純粋な組
換えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０。５５、特許請求の範囲第５３項による変異型ＲＦの組換
えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０。５６、特許請求の範囲第５３項によるＨＩＶ変異型ＢＨ
１０とＲＦとからの組換えハイブリッド型ＨＩＶエンベ
ロープ蛋白質ｇｐ１６０。５７、特許請求の範囲第５３項による変異型ＢＨ１０か
らの組換えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０。５８、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である
、特許請求の範囲第３５項による免疫化学的検定法。５９、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型がＨ
ＩＶ変異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩ
Ｖエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範
囲第３５項による免疫化学的検定法。６０、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０で
ある、特許請求の範囲第３５項による免疫化学的検定法
。６１、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である
、特許請求の範囲第３６項による方法。６２、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とびＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエ
ンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第
３６項による方法。６３、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０からのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２
０である、特許請求の範囲第３６項による方法。６４、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である
、特許請求の範囲第４０項による方法。６５、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第４
０項による方法。６６、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０で
ある、特許請求の範囲第４０項による方法。６７、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０である
、特許請求の範囲第４５項による免疫吸着剤。６８、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第４
５項による免疫吸着剤。６９、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０からのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２
０である、特許請求の範囲第４５項による免疫吸着剤。７０、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が、
変異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０であ
る、特許請求の範囲第４８項によるワクチン組成物。７１、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第４
８項によるワクチン組成物。７２、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０からのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２
０である、特許請求の範囲第４８項によるワクチン組成
物。７３、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が、
変異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０であ
る、特許請求の範囲第５０項による方法。７４、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第５
０項による方法。７５、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０からのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２
０である、特許請求の範囲第５０項による方法。７６、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が、
変異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０であ
る、特許請求の範囲第５１項によるキット。７７、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０変異型が変
異型ＢＨ１０とＲＦとからのハイブリッド型ＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０である、特許請求の範囲第５
１項によるキット。７８、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０変異型が変
異型ＢＨ１０からのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２
０である、特許請求の範囲第５１項によるキット。７９、（１）変異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇ
ｐ１６０；（２）ＨＩＶ変異型ＢＨ１０とＲＦとからの
ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６０；及び（３）変異
型ＢＨ１０のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０：か
らなる群から選ばれる化合物をコードしたＤＮＡ。８０、変異型ＲＦのＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１６
０をコードした、特許請求の範囲第７９項によるＤＮＡ
。８１、ＨＩＶ変異型ＢＨ１０とＲＦとからのＨＩＶエン
ベロープ蛋白質ｇｐ１６０をコードした、特許請求の範
囲７９項によるＤＮＡ。８２、変異型ＢＨ１０のＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ
１２０をコードした、特許請求の範囲第７９項によるＤ
ＮＡ。８３、一つ以上のＨＩＶ分離体からの一つ以上のＨＩＶ
ｇｐ１６０蛋白質を含むワクチン組成物。８４、蛋白質が異なるＨＩＶ分離体からのＨＩＶ蛋白質
のアミノ酸配列からなる場合の、ハイブリッド型ｇｐ１
６０蛋白質を含むワクチン組成物。