JPS63157996A - Ｂ細胞分化因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は人について活性を有するＢ細胞分化因子（以
下ＢＣＤＦと称する）及びヒ）　ＢＣＤＦ遺伝子が組み
込まれているエシェリヒア・コリ細菌等の原核生物を用
いるヒトＢＣＤＦの製造法に関する。本発明に係るヒ）
　ＢＣＤＦは、免疫不全による疾患、癌、及び自己免疫
疾患等に汎く治療薬として利用しうる有用な物質である
。

〔従来の技術〕

リンパ球が産生ずる生物活性、薬理活性のある可溶性の
蛍白性因子であるリンホカインは生体内において微量で
生体の免疫応答機構を調節する作用を有している。リン
ホカインは、その免疫活性物質としての性格より汎く抗
腫瘍剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、免疫不全症治療剤、自
己免疫疾患治療剤としての有用性が期待されている（　
Ａｄｖ、　ｉｎＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、　５０７．１
９８０）　、本発明に係るＢＣＤＦはリンホカインの一
種であり、この様な観点から医薬への応用が期待される
。

さて、抗原刺激を受は活性化された成ｌｐ＜Ｂ細胞は、
Ｔ細胞の助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗
体産生細胞にまで最終的に分化するには、１種またはそ
れ以上のＴ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であるこ
とが知られている。この物質の存在はＲ，Ｗ、Ｄｕｔｔ
ｏｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ。

じ２３，６６　　（１９７５）、　　八、Ｓｃｈｉｍｐ
ｌ　　とＥ、Ｗｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　２３７．１５　　（１９７２）　。

により明らかにされた。彼らはマウスのリンパ球混合物
培養後の培養上清中または抗原やマイトゲンにより刺激
を受けたマウスのリンパ球培養上清が、マウスのＴ細胞
を除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリ
ンパ球のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応
答を増幅させることを見出し、そのような作用を有する
活性本体にＴリンパ球代替因子、すなわちＴＲＦという
呼称を与えた。それ以来ＴＲＦは、抗原非特異的に主要
組織適合遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと略称する。）の
一致を必要としない様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分
裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘
導する液性因子であると定義されている。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す機能上
の証拠が蓄積されており、人においてもマウス同様の分
化因子の存在が示唆されている。

現在では上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細胞
へ分化させる因子をＢＣＤＦと総称するようになった。

このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。

従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＣ叶を産
生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細胞を
十分得ることが困難である点、マイトゲンを用いたため
、ＢＣＤＦに有害なマイトゲンが混入し、これを除去す
るのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ胎児血清
など血清成分を培地に添加する必要があり、これら添加
タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出来ず、Ｂ
ＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得られぬこ
とが障害となっている点など問題が多く、工業的にＢＣ
ＤＦを産生することは出来なかった。また人Ｔ細胞を人
癌細胞と細胞融合して人工融合細胞を得、これによりＢ
ＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（０ｋａｄ
ａ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１５７．　５
８３（１９８３））。しかし、大融合細胞は継代中、リ
ンホカイン産生能が低下してゆくことが多く、実用的Ｂ
ＣＤＦ産生人融合細胞は未だない。

また、人Ｔ細胞白血球ウィルス（以下、ｒＨＴＬＶＪと
記す）により形質転換された人Ｔ細胞によるＢＣＤＦの
生産法も報告されている（特願昭５９−２３５１９９゜
６Ｏ−２５３０１）。

しかしながら、現時点では、エシェリヒア・コリ細菌等
の原核生物によるＢＣＤＦの製造法、即ち、ＢＣ叶に対
応するＤＮＡを原核生物のベクターに組込んで原核生物
細胞内で複製、転写、翻訳せしめて原核生物によりＢＣ
ＤＦを生産する方法及びこの方法により生産されたＢＣ
ＤＦに関しては報告されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明の目的は、ヒ）ＢＣ叶をコードするＤＮＡ
を有するエシェリヒア・コリ細菌等の原核生物によりヒ
トＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドを製造する方法及
び有用なポリペプチドを物質として提供するものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は上記問題点を解決する為に鋭意研、究を重
ねた結果、ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子及び原核生物の細胞内で複製可能なベク
ターＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡにより形質転換され
た原核生物細胞を培地中にて培養し、生産されたヒトＢ
ＣＤＦを採取することにより、本発明を完成に至らしめ
た。以下に本発明の詳細な説明する。

さて、本発明者等はＨＴＬＶ　（人Ｔ細胞白血病ウィル
ス）により形質転換されたヒ）Ｔ細胞の１つであるＶＴ
−１細胞（ＩＦＯ５００９６）がヒトＢＣＤＦを多量に
生産することに注目することにより、ヒトＢＣＤＦをコ
ードする遺伝子を既に同定している（特願昭６ｌ−１８
４８５８）。

尚、念の為に実施例１〜７にヒトＢＣＤＦをコードする
遺伝子クローニングの詳細は記載しである。

さて、ヒ）　ＢＣＤＦを生産する原核生物の調整である
が、まず、ヒ）　ＢＣＤＦをコードする遺伝子を原核性
物の細胞内で複製可能なベクターＤＮＡに組み込む。

この時、ヒトＢＣＤＦをコードするＤＮＡを発現ベクタ
ーのプロモーター配列下流に挿入するか、あるいは、プ
ロモーター配列を持つＤＮＡ片を発現ベクターの０ＤＮ
Ａ挿入の前あるいは後で、しかもヒトＢＣＤＦをコード
するＤＮＡの上流に挿入すればよい。この場合、ヒトＢ
ＣＤＦをコードするｅＤＮＡは第５図に示される様な２
１２個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするが
、本ポリペプチドの２８個のアミノ酸に相当するＮ−末
端領域は極めて疏水性であり、いわゆるシグナル配列と
称せられ、分泌過程で切断される。従って、Ｎ末端ＰＲ
Ｏから始まる１８４個のアミノ酸からなる成熟ヒトＢＣ
ＤＦポリペプチドをコードするＱＤＮＡ部分を発現させ
ることが望ましい。

組み込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、
必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な組
合せの塩基を複数個重合せしめる。

このように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混
合し、リガーゼを用いて接続せしめる。

この様にして得られた組み換えＤＮＡを原核生物宿主に
導入し、得られた形質転換微生物の中からヒＩ−ＢＣＤ
Ｆ産生株を選択すればよい。

本発明において、原核生物としてはエシェリヒア・コリ
、バチルス・ズブチリス等を用いることができるが、好
ましくはエシェリヒア・コリを用いるのがよい。

また、本発明に用いることができるエシェリヒア・コリ
用ベクターとしては、ＥＫ型プラスミドベクター（スト
リンゼント型：　ｐｓｃｌｏｌ、　ｐＲＫ３５３゜ｐＲ
Ｋ６４６．　ｐＲＫ２４８．　ｐＤＦ４１等）、ＥＫタ
イププラスミドヘクタ−（リラソクスドクイブ：　Ｃｏ
１Ｅ　１　。

ｐＶＨ５１，ｐＡｃ１０５．　Ｒ３Ｆ２１２４．　ｐｃ
Ｒｌ、　ｐＭＢ９．　ｐＢＲ３１３゜ｐＢＲ３２２，ｐ
ＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２
８，ｐＫＹ２２８９、　ｐＫＹ２７００．　ｐＫＮ８０
．　ｐＫＣ７，ｐＫＢ１５８．　ｐＭＫ　２００４゜ｐ
ＡｃＹｃｌ、　ｐＡｃＹｃ１８４．　ｄｕｌ等）。λｇ
ｔタイプファージベクター：λｇｔ、λＣ０λｇｔ、λ
Ｂ、　λＷＥＳ、λＣ１λＷＥＳ、λＢ、　λＺＪｖｉ
ｒ、＋λＢ′、λＡＬＯ，λＢ、λＷＥＳ。

Ｔｓ６２２．λＤａｍ等が含まれる。

またプロモーターとしてはｔｒｐ、　ｌａｃ、　ｔａｃ
、　ｔｕｆＢ。

β−ラクタマーゼ、ｌｐｐプロモーターをはじめとして
エシェリヒア・コリ中で機能するすべてのプロモーター
が利用可能である。

組み換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むこと
の出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を
回収後、良く知られているＣａＣＡｚ法によって形質転
換できる。形質転換反応液中にＭｇＣＡ２又はＲｂＣＡ
を共存させれば形質転換効率は向上する。また宿主細胞
のプロトプラスト調製後形質転換させることも可能であ
る。

このよ・うにして得られたヒトＢＣＤＦ遺伝子が組み込
まれている組み換え体原核生物細胞は常Ｗ法によって培
養すればよい。

このようにして得られたＢＣ叶は塩析、真空透析、限外
濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフイー、ク
ロマトフオーカシング、逆相クロマトグラフィー、焦点
電気泳動およびゲル電気泳動等の種々の方法によって培
養物上清から濃縮して精製できる。

尚、形質転換された微生物細胞中にヒ）ＢＣ叶が蓄積さ
れている場合には、ＢＣＤＦは、当該分野の業者の容易
になしうる方法で回収、精製する。簡単に記すと以下の
通りである。培養後、遠心で菌体を集め、リゾチームを
含む溶液や他のｄｅｔｅｒｇｅｎｔを含む液に細胞を懸
濁し、反応後、凍結、融解を繰り返し、細胞抽出液を採
取し、以下前述の精製法及び／又は抗ＢＣ叶抗体固定化
カラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーで簡便
に精製する。

次にＢＣＤＦＣＤ側定法であるが以下のような方法があ
る。

人ＢＣ叶に反応してＩｇＭを産生する人Ｂ細胞株ＣＬ　
４　　（Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、。

８２．５４９０．１９８５）を用イテＢＣＤＦ活性を測
定する。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６×１０３個の
Ｃｌ３を２００μｌの１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ　１１
６４０培地（１ｍβ当りペニシリン１００単位、ストレ
プトマイシン１００μｇ１ゲンタマイシン１０μｇおよ
びＮａＨＣＯ３１６ｍ　Ｍを含む）に入れる。

この混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％
　ＣＯ２存在下、３７℃で培養し、培養上清のＩｇＭ量
を酵素免疫測定法により、測定する。この条件において
最大のＩｇＭ生産量（最高のＣｌ３の反応）の５０％を
示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍＡとした。

また人ＢＣＤＰに反応してＩｇＭを産生する人Ｂ細胞株
ＣＬ　４　（０，５ＡＩＫＩら、Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ　１３゜３１（１９８３））を用いたリバー
スＰＦＣ法でもＢＣＤＦ活性を測定しろる。ＢＣ叶活性
を測定する検液と１×１０４個のＣｌ３を２００μｌの
１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（添加物は
前記と同じ）に入れる。この混合物を９６穴マイクロプ
レート中で３日間、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養す
る。培養細胞・補体・抗ヒ目ｇＭ抗体プロティンＡ結合
緬羊保存血をＨＡＮＫＳ液に溶解したアガロースに混合
して、シャーレ上に拡げ固め、３７℃。

５％ＣＯ□存在下−晩培養した後の溶血理数をもってＢ
Ｃ叶の作用にて人ＩｇＭ産生細胞に分化した細胞数を測
定する。

ところで、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺
伝子でも知られている様に多形現象を示すことが知られ
ている（呑口ら、Ｇｅｎｅ＝　１０．１１〜１５　（１
９８０）　、大野、呑口、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７７．５３０５〜５３０９（１９８１）、Ｇｒａｙ　ｅ
ｔａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５゜５０１〜５０８（
１９８１）。この多形現象によって、蛋白生産物のアミ
ノ酸のあるものが置換される場合もあれば、塩基配列の
変化はあっても全く変わらない場合もある。従って、本
発明においてもヒトＢＣＤＦ活性を有する限りにおいて
第５図のアミノ酸配列の中の１個ないしそれ以上のアミ
ノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリ
ペプチド及びこのポリペプチドをコードするＤＮＡも本
発明に包含される。更に、実施例で示すように、ヒ）　
ＢＣＤＦ活性をもつ１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠
くポリペプチドあるいは、１個ないしそれ以上のアミノ
酸を追加されたポリペプチド、またこれらの組み合せ配
列をもつポリペプチド（アミノ酸の置換も含む）及びこ
れらのポリペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ
も本発明に包含される。ヒトＢＣＤＦとしてのポリペプ
チド機能を阻害する追加アミノ酸配列を有する修飾領域
があっても新たに追加された領域が容易に除去出来るも
のならば本発明のポリペプチド及び遺伝子として利用で
きる。つまり、ヒトＢＣＤＦ活性を存するポリペプチド
は本発明に係るヒトＢＣＤＦである。

〔効　果〕

このように製造されたＢＣＤＦの臨床への応用は大別し
て３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ抗体
を作り、ＢＣ叶と抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦのイム
ノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用いるこ
とが出来ると共に、自己免疫疾患において散見されるＢ
細胞機能異常の修復にも用いうる。第２の応用は各種疾
患の治療への応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機
能低下にともなうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全
症患者にＢＣＤＦ単独または他のリンホカインや免疫療
法剤と共に投与することにより抗体産生機能を正常に戻
すことが考えられる。

またＢＣＤＦの分化活性に着目し、悪性化腫瘍細胞株を
ＢＣ叶により分化させ、増殖阻害を惹起することにより
抗悪性腫瘍剤としても用いることができる。

さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。

Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａ
ｋｉら、Ｊ、　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、１３０．　１２４
１　　（１９８３））、その他のリンホカインを含むＴ
細胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培
養できることが報告されている（　Ｂ、　５ｒｅｄｎｉ
ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。

１５４．１５００　（１９８１）参照）。これらの培養
正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細胞
に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることにより
生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体、
例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞な
どの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細
胞をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞またはＥ
Ｂウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他のリ
ンホカインを組み合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を酸性させることが出来る。これら抗体は感染症や
雀および診断に利用できる。

このようにＢＣＤＦは非常に広範囲に有効な物質である
。

以下に実施例に従って本発明を具体的に説明する。

実施例１ ２１容プラスチツクローラー培養器（フアシヨン＃３０
２７）　　（以下ローラーと称する）中の１１の２０％
ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５　ｘ　１　（１、Ｍ　　２ＭＥ、　１００単位／ｍ７
！ペニシリン、１００μｇ／ｍＩ！、ストレプトマイシ
ン、２０μｇ／ｍｌｌゲンタマイシン及び１６ｍＭＮａ
ＨＣＯ３を含有）に、２Ｘ１０”／ｍｊｌ！細胞数にな
るようＶＴ−１を接種し、ローラーを８　ｒｐｍで回転
させつつ３日間、３７℃で培養した。培養後、培養物を
遠心分離して細胞を集めＲＰＭ１１６４０培地で２回細
胞を洗った後、細胞を２ｐ容ローラー中１ｌのＲＰＭ１
１６４０培地にＩ　Ｘ　１０．、、　／　ｍｊｉ！細胞
濃度になるよう懸濁した。ローラーを８　ｒｐｍで回転
させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後培養物を遠
心分離して、培養上清を得た。

上述のようにＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む培
養上清より、ＢＣＤＦを以下の方法で精製した。

無細胞上清ｌ０Ｉｌを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０
、アミコン・コーポレーション、マサチューセソツ、Ｕ
ＳＡ）を装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セ
ル２０００型、アミコン・コーポレーション、マサチュ
ーセッツ、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４　ｋｇ　
／　ＣＩｌ＋の圧力をかけ濾過した。

濾過膜上部に残った１００ｍＡの濃縮液をさらに限外濾
過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着した限外濾過装置（
アミコン、スタンダードセル５２型）を用い、窒素ガス
により４　ｋｇ　／　ｃｓＭの圧力をかけて濾過した。

濾過膜上部に残った５　ｍ（ｌの濃縮液を採取した。

上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎ、、　２．６
　Ｘ　９０　ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラム
はあらかじめＰＢＳ　　（ホスフェート・バンファード
セイライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェ
ート・バッファー、ｐｌ（７，０）で平衡化した。濃縮
上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５　ｍｌずつ分取し、
分取液のＢＣ叶活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する
両分は分子量３．５±０．５Ｘ１０’ダルトンに相当す
るフラクションに含まれていることがわかった。ゲル濾
過カラムは以下に示すファルマシア・ファインケミカル
ス（スウェーデン）社製の分子量マーカーで検定した。

即ち、ブルーデキストラン２０００　２×１０６、フェ
リチン４．５Ｘ１０５、アルドラーゼ１．５８ｘｌＯ５
、オンアルプミン４．５Ｘ１０’、キモトリプシノーゲ
ン２．５Ｘ１０’及びチトクロームＣ１，１７Ｘ１０’
。また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾過
膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置を用
いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）に
置換した。

ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｐカラム（フ
ァルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）に通
した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液で
洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０ｍｌ１の１
／１０希釈ポリバツフアー７４　（ファルマシア・ファ
インケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラム操
作はファースト・プロティン・リキッド・クロマトグラ
フィー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファインケミカルス
、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５ｍｊ！で行
なった。溶出液を１ｍｌずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とｐ
ｔ＋を測定した。ＢＣＤＦ活性はｐＨ４，９〜５．１の
位置に溶出された。

Ｍｏｎｏ　Ｐカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１
％ＴＦＡ　（）リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化しただ
高速液体クロマトグラフィーにかけ、溶出液０．１％　
ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度をＯから６０％まで直線
的に増加させＢＣＤＦを溶出した。ア七ト二トリル５０
〜５５％で溶出される０、Ｄ、ｚａ。

のピークは他のＯ，Ｄ、ｚｅｏのピークとは完全に分離
しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出さ
れた。このピークを凍結乾燥してＢＣ［ｌＦ標品を得た
。

この標品を還元条件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％ゲル）電気泳動を行なった。

分子量２１０００に相当するゲル区分を切り出し、エッ
ペンドルフチューブ中０，０５％ＳＤＳ、１０ｍＭＮＨ
４，ＨＣＯ３で３７℃、−晩、振盪し抽出した。

Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）を用いたＨＰＬＣにかけ、溶出後０
．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度を０から６０％ま
で直線的に増加させてＢＣＤＦを溶出した。

アセトニトリル５０〜５５％で溶出される０、０．２１
１０のピークは他のｏ、［１，ｚｅｏ　ピークとは完全
に分離しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が
検出された。このピークを凍結乾燥して精製ＢＣＤＦを
得た。

ＢＣ叶蛋白のアミノ酸配列を決定するために前述のよう
にして得られた６μｇの精製ＢＣＤＦをプロティン・シ
ークエンサー（八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　
Ｃｏ、。

Ｃａ１ｆ、Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ）に導入した。アミノ
酸配列の決定方法はＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　
１９３．２６５〜２７５（１９５１）に記載されている
方法により行なった。

Ｎ末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。

Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　
ＧｌｕＡｓｐ　　　Ｓｅｒ　　　Ｌｙｓ　　　Ａｓｐ　
　　Ｖａｌ　　　Ａｌａｌａ 実施例２ 実施例１に記した方法により調製した精製ＢＣＤＦ標品
２０ｐｇを５　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＥ、ｐＨ９，５
のハソファーに？容解し、リシルエンドペプチダーゼ（
Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　（和光）
（Ｌｙｓｙｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔ−ｉｄａｓｅ：　ＢＣ
ＤＦＣＤ−１：２００、モル比）を加え、３７°Ｃ、６
時間反応させ、ＢＣＤＦをフラグメント化した。反応液
を逆相クロマトグラフィー用カラムμＢｏｎｄｏ　Ｐａ
ｃｋ　（０．　２　１　Ｘ　３　０　ｃ＋ｎ）を用いた
　ＨＰＬＣにかげ、溶出液、０．０６％ＴＦ八中のアへ
トニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させて
フラグメントを分離溶出した。この結果ＨＰＬＣの溶出
ピーク１〜９を得た。各ピーク部分の溶出液を凍結乾燥
し、プロティン・シークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏ．、　Ｃａｌｆ，　Ｍｏｄｅｌ　
４７０４）に導入した。

アミノ酸配列の決定は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、
１９３　、２６５〜２７５　（１！’１５１）に記載さ
れている方法により行なった。

アミノ酸配列をＶｆ１第１認たフラグメントとアミノ酸
配列を記す。

フラグメント３ Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕフラ
グメント８ Ｌ’ｙｓ−　Ｌｅｕ−　Ｘ−　Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｎ−　
Ａｓｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｒｐ−　Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−　Ｙ−
　Ｍｅ　ｔフラグメント２ Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ
−Ｙ−Ｌｙｓフラグメント６ Ａｓｐ−Ｖａｌ−へ１ａー八ＩａーＰｒｏ−Ｘ尚、Ｘ及
びＹは同定できなかったアミノ酸フラグメント２，６は
実施例１のＮ末端配列と一致した。

実施例３ 実施例１および２で得たＢＣＤＦのアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、下記のように合成した。

オリゴヌクレオチドの合成はアプライドバイオシステム
社製ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０Ａを用い、シ
リカゲルを同相担体とし、亜リン酸トリエステル法を用
いてヌクレオチド結合反応を行った。常法により保護基
を除去した後、ＣＩＯ逆相カラムＨＰＬＣにてアセトニ
トリルグラジェントを用いて、目的のオリゴヌクレオチ
ドを精製した。

フラグメント３ Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕプロ
ーブ阻 八 ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＧ−ＧＡ　　　
　　　　　・・・　　　３−２ＧＧＧＣ ＧＧＴＣ ＧＴＧＣ ＧＴＧＣ （各６４通りの混合物） フラグメント８ Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−　Ｙ−Ｍｅ　ｔプローブ
階 ＧＣＡ−ＣＡＡ−ＡＡＴ−ＣＡＡ−ＴＧＧ−ＴＴ　　　
・・・８−１ＧＧＣＧ　　　Ｃ ＧＣＴ−ＣＡＡ−ＡＡＴ−ＣＡＡ−ＴＧＧ−ＴＴ　　　
・・・８−２ＣＧＣＧ　　　Ｃ （各３２通りの混合物） Ｎ末端アミノ酸配列 Ｖａｌ−へ１ａ−八ｌａ プローブ隘 ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＴＣ八−へへへ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−１ＣＧＧＣ ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＴＣＴ−八ＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−２ＣＣＧＣ ＧＡＡ−ＧＡＴ−八ＧＴ−＾ＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−３ＣＣＧＣ （各３２通りの混合物） ＣＧＧＧ ＣＧＣＧ ＣＣＧＧ （各６４通りの混合物） 実施例４ （イ）　２ｊ２容プラスチツクローラー培養器（ファル
コン＃３０２７）　　（以下ローラーと称する）中の１
１の２０％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグ
ルタミン、５ｘｌＯ−５Ｍ　　２ＭＥ、１００単位７ｍ
Ａペニシリン、１００μｇ／　ｍｊ！ストレプトマイシ
ン、２．０μｇ／ｍＡゲンタマイシン、１６ｍＭＮａＨ
ＣＯ＋を含有）に２Ｘ１０５／ｍｊ！細胞数にＶＴ−１
を接種し、８　ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃で
培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集めＰ
ＢＳで２回細胞を洗った後細胞（１，８Ｘ１０９細胞）
をＰＢＳ溶液８００　　ｍｊｌ！に懸濁し、細胞を遠心
によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤である
Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ　ｃ
ｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ）を含んだＲ３Ｂ溶液（１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｎａ
ＣＣ１，５ｍＭＭｇ（１！　２）　８００　ｍｊ＋に懸
濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になるように加
えた後ゆるやかに攪拌後、３０００　ｒｐｍで５分遠心
して核を含む細胞ｄｅｂｒｉｓを除去し、その上滑液に
ＳＤＳ　（最終濃度０．５％）とＥＤＴＡ　（最終濃度
５　ｍ　Ｍ　）を加えた後、直ちにフェノールを等量刑
え、細胞質ＲＮＡを抽出した。

合計３回フェノール抽出を繰り返してから、２容エタノ
ールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め、１０　
ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ４Ｃｊ２　、　ｐＨ７，５で溶解した
。

このようにしてＶＴ−１細胞から得られたＲＮＡ量は３
０■であった。

次にこのＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ（
ｄ　Ｔ）−セルロース（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ。

Ｔｙｐｅ　７　）を用い、カラムクロマトグラフィーを
行なった。吸着は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ　、　
ｐＨ７，５，０，５Ｍ　Ｎａ（，７！、　　１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、　　０．５％ＳＤＳ溶液にＲＮＡを溶解して
行ない１、緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、、ｐ
Ｈ７，５，０，５Ｍ　ＮａＣｊ２．　１ｍＭ１１＋ＤＴ
Ａ）で洗浄後、溶出は水と１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！（ｐＨ７，５）で交互にｍＲＮＡを溶出することに
より行なった。この結果溶出されたｍＲＮＡ量は５７６
μｇであった。

（ＩＩ）　　（イ）で調製したｍＲＮＡ　５μｇを用い
て二重鎖ｃＤＮＡを作製した。ＧｔｌＢＬＥｌｌ、　Ｕ
とＨＯＦＦＭＡＮ、　Ｂ＋　Ｊ、　＋　（Ｇｅｎｅ２５
、２６３．１９８３）の方法に従い、ｃＤＮＡ合成キッ
ト（アマジャム）を用いアマジャムのプロトコールによ
って二重鎖ｃＤＮＡを作製した。すなわち、ｍＲＮＡよ
り逆転写酵素によりジングルストランドｃＤＮＡを合成
し、ｍＲＮ八とｃＤＮへのハイブリッドを基質として、
大腸菌リボヌクレアーゼＨを利用してＲＮＡ鎖にニック
とギャプを形成した。さらに大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■によって、二ツクトランスレーションタイプの反応に
よりｍＲＮＡをＤＮＡに置き換え二重鎖ＤＮＡを作製し
た。この３′末端にある小さなオーバーハングを７４　
’ＤＮＡポリメラーゼを用いて除去し、二重鎖ｃＤＮＡ
を作製した。最終的に得た二重鎖ｃＤＮＡは１．０８μ
ｇであった。

（ハ）得られた二本鎖ｃＤＮＡ　１．０８μｇを蔗糖密
度勾配遠心法（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！、　　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，５を含む溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、４
０．０００ｒｐｍ　、　　４℃下で１３時間）により分
画し、その１部をアガロースゲル電気泳動法によるオー
トラジオダラムにより解析し、二本鎖ｃＤＮＡのサイズ
が５００ｂｐ以上の両分を集めてエタノール沈澱法で回
収した。回収した二本鎖ｃＤＮＡは約０．６μｇであっ
た。

（＝）０．１Ｍカコジル酸カリウム（トリスＢａ５ｅで
ｐ）ｌを７．２にしたもの）１０ｍＭ　’ＤＴＴ、２ｍ
ＭＣｏＣｊ！　ｚ、　０．５　ｍ　Ｍ　”Ｐ−ｄＣＴＰ
　　（比活性ＩＸＩＯ６ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌｅ）　＋　
　０．６１１　ｇ二本鎖ｃＤＮＡおよび５０単位のデオ
キシヌクレオチジルターミナルトランスフェラーゼ（Ｂ
　ＲＬ）を混合し、２４℃、２０分間インキュベートし
た後、フェノール処理を行い、セファデックスＧ−５０
カラムを通してｃＤＮＡ画分を集め、エタノール沈澱物
として０．２４μｇのｄＣ−テイルしたｃＤＮＡを得た
。このｃＤＮＡは約１３個のｄＣＭＰ残基が３′両末端
に付加されていた。

（ネ）一方、第１図に示したようにサル細胞（ＣＯ５細
胞）でのｃＤＮＡ発現ベクターｐＱをｐＣＥＩＬ−２（
Ｎａｔｕｒｅ、　３０２　、３０５　、　（１９８３）
）から構築した。

ｐＱはｃＤＮＡを両向きのＳＶ４０初期プロモーターに
はさみごみができ、ｃＤＮＡがどちらの方向に挿入され
てもＣＯ８細胞中でｃＤＮ＾にコードされるペプチド蛋
白を発現させることができる。また、Ｅ、Ｃｏ１１中で
も複製可能で、テトラサイクリン耐性として選択するこ
とができる。

このｐＱをＰｓｔ　Ｉで切断し、先程のｄｓ−ｃＤＮＡ
の３′端の両端にｄＣｔａｉｌをつけたのと全く同じよ
うにｄＧ　ｔａｉｌを１３個前後付与した。

次にこのｃｌＧ−ｔａｉｌｅｄ　ｐ　Ｑ　１００ｎｇと
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄｄＳ−ｃＤＮＡ　２０ｎｇを５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！、　ｐＨ７，５゜０、１　
Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液に混
合し、まず６５℃で２分間、ついで４５℃で６０分間、
３７℃で６０分間、そして室温で６０分間インキュベー
トした。そしてこのアニーリングしたＤＮＡをコンピテ
ントなＥ、　Ｃｏ１１　　ＭＣ１０６１に導入した。次
にＭＣ１０６１のコンピテント細胞の作り方、導入法を
以下に示す。

Ｅ、　Ｃｏ１ｔ　ＭＣ１０６１を１００ｍｌの平培地（
２％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２０，ｐＨ７，６）に接種し、培養液の吸光
度が５５０ｎｍで０．３〜０゜５付近になるまで３７℃
で振盪培養した。培養終了後、培養液を５分間、０℃に
保持し、菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂｌ（３０ｍ
Ｍ酢酸カリウム、１００ｍＭ　Ｒｈ（１，１０ｍＭ　Ｃ
ａ（１２，５０ｍＭ　ＭｎＣｊ２２．　１５％グリセリ
ン。

ｐＨ５，８＞の４０ｍ１ｔに懸濁し、０℃に５分間静置
した。

再び菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂｎ（１０ｍＭ　
ＭＯＰＳ　ｏｒ　ＰＩＰＥＳ、　　７５ｍＭ　ＣａＣ７
！２．１０ｍＭ　Ｒｈ（Ｊ！。

１０％グリセリン、ｐＨ６，５）の４０ｍｊ！に懸濁し
、０℃で１５分間静置した。この懸濁液を分注して一７
０℃に保存した。

次にこのように調製したコンピテント細胞の１００μｌ
を１５分間、０℃に保持し、この中に先程ｄＧ−ｔａｉ
ｌｅｄ　ｐＱ　ｖｅｃｔｏｒとｄＣ−ｔａｉｌｅｄ　ｃ
ＤＮＡとをアニールした標品１０μ！及び５０ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１ｚ　。

１０ｍＭ　ＣａＣＡｚの溶液９０μβとを混合し、Ｏ”
ｃで２０分間静置する。ついで３７℃で６０秒間熱処理
後、１〜２分間、０℃に保持し、これに！培地１ｍＡを
加え、３７℃で６０分間振とう培養した。この培養液を
１５μｇ／ｍｌｌのテトラサイタリンと２５μｇ／ｍβ
のストレプトマイシンを含むＬ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１１０，１％グル
コース）ノ寒天フレートに塗抹し、３７℃で一晩インキ
ユベートするとコロニーが出現した。

（へ）得られた形質転換株約１５０．０００クローンに
対し、プローブ８−１．および８−２を用いてＧｒｕｎ
ｓｔｅｉｎ、　ＭらＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　６８　。

３７９　　（１９７９）の方法でコロニーハイブリダイ
ゼーションを行ったところ、８−１とハイブリダイズす
る株が１０クローン認められた。さらにこれらの１０ク
ローンに対してプローブ３−１〜３−６を用いて、同様
の方法でコロニーハイブリダイゼーションを行ったとこ
ろプローブ３−２とハイブリダイズする株１クローンを
得た。本クローンが保持するプラスミドＤＮＡを粗抽出
精製し、制限酵素ＰｓｔＩで切断後、ｃＤＮＡインサー
トをアガロース電気泳動にてｐＯベクターと分離した。

プローブ８−１．プローブ３−２．プローブＮ−２また
はプローブＮ−５を用いてサザンハイブリダイゼーショ
ン分析を行ったところいずれの１ローブともハイブリダ
イズした。その他のプローブとはハイブリダイズしなか
った。

このプラスミドＤＮＡをｐＢＳＦ２−３８と名づけた。

すなわち本ｐＢＳＦ２−３８のもつｃＤＮＡインサート
はＢＣＤＦ活性をもつ蛋白の明らかにされた部分アミノ
酸配列に相当する遺伝子配列を有することが明らかであ
り、本ｃＤＮＡはＢＣＤＦ遺伝子であると同定した。

実施例５ （イ）ｐＢＳＦ２−３８　　プラスミドＤＮＡを大量調
製するために本ｐＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０６
１を２０μｇ／　ｍ　ｌのテトラサイリンと２５μｇ／
ｍｅのストレプトマイシンを含む！培地１００ｍ１に接
種し、３７℃で５〜７時間振盪培養した。次に最終濃度
１７０μｇ／ｍｅとなるようにクロラムフェニコールを
含む新たな！培地１００ｍＡを加え、さらに−晩振盪培
養した。

このようにして増幅されたプラスミドＤＮＡを以下のよ
うに精製した。

培養液を遠心分離により菌体のみ集め、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩＩ　、　ｐＨ７，５の５　ｍｌｌに懸濁し一
８０℃に凍結後、融解して次にリゾチーム（最終濃度、
２■／ｍ１ｌ）を加えて０℃で１０分間静置し、さらニ
ＥＤＴＡ　（最終濃度０．１Ｍ）を加え、０℃で１０分
間静置する。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終濃
度０．１％）を加えて０℃で６０分間静置する。ついで
３０．ＯＯＯｒｐｍ　、３０分間遠心分離し、その上清
液を等量の水飽和フェノールで処理する。その水層をさ
らに等量のクロロホルムで処理し、その水層を抽出し、
これに最終濃度２０μｇ　／ｍβとなるようにＲＮａｓ
ｅを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。

その後０．２容の５ＭＮａＣｎと１７３容のポリエチレ
ングリコールを加え、０℃に６０分間静置後、１０、Ｏ
ＯＯｒｐｍ　２０分間、遠心分離によりＤＮＡ沈殿を回
収する。

次にこの沈殿を３．８ｍＡの水に溶解し、４ｇのＣｓＣ
ｌを加えて溶解後、Ｌｏｎｇ／ｍ＃のＥｔＢｒの２００
μ／を加えて４０．ＯＯＯｒｐｍ　、　　１６時間、２
０℃で超遠心分画を行う。

遠心終了後、ｐｌａｓｍｉｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ画分を抽出し
、水飽和ｎ−ブタノールの１〜２容で４回抽出操作を行
ってＥｔＢｒを除（。その後Ｈ２Ｏ中で透析を行ってＣ
ｓＣ１を除去後、３Ｍ酢酸ソーダｐｎｓ、ｅの１７１０
容を加え、さらに２容の冷エタノールを加えて、−２０
℃で−＠静装する。このエタノール沈殿を遠心分離で集
めて８０％エタノール水溶液で洗浄後、よく乾燥し、こ
の沈殿物を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！、　ｐＨ７，
５の５０μｌに溶解しサル細胞トランスフェクションた
めのサンプルとした。

（ｒｌ）　　サルＣＯ５−７細胞へのプラスミドの感染
法ＣＯ３−７細胞を１ＸＩＱ５／ｍ７！になる様に１０
％牛脂児血清含有ＲＰＭｒに懸濁し、この３ｍｎ分を６
Ｃ１１シヤーレにて５％炭炭酸ガスインキュベーター内
子７で一夜培養した。培養上清を除去し、新しい１０％
牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　３　ｍ　ＩＩを加え、３７℃
、５％炭酸ガスインキュベーター内で２時間培養した。

培養後、上清を除去し、ＴＢＳ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ！、ｐＨ７，５，１３０ｍＭ　ＮａＣｊ２．５ｍ
Ｍ　ＫＣｊ２　、０．６ｍＭ　ＮａｚＨＰＯｎ）２．５
　ｎｕにて１回洗浄した。このＣＯ５−７細胞にプラス
ミド混合物（ＴＢＳ　（＋）（ＴＢＳに０．７　ｍＭ　
ＣａＣＡ　ｔ、０．５ｍＭＭｇｃｊｔ２を加えたもの）
１．０ｍＪ、プラスミドＤＮＡ２μｇおよび１０　ｍｇ
／ｍ　１２　ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ５０μりを加え
、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で４時間イ
ンキュベートし、上清を除去後、Ｔ　Ｂ　Ｓ　２．５　
ｍ　Ａで洗浄除去し、１５０／ｊＭクロロキン含有１０
％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　２．５　ｍｌを加えた。３
７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキ
ュベート後上清を除去し、ＴＢＳ２．５ｍｆ！で２回洗
浄した。１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　３　ｍ　ｊ！
を加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で一
夜培養した。上清を除去後回ＲＰＭＩ　３　ｍ　１２を
加え、３７℃５％炭酸ガスインキュベーター内で２日培
養した。そしてこの培養上清を遠沈後その上清をＢＣＤ
ＦＣＤ側定用サンプルとした。

ＣＯ８培養上清をＣＬ４を用いてＢＣＤＦ活性を測定し
た結果を第２図及び第３図に示す。ｐＢＳＦ２−３８プ
ラスミドＤＮＡを導入したＣＯ３−７細胞は対照に比ベ
明らかなりＣＤＦ活性を示した。

このように真核生物細胞ＣＯ５−７で生産されたりコン
ビナンドヒトＢ（：ＤＦは培養液を抗ＢＣＤＦ抗体固定
化カラムを通し、次いで前出の逆相ＨＰＬＣ（ジンクロ
ンＣｌ８）を用いて精製された。本ＢＣＤＦはｃＤＮＡ
構造にＮ−グリコシレージョン位置のあることより糖鎖
を含有するものであり、その理化学的性質は実施例１の
方法にてＶＴ−１培養上清により精製された純化ＢＣＤ
Ｆのそれに一致した。すなわち分子量：３．５±０．５
Ｘ１０’ダルトン（ゲル濾過法）２．２±０．２Ｘ１０
’ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法） 等電点：ｐＨ４，９〜５．１ であった。

実施例６ 実施例５（イ）により調製したｐＢＳＦ２−３８より制
限酵素Ｂａｍ１ｌＩで切り出したＢＣＤＦ　ｃＤＮＡ　
１ｎｓｅｒｔをプロＢＣＤＦ　ＩＴＩＩ；ｌ’ＮＡ −ブとしてＢＣＤＦ　ｍＲＮＡサイズ、分子種、翼卵補
年産生株の評価を行なった。用いたｍＲＮＡは本ＢＣＤ
Ｆを産生するｖＴ−１細胞をはじめとして他にＢＣＤＦ
を産生ずると考えられるＣ　Ｅ　Ｓ　Ｓ　、　ＲＰＭＩ
　１７８８およびＴＰＡで刺激したヒト扁桃腺細胞とＢ
ＣＤＦ活性の認められないＣＬ４、Ｊｕｒｋａｔ、　Ｃ
ＥＭおよび無刺激のヒト扁桃腺細胞から実施例４の（イ
）と同じ方法で調製したものである。

各々ｍＲＮＡ１０　、ｌｊｇ　／　３．６　ｕ　Ｒ，５
ＸＭＯＰＳ緩衝液（０，１Ｍ　ＭＯＰＳ　　（ｐＨ７，
０）　７５ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　５ｍＭＥＤＴＡ　）６
．０μ！、ホルムアルデヒド５．４μ！およびホルムア
ミド１５．０μｌを６０°Ｃ１５分間インキュベートし
、これに色素液（０，０５％ブロモフェノールブルーお
よび０．０５％キシレンシアツール含有８０％グリセロ
ール液）３μｌを加えたものを調整サンプルとした。本
サンプルを１部ＭＯＰＳ緩衝液、１．８％ホルムアルデ
ヒド含有１．６％アガロースゲルにて電気泳動し、その
後、常法によりニトロセルロースフィルターにブロッテ
ィングした。そして本フィルターを８０℃３時間ベータ
した。この様に調製したフィルターを０．１％ＳＤＳ含
有３ＸＳＳＣに浸漬後、１×デンハルト溶液、５０％ホ
ルムアミド、５ＸＳＳＣ１２５０１部ｇ／ｍｔ２ニシン
ＤＮＡ含有５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）にて４２℃で一夜プレハイブリダイズした。そして
、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳ
Ｃ，２５０ｐｇ　／ｍＩ！ニシンＤＮＡ含有５０ｍＭナ
トリウムリン酸緩衝液（ｐ）１６．５　）中にて３２ｐ
ラベル化ｐＢｓＦ２−３８のＢａｍＨＩ　ｃＤＮ八イフ
ィンサートブローフ゛として４２℃−夜ハイプリダイズ
した。

ハイブリダイズしたフィルターを室温で０．２％ＳＤＳ
含有２ＸＳＳＣにて５分間４回、５０℃で０．２％ＳＤ
Ｓ含有０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃにて３０分間２回洗浄
し、風乾後、オートラジオダラムを作成した。

その結果、Ｖ　Ｔ　−１、ＣＥ！ＳＳ　（ＢＣＤＦ産生
株）、ＲＰＭＩ　１７８Ｂ由来のｍＲＮＡにはｐＢＳＦ
２−３８のｃＤＮＡプローブはハイブリダイズした。Ｂ
ＣＤＦを産生じないと思われるＣ　Ｌ　−４、Ｊｕｒｋ
ａｔ、　ＣＥＭおよびＢＣＤＦ非産生ＣＥＳＳ由来のｍ
ＲＮＡにはハイブリダイズしなかった。

またｐＢＳＦ２−３８のｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズするｍＲＮＡの５ｉｚｅはほぼ１５〜１６Ｓと推定
された。

１部を第４図に示す。

実施例７ ｐＢｓＦ２−３８を保持するＭＣ１０６１より実施例５
の（イ）に記した通りプラスミドＤＮＡを得、制限酵素
ＢａｍＨＩで切り出すことによりＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを
調製した。そして制限酵素地図と塩基配列を決定した。

塩基配列はＭａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔの化学法（Ｍ
ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

餞、　４９９　（’８０）　”）およびＭ１３ファージ
（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ＋１９．２
６９（’８２））を使ったジデオキシヌクレオチド鎖集
結法（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、
７４．５４６３（’７７）の方法により決定した。決定
された塩基配列及びアミノ酸配列を第５図に示した。ま
た制限酵素地図は第６図に示した。

ここに決定されたヒ）　ＢＣＤＦ塩基配列は実施例１゜
２で開示されたアミノ酸部分配列構造を全て正確に含む
。

実施例８ （１）　　ヒトＢＣＤＦ遺伝子を発現させるために使用
したベクターＤＮＡを以下のように構築した。（第７図
） まず第８図に示すＤＮＡ配列を持つＤＮＡ断片（ａｌ〜
（２）をそれぞれ固相リン酸トリエステル法で合成した
。ｉａ）およびｆｇ）以外は、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼとＡＴＰを用いて５′末端をリン酸化しておいた
。

次に（ａｌ〜（ｊ２）を混合し、アニール後、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて二本鎖合成り　Ｎ　Ａ　（Ａ）を形
成させた。一方ｐＴ９−１１を制限酵素ＨｐａＩおよび
Ｘｂａｌで切断し、アガロースゲル電気泳動により大き
なりＮＡ断片を分離した。次に得られたｐＴ９−１１断
片と合成りＮＡ（Ａ）（第８図参考）を混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを使って結合させた。

得られた組換えＤＮＡを、エシェリヒア・コリＨ８１０
１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択し
た。分離した株から、プラスミドＤＮＡを得て制限酵素
による切断試験および塩基配列の決定を行うことにより
、合成型）１１Ｌ−２ｃＤＮＡを有するｐＴ　１３　Ｓ
　（Ｎｃｏ）を保持する菌を選択した。

（２）　　プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）およびｐＢ
ＳＦ２−３８を用いてヒトＢＣ叶を発現する組換えＤＮ
Ａを以下のように構築した。（第９図及び第１０図）ｉ
）プラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）を制限酵素Ｎｃｏ　
ＩおよびＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動に
より大きなりＮＡ断片を単離精製した。

他方、プラスミドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動によりヒトＢＣＤ
Ｆ　ｃＤＮＡインザートを含む小さなりＮＡ断片を回収
した。そして、該ＢａｍＨｒヒトＢＣＤＦ　ｃｌ）ＮＡ
ゼインートを制限酵素ＸｂａＩで完全切断し、更にＭｖ
ａｌで部分切断した。

次に、トリプトファンプロモーター／オペレーター（ｔ
ｒｐ　ｐｌｏ）を含むｐＴ　１３　Ｓ　（Ｎｃｏ）断片
、ヒＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを含むＭｖａ　Ｉ　−Ｘｂａ　
Ｉ断片含有ＤＮＡ混合物および合成り　Ｎ　Ａ　（Ｂ）
　（５′ＣＡＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣ”と５′末端
をリン酸化した５′ＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧ３’　）
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得
られた組換えＤＮＡを、エシェリヒア・コリＨＢ　１０
１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択し
た。得られた株よりコロニーハイブリダイゼーション法
により合成り　Ｎ　Ａ　（Ｂ）とハイブリダイズするＤ
ＮＡを有する株を選択した。

分離した株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による
切断試験および結合部位付近の塩基配列の決定を行なう
ことにより、ｐＴＢＣＤＦ−０１を保持する菌を選定し
た（　ｐＴＢＣＤＦ−０１／　ＨＢ　１０１　）。

ｉｉ）プラスミドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素Ｂａｎ１
で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏｗ）
処理し、Ｘｂａｌで切断後、アガロースゲル電気泳動に
より約１５０塩基対ＤＮＡ断片を分離した。

１ｉｉ）ｉ）で得たｐＴＢＣＤＦ−０１を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）処理後、Ｘｂａｌで切断し、アガロースゲル電気
泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。

１ｖ）ｉｉ）と１１１）で得られた２種類のＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組
換えＤＮＡをエシェリヒア・コリＨ８１０１株へ導入し
、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた
株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験
を行なうことによりｐＴＢＣＤＦ−０２を保持する菌を
選定した（ｐＴＢＣＤＦ−０２／ＨＢＩＯＩ、　（１４
ＲＭ　ｐ−９０６１））。

ｖ）　７’ラスミＦ　ｐＴＢＣＤＦ−ＯｆまたはｐＴＢ
ＣＤＦ−０２を保持するエシェリヒア・：Ｉ’ＪＨＢ　
１０１株ヲ２５μｇ／ｍｅストレプトマイシンおよび２
５μｇ／ｍｌｌアンピシリンを含むし培地（１％バタト
トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５　％ＮａＣ（
１、０，１％グルコース、ｐＨ７，５）　　１０ｍｌ中
で３７℃−晩生前させた。ついで培養懸濁液５ｍｌをＭ
９−カザミノ酸培地（０，６％ＮａＪＰＯ４・１２Ｈ２
０、０，３％ＫＨｚＰＯ４，０，０５％Ｎａ（Ｊ！、０
．１％ＮＨ４，Ｃ６，０，０５％Ｍｇ５Ｏｎ・７　Ｈｚ
Ｏ，０，００１４７％ＣａＣＲ２＋　ｏ、　２％グルコ
ース、０．２％カザミノ酸、０．０２％Ｌ−ロイシン、
０．０２％Ｌ−プロリフ、　　０．０００２％チアミン
塩酸塩、１００μｇ　／　ｍ　ｌ！チアンシリン、２５
μｇ／ｍβストレプトマイシン、ｐＨ７，４）へ接種し
、２８℃にて３時間培養した。その後２５μｇ／ｍβに
なる様３−インドールアクリル酸（１４４）を添加し、
２３℃にて２１時間誘導培養した。培養菌体を遠心分離
し、２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ）＋７．５　、　３０ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ！、を含む）で洗浄し、同じ緩衝液８ｍ６
に懸濁した。かくして菌体内に産生される蛋白を５０　
ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）または１■／ｍβリゾチーム消化に引き続きソニ
ック処理（５０Ｗ、３０秒間）することにより抽出した
。

表１に示す如くヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡの３′末端側の
一部が欠損し、その欠損部にヒ）ＩＬ−２ＣＤＮΔの一
部が結合している。ｐＴＢｃＤＦ−Ｏｆ／ＨＢＩＯＩ及
び完全な形のヒトＢＣＤＦ　、ＤＮ八を有するｐＴＢＣ
ＤＦ−０２／ＨＢＩＯＩのどちらの培養抽出液はＢＣＤ
Ｆ活性を示した。

表Ｌ　　Ｍｉみ換えＤＮＡ保持菌の培養抽出液のＢＣＤ
Ｆ活性（リバース・プラーク法による）ここに得られた
りコンビナンドＢＣＤＦは実施例１と同様の方法で精製
濃縮され、単一蛋白標品が逆相クロマトグラフ用カラム
５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−Ｐ（Ｃ＋ａ）を用いたＨ
　Ｐ　Ｌ　Ｃにて、アセトニトリル９７４度５０−５５
％で溶出された。そのアミノ酸配列も実施例１同様に決
定され、Ｎ端構造を確認した。

すなわちｐＴＢＣＤＦ−０２／ＨＢＩＯＩが生産するポ
リペプチドは下記のアミノ酸配列を有する。

ＰＲＯＶＡＬ　　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　ＧＬＵ　　Ａ
ＳＰ　　ＳＥＲＬＹＳ　　ＡＳＰ　　ＶＡＬＡＬＡ　　
ＡＬＡ　　ＰＲＯ１（Ｉｓ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　　Ｐ
Ｉ？ＯＬＥＵ　　Ｔｌ（ＲＳＥＲ５ＥＲＧＬＵ　　ＡＲ
Ｇ　　ＩＬＥ　　ＡＳＰ　　ＬＹＳ　　ＧＬＮ　　ＩＬ
Ｅ　ＡＲＧ　　ＴＹＲＩＬＥ　　ＬＥＵ＾ＳＰ　ＧＬＹ
　ＩＬＥ　ＳＥＲＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　Ｇ
ＬＵ　ＴＨＲＣＹＳＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＡＳＮ　Ｍ
ＥＴ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＵＡ
ＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＡＳＮ　　Ａ
ＳＮ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　ＬＥｌｌ　　ＰＲＯＬＹ
ＳＭＥＴ　　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＬＹＳ　　ＡＳＰ　
　ＧＬＹ　　ＣＹＳ　　ＰＨＥ　　ＧＬＮ　　ＳＥＲ’
　ＧＬＹＰＨＥ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｔｌ（ＲＣ
ＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬＥＴＨＲ
ＧＬｙ　ＬＥＵ　ＬＥＤ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　Ｖ
ＡＬ　ＴＹＲＬＥＵ　ＧＬＵＴＹＲＬＥＵ　　ＧＬＮ　
　ＡＳＮ　　ＡＲＧ　　ＰＨＥ　　ＧＬＵ　　ＳＥＲＳ
ＥＲＧＬＵ　　ＧＬＵＧＬＮ　　ＡＬＡ　　ＡＲＧ　　
ＡＬＡ　　ＶＡＬ　　ＧＬＮ　　ＭＥＴ　　ＳＥＲＴＨ
ＲＬＹＳ　　ＶＡＬＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＩＥ　
ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　Ａ
ＳＮＬＥＵ　　ＡＳＰ　　ＡＬＡ　ＩＬＥ　　ＴＨＲＴ
ＨＲＰＲＯＡＳＰ　　ＰＲＯＴＨＲＴＨＲ八Ｓへ　　Ａ
ＬＡ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＴＨＲＬＹＳ　　
ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＬＡ　　ＧＬＮ八Ｓへ　　ＧＬ
Ｎ　　ＴＲＰ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＳＰ　　ＭＥ
Ｔ　　ＴＨＲＴＨＲＨＩＳ　　ＬＥＵＩＬＥ　　ＬＥ［
Ｉ　　ＡＲＧ　　ＳＥＲＰＨＥ　　ＬＹＳ　　ＧＬＵ　
　ＰＨＥ　　ＬＥＵ　ＧＬＮ　　５ＥＲ３ＥＲＬＥＵ　
　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　
　ＭＥＴ実施例９ （１）プラスミドｐＴ１３ｓ　（Ｎｃｏ）　（実施例８
に記述）及び、ｐＢＳＦ２−３８を用いてヒトインター
ロイキン−２（ＨＩＬ−２）とのヒトＢＣＤＦ融合蛋白
（△ＨＩ　Ｌ　−２−ＢＣＤＦ）を生産する組み換えＤ
ＮＡを以下のように構築した。（第１１．１２図）ｉ）
プラスミドρＴ１３Ｓ　（Ｎｃｏ）を制限酵素ＢｇｌＩ
ＩおよびＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動に
より大きなりＮＡ断片を単離精製した。他方、プラスミ
ドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動によりヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡイ
ンサートを含む小さなりＮＡ断片を回収した。

そして、該ＢａｍＨＩヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡインサー
トを制限酵素Ｘｂａｌで完全切断し、更にＭｖａＩで部
分切断した。

次に、上記プロモータを含むｐＴ１３ｓ　（Ｎｃｏ）断
片。

ヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを含むＭｖａ　Ｉ　−Ｘｂａ　
Ｉ断片含有ＤＮＡ混合物および合成り　Ｎ　Ａ　（Ｃ）
　　Ｃ５′ＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＣＣＣ′３′と５′末端をリン酸化した”　ＴＧ
ＧＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡ３’　）
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得
られた組換えＤＮＡを、エシェリヒア・コリＨＢ　１０
１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択し
た。得られた株よりコロニーハイブリダイゼーション法
により合成り　Ｎ　Ａ　（Ｃ）　とハイブリダイズする
ＤＮＡを有する株を選択した。分離した株からプラスミ
ドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験および結合部位
付近の塩基配列の決定を行なうことにより、ｐＴＢＣＤ
Ｆ−１１を保持する菌を選定した（ｐＴＢＣＤＦ−１１
／ＨＢ　１０１　）。

ｉｉ）プラスミドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素Ｂａｎ１
で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏｗ）
処理し、ＸｂａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
より約１５０塩基対ＤＮＡ断片を分離した。

１ｉｉ）ｉ）で得たｐＴＢＣＤＦ−１１を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎ
ｏｉｙ）処理後、Ｘｂａｌで切断し、アガロースゲル電
気泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。

１ｖ）ｉｉ）とｉｉｉ　）で得られた２種類のＤＮＡ断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた
組換えＤＮＡをエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株へ導入
し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られ
た株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断試
験を行なうことによりｐＴＢＣＤＦ−１２を保持する菌
を選定した（ｐＴＢＣＤＦ−１２／　ＨＢ　１０１　、
　（ＦＢＩＩＭ　Ｐ−９０６２）。

ｖ）　ＢＣＤＦ　ｃＤＮＡの５′末端にヒトＩＬ−２ｃ
ＤＮＡの一部が結合、かつ３′末端側の一部が欠損し、
その欠損部にヒ）ＩＬ２ｃＤＮＡの一部が結合している
プラスミドｐＴＢＣＤＦ−１１を保持するＨＢＩＯＩ及
び完全なりＣＤＦ　ｃＤＮＡの５′末端側にヒトＩＬ−
２ｃＤＮＡの一部が結合しているプラスミドｐＴＢＣＤ
Ｆ−１２を保持するＨＢＩＯＩの両方を実施例８に従い
培養し、抽出液を得た。表２に示す如く、両培養抽出液
はＢＣＤＦ活性を示した。

表２　組み換えＤＮＡ保持菌の培養抽出液のＢＣＤＦ活
性（リバース・プラーク法による）実施例１０ 実施例８に従いｐＴＢＣＤＦ−１２／ＨＢＩＯＩ　（実
施例９に記述）を培養し、以下の手順で菌体内に生成し
た顆粒を抽出した。

遠心分離により菌体を集め、１０倍濃縮になるように、
３０ｍＭ　ＮａＣｊ２を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
ｌ緩衝液（ｐＨ７，５＞を添加し、懸濁後、そこにリゾ
チーム１■／ｌβ、　ＥＤＴＡｏ、　０５　Ｍを添加し
攪拌した後、水中にて、１時間放置した。次いで、超音
波破砕で菌体を破壊し、１０．ＯＯＯｒｐｍ、　５分間
の遠心分離で顆粒を回収した。

この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、△ＨＩＬ−
２−ＢＣＤＦ濃度が１００．ｃｒｇ／ｍＡ、及び２Ｍ塩
酸グアニジン溶液となるように、濃度調整を行ない、こ
れに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グルタチオン
１０ｍＭを添加し、ｐＨ８，０、室温で１０〜１６時間
放置した。次に５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５によるゲル
濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリクレイ
ン反応用緩衝液溶液となった△ＨＩＬ−２−ＢＣＤＦ相
当画分を得た。本物質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により、分子量は、アミノ酸組成から計算し
た値とほぼ一致し、又、プロテインシークエンサーにて
、Ｎ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、ＨＩＬ−２
の配列であることが確認された。

すなわち、このＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドは下
記のアミノ酸配列を有する。

ＡＬＡ　ＰＲＯＴＨＲＳＥＲＳＥＲＳＥＲＴＨＲＬＹＳ
　ＬＹＳ　ＴＨＲＧＬＮＬＥＵ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＧＬ
Ｕ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＬＥＵ
　ＰＩ−ＩＥＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＰＲＯＶＡＬ　　Ｐ
ＲＯＰＲＯＧＬＹ　　ＧＬＵ　　ＡＳＰ　　ＳＥＲＬＹ
ＳＡｓｐ　　ＶＡＬ　　ＡＬＡ　　ＡＬＡ　　ＰＲＯＨ
ＩＳ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　　ＰＲＯＬＥＵ　　Ｔ）Ｉ
Ｒ３ＥＲＳＥＲＧＬＵ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＬＹ
Ｓ　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＡＲＧ　ＴＹＲＩＬＥ　　ＬＥＵ
　　ＡＳＰ　　ＧＬＹ　　ＩＬＥ　　ＳＥＲＡＬＡ　　
ＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＬＹＳ　　ＧＬＵＴＨＲＣＹＳ　
　ＡＳＮ　　ＬＹＳ　　ＳＥＲＡＳＮ　　？ｔＥＴ　　
ＣＹＳ　　ＧＬＵ　　ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　　ＧＬＵ　
　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＡＳＮ　
　ＡＳＮ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　ＬＥＵＰＲＯＬＹＳ
　　ＭＥＴ　　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＬＹＳ　　ＡＳＰ
　　ＧＬＹ　　ＣＹＳ　　ＰＨＥ　　ＧＬＮＳＥＲＧＬ
Ｙ　　ＰＨＥ　　ＡＳＮ　　ＧＬＵ　　ＧＬＵ　　ＴＨ
ＲＣＹＳ　　ＬＥＵ　　ＶＡＬ　　ＬＹＳＩＬＥ　　Ｉ
ＬＥ　ＴＨＲＧＬＹ　　ＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＧＬＵ　
　ＰＨＥ　ＧＬＵ　　ＶＡＬ　　ＴＹＲＬＥＵ　　ＧＬ
Ｕ　　ＴＹＲＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＳＮ　　ＡＲＧ　
　ＰＨＥ　ＧＬＵ　　ＳＥＲ５ＥＲＧＬＵ　　ＧＬＵ　
　ＧＬＮ　　ＡＬＡ　　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬ　
ＧＬＮ　　ＭＥＴ　　ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ　　ＶＡＬ　
　ＬＥｔｌ　　ＩＬＥ　ＧＬＮ　　ＰＨＥ　　ＬＥＵ　
　ＧＬＮ　　ＬＹＳ　　ＬＹＳ　　ＡＬＡＬＹＳ　　Ａ
ＳＮ　　ＬＥＤ　　Ａ’ＳＰ　　ＡＬＡ　　ＩＬＥ　　
ＴＨＲＴＨＲＰＩＩＯＡＳＰ　　ＰＲＯＴＨＲＴＨＲＡ
ＳＮ　　ＡＬＡ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＴＨＲ
ＬＹＳ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮＡＬＡ　　ＧＬＮ　　ＡＳ
Ｎ　　ＧＬＮ　　ＴＲＰ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＳ
Ｐ　　ＭＥＴ　　ＴＨＲＴＨＲＨＩＳ　　ＬＥ’Ｕ　　
ＩＬＥ　　ＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＳＥＲＰＨＥ　　ＬＹ
Ｓ　　ＧＬＵ　　Ｐ）ＩＥ　　ＬＥＵＧＬＮ　ＳＥＲＳ
ＥＲＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＲＧ
　　ＧＬＮ　　ＭＥＴ（２）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ　ＮａＣＡを含む、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＡ緩衝液、ｐＨ７，８中で得られた△ＨＩ　Ｌ−２−
ＢＣＤＦ８０ｖｇとヒトプラズマカリクレインを３７℃
、１５時間反応後、逆相ＨＰＬＣで＾１ａ−ＢＣＤＦ相
当画分を分取した。これを、プロテインシークエンサー
にてＮ末端付近のアミノ酸配列を分析した結果△旧Ｌ−
２−ＢＣＤＦが定量的にＡｌａ−ＢＣ叶蛋白に変換され
たことが確認された。なおｒ　Ａｌａ−ＢＣＤ、ＦＪと
は、ＢＣ叶のＮ末端にＡｌａ　１個が付加したものであ
り、具体的には下記のアミノ酸配列を有する。

ＡＬＡ　　ＰＲＯＶＡＬ　　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　Ｇ
ＬＵ　　ＡＳＰ　　ＳＥＲＬＹＳ　　ＡＳＰＶＡＬ　　
ＡＬＡ　　ＡＬＡ　　ＰＲＯＨＩＳ　　ＡＲＧ　　ＧＬ
Ｎ　　ＰＲＯＬＥＵ　　ＴＨＲ５ＥＲ５ＥＲＧＬＵ　　
ＡＲＧ　　ＩＬＥ　　ＡＳＰ　　ＬＹＳ　　ＧＬＮ　　
ＩＬＥ　　ＡＲＧ　　ＴＹＲＩＬＥＬＥＵ　ＡＳＰ　Ｇ
ＬＹ　ＩＬＥ　ＳＥＲＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＬＹＳ
　ＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　　ＡＳＮ　　ＬＹＳ　　ＳＥ
ＲＡＳＮ　　ＭＥＴ　　ＣＹＳ　　ＧＬＵ　　ＳＥＲＳ
ＥＲＬＹＳＧＬＵ　　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＬＡ　　
ＧＬＵ　　ＡＳＮ　　ＡＳＮ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　
ＬＥＵ　　ＰＲＯＬＹＳ　　ＭＥＴ　　ＡＬＡ　　ＧＬ
Ｕ　　ＬＹＳ　　ＡＳＰ　　ＧＬＹ　　ＣＹＳ　　ＰＨ
Ｅ　　ＧＬＮ　　５ＥＲＧＬＹ　　ＰＨＦ、　　ＡＳＮ
　　ＧＬＵ　　ＧＬＵ　　ＴＨＲＣＹＳ　　ＬＥＵ　　
ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥＩＬＥ　ＴＨＲＧＬＹ　Ｌ
ＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＴＹ
ＲＬＥＵＧＬＵ　　ＴＹＲＬＥＤ　　ＧＬＮ　　ＡＳＮ
　　ＡＲＧ　　ＰＨＥ　　ＧＬＵ　　ＳＥＲＳＥＲＧＬ
ＵＧＬＵ　　ＧＬＮ　　ＡＬＡ　　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　
　ＶＡＬ　　ＧＬＮ　　ＭＥＴ　　ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ
ＶＡＬ　　ＬＥＵ　　ＩＬＥ　　ＧＬＮ　　ＰＨＥ　　
ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＬＹＳ　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　
ＬＹＳ八Ｓへ　　ＬＥＵ　　ＡＳＰ　　ＡＬＡ　　ＩＬ
Ｅ　　ＴＨＲＴＨＲＰＲＯ八ＳＰ　　ＰＲＯＴＨＲＴＨ
ＲＡＳＮ　　ＡＬＡ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵ　　Ｔ
ＨＲＬＹＳ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＬ八へＬＮ　　
ＡＳＮ　　ＧＬＮ　　ＴＲＰ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　
ＡＳＰ　　門ＥＴ　　ＴＨＲＴＨＲＨｌｓＬＥＵ　ＩＬ
Ｅ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＩＥ　ＬＹＳ　ＧＬＩＩ
　ＰＩ（Ｅ　ＬＥＵ　ＧＬＮＳＥＲＳＥＲＬＥＵ　　Ａ
ＲＧ　　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　　Ｍ
ＥＴ（３）アミノペプチダーゼＰによるＮ末端Ａｌａの
除去 アミノペプチダーゼＰは、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、皿。

５２１　（１９７０）に記載されている方法により精製
を行なった。

（２）テ得られたＡｌａ−ＢＣＤＦ溶液を、０．４ｍＭ
　ＭｎＣＡ　２を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃｊ！
緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘＧ
　−２５によるゲル濾過でＡｌａ−ＢＣＤＦ相当画分を
得た。このようにして得られたＡｌａ−ＢＣＤＦ　５０
μｇにアミノペプチダーゼＰを添加し、３７℃、１６時
間反応後、逆相ＨＰＬＣ：テＢＣＤＦ相当画分を分取し
た。さらに、プロテインシークエンサーにてＮ末端側の
アミノ酸配列を分析した結果、Ａｌａ−ＢＣＤＦが定量
的にＢＣ叶に変換されたことが確認された。なお表３に
は、Ａｌａ−ＢＣ叶およびＢＣ叶の活性を示す。

表３　　ｐＴＢＣＤＦ−１２／ＨＢＩＯＩ生産物ノＢＣ
ＤＦ活性（リバース・プラーク法による） ＢＣＤＦ活性を示す。

実施例１１ プラスミドｐＴＢＣＤＦ−０１及びｐＴ９−１１を用い
てＣ末端の欠落したヒ）　ＢＣＤＦを発現する組換えＤ
ＮＡを以下のように構築した。（第１３図）ｉ）プラス
ミドｐＴＢＣＤＦ−０１を制限酵素Ｘｂａｌで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏｗ）処理し、Ｐ
ｖｕｌで切断後、アガロースゲル電気泳動によりｔｒｐ
　ｐｌｏおよび３′欠落ヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを含む
小さなりＮＡ断片を分離した。一方、プラスミドｐＴ９
−１１を制限酵素ＢａｍＨＩおよびｐｖｕＩで切断し、
アガロースゲル電気泳動によりｔｒｐ　Ａターミネータ
−を含む大きいＤＮＡ断片を回収した。

この様にして調整した両ＤＮＡ断片と合成りＮＡ（Ｃ）
　　　（”ＣＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＴＧ八八ＴＧＡＡＴ
３　′　とへへ′　ＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＣ
ＧＧＧＣＴＡＧＧ″′）を混合し、Ｔ　４　ＤＮＡリガ
ーゼを使って結合させた。得られた組換えＤＮＡを、エ
シェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株へ導入し、アンピシリン
抵抗性を有する株を選択した。

分離した株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による
切断試験および結合部位付近の塩基配列の決定を行なう
ことにより、ｐＴＢＣＤＦ−０３を保持する菌を選定し
た（ｐＴＢＣＤＦ−０３／ＨＢ　１０１　）。

尚、ｐＴＢＣＤＦ−０３はＢＣＤＦ　ｃＤＮＡの３′末
端側の一部が欠損している遺伝子を有するプラスミドで
ある。

また、ｐＴＢＣＤＦ−０３／ＨＢ　１０１が生産するポ
リペプチドは下記のアミノ酸配列を有するものと考えら
れる。

ＰＲＯＶＡＬ　　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　ＧＬＵ　　Ａ
ＳＰ　　ＳＥＲＬＹＳ　　ＡＳＰ　　ＶＡＬＡＬＡ　Ａ
ＬＡ　ＰＲＯ旧Ｓ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＲＯＬＥＵ　Ｔ
ＩＩＲＳＥＲ５ＥＲＧ［、Ｕ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＳＰ
　ＬＹＳ　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＡＲＧ　ＴＹＲＩＬＥ　Ｌ
ＥＵＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＳＥＲＡＬＡ　ＬＥＵ　
ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳＡＳＮ　　ＬＹ
Ｓ　　ＳＥＲＡＳＮ　　ＭＥＴ　　ＣＹＳ　　ＧＬ［ｌ
　　ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　　ＧＬＵ八ＬＡ　　ＬＥＵ　
　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＡＳＮ　　ＡＳＮ　　ＬＥＵ　
　ＡＳＮ　　ＬＥＵ　　ＰＲＯＬＹＳＭＥＴ　　ＡＬＡ
　　ＧＬＵ　　ＬＹＳ　　ＡＳＰ　　ＧＬＹ　　ＣＹＳ
　　ＰＨＥ　　ＧＬＮ　　ＳＥＲＧＬＹＰＩ（Ｅ　　Ａ
ＳＮ　　ＧＬＵ　　ＧＬＵ　　ＴＨＲＣＹＳ　　ＬＥＵ
　　ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥ　　ＩＬＥＴｌ（ＲＧ
ＬＹ　　ＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＧＬＵ　　ＰＩＥ　　Ｇ
ＬＵ　　ＶＡＬ　　ＴＹＲＬＥＵ　　ＧＬｔｌＴＹＲＬ
ＥＵ　ＧＬＮ　　ＡＳＮ　　ＡＲＧ　　ＰＨＥ　ＧＬＵ
　　ＳＥＲＳＥＲＧＬＵ　ＧＬＵＧＬＮ　　ＡＬＡ　　
ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬ　　ＧＬＮ　　ＭＥＴ　　
ＳＥＩ？　　ＴＨＲＬＹＳ　　ＶＡＬＬＥＤ　　ＩＬＥ
　　ＧＬＮ　　ＰＨＥ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＬＹＳ
　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＬＹＳ　　ＡＳＮＬＥＤ　　
ＡＬＡ ｉｉ　）　ｐＴＢＣＤＦ−０３／　ＨＢ　１０１から実
施例８と同様に培養抽出液を調製した。表４に示す如く
、ｐＴＢＣＤＦ−０３／ＨＢ　１０１の培養抽出液はＢ
ＣＤＦ活性を示した。

表４　組み換えＤＮＡ保持菌の培養抽出液のＢＣ叶活性
（リバース・プラーク法による）

【図面の簡単な説明】

第１図は、サル細胞発現用組み換えＤＮＡの構築法。第
２図は、Ｅｌ　ｉｓａ法で測定したｐＢＳＦ　２−３８
ｃＤＮＡを遺伝子導入したサル細胞ＣＯ５−７の培養上
清のＢＣＤＦ活性。第３図は、リバース・プラーク法に
より測定したｐＢＳＦ　２−３８　ｃＤＮＡを遺伝子導
入したサル細胞ＣＯ３−７の培養上清のＢＣＤＦ活性。 第４図は、ｐＢＳＦ　２−３８　ｃＤＮＡインサートの
ノーザンブロッティング分析。第５図は、ＢＣＤＦの塩
素配列及びアミノ酸配列。第６図は制限酵素地図。 第７図はプラスミドｐＴ１３ｓ　（Ｎｃｏ）の構築図。 第８図は合成型ヒトインターロイキン２（ＨＩＬ−２）
の塩基配列及び制限酵素地図。第９図はプラスミドｐＴ
ＢＣＤＦ−０１の構築図。第１０図はプラスミドｐＴＢ
ＣＤＦ−０２の構築図。第１１図はプラスミドｐＴＢＣ
ＤＦ−１１の構築図。第１２図はプラスミドｐＴＢＣＤ
Ｆ−１２の構築図。第１３図はプラスミドｐＴＢＣＤＦ
−０３の構築図。 ＯＸ５４　　　Ｘ１８　　　　Ｘ６ サンプルの希釈度 サンプルの希釈度 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡｌｏ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＢ細胞分子化因子（以下ＢＣＤＦと記す）活
   性を有するポリペプチド。
2. （２）ポリペプチドがＮ末端にＰｒｏを有するものであ
   る特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
3. （３）ポリペプチドがＣ末端にＭｅｔを有するものであ
   る特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
4. （４）ポリペプチドがＮ末端にＰｒｏを有し、かつＣ末
   端にＭｅｔを有するものである特許請求の範囲第１項記
   載のポリペプチド。
5. （５）ポリペプチドが該ポリペプチドの構造中にＰｒｏ
   −Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕのアミノ酸
   部分配列を有し、かつ、糖鎖を含有しないものである特
   許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
6. （６）ポリペプチドが原核生物細胞で生産されたもので
   ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
7. （７）ポリペプチドが該ポリペプチド鎖に物理的、化学
   的改変を加えた修飾体であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のポリペプチド。
8. （８）ポリペプチドが下記のアミノ酸配列（ I ）を有
   するものである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチ
   ド。 アミノ酸配列（ I ）： 【アミノ酸配列があります】
9. （９）ポリペプチドが下記のアミノ酸配列（II）を有す
   るものである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
   。 アミノ酸配列（II）： 【アミノ酸配列があります】
10. （１０）ポリペプチドが下記のアミノ酸配列（III）を
    有するものである特許請求の範囲第１項記載のポリペプ
    チド。 アミノ酸配列（III）：
11. （１１）ポリペプチドが下記のアミノ酸配列（IV）を有
    するものである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチ
    ド。 アミノ酸配列（IV）： 【アミノ酸配列があります】
12. （１２）ポリペプチドが下記のアミノ酸配列（Ｖ）を有
    するものである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチ
    ド アミノ酸配列（Ｖ）：
13. （１３）ポリペプチドが該ポリペプチド構造中の１個ま
    たは複数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置き換えた構造
    を有するものである特許請求の範囲第８項ないし第１２
    項記載のポリペプチド。
14. （１４）ポリペプチドが該ポリペプチドのＮ末端または
    Ｃ末端より１個もしくは複数個のアミノ酸が欠損し、か
    つ連続している複数のアミノ酸からなるものである特許
    請求の範囲第８項ないし第１２項記載のポリペプチド。
15. （１５）ポリペプチドが該ポリペプチドのＮ末端及び／
    またはＣ末端に１個もしくは複数個のアミノ酸が付加さ
    れたものである特許請求の範囲第８項ないし第１２項記
    載のポリペプチド。
16. （１６）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
    ドする遺伝子及び原核生物の細胞内で複製可能なベクタ
    ーＤＮＡよりなることを特徴とする組み換えＤＮＡ。
17. （１７）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
    ドする遺伝子及び原核生物の細胞内で複製可能なベクタ
    ーＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡにより形質転換された
    ことを特徴とする原核生物細胞。
18. （１８）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
    ドする遺伝子及び原核生物の細胞内で複製可能なベクタ
    ーＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡにより形質転換された
    原核生物細胞を培地中にて培養し、生産されるヒトＢＣ
    ＤＦを採取することを特徴とするヒトＢＣＤＦの製造法
    。