JPS6315551B2 - - Google Patents
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Description
本発明は免疫学的検査用試薬に関し、特に粒子
状担体に免疫活性物質を固定化してなる免疫活性
粒子を用いてヒト又は動物の体液中の成分を検出
若しくは測定又は細胞を識別する免疫学的検査用
試薬における粒子状担体の改良に関する。 抗原と抗体との反応を利用してその一方を免疫
学的に検出又は定量する場合に、測定したい物質
に結合する側の物質を粒子状担体に固定化させて
おき、その粒子が被測定物質の存在下で凝集を起
こす現象を利用して高感度の測定を行なう方法は
免疫学的臨床検査の重要な手段となつている。ま
た逆に測定しない物質を粒子状担体に固定化させ
ておき、その被測定物質と特異的に反応する抗原
又は抗体の存在による被測定物質固定化粒子の凝
集が、被検液中の被測定物質の存在により阻止さ
れることにより被測定物質を検出又は定量する方
法も免疫学的臨床検査において広く用いられてい
る。また特定の細胞と選択的に結合する物質を粒
子状担体に固定させておき、その粒子が細胞に結
合するか否かによつて細胞の識別を行なう方法も
免疫学的検査の手段としてしばしば採用されてい
る。 このような免疫活性粒子を用いた免疫学的検査
用試薬における粒子状担体としては、従来、ヒト
を含む哺乳動物や鳥類の赤血球、カオリンや炭素
など無機物の粒子、天然ゴムラテツクスやポリス
チレンなどの有機高分子化合物のラテツクスが凝
集反応用として広く用いられている。これらのう
ち赤血球は多種類の抗原・抗体を固定化すること
が可能で応用範囲が最も広い。しかし採取する動
物個体によつて品質等に差があること、安定性に
難があり保存が難しいこと、またヒト血清により
非特異的に凝集する場合があることなどの問題点
がある。非生物由来の粒子として最も広く用いら
れているのはポリスチレン粒子であり、これは合
成高分子化合物であるところから品質を一定にす
ることが可能でまたそれ自体では安定である。ポ
リスチレンは疎水性で種々の蛋白質を吸着する性
質があるため、通常ポリスチレンへの抗原又は抗
体の固定化は物理吸着によつて行なわれる。しか
し物理吸着によつて抗原又は抗体を固定化した場
合には固定化した抗原（又は抗体）と遊離の抗原
（又は抗体）との間に平衡が存在し、そのため測
定の目的物質である対応する抗体（又は抗原）に
対して粒子に固定化した抗原（又は抗体）と遊離
の抗原（又は抗体）との間に競争反応が起こり、
その競争反応は凝集に対して抑制的に作用する。
その結果、多くの例において感度と安定性の不足
が指摘されている。また当然のことながらポリス
チレンに対して物理的に吸着されにくい物質は固
定化することができない。これらの問題点のため
にポリスチレン粒子は赤血球を担体とする場合に
比較して限られた範囲でしか実用に供されていな
い。これらの問題点の解決を図る目的で、最近、
スチレン−メタクリル酸コポリマーラテツクスに
ヒト絨毛性ゴナドトロピンをカルボジイミドを使
用して結合させた試薬（DT2、649、218）、カル
ボキシル化スチレン−ブタジエンコポリマー、カ
ルボキシル化ポリスチレン、アミノ基をもつカル
ボキシル化ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、
アクリロニトリルポリマー、メタクリル酸ポリマ
ー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコ
ポリマー、ポリ酢酸ビニルアクリレート、ポリビ
ニルピリジン、塩化ビニル−アクリレートコポリ
マーなど種々のラテツクスポリマーにヒト絨毛性
コナドトロピン、ヒト血清アルブミン又は変性ガ
ンマグロブリンをアミド結合を介して縮合させた
粒径0.01〜0.9ミクロンの粒子からなる試薬（特
公昭53−12966）、メタクリル酸、２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート及びメチルメタクリレート
を共重合して製造したヒドロキシル基とカルボキ
シル基を含有するメチルメタクリレート系ラテツ
クスにトレポネーマ抗原を臭化シアノゲン又はカ
ルボジイミド法で結合させた試薬（臨床病理27、
補冊、522頁（1978）などの、共有結合により抗
原又は抗体を担体に結合させた試薬が提案されて
いる。しかし上記した免疫学的検査用試薬におけ
る担体の多く、たとえばスチレン−メタクリル酸
コポリマーはポリマー主成分に疎水性部分が多量
に含まれているため蛋白質を吸着する傾向を有し
ている。一般にヒト又は動物の体液中には多種類
の蛋白質が含まれ、とくに血漿又は血清中にはこ
れが高濃度で含有されている。検体体液から蛋白
質が担体に吸着されると、それが目的とする抗原
−抗体反応に干渉し、凝集反応の選択性や感度の
低下をもたらすおそれがある。また上記した担体
の一部、たえとばアクリル酸ポリマーは電解質で
ある。一般に多量の電解質の存在は抗原と抗体と
の結合を弱めることが知られており、凝集反応を
目的とする担体として電解質ポリマーを使用する
ことは好ましいことではない。さらにアクリル酸
ポリマーやメタクリル酸ポリマーは等電点PHの高
い蛋白質とイオン的に結合する。目的とする免疫
反応の構成因子以外の蛋白質が担体に結合するこ
とは前記したように好ましいことではない。そこ
で本発明者等は免疫活性物質を上記したような化
学結合により固定化することが可能にして、検体
体液に対して安定で非特異的凝集を起こしにくく
また検体中の蛋白質の非特異的吸着や、細胞に対
する非特異的付着のない免疫学的検査用試薬担体
を開発すべく検討した結果、ここに効果の顕著な
本発明に到達した。 即ち本発明は、粒子担体に免疫活性物質を固定
化してなる免疫学的検査用試薬において、粒子状
担体として 式 （但しＲは水素またはメチル基を示す） にて示される反復単位を有する架橋重合体よりな
る平均直径0.03μｍ〜10μｍの微粒子を用いてなる
免疫学的検査用試薬を提供するものである。 本発明の微粒子状担体はたとえば次の方法によ
つて製造することができる。 その１は、2.3−ジオキシプロピルアクリレー
ト及び／又はメタクリレートを単独又は他の共重
合性単量体と共に重合する方法である。 その２は、グリシジルアクリレート及び／又は
メタクリレートを単独又は他の共重合性単量体と
共に重合し、生成重合体中のエポキシ基を加水分
解によつて開環しα、β−ジオール体に変換する
方法である。この場合、エポキシ基の加水分解は
弱酸性又は弱アルカリ性条件下に実施することが
望ましい。 その３は、アクリル酸及び１又はメタクリル酸
のアルキル、シクロアルキル又はアラルキルエス
テルを単独又は他の共重合性単量体と共に重合
し、生成重合体とグリセリンとを反応させてエス
テル交換によつて重合体中のエステル残基を本発
明所定のものに変換する方法である。 その４は、アクリル酸及び／又はメタクリル酸
を単独又は他の共重合性単量体と共に重合し、生
成重合体をグリセリンと反応させることによつて
重合体中のカルボキシル基をエステル化する方法
である。 上記において架橋結合は実質的不溶性を示す程
度に３次元化していればよい。また共重合性単量
体を共存させる場合には、その量は50モル％以下
であることが好ましい。 共重合性単量体として適当なものは、例えば２
−オキシエチルアクリレート、２−オキシエチル
メタクリレート、重合度２ないし25のポリエチレ
ングリコールモノアルキルエーテルのメタクリル
酸エステル、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニルなどであ
る。２，３−ジオキプロピルアクリレート及び／
又はメタクリレート、グリシジルアクリレート及
び／又はメタクリレートを重合する場合には通常
単量体の中に炭素炭素二重結合を分子内に２基以
上含む多官能性単量体が少量含まれており、また
重合中の副反応によつても生成重合体に架橋構造
が形成され、不溶性となる。したがつて架橋剤を
重合系に添加することは必須ではないが、通常重
合に当つて重合性炭素炭素二重結合を分子内に２
基以上含む多官能性単量体を添加して積極的に重
合体を架橋させることがのぞましい。そのような
目的で重合系に添加するに適した多官能性単量体
は多数存在するが、若干例をあげれば、ジビニル
ベンゼン、エチレングリコールジメタクリレー
ト、Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド、コ
ハク酸ジビニル、コハク酸ジアリル、メタクリル
酸ビニル、メタクリル酸アリル、トリアリルシア
ヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどであ
る。また架橋結合は重合反応後生成重合体の反応
性を利用してこれを多官能化合物と反応させるこ
とによつて導入することもできる。例えば単量体
としてグリシジルアクリレート及び／又はメタク
リレートを用いた場合には生成重合体に含まれる
エボキシ基とエチレンジアミンなどのジアミンと
を反応させることにより重合体を架橋重合体にす
ることができる。重合系にアクリル酸、メタクリ
ル酸、マレイン酸、フマル酸または無水マレイン
酸などの不飽和カルボン酸を共重合成分として加
えることによりこれらに由来するカルボキシル基
を免疫活性物質を固定化させるための官能基とし
て利用することもできる。ただしこのような電解
質単量体は全単量体中の10モル％以下にとどめる
のがのぞましい。 重合反応は通常乳化重合、沈澱重合又は懸濁重
合によつて好ましく行なわれる。これらいずれの
方法も重合と同時に重合体が粒子状になつて析出
するので本発明の目的に適している。とくに好ま
しいのは沈澱重合である。沈澱重合は、単量体は
溶解するが重合によつて生成する重合体は溶解し
ない媒体中で重合を行なう方法であつて、単量体
と重合媒体との組合せを選択することによつて生
成する重合体粒子の平均直径を0.03ないし10μｍ
の範囲に入るよう調節することが比較的容易であ
り、粒径の分布も比較的狭い。また沈澱重合は、
乳化重合や懸濁重合の場合と異なつて、乳化剤や
懸沈安定剤を使用しないので、重合反応後これら
の添加剤を除去する必要がないのも利点の一つで
ある。粒子の形状は多くの場合球形であるが球形
であることは必要条件ではなく不規則な形状であ
つても差し支えない。不規則な形状の粒子の直径
は最大径と最小径の和の1/2とする。平均直径は
式(1)によつて定義されるによつて表わされる。
ただしdiはｉ番目の粒子 ＝N 〓i=1 di／Ｎ …(1) の直径、Ｎは粒子の総数である。凝集反応が判定
しやすいのは経験的に平均直径が0.1μｍ以上10μ
ｍ以下の場合である。また細胞標識の目的には平
均直径は0.03μｍ以上5μｍ以下の範囲が好ましい。
また染料ないし顔料により適当に着色するか螢光
を付与した粒子は凝集反応、細胞標識のいずれの
目的に対しても好都合である。 免疫活性物質の粒子への固定化は共有結合によ
つて好ましく行なわれる。ここで免疫活性物質と
は体液中の測定の目的となる成分又は該成分と特
異的に結合する物質又は細胞と特異的に結合する
物質を意味し検査目的に応じ適宜周知の免疫活性
物質が選択されうる。免疫活性物質は、通常蛋白
質であるか、その構成成分として蛋白質部分を含
んでいるため、蛋白質を固定化する公知の方法に
より本発明微粒子状担体上に固定化することがで
きる。例えば本発明微粒子状担体は分子中にヒド
ロキシル基を有するので臭化シアノゲンによりこ
れを活性化して蛋白質と反応させることにより固
定化することができる。また共重合により生成重
合体にカルボキシル基を導入しておけばカルボジ
イミドにより蛋白質のアミノ基とアミド結合を形
成させて免疫活性物質を固定化することができ
る。またグリシジルアクリレート及び／又はメタ
クリレートを用いて重合した場合には、生成重合
体のエポキシ基の一部にアンモニア又はエチレン
ジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどの脂肪族
ジアミンを反応させるこにより重合体に１級アミ
ノ基を導入した後、残るエポキシ基を加水分解し
てジオールに変換することにより、１級アミノ基
を含有する親水性微粒子状担体を調製することが
できる。またエポキシ基に対するアンモニア又は
ジアミンの反応と加水分解の順序を逆にして、加
水分解を先に行なうが一部のエポキシ基は未反応
のまま残しておき、残存エポキシ基をアミノ化し
てもよい。この加水分解は通常酸性又はアルカリ
性水溶液で重合体微粒子を処理することにより実
施され、重合体中のエポキシ基を加水分解してジ
オールに変換するものである。その際反応条件が
過酷であるとエステル結合まで加水分解されるの
でそれを避けるためにできるだけ緩和な条件を選
ぶことが望ましい。アルカリはエステルを切断す
る傾向が強いので一般的に言えば酸性の条件を使
用するのが好ましい。酸としては例えば硫酸、塩
酸、硝酸、リン酸などの無機酸又はベンゼンスル
ホン酸、トルエンスルホン酸などの有機酸の希薄
水溶液が好ましい。酸濃度としては0.01ないし１
規定の範囲が好ましい。加水分解温度は０℃ない
し60℃の範囲が好ましい。それより高温では副反
応が無視できなくなる。上記のように反応条件が
緩和であるため反応速度が小さく、十分な撹拌を
行なつても通常反応完結には相当の時間を要す
る。そこで反応系にアセトン、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサンなど水に可溶で該重合体を膨潤さ
せる能力のある有機溶媒を添加すると反応を促進
することができる。これらの溶媒によつて重合体
が膨潤し酸が重合体粒子内部に拡散するのを助け
られるものと解釈されるが、その結果加水分解の
反応時間を短縮することができる。加水分解終了
後、粒子は通常十分量の水で洗浄される。さらに
炭酸水素ナトリウム水溶液等で洗浄してもよい。
このようにしてほとんど副反応を起すことなくエ
ポキシ基を１，２−ジオールに変換し、2.3−ジ
オキシプロピルアクリレート及び／又はメタクリ
レートを主成分とする重合体粒子を製造すること
ができる。本発明重合体と１分子中に１級アミノ
基を２基以上有するポリアミノ化合物とを反応さ
せエステルアミド交換を行なうことによつて、担
体の微粒子状重合体中にアミノ基を導入すること
も可能である。 このようにして製造したアミノ基含有微粒子に
は、既知の方法によりアミノ基の反応性を利用し
て免疫活性物質を固定化することができる。免疫
活性物質がアミノ基を有する場合には、分子内に
アミノ基と結合し得る官能基を２基以上有する化
合物を結合剤として、担体に固定化する方法が好
ましい。とくに好ましい結合剤はグルタルアルデ
ヒドで代表されるα，ω−ジアルデヒドである。
またポリアクロレイン、ジアルデヒドデンプン、
ジアルデヒドデキストランのような高分子ポリア
ルデヒドも良好な結合剤である。固定化に当つて
はアミノ基含有微粒子状重合体を結合剤で処理
し、次いで該微粒子状重合体を洗浄して未反応の
遊離結合剤を除いた後、免疫活性物質と接触させ
れば、免疫活性物質の固定化による活性低下を最
小限にとどめることができる。このようにしてジ
アルデヒドを結合剤として免疫活性物質を微粒子
状担体に固定化すれば、通常その結合は強固であ
り、固定化された免疫活性物質が微粒子状担体か
ら離脱することはないが、場合によつてはさらに
その結合を強化するために水素化ホウ素ナトリウ
ムまたは水素化シアンホウ素ナトリウムで処理す
ることが有効である。 重合体のカルボキシル基と免疫活性物質のアミ
ノ基とからアミド結合を生成させるためには、カ
ルボジイミドを縮合剤として両者を反応させれば
１段階で目的を達することができる。しかし免疫
活性物質の失活を最小限にするためには、カルボ
ジイミドにより重合体のカルボキシル基とＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドとを縮合させて生成させ
た活性エステルにアミノ基を有する免疫活性物質
を反応させる方法がすすめられる。 また免疫活性物質を微粒子状担体に結合させる
に当つていわゆるスペーサーを介して結合させる
ことが有効な場合もある。例えば微粒子重合体の
官能基としてカルボキシル基が存在する場合、ε
−アミノカプロン酸やヘキサメチレンジアミンな
どのスペーサーを介して免疫活性物質を結合する
方法も好ましい。免疫活性物質の微粒子担体への
固定化法は上記の例に限定されるものではなく、
また固定化される免疫活性物質の個々の場合に応
じて免疫活性保持の度合の高い固定化法を経験的
に選ぶことができる。 本発明において免疫活性物質とは抗原および抗
体のみでなく、補体、Fcレセプター、補体レセ
プターなど液性免疫反応ないし細胞性免疫反応に
関与してある物質又は細胞に特異的に結合する物
質を意味するものとする。 微粒子に結合固定化する対象となる免疫活性物
質としては、例えば梅毒トレポネーマ抗原、Ｂ型
肝炎表面抗原（HBs抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原に
対する抗体（抗HBs抗体）、風疹抗原、トキソプ
ラズマ抗原、ストレプトリジンＯ、抗ストレプト
リジンＯ抗体、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（HCG）、抗HCG抗体、熱凝集
ヒトIgG、核蛋白、DNA、抗CR抗体、エストロ
ゲン、抗エストロゲン抗体、抗C1q抗体、抗C1r
抗体、抗C1s抗体、抗C3抗体、抗C4抗体抗C4抗
体、ヒトIgG、ヒトIgM、抗ヒトIgG抗体、抗ヒ
トIgM抗体、プロテインＡなど周知の免疫活性物
質を検査目的に応じ適宜選択することができる。 本発明の検査試薬を構成する微粒子は、検体体
液に対して安定で非特異的凝集を起こしにくくま
た検体中の蛋白質を非特異的に吸着することがな
いという特長を有し、免疫反応を粒子の凝集によ
り検出ないし測定するという目的に非常によく合
致していると共に細胞に対する非特異的付着がな
く細胞標識という目的に対しても非常によく合致
している。次に本発明を実施例により説明する。 実施例 １ （担体微粒子調製） グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールジメタ
クリレートの３者を85.7：9.5：4.8のモル比で混
合し、その単量体混合物24部（重量、以下同様）
をプロピオン酸エチル76部に溶解し、２，2′−ア
ゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロ
ニトリル）0.13部を添加して重合させた。重合開
始剤の初濃度は4.7ｍmol／である。重合はア
ルゴン雰囲気下40℃で３時間静置状態で行なつ
た。所定時間経過後白濁した重合混合物をアセト
ンに注ぎ、1500×ｇ、10分間遠心分離し、沈降し
た粒子をエタノールで再分散して洗浄、次いで再
び遠心分離した。減圧下に乾燥して11.3部の微粒
子状重合体を得た。この重合体微粒子１部を水50
部、アセトン50部および濃硫酸0.2部の混合液に
分散し、30℃で７日間撹拌して加水分解を行なつ
た。この重合体微粒子の光学顕微写真（1000倍）
を撮り、粒子直径の分布を数えると表１の通りで
ある。直径の平均は3.52μｍ、標準偏差は0.447μ
ｍ、したがつて標準偏差／平均＝0.126である。
状担体に免疫活性物質を固定化してなる免疫活性
粒子を用いてヒト又は動物の体液中の成分を検出
若しくは測定又は細胞を識別する免疫学的検査用
試薬における粒子状担体の改良に関する。 抗原と抗体との反応を利用してその一方を免疫
学的に検出又は定量する場合に、測定したい物質
に結合する側の物質を粒子状担体に固定化させて
おき、その粒子が被測定物質の存在下で凝集を起
こす現象を利用して高感度の測定を行なう方法は
免疫学的臨床検査の重要な手段となつている。ま
た逆に測定しない物質を粒子状担体に固定化させ
ておき、その被測定物質と特異的に反応する抗原
又は抗体の存在による被測定物質固定化粒子の凝
集が、被検液中の被測定物質の存在により阻止さ
れることにより被測定物質を検出又は定量する方
法も免疫学的臨床検査において広く用いられてい
る。また特定の細胞と選択的に結合する物質を粒
子状担体に固定させておき、その粒子が細胞に結
合するか否かによつて細胞の識別を行なう方法も
免疫学的検査の手段としてしばしば採用されてい
る。 このような免疫活性粒子を用いた免疫学的検査
用試薬における粒子状担体としては、従来、ヒト
を含む哺乳動物や鳥類の赤血球、カオリンや炭素
など無機物の粒子、天然ゴムラテツクスやポリス
チレンなどの有機高分子化合物のラテツクスが凝
集反応用として広く用いられている。これらのう
ち赤血球は多種類の抗原・抗体を固定化すること
が可能で応用範囲が最も広い。しかし採取する動
物個体によつて品質等に差があること、安定性に
難があり保存が難しいこと、またヒト血清により
非特異的に凝集する場合があることなどの問題点
がある。非生物由来の粒子として最も広く用いら
れているのはポリスチレン粒子であり、これは合
成高分子化合物であるところから品質を一定にす
ることが可能でまたそれ自体では安定である。ポ
リスチレンは疎水性で種々の蛋白質を吸着する性
質があるため、通常ポリスチレンへの抗原又は抗
体の固定化は物理吸着によつて行なわれる。しか
し物理吸着によつて抗原又は抗体を固定化した場
合には固定化した抗原（又は抗体）と遊離の抗原
（又は抗体）との間に平衡が存在し、そのため測
定の目的物質である対応する抗体（又は抗原）に
対して粒子に固定化した抗原（又は抗体）と遊離
の抗原（又は抗体）との間に競争反応が起こり、
その競争反応は凝集に対して抑制的に作用する。
その結果、多くの例において感度と安定性の不足
が指摘されている。また当然のことながらポリス
チレンに対して物理的に吸着されにくい物質は固
定化することができない。これらの問題点のため
にポリスチレン粒子は赤血球を担体とする場合に
比較して限られた範囲でしか実用に供されていな
い。これらの問題点の解決を図る目的で、最近、
スチレン−メタクリル酸コポリマーラテツクスに
ヒト絨毛性ゴナドトロピンをカルボジイミドを使
用して結合させた試薬（DT2、649、218）、カル
ボキシル化スチレン−ブタジエンコポリマー、カ
ルボキシル化ポリスチレン、アミノ基をもつカル
ボキシル化ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、
アクリロニトリルポリマー、メタクリル酸ポリマ
ー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコ
ポリマー、ポリ酢酸ビニルアクリレート、ポリビ
ニルピリジン、塩化ビニル−アクリレートコポリ
マーなど種々のラテツクスポリマーにヒト絨毛性
コナドトロピン、ヒト血清アルブミン又は変性ガ
ンマグロブリンをアミド結合を介して縮合させた
粒径0.01〜0.9ミクロンの粒子からなる試薬（特
公昭53−12966）、メタクリル酸、２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート及びメチルメタクリレート
を共重合して製造したヒドロキシル基とカルボキ
シル基を含有するメチルメタクリレート系ラテツ
クスにトレポネーマ抗原を臭化シアノゲン又はカ
ルボジイミド法で結合させた試薬（臨床病理27、
補冊、522頁（1978）などの、共有結合により抗
原又は抗体を担体に結合させた試薬が提案されて
いる。しかし上記した免疫学的検査用試薬におけ
る担体の多く、たとえばスチレン−メタクリル酸
コポリマーはポリマー主成分に疎水性部分が多量
に含まれているため蛋白質を吸着する傾向を有し
ている。一般にヒト又は動物の体液中には多種類
の蛋白質が含まれ、とくに血漿又は血清中にはこ
れが高濃度で含有されている。検体体液から蛋白
質が担体に吸着されると、それが目的とする抗原
−抗体反応に干渉し、凝集反応の選択性や感度の
低下をもたらすおそれがある。また上記した担体
の一部、たえとばアクリル酸ポリマーは電解質で
ある。一般に多量の電解質の存在は抗原と抗体と
の結合を弱めることが知られており、凝集反応を
目的とする担体として電解質ポリマーを使用する
ことは好ましいことではない。さらにアクリル酸
ポリマーやメタクリル酸ポリマーは等電点PHの高
い蛋白質とイオン的に結合する。目的とする免疫
反応の構成因子以外の蛋白質が担体に結合するこ
とは前記したように好ましいことではない。そこ
で本発明者等は免疫活性物質を上記したような化
学結合により固定化することが可能にして、検体
体液に対して安定で非特異的凝集を起こしにくく
また検体中の蛋白質の非特異的吸着や、細胞に対
する非特異的付着のない免疫学的検査用試薬担体
を開発すべく検討した結果、ここに効果の顕著な
本発明に到達した。 即ち本発明は、粒子担体に免疫活性物質を固定
化してなる免疫学的検査用試薬において、粒子状
担体として 式 （但しＲは水素またはメチル基を示す） にて示される反復単位を有する架橋重合体よりな
る平均直径0.03μｍ〜10μｍの微粒子を用いてなる
免疫学的検査用試薬を提供するものである。 本発明の微粒子状担体はたとえば次の方法によ
つて製造することができる。 その１は、2.3−ジオキシプロピルアクリレー
ト及び／又はメタクリレートを単独又は他の共重
合性単量体と共に重合する方法である。 その２は、グリシジルアクリレート及び／又は
メタクリレートを単独又は他の共重合性単量体と
共に重合し、生成重合体中のエポキシ基を加水分
解によつて開環しα、β−ジオール体に変換する
方法である。この場合、エポキシ基の加水分解は
弱酸性又は弱アルカリ性条件下に実施することが
望ましい。 その３は、アクリル酸及び１又はメタクリル酸
のアルキル、シクロアルキル又はアラルキルエス
テルを単独又は他の共重合性単量体と共に重合
し、生成重合体とグリセリンとを反応させてエス
テル交換によつて重合体中のエステル残基を本発
明所定のものに変換する方法である。 その４は、アクリル酸及び／又はメタクリル酸
を単独又は他の共重合性単量体と共に重合し、生
成重合体をグリセリンと反応させることによつて
重合体中のカルボキシル基をエステル化する方法
である。 上記において架橋結合は実質的不溶性を示す程
度に３次元化していればよい。また共重合性単量
体を共存させる場合には、その量は50モル％以下
であることが好ましい。 共重合性単量体として適当なものは、例えば２
−オキシエチルアクリレート、２−オキシエチル
メタクリレート、重合度２ないし25のポリエチレ
ングリコールモノアルキルエーテルのメタクリル
酸エステル、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニルなどであ
る。２，３−ジオキプロピルアクリレート及び／
又はメタクリレート、グリシジルアクリレート及
び／又はメタクリレートを重合する場合には通常
単量体の中に炭素炭素二重結合を分子内に２基以
上含む多官能性単量体が少量含まれており、また
重合中の副反応によつても生成重合体に架橋構造
が形成され、不溶性となる。したがつて架橋剤を
重合系に添加することは必須ではないが、通常重
合に当つて重合性炭素炭素二重結合を分子内に２
基以上含む多官能性単量体を添加して積極的に重
合体を架橋させることがのぞましい。そのような
目的で重合系に添加するに適した多官能性単量体
は多数存在するが、若干例をあげれば、ジビニル
ベンゼン、エチレングリコールジメタクリレー
ト、Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド、コ
ハク酸ジビニル、コハク酸ジアリル、メタクリル
酸ビニル、メタクリル酸アリル、トリアリルシア
ヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどであ
る。また架橋結合は重合反応後生成重合体の反応
性を利用してこれを多官能化合物と反応させるこ
とによつて導入することもできる。例えば単量体
としてグリシジルアクリレート及び／又はメタク
リレートを用いた場合には生成重合体に含まれる
エボキシ基とエチレンジアミンなどのジアミンと
を反応させることにより重合体を架橋重合体にす
ることができる。重合系にアクリル酸、メタクリ
ル酸、マレイン酸、フマル酸または無水マレイン
酸などの不飽和カルボン酸を共重合成分として加
えることによりこれらに由来するカルボキシル基
を免疫活性物質を固定化させるための官能基とし
て利用することもできる。ただしこのような電解
質単量体は全単量体中の10モル％以下にとどめる
のがのぞましい。 重合反応は通常乳化重合、沈澱重合又は懸濁重
合によつて好ましく行なわれる。これらいずれの
方法も重合と同時に重合体が粒子状になつて析出
するので本発明の目的に適している。とくに好ま
しいのは沈澱重合である。沈澱重合は、単量体は
溶解するが重合によつて生成する重合体は溶解し
ない媒体中で重合を行なう方法であつて、単量体
と重合媒体との組合せを選択することによつて生
成する重合体粒子の平均直径を0.03ないし10μｍ
の範囲に入るよう調節することが比較的容易であ
り、粒径の分布も比較的狭い。また沈澱重合は、
乳化重合や懸濁重合の場合と異なつて、乳化剤や
懸沈安定剤を使用しないので、重合反応後これら
の添加剤を除去する必要がないのも利点の一つで
ある。粒子の形状は多くの場合球形であるが球形
であることは必要条件ではなく不規則な形状であ
つても差し支えない。不規則な形状の粒子の直径
は最大径と最小径の和の1/2とする。平均直径は
式(1)によつて定義されるによつて表わされる。
ただしdiはｉ番目の粒子 ＝N 〓i=1 di／Ｎ …(1) の直径、Ｎは粒子の総数である。凝集反応が判定
しやすいのは経験的に平均直径が0.1μｍ以上10μ
ｍ以下の場合である。また細胞標識の目的には平
均直径は0.03μｍ以上5μｍ以下の範囲が好ましい。
また染料ないし顔料により適当に着色するか螢光
を付与した粒子は凝集反応、細胞標識のいずれの
目的に対しても好都合である。 免疫活性物質の粒子への固定化は共有結合によ
つて好ましく行なわれる。ここで免疫活性物質と
は体液中の測定の目的となる成分又は該成分と特
異的に結合する物質又は細胞と特異的に結合する
物質を意味し検査目的に応じ適宜周知の免疫活性
物質が選択されうる。免疫活性物質は、通常蛋白
質であるか、その構成成分として蛋白質部分を含
んでいるため、蛋白質を固定化する公知の方法に
より本発明微粒子状担体上に固定化することがで
きる。例えば本発明微粒子状担体は分子中にヒド
ロキシル基を有するので臭化シアノゲンによりこ
れを活性化して蛋白質と反応させることにより固
定化することができる。また共重合により生成重
合体にカルボキシル基を導入しておけばカルボジ
イミドにより蛋白質のアミノ基とアミド結合を形
成させて免疫活性物質を固定化することができ
る。またグリシジルアクリレート及び／又はメタ
クリレートを用いて重合した場合には、生成重合
体のエポキシ基の一部にアンモニア又はエチレン
ジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどの脂肪族
ジアミンを反応させるこにより重合体に１級アミ
ノ基を導入した後、残るエポキシ基を加水分解し
てジオールに変換することにより、１級アミノ基
を含有する親水性微粒子状担体を調製することが
できる。またエポキシ基に対するアンモニア又は
ジアミンの反応と加水分解の順序を逆にして、加
水分解を先に行なうが一部のエポキシ基は未反応
のまま残しておき、残存エポキシ基をアミノ化し
てもよい。この加水分解は通常酸性又はアルカリ
性水溶液で重合体微粒子を処理することにより実
施され、重合体中のエポキシ基を加水分解してジ
オールに変換するものである。その際反応条件が
過酷であるとエステル結合まで加水分解されるの
でそれを避けるためにできるだけ緩和な条件を選
ぶことが望ましい。アルカリはエステルを切断す
る傾向が強いので一般的に言えば酸性の条件を使
用するのが好ましい。酸としては例えば硫酸、塩
酸、硝酸、リン酸などの無機酸又はベンゼンスル
ホン酸、トルエンスルホン酸などの有機酸の希薄
水溶液が好ましい。酸濃度としては0.01ないし１
規定の範囲が好ましい。加水分解温度は０℃ない
し60℃の範囲が好ましい。それより高温では副反
応が無視できなくなる。上記のように反応条件が
緩和であるため反応速度が小さく、十分な撹拌を
行なつても通常反応完結には相当の時間を要す
る。そこで反応系にアセトン、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサンなど水に可溶で該重合体を膨潤さ
せる能力のある有機溶媒を添加すると反応を促進
することができる。これらの溶媒によつて重合体
が膨潤し酸が重合体粒子内部に拡散するのを助け
られるものと解釈されるが、その結果加水分解の
反応時間を短縮することができる。加水分解終了
後、粒子は通常十分量の水で洗浄される。さらに
炭酸水素ナトリウム水溶液等で洗浄してもよい。
このようにしてほとんど副反応を起すことなくエ
ポキシ基を１，２−ジオールに変換し、2.3−ジ
オキシプロピルアクリレート及び／又はメタクリ
レートを主成分とする重合体粒子を製造すること
ができる。本発明重合体と１分子中に１級アミノ
基を２基以上有するポリアミノ化合物とを反応さ
せエステルアミド交換を行なうことによつて、担
体の微粒子状重合体中にアミノ基を導入すること
も可能である。 このようにして製造したアミノ基含有微粒子に
は、既知の方法によりアミノ基の反応性を利用し
て免疫活性物質を固定化することができる。免疫
活性物質がアミノ基を有する場合には、分子内に
アミノ基と結合し得る官能基を２基以上有する化
合物を結合剤として、担体に固定化する方法が好
ましい。とくに好ましい結合剤はグルタルアルデ
ヒドで代表されるα，ω−ジアルデヒドである。
またポリアクロレイン、ジアルデヒドデンプン、
ジアルデヒドデキストランのような高分子ポリア
ルデヒドも良好な結合剤である。固定化に当つて
はアミノ基含有微粒子状重合体を結合剤で処理
し、次いで該微粒子状重合体を洗浄して未反応の
遊離結合剤を除いた後、免疫活性物質と接触させ
れば、免疫活性物質の固定化による活性低下を最
小限にとどめることができる。このようにしてジ
アルデヒドを結合剤として免疫活性物質を微粒子
状担体に固定化すれば、通常その結合は強固であ
り、固定化された免疫活性物質が微粒子状担体か
ら離脱することはないが、場合によつてはさらに
その結合を強化するために水素化ホウ素ナトリウ
ムまたは水素化シアンホウ素ナトリウムで処理す
ることが有効である。 重合体のカルボキシル基と免疫活性物質のアミ
ノ基とからアミド結合を生成させるためには、カ
ルボジイミドを縮合剤として両者を反応させれば
１段階で目的を達することができる。しかし免疫
活性物質の失活を最小限にするためには、カルボ
ジイミドにより重合体のカルボキシル基とＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドとを縮合させて生成させ
た活性エステルにアミノ基を有する免疫活性物質
を反応させる方法がすすめられる。 また免疫活性物質を微粒子状担体に結合させる
に当つていわゆるスペーサーを介して結合させる
ことが有効な場合もある。例えば微粒子重合体の
官能基としてカルボキシル基が存在する場合、ε
−アミノカプロン酸やヘキサメチレンジアミンな
どのスペーサーを介して免疫活性物質を結合する
方法も好ましい。免疫活性物質の微粒子担体への
固定化法は上記の例に限定されるものではなく、
また固定化される免疫活性物質の個々の場合に応
じて免疫活性保持の度合の高い固定化法を経験的
に選ぶことができる。 本発明において免疫活性物質とは抗原および抗
体のみでなく、補体、Fcレセプター、補体レセ
プターなど液性免疫反応ないし細胞性免疫反応に
関与してある物質又は細胞に特異的に結合する物
質を意味するものとする。 微粒子に結合固定化する対象となる免疫活性物
質としては、例えば梅毒トレポネーマ抗原、Ｂ型
肝炎表面抗原（HBs抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原に
対する抗体（抗HBs抗体）、風疹抗原、トキソプ
ラズマ抗原、ストレプトリジンＯ、抗ストレプト
リジンＯ抗体、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（HCG）、抗HCG抗体、熱凝集
ヒトIgG、核蛋白、DNA、抗CR抗体、エストロ
ゲン、抗エストロゲン抗体、抗C1q抗体、抗C1r
抗体、抗C1s抗体、抗C3抗体、抗C4抗体抗C4抗
体、ヒトIgG、ヒトIgM、抗ヒトIgG抗体、抗ヒ
トIgM抗体、プロテインＡなど周知の免疫活性物
質を検査目的に応じ適宜選択することができる。 本発明の検査試薬を構成する微粒子は、検体体
液に対して安定で非特異的凝集を起こしにくくま
た検体中の蛋白質を非特異的に吸着することがな
いという特長を有し、免疫反応を粒子の凝集によ
り検出ないし測定するという目的に非常によく合
致していると共に細胞に対する非特異的付着がな
く細胞標識という目的に対しても非常によく合致
している。次に本発明を実施例により説明する。 実施例 １ （担体微粒子調製） グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールジメタ
クリレートの３者を85.7：9.5：4.8のモル比で混
合し、その単量体混合物24部（重量、以下同様）
をプロピオン酸エチル76部に溶解し、２，2′−ア
ゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロ
ニトリル）0.13部を添加して重合させた。重合開
始剤の初濃度は4.7ｍmol／である。重合はア
ルゴン雰囲気下40℃で３時間静置状態で行なつ
た。所定時間経過後白濁した重合混合物をアセト
ンに注ぎ、1500×ｇ、10分間遠心分離し、沈降し
た粒子をエタノールで再分散して洗浄、次いで再
び遠心分離した。減圧下に乾燥して11.3部の微粒
子状重合体を得た。この重合体微粒子１部を水50
部、アセトン50部および濃硫酸0.2部の混合液に
分散し、30℃で７日間撹拌して加水分解を行なつ
た。この重合体微粒子の光学顕微写真（1000倍）
を撮り、粒子直径の分布を数えると表１の通りで
ある。直径の平均は3.52μｍ、標準偏差は0.447μ
ｍ、したがつて標準偏差／平均＝0.126である。
【表】
加水分解微粒子を減圧で乾燥した後、乾燥微粒
子0.1ｇをエチレンジアミン10mlに分散し、80℃
で４時間撹拌した。反応終了後遠心分離して蒸留
水で洗浄した。この粒子はアミノ基を含んでおり
次に記載するような方法で免疫活性蛋白質を固定
化することができる。 （抗ヒトIgG抗体の固定化） 上記アミノ基含有微粒子をポリマー含量が0.5
％になるように蒸留水20mlに分散し、25％グルタ
ルアルデヒド水溶液１mlと混合した。混合液を30
℃で１時間撹拌した後遠心分離を繰返して粒子を
蒸留水で洗浄した。４回水洗後蒸留水をリン酸塩
緩衝生理食塩水（以下PBSと略記、リン酸水素
２ナトリウム＋リン酸水素１カリウム濃度
0.01mol／、塩化ナトリウム濃度0.14mol／、
PH7.2）1.5mlで置換し、グルタルアルデヒドによ
り活性化された粒子を分散させた。そこへ抗ヒト
IgG抗血清（兎）IgGフラクシヨン溶液（抗体1.9
mg／ml）をPBSで10倍に希釈した液0.5mlを加え、
30℃で３時間撹拌した後、16時間室温で静置し
た。次に粒子はPBSで遠沈を４回繰返して洗浄
し、洗浄後の粒子はPBS2mlに分散してウシ血清
アルブミン（以下BSAと略記）20mgを添加して
４℃で保存した。 上記のようにして製造した抗ヒトIgG抗体固定
化粒子の力価の判定はマイクロプレート法によつ
て行なつた。すなわちＶ字型マイクロプレートの
各ウエルに所定濃度のヒトIgGのPBG溶液100μ
を入れ、抗ヒトIgG抗体固定化粒子分散液10μ
を加えて振 混合した後、室温で２時間静置し、
沈降像によつて凝集の程度を判定した。その結果
は表２の通りでヒトIgGを0.01μｇ／ml以下の濃
度で検出できることがわかる。
子0.1ｇをエチレンジアミン10mlに分散し、80℃
で４時間撹拌した。反応終了後遠心分離して蒸留
水で洗浄した。この粒子はアミノ基を含んでおり
次に記載するような方法で免疫活性蛋白質を固定
化することができる。 （抗ヒトIgG抗体の固定化） 上記アミノ基含有微粒子をポリマー含量が0.5
％になるように蒸留水20mlに分散し、25％グルタ
ルアルデヒド水溶液１mlと混合した。混合液を30
℃で１時間撹拌した後遠心分離を繰返して粒子を
蒸留水で洗浄した。４回水洗後蒸留水をリン酸塩
緩衝生理食塩水（以下PBSと略記、リン酸水素
２ナトリウム＋リン酸水素１カリウム濃度
0.01mol／、塩化ナトリウム濃度0.14mol／、
PH7.2）1.5mlで置換し、グルタルアルデヒドによ
り活性化された粒子を分散させた。そこへ抗ヒト
IgG抗血清（兎）IgGフラクシヨン溶液（抗体1.9
mg／ml）をPBSで10倍に希釈した液0.5mlを加え、
30℃で３時間撹拌した後、16時間室温で静置し
た。次に粒子はPBSで遠沈を４回繰返して洗浄
し、洗浄後の粒子はPBS2mlに分散してウシ血清
アルブミン（以下BSAと略記）20mgを添加して
４℃で保存した。 上記のようにして製造した抗ヒトIgG抗体固定
化粒子の力価の判定はマイクロプレート法によつ
て行なつた。すなわちＶ字型マイクロプレートの
各ウエルに所定濃度のヒトIgGのPBG溶液100μ
を入れ、抗ヒトIgG抗体固定化粒子分散液10μ
を加えて振 混合した後、室温で２時間静置し、
沈降像によつて凝集の程度を判定した。その結果
は表２の通りでヒトIgGを0.01μｇ／ml以下の濃
度で検出できることがわかる。
【表】
なお上記凝集反応がヒトIgGに特異的であるこ
とは次のようにして確認した。マイクロプレート
の各ウエルに表２と同濃度のヒトIgG溶液を100μ
入れ、そこへ抗ヒトIgG抗血清（兎）（抗体濃
度１mg／ml）を10μ加え、室温で２時間インキ
ユベートした。次いで抗ヒトIgG抗体を固定化し
た微粒子の分散液10μを加え、表２の実験と同
様に反応させて沈降像を観察した。その結果どの
ウエルでも凝集は認められなかつた。 実施例 ２ （ヒトIgGの固定化） 実施例１と同様にして調製したアミノ基含有微
粒子に実施例１の抗ヒトIgG抗体の代りにヒト
IgGを使用して固定化した。ただし粒子をエチレ
ンジアミンで処理する際に乾燥粒子ではなく遠沈
により分離した含水微粒子を使用した。またグル
タルアルデヒド25％水溶液は１mlではなく３ml使
用した。それ以外は実施例１と全く同様である。
PBS2mlにポリマー0.1ｇが含有される状態で粒子
を分散し、0.8mg／mlの濃度のヒトIgG PBS溶液
１mlと混合し、30℃で14時間撹拌した。反応後粒
子を遠沈して洗浄後粒子をナトリウムアシド0.4
mgおよびBSA20mgを含有するPBS2mlに分散して
４℃で保存した。マイクロプレート法により実施
例１と同様にして抗ヒトIgG抗体と反応させ凝集
試験を行なつた結果は表３の通りであつた。抗ヒ
トIgG抗血清（兎）IgGフラクシヨンの代りに、
正常兎血清のIgGフラクシヨンを用いて上記と同
様なマイクロプレート試験で行なつた場合には、
どのウエルでも凝集は認められなかつた。したが
つて表３の凝集反応は微粒子に固定化されたヒト
IgGと遊離の抗ヒトIgG抗体との抗原抗体反応に
よる特異的なものである。この微
とは次のようにして確認した。マイクロプレート
の各ウエルに表２と同濃度のヒトIgG溶液を100μ
入れ、そこへ抗ヒトIgG抗血清（兎）（抗体濃
度１mg／ml）を10μ加え、室温で２時間インキ
ユベートした。次いで抗ヒトIgG抗体を固定化し
た微粒子の分散液10μを加え、表２の実験と同
様に反応させて沈降像を観察した。その結果どの
ウエルでも凝集は認められなかつた。 実施例 ２ （ヒトIgGの固定化） 実施例１と同様にして調製したアミノ基含有微
粒子に実施例１の抗ヒトIgG抗体の代りにヒト
IgGを使用して固定化した。ただし粒子をエチレ
ンジアミンで処理する際に乾燥粒子ではなく遠沈
により分離した含水微粒子を使用した。またグル
タルアルデヒド25％水溶液は１mlではなく３ml使
用した。それ以外は実施例１と全く同様である。
PBS2mlにポリマー0.1ｇが含有される状態で粒子
を分散し、0.8mg／mlの濃度のヒトIgG PBS溶液
１mlと混合し、30℃で14時間撹拌した。反応後粒
子を遠沈して洗浄後粒子をナトリウムアシド0.4
mgおよびBSA20mgを含有するPBS2mlに分散して
４℃で保存した。マイクロプレート法により実施
例１と同様にして抗ヒトIgG抗体と反応させ凝集
試験を行なつた結果は表３の通りであつた。抗ヒ
トIgG抗血清（兎）IgGフラクシヨンの代りに、
正常兎血清のIgGフラクシヨンを用いて上記と同
様なマイクロプレート試験で行なつた場合には、
どのウエルでも凝集は認められなかつた。したが
つて表３の凝集反応は微粒子に固定化されたヒト
IgGと遊離の抗ヒトIgG抗体との抗原抗体反応に
よる特異的なものである。この微
【表】
粒子による抗ヒトIgG抗体の検出限界は約１mg／
mlであり、放射免疫測定に匹敵する検出感度とい
うことができる。また別の凝集試験法としてガラ
ス板上で所定濃度の抗ヒトIgG抗体溶液とヒト
IgG固定化粒子分散液とを各10μをとり両者を
混ぜ合わせて３分後に肉眼で凝集を判定すること
もできる。この方法では1μｇ／ml以上の濃度の
抗ヒトIgG抗体を検出することができた。 実施例 ３ （担体微粒子調製） 実施例１と同様にして重合を行ない、重合体微
粒子を得た。この重合体微粒子を10％アンモニア
水溶液中にポリマー含量が0.66％になるように分
散し、30℃で２時間撹拌してアミノ化を行なつ
た。アミノ化粒子を蒸留水で洗浄した後0.3％硫
酸水溶液にポリマー含量が１％になるように分散
し、30℃で10日間撹拌して加水分解を行なつた。
加水分解終了後蒸留水で十分洗浄した。 （TP抗原固定化） 上記のようにして調製したアミノ基含有担体微
粒子を3.3％グルタルアルデヒド水溶液にポリマ
ー含量が0.5％になるように分散し、30℃で１時
間撹拌した。グルタルアルデヒドで活性化した粒
子は蒸留水で十分に洗浄した後梅毒病原体
Treponema pallidum（以下TPと略記）Nichols
株菌体成分と下記のようにして反応させた。すな
わちTP菌体をPBS中に109／mlの割合で分散させ
た分散液を10KHzの超音波により氷水で冷却しな
がら20分間処理し菌体を破壊し、これをTP抗原
原液とした。グルタルアルデヒド活性化粒子の
PBS分散液（ポリマ含量５％）１容とTP抗原原
液１容とを混合し30℃で３時間撹拌した。反応終
了後TP抗原固定化粒子は蒸留水で十分洗浄し、
BSA1％およびナトリウムアジド0.02％を添加し
たPBSにポリマー含量が2.5％になるように分散
した。このTP抗原固定化粒子とTPHA法による
力価1280の梅毒陽性血清とを実施例１および２と
同様にしてマイクロプレートで反応させた。検体
血清は市販TPHAキツト（富士臓器製薬）の吸
収希釈用液で80倍を起点して2n希釈を行なつた。
また対象として陰性血清でも同様の試験を行なつ
た。その結果陽性血清では10240倍まで凝集が認
められ、陰性血清ではどの希釈倍率でも凝集は認
められなかつた。またガラス板上でTP抗原固定
化粒子分散液と希釈検体血清の各10μを混合し
て３分後に判定する試験法では、上記陽性血清で
は40倍希釈まで凝集が認められた。陰性血清では
２倍以上に希釈すれば凝集は認められなかつた。 実施例 ４ （担体微粒子の着色） 実施例３記載の方法で調製した担体微粒子の分
散液（ポリマー含量１％）５mlに200倍希釈した
ときに635nｍの吸光度が0.48を示すトルイジンブ
ルーＯ水溶液0.6ｍを加え30℃で30分撹拌した後
PBSで洗浄した。粒子は青色に染色され、染料
の溶出はほとんど認められない。 （TP抗原固定化） 上記着色粒子を実施例３と同様にしてグルタル
アルデヒドで活性化した。BSAを0.5mg／mlの濃
度で溶解したPBSでTP抗原原液を４倍に希釈
し、TP抗原希釈溶液１容とグルタルアルデヒド
活性化着色粒子分散液（ポリマー含量2.5％）１
容とを混合し、30℃で２時間撹拌した。反応終了
後TP抗原固定化微粒子はPBSで洗浄した後、
BSA1％およびナトリウムアジド0.02％を含む
PBSポリマー含量が0.25％になる割合で分散し、
４℃で保存した。TP抗原固定化着色粒子の活性
検定は次のようにして行なつた。すなわちマイク
ロプレートの各ウエルに希釈検体血清（希釈には
実施例３と同じ用液を使用した）を50μおよび
TP抗原固定化着色粒子分散液50μを入れて混
合し２時間静置した後沈降像を肉眼で検査した。
検体して使用した陽性血清のTPHA力価は1280
で、20倍を起点として2n希釈を行なつた結果2560
倍以下の場合に凝集が認められた。TPHA力価
と比較するために最終希釈倍率に換算するとこの
TP抗原固定化着色粒子の検出感度は5120倍に相
当する。なおコントロール実験として陰性血清を
使用した同様の実験では最終希釈倍率40以上では
凝集が認められなかつた。 実施例 ５ （ヒト絨毛性ゴナドトロピン固定化） 実施例３記載の方法で調製したアミノ基含有微
粒子を実施例３と同様にしてグルタルアルデヒド
で活性化した。グルタルアルデヒド活性化粒子は
ポリマー含量が１％になるようにPBSに分散し
た。一方純度3230IU／mgのヒト絨毛性ゴナドト
ロビン（以下HCGと略記）をPBSに１mg／mlの
濃度で溶解した。グルタルアルデヒド活性化粒子
分散液とHCG溶液とを溶積比１：１で混合し、
30℃で16時間撹拌した。反応終了後HCG固定化
粒子はPBSで洗浄し、BSAを１％含むPBS中に
ポリマー含量が２％になる割合で分散した。
HCG固定化粒子の活性検定は次のようにして行
なつた。 Ｕ字型マイクロプレートの各ウエルに所定濃度
のHCG／PBS溶液100μおよび所定濃度の抗
HCG抗血清（兎）溶液10μ（抗HCG抗血清と
希釈用液は市販微量HCG・LH測定用キツト“ル
テオノスチコン”のものを使用した）とを混合
し、インキユベーシヨンのため23℃で２時間静置
した。インキユベーシヨン後HCG固定化粒子分
散液10μを各ウエルに加え、振盪してよく混合
した後２時間静置した。試験結果を表４にまとめ
た。微量のHCGを検出するためには、ここで使
用した抗HCG抗血清は５倍に希釈するのが適当
で、10IU／の濃度のHCGを検出することがで
きた。
mlであり、放射免疫測定に匹敵する検出感度とい
うことができる。また別の凝集試験法としてガラ
ス板上で所定濃度の抗ヒトIgG抗体溶液とヒト
IgG固定化粒子分散液とを各10μをとり両者を
混ぜ合わせて３分後に肉眼で凝集を判定すること
もできる。この方法では1μｇ／ml以上の濃度の
抗ヒトIgG抗体を検出することができた。 実施例 ３ （担体微粒子調製） 実施例１と同様にして重合を行ない、重合体微
粒子を得た。この重合体微粒子を10％アンモニア
水溶液中にポリマー含量が0.66％になるように分
散し、30℃で２時間撹拌してアミノ化を行なつ
た。アミノ化粒子を蒸留水で洗浄した後0.3％硫
酸水溶液にポリマー含量が１％になるように分散
し、30℃で10日間撹拌して加水分解を行なつた。
加水分解終了後蒸留水で十分洗浄した。 （TP抗原固定化） 上記のようにして調製したアミノ基含有担体微
粒子を3.3％グルタルアルデヒド水溶液にポリマ
ー含量が0.5％になるように分散し、30℃で１時
間撹拌した。グルタルアルデヒドで活性化した粒
子は蒸留水で十分に洗浄した後梅毒病原体
Treponema pallidum（以下TPと略記）Nichols
株菌体成分と下記のようにして反応させた。すな
わちTP菌体をPBS中に109／mlの割合で分散させ
た分散液を10KHzの超音波により氷水で冷却しな
がら20分間処理し菌体を破壊し、これをTP抗原
原液とした。グルタルアルデヒド活性化粒子の
PBS分散液（ポリマ含量５％）１容とTP抗原原
液１容とを混合し30℃で３時間撹拌した。反応終
了後TP抗原固定化粒子は蒸留水で十分洗浄し、
BSA1％およびナトリウムアジド0.02％を添加し
たPBSにポリマー含量が2.5％になるように分散
した。このTP抗原固定化粒子とTPHA法による
力価1280の梅毒陽性血清とを実施例１および２と
同様にしてマイクロプレートで反応させた。検体
血清は市販TPHAキツト（富士臓器製薬）の吸
収希釈用液で80倍を起点して2n希釈を行なつた。
また対象として陰性血清でも同様の試験を行なつ
た。その結果陽性血清では10240倍まで凝集が認
められ、陰性血清ではどの希釈倍率でも凝集は認
められなかつた。またガラス板上でTP抗原固定
化粒子分散液と希釈検体血清の各10μを混合し
て３分後に判定する試験法では、上記陽性血清で
は40倍希釈まで凝集が認められた。陰性血清では
２倍以上に希釈すれば凝集は認められなかつた。 実施例 ４ （担体微粒子の着色） 実施例３記載の方法で調製した担体微粒子の分
散液（ポリマー含量１％）５mlに200倍希釈した
ときに635nｍの吸光度が0.48を示すトルイジンブ
ルーＯ水溶液0.6ｍを加え30℃で30分撹拌した後
PBSで洗浄した。粒子は青色に染色され、染料
の溶出はほとんど認められない。 （TP抗原固定化） 上記着色粒子を実施例３と同様にしてグルタル
アルデヒドで活性化した。BSAを0.5mg／mlの濃
度で溶解したPBSでTP抗原原液を４倍に希釈
し、TP抗原希釈溶液１容とグルタルアルデヒド
活性化着色粒子分散液（ポリマー含量2.5％）１
容とを混合し、30℃で２時間撹拌した。反応終了
後TP抗原固定化微粒子はPBSで洗浄した後、
BSA1％およびナトリウムアジド0.02％を含む
PBSポリマー含量が0.25％になる割合で分散し、
４℃で保存した。TP抗原固定化着色粒子の活性
検定は次のようにして行なつた。すなわちマイク
ロプレートの各ウエルに希釈検体血清（希釈には
実施例３と同じ用液を使用した）を50μおよび
TP抗原固定化着色粒子分散液50μを入れて混
合し２時間静置した後沈降像を肉眼で検査した。
検体して使用した陽性血清のTPHA力価は1280
で、20倍を起点として2n希釈を行なつた結果2560
倍以下の場合に凝集が認められた。TPHA力価
と比較するために最終希釈倍率に換算するとこの
TP抗原固定化着色粒子の検出感度は5120倍に相
当する。なおコントロール実験として陰性血清を
使用した同様の実験では最終希釈倍率40以上では
凝集が認められなかつた。 実施例 ５ （ヒト絨毛性ゴナドトロピン固定化） 実施例３記載の方法で調製したアミノ基含有微
粒子を実施例３と同様にしてグルタルアルデヒド
で活性化した。グルタルアルデヒド活性化粒子は
ポリマー含量が１％になるようにPBSに分散し
た。一方純度3230IU／mgのヒト絨毛性ゴナドト
ロビン（以下HCGと略記）をPBSに１mg／mlの
濃度で溶解した。グルタルアルデヒド活性化粒子
分散液とHCG溶液とを溶積比１：１で混合し、
30℃で16時間撹拌した。反応終了後HCG固定化
粒子はPBSで洗浄し、BSAを１％含むPBS中に
ポリマー含量が２％になる割合で分散した。
HCG固定化粒子の活性検定は次のようにして行
なつた。 Ｕ字型マイクロプレートの各ウエルに所定濃度
のHCG／PBS溶液100μおよび所定濃度の抗
HCG抗血清（兎）溶液10μ（抗HCG抗血清と
希釈用液は市販微量HCG・LH測定用キツト“ル
テオノスチコン”のものを使用した）とを混合
し、インキユベーシヨンのため23℃で２時間静置
した。インキユベーシヨン後HCG固定化粒子分
散液10μを各ウエルに加え、振盪してよく混合
した後２時間静置した。試験結果を表４にまとめ
た。微量のHCGを検出するためには、ここで使
用した抗HCG抗血清は５倍に希釈するのが適当
で、10IU／の濃度のHCGを検出することがで
きた。
【表】
【表】
実施例 ６
（カルボキシル基含有担体微粒子の調製）
グリシジルメタクリレート、メタクリル酸、２
−オキシエチルメタクリレートおよびエチレング
リコールジメタクリレートの４者を75.7：10.0：
9.5：4.8のモル比で混合し、その単量体混合物24
部をプロピオン酸エチル76部に溶解し、２，2′−
アゾビス（2.4−ジメチル−４−メトキシバレロ
ニトリル）0.13部を添加して、アルゴン雰囲気下
40℃で２時間静置状態で重合させた。白濁した重
合液を実施例１と同様に処理して、3.2部の重合
体微粒子を得た。重合体微粒子は実施例１と同条
件で加水分解した。水中における加水分解粒子の
平均直径は0.5μｍであつた。加水分解粒子100mg
を0.1mol／塩化ナトリウム溶液４mlに分散し、
リン酸２ナトリウムとリン酸１カリウムの溶液で
PHを6.5に調節すると液量は５mlになつた。この
カルボキシル基含有微粒子分散液2.5mlを４℃に
冷却しそこへε−アミノカプロン酸１mgおよびＮ
−アセチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩10mgを加え、氷溶中
で２時間撹拌した。次いで同量のＭ／10グリシン
−炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（PH7.0）を加え
て15分撹拌を続けた後粒子を遠心分離し水洗し
た。このようにしてスペーサーを導入した微粒子
担体100mgをＭ／10塩化ナトリウム水溶液2.5mlに
分散し、氷浴で冷却しつつヒトIgG2mgを加えた。
この時分散液のPHは6.5であつた。そこへＮ−ア
セチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド塩酸塩10mgを加え、氷浴中で２時
間撹拌した。次いで同量の前記と同じグリシン−
炭酸水素ナトリウム緩衝溶液を加え15分間撹拌を
続けた後粒子を遠心分離して水洗し、PBS1mlに
分散した。この様にして調製したヒトIgG固定化
粒子分散液10μと抗ヒトIgG抗血清（兎）のIgG
フラクシヨンのPBS溶液10μをガラス板上で混
合して観察した。抗ヒトIgG抗体濃度が100μｇ／
mlのときは激しい凝集が起こつたが、10μｇ／ml
のときはほとんど凝集が認められなかつた。また
実施例２と同じ方法でマイクロプレート法によつ
て試験した結果、抗ヒトIgG抗体濃度が0.1μｇ／
ml以上で凝集が認められた。 実施例 ７ 実施例１記載の条件で重合および加水分解を行
なつて得た重合体微粒子を担体として使用した。
この担体微粒子100mgを2M炭酸ナトリウム水溶液
（PH11.0）10mlに分散した。別にＮ−メチルピロ
リドン1.2mlに100mgの臭化シアノゲンを溶解した
溶液を調製し、氷浴で冷却しながら上記担体粒子
分散液に加えた。そのまま氷浴上で10分撹拌した
後遠心分離し、活性化粒子をＭ／８炭酸水素ナト
リウム水溶液（PH8.2）で洗浄した。同様にして
遠心分離、洗浄の操作を３回繰返した。ヒトIgG
をＭ／８炭酸水素ナトリウムに１mg／mlの濃度で
溶解し、その溶液10mlと活性化粒子をＭ／８炭酸
水素ナトリウム水溶液にポリマー含量が１％にな
るように分散した分散液10mlとを混合して４時間
室温で撹拌した。次いで粒子を遠心分離してＭ／
８炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、１％
エタノールアミン水溶液（PH10.0）20mlに分散し
た。室温で３分間撹拌し、遠心分離して蒸留水で
洗浄した。さらにPBSで３回洗浄した後、BSA1
％を添加したPBS4mlにポリマー含量が５％にな
るように分散した。このようにして調製したヒト
IgG固定化粒子分散液と抗ヒトIgG抗体PBS溶液
とをマイクロプレート上で実施例２と同様にして
混合し沈降像を観察した。その結果ヒトIgG濃度
が0.1μｇ／ml以上の場合に凝集が認められた。 実施例 ８ グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリ
レート、２−オキシエチルメタクリレート、２−
オキシエチルアクリレートおよびトリエチレング
リコールジメタクリレートを30：25：20：20：５
のモル比で混合し、その単量体混合物25部を酢酸
ｎ−プロピル75部に溶解し、２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部を添加して重合させた。重合は窒素ガ
ス雰囲気下２時間静置することにより進行した。
重合混合物を実施例１と同様に処理して8.4部の
重合体微粒子を得た。さらに実施例２と同様にし
て希硫酸による加水分解およびエチレンジアミン
処理によるアミノ化を行なつた。得られたアミノ
化粒子にヒトIgGを実施例２と同様にして固定し
た。ここで得られたヒトIgG固定化粒子の活性を
実施例２と同様にして検定すると10mg／ml以上の
濃度の抗ヒトIgG抗体を凝集によつて検出するこ
とができた。 実施例 ９ 実施例１における抗ヒトIgG抗血清（兎）IgG
フラクシヨンの代りに抗マウス抗血清（山羊）
IgGフラクシヨンを使用し、その他は実施例と同
様にして担体微粒子に抗マウスIgG抗体を固定化
した。このようにして調製した抗マウスIgG抗体
固定化微粒子によつて細胞表面にIgGを有するマ
ウスの脾臓細胞を次のようにして標識した。月令
３月のインブレツトddyマウス（オス）の脾臓を
採り、氷冷しながら生理食塩水中ですりつぶし、
ピペツテイングしてから試験管に移した。この試
験管を５分間直立させて静置し、浮遊している細
胞のみをパスツールピペツトで吸い上げナイロン
ガーゼで過した。過した細胞浮遊液は４℃、
800rpm5分間で遠沈し、さらにイーグルMEM培
地で同様に遠沈して洗つた後、細胞はイーグル
MEM培地に３×106／mlに分散させた。一方抗
マウスIgG抗体固定化粒子は0.1％のBSAを含む
PBSに109／mlの割合で分散させた。細胞分散液
0.2mlと抗マウスIgG抗体固定化粒子0.2mlとを混
合して37℃で15分インキユーベートした。次いで
160×ｇで１分遠心し、再び穏やかに分散させ、
分散液の１滴を採つてスライドガラス上でトルイ
ジンブルー溶液１滴と混ぜ合わせた。光学顕微鏡
で観察し１細胞について重合体粒子が３個以上付
着しているものをロゼツトとして数えると、マウ
ス脾臓細胞のロゼツト形成率は20％であつた。そ
れに対してマウス胸腺細胞で同様の実験を行つた
結果、ロゼツト形成率は２％であつた。 実施例 10 実施例９の抗マウスIgG抗血清（山羊）IgGフ
ラクシヨンの代りに抗マウスIgM抗血清（山羊）
を使用し、その他は実施例９と同様にして担体微
粒子に抗マウスIgM抗体を固定化した。このよう
にして調製した抗マウスIgM抗体固定化微粒子に
よつて細胞表面にIgMを有するマウスの脾臓細胞
を実施例９と同様にして標識した。その結果マウ
ス脾臓細胞のロゼツト形成率は22％であつた。そ
れに対してマウス胸腺細胞で同様の実験を行なつ
た結果、ロゼツト形成率は１％であつた。 実施例 11 ヒトγ−グロブリン13mgを生理食塩水２mlに溶
解し、63℃で30分間加熱し、10000×Ｇで30分遠
沈して上清を採つた。高速液体クロマトグラフに
よる分析結果ではmonomeric human γ−
globulinとaggregated human γ−globulin（以
下AHGと略記する）との比率は１：１（ピーク面
積比）であつたが、精製せずに固定化に使用し
た。担体は実施例３と同様にして調製したアミノ
化ポリマー微粒子を同様にグルタルアルデヒドで
処理して使用した。AHGの濃度を２mg／mlにな
るように調節し、BSAを10mg／mlになるように
添加したPBS溶液と、同容のグルタルアルデヒ
ド処理した担体ポリマー１％を含むPBS分散液
とを混合した。混合液を30℃で2hr撹拌した後、
遠沈して微粒子を蒸留水で洗浄し、BSA1％およ
びナトリウムアジド0.02％を添加したPBSにポリ
マー含量が2.5％になるように再分散した。この
ようにして調製したAHG固定化微粒子の分散液
10μとリウマチ因子検出用試薬“RA（KW）”
（日本凍結乾燥研究所）の対照陽性血清および対
照陰性血清各10μとをスライドグラス上で混合
した。約１分後に陽性血清では顕著な凝集が認め
られたが、陰性血清では凝集が認められなかつ
た。 実施例 12 実施例３と同様にしてアミノ化ポリマー微粒子
を調製し、グルタルアルデヒドで処理してPBS
中に１％の濃度で分散した。別にプロテインＡを
PBSに１mg／mlの濃度で溶解した。これら両者
を１：１（volume）で混合し30℃で２時間撹拌し
た。反応終了後微粒子を遠心分離し、蒸留水で洗
浄してベロナール緩衝食塩水溶液（以下VBSと
略記）に2.5％の濃度で分散した。ただしVBSと
は１にベロナールナトリウム塩0.824ｇ、塩化
ナトリウム8.5ｇおよびナトリウムアジド0.2ｇを
溶解し、塩酸を加えてPHを8.0に調節したPH緩衝
水溶液である。実施例10と同様に調製したAHG
をVBSで希釈した溶液10μとプロテインＡ固定
化微粒子分散液10μとをスライドグラス上で混
合すると、AHG濃度が30μｇ／ml以上の場合に
凝集が認められた。それに対してVBSで２倍に
希釈したヒト血清にAHGを溶解した場合には、
AHG濃度が130μｇ／mlでも凝集が認められなか
つた。これはヒト血清中に高濃度で含まれるIgG
が微粒子表面に固定化されたプロテインＡと結合
することにより、プロテインＡ固定化微粒子の
AHGによる凝集を阻止したためと解釈される。
−オキシエチルメタクリレートおよびエチレング
リコールジメタクリレートの４者を75.7：10.0：
9.5：4.8のモル比で混合し、その単量体混合物24
部をプロピオン酸エチル76部に溶解し、２，2′−
アゾビス（2.4−ジメチル−４−メトキシバレロ
ニトリル）0.13部を添加して、アルゴン雰囲気下
40℃で２時間静置状態で重合させた。白濁した重
合液を実施例１と同様に処理して、3.2部の重合
体微粒子を得た。重合体微粒子は実施例１と同条
件で加水分解した。水中における加水分解粒子の
平均直径は0.5μｍであつた。加水分解粒子100mg
を0.1mol／塩化ナトリウム溶液４mlに分散し、
リン酸２ナトリウムとリン酸１カリウムの溶液で
PHを6.5に調節すると液量は５mlになつた。この
カルボキシル基含有微粒子分散液2.5mlを４℃に
冷却しそこへε−アミノカプロン酸１mgおよびＮ
−アセチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩10mgを加え、氷溶中
で２時間撹拌した。次いで同量のＭ／10グリシン
−炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（PH7.0）を加え
て15分撹拌を続けた後粒子を遠心分離し水洗し
た。このようにしてスペーサーを導入した微粒子
担体100mgをＭ／10塩化ナトリウム水溶液2.5mlに
分散し、氷浴で冷却しつつヒトIgG2mgを加えた。
この時分散液のPHは6.5であつた。そこへＮ−ア
セチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド塩酸塩10mgを加え、氷浴中で２時
間撹拌した。次いで同量の前記と同じグリシン−
炭酸水素ナトリウム緩衝溶液を加え15分間撹拌を
続けた後粒子を遠心分離して水洗し、PBS1mlに
分散した。この様にして調製したヒトIgG固定化
粒子分散液10μと抗ヒトIgG抗血清（兎）のIgG
フラクシヨンのPBS溶液10μをガラス板上で混
合して観察した。抗ヒトIgG抗体濃度が100μｇ／
mlのときは激しい凝集が起こつたが、10μｇ／ml
のときはほとんど凝集が認められなかつた。また
実施例２と同じ方法でマイクロプレート法によつ
て試験した結果、抗ヒトIgG抗体濃度が0.1μｇ／
ml以上で凝集が認められた。 実施例 ７ 実施例１記載の条件で重合および加水分解を行
なつて得た重合体微粒子を担体として使用した。
この担体微粒子100mgを2M炭酸ナトリウム水溶液
（PH11.0）10mlに分散した。別にＮ−メチルピロ
リドン1.2mlに100mgの臭化シアノゲンを溶解した
溶液を調製し、氷浴で冷却しながら上記担体粒子
分散液に加えた。そのまま氷浴上で10分撹拌した
後遠心分離し、活性化粒子をＭ／８炭酸水素ナト
リウム水溶液（PH8.2）で洗浄した。同様にして
遠心分離、洗浄の操作を３回繰返した。ヒトIgG
をＭ／８炭酸水素ナトリウムに１mg／mlの濃度で
溶解し、その溶液10mlと活性化粒子をＭ／８炭酸
水素ナトリウム水溶液にポリマー含量が１％にな
るように分散した分散液10mlとを混合して４時間
室温で撹拌した。次いで粒子を遠心分離してＭ／
８炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、１％
エタノールアミン水溶液（PH10.0）20mlに分散し
た。室温で３分間撹拌し、遠心分離して蒸留水で
洗浄した。さらにPBSで３回洗浄した後、BSA1
％を添加したPBS4mlにポリマー含量が５％にな
るように分散した。このようにして調製したヒト
IgG固定化粒子分散液と抗ヒトIgG抗体PBS溶液
とをマイクロプレート上で実施例２と同様にして
混合し沈降像を観察した。その結果ヒトIgG濃度
が0.1μｇ／ml以上の場合に凝集が認められた。 実施例 ８ グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリ
レート、２−オキシエチルメタクリレート、２−
オキシエチルアクリレートおよびトリエチレング
リコールジメタクリレートを30：25：20：20：５
のモル比で混合し、その単量体混合物25部を酢酸
ｎ−プロピル75部に溶解し、２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部を添加して重合させた。重合は窒素ガ
ス雰囲気下２時間静置することにより進行した。
重合混合物を実施例１と同様に処理して8.4部の
重合体微粒子を得た。さらに実施例２と同様にし
て希硫酸による加水分解およびエチレンジアミン
処理によるアミノ化を行なつた。得られたアミノ
化粒子にヒトIgGを実施例２と同様にして固定し
た。ここで得られたヒトIgG固定化粒子の活性を
実施例２と同様にして検定すると10mg／ml以上の
濃度の抗ヒトIgG抗体を凝集によつて検出するこ
とができた。 実施例 ９ 実施例１における抗ヒトIgG抗血清（兎）IgG
フラクシヨンの代りに抗マウス抗血清（山羊）
IgGフラクシヨンを使用し、その他は実施例と同
様にして担体微粒子に抗マウスIgG抗体を固定化
した。このようにして調製した抗マウスIgG抗体
固定化微粒子によつて細胞表面にIgGを有するマ
ウスの脾臓細胞を次のようにして標識した。月令
３月のインブレツトddyマウス（オス）の脾臓を
採り、氷冷しながら生理食塩水中ですりつぶし、
ピペツテイングしてから試験管に移した。この試
験管を５分間直立させて静置し、浮遊している細
胞のみをパスツールピペツトで吸い上げナイロン
ガーゼで過した。過した細胞浮遊液は４℃、
800rpm5分間で遠沈し、さらにイーグルMEM培
地で同様に遠沈して洗つた後、細胞はイーグル
MEM培地に３×106／mlに分散させた。一方抗
マウスIgG抗体固定化粒子は0.1％のBSAを含む
PBSに109／mlの割合で分散させた。細胞分散液
0.2mlと抗マウスIgG抗体固定化粒子0.2mlとを混
合して37℃で15分インキユーベートした。次いで
160×ｇで１分遠心し、再び穏やかに分散させ、
分散液の１滴を採つてスライドガラス上でトルイ
ジンブルー溶液１滴と混ぜ合わせた。光学顕微鏡
で観察し１細胞について重合体粒子が３個以上付
着しているものをロゼツトとして数えると、マウ
ス脾臓細胞のロゼツト形成率は20％であつた。そ
れに対してマウス胸腺細胞で同様の実験を行つた
結果、ロゼツト形成率は２％であつた。 実施例 10 実施例９の抗マウスIgG抗血清（山羊）IgGフ
ラクシヨンの代りに抗マウスIgM抗血清（山羊）
を使用し、その他は実施例９と同様にして担体微
粒子に抗マウスIgM抗体を固定化した。このよう
にして調製した抗マウスIgM抗体固定化微粒子に
よつて細胞表面にIgMを有するマウスの脾臓細胞
を実施例９と同様にして標識した。その結果マウ
ス脾臓細胞のロゼツト形成率は22％であつた。そ
れに対してマウス胸腺細胞で同様の実験を行なつ
た結果、ロゼツト形成率は１％であつた。 実施例 11 ヒトγ−グロブリン13mgを生理食塩水２mlに溶
解し、63℃で30分間加熱し、10000×Ｇで30分遠
沈して上清を採つた。高速液体クロマトグラフに
よる分析結果ではmonomeric human γ−
globulinとaggregated human γ−globulin（以
下AHGと略記する）との比率は１：１（ピーク面
積比）であつたが、精製せずに固定化に使用し
た。担体は実施例３と同様にして調製したアミノ
化ポリマー微粒子を同様にグルタルアルデヒドで
処理して使用した。AHGの濃度を２mg／mlにな
るように調節し、BSAを10mg／mlになるように
添加したPBS溶液と、同容のグルタルアルデヒ
ド処理した担体ポリマー１％を含むPBS分散液
とを混合した。混合液を30℃で2hr撹拌した後、
遠沈して微粒子を蒸留水で洗浄し、BSA1％およ
びナトリウムアジド0.02％を添加したPBSにポリ
マー含量が2.5％になるように再分散した。この
ようにして調製したAHG固定化微粒子の分散液
10μとリウマチ因子検出用試薬“RA（KW）”
（日本凍結乾燥研究所）の対照陽性血清および対
照陰性血清各10μとをスライドグラス上で混合
した。約１分後に陽性血清では顕著な凝集が認め
られたが、陰性血清では凝集が認められなかつ
た。 実施例 12 実施例３と同様にしてアミノ化ポリマー微粒子
を調製し、グルタルアルデヒドで処理してPBS
中に１％の濃度で分散した。別にプロテインＡを
PBSに１mg／mlの濃度で溶解した。これら両者
を１：１（volume）で混合し30℃で２時間撹拌し
た。反応終了後微粒子を遠心分離し、蒸留水で洗
浄してベロナール緩衝食塩水溶液（以下VBSと
略記）に2.5％の濃度で分散した。ただしVBSと
は１にベロナールナトリウム塩0.824ｇ、塩化
ナトリウム8.5ｇおよびナトリウムアジド0.2ｇを
溶解し、塩酸を加えてPHを8.0に調節したPH緩衝
水溶液である。実施例10と同様に調製したAHG
をVBSで希釈した溶液10μとプロテインＡ固定
化微粒子分散液10μとをスライドグラス上で混
合すると、AHG濃度が30μｇ／ml以上の場合に
凝集が認められた。それに対してVBSで２倍に
希釈したヒト血清にAHGを溶解した場合には、
AHG濃度が130μｇ／mlでも凝集が認められなか
つた。これはヒト血清中に高濃度で含まれるIgG
が微粒子表面に固定化されたプロテインＡと結合
することにより、プロテインＡ固定化微粒子の
AHGによる凝集を阻止したためと解釈される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 粒子状担体に免疫活性物質を固定化してなる
免疫学的検査用試薬において、粒子状担体として
式 （但しＲは水素またはメチル基を示す） にて示される反復単位を有する架橋重合体よりな
る平均直径0.03μｍ〜10μｍの微粒子を用いること
を特徴とする免疫学的検査用試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4361880A JPS56141559A (en) | 1980-04-04 | 1980-04-04 | Reagent for immunological inspection |
| US06/250,073 US4418152A (en) | 1980-04-04 | 1981-04-01 | Immunological, diagnostic reagents having particulate carriers of glycidyl acrylate polymers |
| DE8181102547T DE3171001D1 (en) | 1980-04-04 | 1981-04-03 | Diagnostic reagents for immunological tests and a process for preparing the same |
| BR8102029A BR8102029A (pt) | 1980-04-04 | 1981-04-03 | Reagente para diagnostico para testes imunologicos e processo para sua preparacao |
| CA000374624A CA1156799A (en) | 1980-04-04 | 1981-04-03 | Diagnostic reagents for immunological tests and process for preparing the same |
| EP81102547A EP0038960B1 (en) | 1980-04-04 | 1981-04-03 | Diagnostic reagents for immunological tests and a process for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4361880A JPS56141559A (en) | 1980-04-04 | 1980-04-04 | Reagent for immunological inspection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56141559A JPS56141559A (en) | 1981-11-05 |
| JPS6315551B2 true JPS6315551B2 (ja) | 1988-04-05 |
Family
ID=12668820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4361880A Granted JPS56141559A (en) | 1980-04-04 | 1980-04-04 | Reagent for immunological inspection |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4418152A (ja) |
| EP (1) | EP0038960B1 (ja) |
| JP (1) | JPS56141559A (ja) |
| BR (1) | BR8102029A (ja) |
| CA (1) | CA1156799A (ja) |
| DE (1) | DE3171001D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3264269D1 (en) * | 1981-07-17 | 1985-07-25 | Toray Industries | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor |
| SE8201972L (sv) * | 1982-03-29 | 1983-09-30 | Gambro Lundia Ab | Magnetiskt paverkbara kristalliserade kolhydrat sferer eller partiklar att anvendas tillsammans med bioadsorberande material |
| JPS58209984A (ja) * | 1982-05-28 | 1983-12-07 | Japan Synthetic Rubber Co Ltd | 粒子状重合体よりなる担体 |
| JPS59224565A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-12-17 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 抗原検出用試薬 |
| US4760030A (en) * | 1984-09-10 | 1988-07-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Quantitative opaque particle agglutination assay |
| DE3568583D1 (en) * | 1985-08-29 | 1989-04-13 | Berol Kemi Ab | A carrier with an immobilised, biologically active substance, a method for its preparation, and the use thereof |
| DE3541033A1 (de) * | 1985-11-19 | 1987-05-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantifizierung von zellpopulationen bzw. subpopulationen sowie hierfuer geeignetes reagenz |
| EP0228225A3 (en) * | 1985-12-16 | 1989-07-26 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Immunoassay kit and method employing modified solid surface |
| JPS62197425A (ja) * | 1986-02-25 | 1987-09-01 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 球状熱可塑性樹脂の製造方法 |
| US5200270A (en) * | 1986-02-25 | 1993-04-06 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
| US4882226A (en) * | 1986-09-23 | 1989-11-21 | Akzo N.V. | Carrier material for use in chromatography or carrying out enzymatic reactions |
| US5206136A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Rapid membrane affinity concentration assays |
| US5281416A (en) * | 1986-12-23 | 1994-01-25 | Royal Melbourne Institute Of Technology Limited | Swine dysentery vaccine |
| CA1304289C (en) * | 1986-12-23 | 1992-06-30 | Peter John Coloe | Diagnostic test for swine dysentery |
| US5160626A (en) * | 1987-09-14 | 1992-11-03 | Gelman Sciences Inc. | Blotting methods using polyaldehyde activated membranes |
| US4961852A (en) * | 1987-09-14 | 1990-10-09 | Gelman Sciences, Inc. | Polyaldehyde activated membranes |
| US4992172A (en) * | 1987-09-14 | 1991-02-12 | Gelman Sciences, Inc. | Blotting methods using polyaldehyde activated membranes |
| US4824870A (en) * | 1987-09-14 | 1989-04-25 | Gelman Sciences, Inc. | Polyaldehyde activated membranes |
| US5593897A (en) * | 1988-04-04 | 1997-01-14 | Northwestern University | Binding of immune complexes by modified forms of C-reactive protein |
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| US5200315A (en) * | 1990-07-25 | 1993-04-06 | Eastman Kodak Company | Particulate biologically active reagent containing polyoxyalkylene side chains, analytical element and methods for use of the reagent |
| CA2127605A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-24 | Peter J. Degen | Affinity separation method |
| DE19518771C2 (de) * | 1995-05-22 | 1997-12-04 | Deutsches Krebsforsch | Mittel enthaltend einen Komplex aus einem polymeren Mediator und einem Peptid, sowie eine Trägeroberflächen zur adsorptiven Bindung des Komplexes |
| WO2004060343A1 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Nektar Therapeutics | Antibody-containing particles and compositions |
| US8183057B2 (en) * | 2004-09-14 | 2012-05-22 | Mitsubishi Chemical Corporation | Biomaterial construct, its producing method, biomaterial support, target material purifying method, affinity chromatography container, separation chip, analyzing method and analyzing separator for target material, biomaterial complex, and its support, sensor chip, solid support with biomaterial fixed thereon |
| US7309023B2 (en) | 2005-01-13 | 2007-12-18 | Steven Kaiser | Self-adjusting flexible track for use with electric model vehicles |
| JP4866112B2 (ja) * | 2005-07-27 | 2012-02-01 | 三菱化学株式会社 | 生体物質構造体及び生体物質構造体の製造方法、並びに、生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及び、センサーチップ |
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