JPS63139200A - ヒト分化誘導因子ｂｕｆ−３抗体及びそれを用いる定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はヒト分化誘導因子（以下ＢＵＦ−３と記す）に
対する抗体及びその抗体を用いる卵胞刺激ホルモン放出
蛋白質（以下ＦＲＰと記す）の定量法に関する。

〈従来技術〉 本発明者らは以前よ、！ｌ）　ＢＵＦ−３に関する研究
を行なってきている（特願昭６１−１５００３３及び昭
和６１年１０月２７日出頼の［ヒト分化誘導因子ＢＵＦ
−３Ｊ、出願人味の素株式会社）３．一方、ネイチャー
誌（Ｎａｔｕｒｅ、３，２１，７２４−７２５゜（１９
８６）　、Ｎａｔｕｒｅ　ｐ　３２１　ｅ　７７６−７
８２＋（１９８６））には卵胞刺激ホルモン放出蛋白質
（以下、　ＦＲＰと記す）についての報告があシ、との
ＦＲＰは偶然にもＢＵＦ　−３と同一物質である。

このことよりＢＵＦ−３に対する抗体の調製は換言すれ
ばＦＲＰに対する抗体の調製を意味するので、下記のよ
うにより一層利用範囲が広がるものと考えられる。

ＦＲＰの作用によシ放出される卵胞刺激ホルモン（以下
、ＦＳＨと記す）は黄体形成ホルモン（以下、ＬＨと記
す）と並んで卵母細胞を成熟卵子に導くだめの必須ホル
モンである。

従ってとのＦＳＨレベルを低く保つことにより避妊効果
が期待できるわけである。現在用いられている避妊薬は
ステロイド系であシ中枢に働くため副作用が免れないが
ＦＲＰに対する抗体を用いることができればこれによる
ＦＳＨレベルの調節はより直接的に卵母細胞に働くので
副作用の心配が少ない。

また、　ＦＳＨ過多が閉経期においてみられると更年期
障害の症状がみられることがわかっている。

以上のように、ＦＲＰに対する抗体を得ることができた
ならば、ＦＳＨレベルの調節と通して避妊及び更年期障
害の治療に利用できる。また、この抗体を用いるＦＲＰ
の定量法は従来の方法に比較して、簡便に不妊及び更年
期障害の診断に活用できる。

しかしながら、ＦＲＰはヒトホルモンであるので、大量
に得ることができず、従ってその抗体を調製することは
困難であった。

く本発明が解決しようとする問題点〉 この発明の課題はＦＲＰに対する抗体及びこの抗体を用
いるＦＲ，Ｐの定量法の提供である。

〈問題点を解決する為の手段〉 本発明者らは上記課題を解決すべき鋭意研究をを重ねた
結果、ＦＲｐとＢＵＦ−３は同一物質であることに注目
して本発明の課題を解決した。

すなわち、ヒト白血病細胞が産生ずるＢＵＦ　−３に対
する抗体及び酵累標識免疫測定法において、ＢＩＪＦ−
３に対する抗体を用いたＦＲＰの定量法を見い出すこと
により、本発明を完成に至らしめたわけである。

以下に本発明の詳細な説明する。

ＦＲＰはまずブタの卵胞から抽出されその構造が決定さ
れた物質である（　Ｎａｔｕｒｅ　、　３２１　、７２
４−７２５．及び７７６−７８２（１９８６））。

ヒトのＦＲＰもブタのＦＲＰと全く同一の構造をとる。

すなわちβ□−β□ホモダイマー構造である。

またこのＦＲＰは偶然にもヒト白血病細胞を特定の分化
誘導物質の共存下で培養又は誘導することにより産生さ
れるヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３と同一であるととがわ
かっている。このＢ　ＵＦ　−３は以下の理化学的性質
を有する。

すなわち、 （、）分子量：１６±１ｋｄ（１，０％メルカプトエタ
ノール存在下、５ＤＳ−電気泳動 法） ２５±１　ｋｄ　（メルカプトエタノール非存在下、８
ＤＳ−電気泳動法） （ｂ）等電点：ｐＩ６．３士０．２（クロマトフす−カ
ミフグ法） ｐＩ７．３（等電点電気泳動法） （ｃ）ＩＩＪ″１安定性：　ｐ）ｌ　２．０〜１０．０
の範囲で安定（ｄ）熱安定性＝６５℃、６０分の加熱で
安定（ｅ）有機溶媒安定性： 低級アルコール、アセトニトリル に対し安定 （ｆ）プロテアーゼ耐性： プロナーゼ処理で完全に失活する。

（ω比活性：２Ｘ１０Ｕ／Ｉｎ９蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： 本発明者らはＢＵＦ　−３を抗原として動物に免疫した
。免疫動物はウサギ、マウス、ラット、ニワトリなどの
ヒト、ウシ、ブタ以外の温血動物であればよい。免疫方
法は通常の方法でよい。得られた抗血清よシ本発明の抗
体を得る方法も従来知られているいずれの方法も採用で
きる。

また、本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクロ
ーナル抗体でもよい。次に抗体の調製法であるが、具体
的にはポリクローナル抗体の場合は抗血清を３３チ飽和
硫安で沈澱させ、イムノグロブリンＧ　（ＩｇＧ画分）
を分取する。この画分が抗ＢＵＦ−３活性があるのか否
かを判定するには以下の方法を用いる。

公知の酵素標識免疫吸着測定法（以下ＥＬＩＳＡ法と略
す）に従いプレートに吸着した抗原に抗体を結合させ、
これを酵素標識した２次抗体と反応させ酵素の発色反応
で抗体活性を測定する。あるいはラジオアイソトープで
抗原を標識する公知のラジオイムノアッセイ法でもよい
。

またモノクローナル抗体の調製の場合は、免疫した動物
の牌細胞とシエロースを融合させ得られる融合細胞（ハ
イプリドーマ）を選択してクローン化し次いで生体外（
ｌｎ　ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）
で培養し、この培養物よシ特異性の高いモノクローナル
抗体を採取する。

以上述べたようにして生成した抗体を必要に応じて精製
する。精製方法は、塩析、透析、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど公知の
方法を組み合わせればよい。

さらに抗体を酵素例えばペルオキシダーゼ−？フルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシターゼ等で標識すれば
ＥＬＩＳＡ法に用いる際、２次抗体が不要となるので測
定が単純化できる。尚、このようにして得られたモノク
ローナル抗体は以下のような性質を有する。

■免疫グロブリンの種類：　ＩｇＭ、ＩｇＧ■分子量　
　　　　　：ＩｇＭは２５〜３５万ＩｇＧは５〜７万 ■得られたモノクローナル抗体はＦＲＰ　（ＢＵＦ　−
３）蛋白と結合する。

次に上記抗体を用いた酵素免疫吸着測定法によるＦＲＰ
の定量法について記載する。

ＥＬＩＳＡ法には下記のような固相サンドイツチ法、固
相直接法、固相競合法があるが、本発明においてはいず
れの方法を用いてもよい。

まず固相サンドイツチ法であるが、使用するグレートを
ＢＵＦ−３に対する抗体で感作し、次いでＦ’ＲＰ含有
試料を添加後、上述の酵素標識抗体を結合させ、さらに
発色基質を加えて酵素と反応させる。結合する酵累量は
ＦＲＰ　量に依存するので、発色最終産物の量を測定す
ることによってＦＲＰを定量することができる。

固相直接法であるが、この方法はＦＲＰ含有試料を直接
プレートに感作し、プレート非吸着面を抗原と無関係の
タンパク質、例えばウシの血清アルブミンなどでブロッ
クし次いで酵素標識抗体を反応させ以下固相サンドイツ
チ法と同様にしてＦＲＰを定量する。

固相競合法は一定量のＦＲＰを直接プレートに感作、ブ
ロッキング処理した後、酵素標識抗体と遊離のＦＲＰ共
存液（被験液）とを添加し、抗体の固相ＦＲＰへの結合
阻害塵を測定することによ、り　ＦＲＰを定量する方法
である。

すなわち固相競合法の原理は被験液中の遊離のＦＲＰと
固相ＦＲＰとの間に競合が起こり、前者が多ければ、抗
体と結合する後者の量が減少するのでその度合をあらか
じめ既知量のＦＲＰを用いて作った標準曲線にあてはめ
るものである。

以上、ＦＲＰに関して述べて来たが、本発明の抗体はア
フィニティークロマトグラフィーによるＢＵＦ−３の精
製にも当然利用できる。

すなわち取得した抗体を不溶性担体に結合させたグルに
ＢＵＦ　−３混合物を添加し、未結合の夾雑物を洗い流
した後、　ＢＵＦ−３を溶出すればよい。

〈効果〉 ＦＲＰとＢＵＦ−３が同一物質であることに着目するこ
とによシ従来得ることができなかったＦＲＰに対する抗
体をＢＵＦ−３よシ調製することができたわけである。

本発明に係る抗体及びこの抗体を用いた試料中のＦＲＰ
　＠　ｉの定量法は■更年期障害の治療及び診断、■避
妊及び不妊性の診断等に利用できる。

実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。

〈実施例１〉 ５チ牛脂児血清を有するＲＰＭＩ　−１６４０無菌培地
５．　ＯＬを２０！容スピンナーフラスコに張シ込み、
この培地にＴＨＰ−１ｆｇｆＩ胞を２　Ｘ　１０’個／
−になるように懸濁した。これを３７℃で４日間培養し
、得られた培養液を遠心分離し、ＴＨＰ−１細胞を無菌
的に採取した。この細胞を別のスピンナーフラスコに入
れた血清を含壕ない上記ＲＰＭＩ　−１６４０培地５．
Ｏ！に移し、これにＴＰＡを１０　ｎｆ／−添加し、ゆ
るやかに液を攪拌（１００ｒ−ｐ−ｍ　）　しつつ、３
７℃で２時間培養（誘導）を行った。このようにして得
られた培養液を遠心分離して細胞を分離、除去し２０単
位／−の活性を有する培養液を得た。

このようにして得た培養液１００＃に硫安を加え（７０
チ飽和）、生ずる沈澱物を遠心分離（１０，０００ｒｐ
ｍ、１０分間）により採取し、少量の０．０５Ｍ）リス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解後回緩衝液に対し
て十分透析した。透析内液を同緩衝液で十分平衡化した
ＤＥＡＥ　−）−ヨーｉ４−ル６５０Ｍ（７Ｘ７０ｍ）
に負荷した。このカラムを同緩衝液５．０！で洗浄した
後、０−０．２Ｍの食塩を含有する同緩衝液で溶出した
。分化誘導活性は０．１　Ｍの食塩で溶出された。この
活性区分を集め固型硫安を７０チ飽和し、加えて硫安を
沈澱させた。遠心分離によりこの沈澱物を集め、水２０
−に溶解した。この液に８０チ飽和の硫安溶液を２〇−
加え、４０係飽和硫安を含む０．０５　Ｍトリス−ＨＣ
１緩衝液（ｐＨ７，７）であらかじめ平衡化させたプチ
ルトーヨーパール６５０Ｍカラム（２５Ｘ　３０　ｃｍ
　）に負荷した。硫安濃度を段階的に下げた後、３０％
エタノールで溶出すると分化誘導活性物質が溶出された
。このプチルトーヨーノ臂−ルによる疎水クロマトグラ
フィーの溶出ノ母ターンを第１図に示した。活性区分を
集め減圧下で濃縮してエタノールを除去し、この濃縮液
を０．０５Ｍトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，７）に対
して透析した。透析内液を同緩衝液で平衡化したスーパ
ーローズ（ファルマシア社製グル濾適用カラム）を用い
てダル濾過を行った。そのダル濾過溶出パターンを第２
図に示した。第２図に示すようにＦ５−５に対する分化
誘導活性物質の溶出時間は５６０分であり、標準蛋白質
の溶出時間に基づいてＢＵＦ　−３の分子量を１０±０
．５　ｋｄと算出した。このサンダルを０．０５　Ｍ　
）リス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に対して透析し、
これを同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　Ｉ（Ｒ５／
　５　カラム（ファルマシア製陰イオン交換体）を使用
するファルマシアＦＰＬＣ（ＦａｓｔＰｒｏｔｏｉｎ　
　＃　　ｐ＠ｐｔｉｄｅ　　ｅ　Ｐｏ１ｙｎｕｅｌｅｏ
ｔｉｄｅ　　ｐ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ）システムによシ精製した。溶出は０．０５　Ｍ
から０．１Ｍまでの食塩のグラジェント溶出を行った。

　ＢＵＦ−３活性は０．１Ｍ附近の食塩で溶出された。

この工程に於る精製倍率は約５倍であシ、はは単一な蛋
白に精製された。次にこのサンプルをハイボアＲＰ３０
４（バイオラッド社製、Ｃ−４逆相用カラム）を用いて
逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。条件は０．
１　％　）リフルオロ酢酸を展開液としｎ−プロパツー
ルの濃度をＯチから８０％直線的に変えて溶出した。そ
の溶出ノ臂ターンを第３図に示した。第３図に示す蛋白
ピークと活性は完全に一致した。この活性ピークを集め
て約１００μｍの精製標品を得た。このサンプルについ
て５ＤＳ−ポリアクリルアミドダル電気泳動（）ｌ′に
ル濃度：１５．Ｏチ、１．０％メルカゾトエタノール共
存下）を行った。その結果、１６ｋｄに単一々バンド（
銀染色法）が認められ、他に蛋白のバンドは検出されな
かった。また、メルカプトエタノールの非存在下では２
５　ｋｄであった。このようにして精製されたサンプル
の比活性は約２×１０　Ｕ膚蛋白であった。

この電気泳動的に単一に精製されたサンプル３００μ２
をジチオスレイトル６００μｍで６時間還元した後ピリ
ジルエチル化した後、その１０μｍをアゾライド・バイ
オシステムズ社製気相アミノ［／−フェンシングアナラ
イザー（モデル４７０Ａ）を用い、Ｎ末端より順次エド
マン分解を行った。遊離してくるフェニルチオヒダント
イン−アミノ酸を、高速液体クロマトグラフィー（スベ
クトロフィジクス社製ＨＰＬＣ装置５Ｐ８１００．カラ
ムはデュポン社製ゾルパックスＯＤＳ　）にて分析を行
った。その結果、本発明のＢＵＦ−３のアミノ末端から
のアミノ酸配列は下記のとおシであった。

Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｓ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−
Ａｇｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｉ　１ｓ−１１ｅ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ　−８ｓ　ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｈｉ　ｓ　−Ａ
ｌ　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｍ　−Ｇｌ　ｕ−Ｇ１
７次に、非還元ＢＵＦ−３について、等電点、−安定性
等信の理化学的性質を調べた。その結果を以下に示した
。

（１）等電点：ｐＨ６，３±０．２（クロマトフオーカ
シング法） ７．３±０．２（等電点電気泳動法） （ｂ）　ＰＨ安定性：　ｐＨ２，０〜１０．０の範囲で
安定（４℃７時間） （ｅ）熱安定性＝６５℃、６０分の加熱で安定（Ｐ）１
７．４） （ｄ）溶媒安定性ニア七トニトリル、低級アルコールに
対して安定（２５℃） （ｅ）プロプアーゼに対する安定性： プロナーゼ処理によシ完全に失活 する。

（一定量のＢＵＦ　−３を１チのＮａＨＣＯｓ液に溶解
し、これにＢＵＦ−３の１／１０量のプロナーゼを加え
、３７℃で 一夜酵素処理で完全に失活する） 尚、上記クロマトフす−カシングによる等電点の測定は
以下のようにして行った。精製したサンプルを２５ｍＭ
ビストリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析し
、同緩衝液で平衡化したポリバッファー交換体ＰＢＥ９
４（ファルマシア製）カラム（１，ＯＸ　４０ｍ）に負
荷し、１／１０に稀釈したー５．０ノポリパツフアー（
ファルマシア製）で溶出する。等電点は、活性の溶出位
置の−で表わされる。

一方、等電点電気泳動法による等電点の測定は、ＬＫＢ
社（スウェーデン）製の等電点電気泳動装置（ＬＫＢ　
−Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ　）及び試薬（Ａｍｐｈｏｌｉ
ｎｅ　）を用い、　ＬＫＢ−アンホラインＰＡＧプレー
トの測定方法に従い、測定した。試料を平板ダル（ＬＫ
Ｂ１８０４−１０１　ｔｐＨ３，５〜９．５）に添加後
１５００Ｖで２．５時間泳動を行い、マーカーとしてフ
ァルマシア社製の等電点測定用キラ）　（ｐＨ３〜１０
）を用いて等電点を測定した。その結果、等電点け７．
３であった。

本発明に使用したＴＨＰ−１はＩｎｔｏ　Ｊｔ　Ｃｈｎ
Ｑ＠ｒ　ｇ２６．１７１−１７６、（１９８０）に記載
されているものであシ、との報文の著者より分与された
ものである。ＴＨＰ−１は他にもＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｅａｄ、Ｓｅｔ　　、　　：Ｕ、Ｓ、Ａ３０ｐｐ　　
５　３　９７　−５４０１（１９８３）　　、　　Ｃａ
ｎｃ＠ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４２　　ｅ　　４８４−
４８９　（１９８２）にも記載されていて、これらの研
究機関にも分与されている。また更に本発明者らは権利
を有するいずれのものに対してもＴＨＰ−１を分与する
用意がある。

このようにして単離されたＢＵＦ−３の全−次構造は以
下の方法で決定した。

■　トリプシン分解 ピリジルエチル化したＢＩＪＦ−３１００μｍに１％炭
酸水素アンモニウム１００μ６に溶解した１リゾシン１
０μｍを加え、３７℃６時間反応した。反応終了後反応
液をハイデアＲＰ３１８（バイオラッド社）カラムにア
ゾライし、アセトニトリルと０．１チドリフロロ酢酸で
リニアなグラジェントをかけて溶出した（第４図）。

得られたＴ１〜Ｔ４のピークを分取し、各々のベプチド
アラグメントを気相式アミノ酸シークエンサー（ＡＢＩ
社４７０Ａ／１２ＯＡ型）で分析し、次のような結果を
得た。

Ｔ　　、　　　：　　Ｌｓｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍ＠ｔ
−８ｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ”Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ａｓ＋ｎ−ｌｌ５−ＩＩｓＴ
　１　　：　　Ｈｌｓ−８＊ｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１
ｓ−Ａｓｎ−Ｈｌｓ−ＴｙｒＴ　ｚ　　：　　Ｈｌｍ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙａ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｈｌｓ−１１ａ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−８ｏｒ−Ｇｌｙ−８ｏｒ−８ｏｒ
−Ｌｅｕ Ｔ４　　：　　Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｍｅ
ｔ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−８＊ｒ ■　ブロムシアン分解 ピリジルエチル化ＢＴＪＦ−３、１００μｍを７０％ギ
酸に溶解し、少量のブロムシアンを添加し、室温で２４
時間反応した。反応液をハイデアＲＰ　３１８カラム（
バイオランド社）を用いて、０．１％トリフロロ酢酸と
８０チアセトニトリルのグラジェント溶出を行った（第
５図）。フラグメントＣＮＩ〜３を分取し、　ＡＢＩ社
気相式アミノ酸シークエンサーでアミノ酸配列を分析し
た。結果は以下に示した。

ＣＮＩ　：　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｌｇ−８ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙ＋−８ｅｒ−
Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙａ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ ＣＮ２　　：　　Ｌｓｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ＝Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａａｎ−１１ｅ−１１ｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ｒ　ｌａ−Ｇｉｎ−ＡｇｎＣＮ３
　　：　Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌ＠−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ噛−Ｖａ
ｌ−８ｅｒ−Ｐｈ・ ■　８ｔａｐｈｙｒｏｅｏｅｕｓ　ａｕｒｅｕｍ　Ｖ、
　ｐｒｏｔｅａｓｅ分解ピリジルエチル化ＢＵＦエチ、
１００μｍを１チ炭酸水゛凛アンモニウム１００μ！に
溶解し、１０μ？の’５ｔａｐｈｙｒｏｅｏｃｕｓ　ａ
ｕｒｅｕｍ　Ｖ　＠　ｐｒｏｔｓａｍ＠を用いて３７℃
、２８時間分解し、反応液をノ１イポアＲＰ３１８　（
バイオラッド社）を用いて、トリプシン分解の場合と同
様に、分取し得られたフラグメントについて気相法アミ
ノ酸シークエンサー（ＡＢＩ社４７０Ａ／１２　ＯＡ型
）で分析をして以下のような結果を得た＠ Ｖ　１　　：　Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ａａｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−８ｏｒ−Ｐｈａ−
Ｌｙｉ−Ａｓｐ−Ｉ　ｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ Ｖ、　　：　Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−１１ｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−８ｅｔ−
８ｏｒ−Ｌｓｕ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｌ　ａ−８ｅｒ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−ＩＩｓ−Ａｓｎ−Ｈｌｓ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｍ＠ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ■、■、■の結果を総合
してＢＵＦ−３のアミノ酸配列を以下のように決定した
。

アミノ酸配列： Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａ
ｓｎ　Ｍｅｔ　ＩＩｓ　ＶａｌＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ
　Ｇｌｙ　Ｃｙ［ｌ５ｅｒ以上のことから単離し、構造
決定を行ったＢＵＦ−３はすでに報告されているＦＲＰ
と同一物質であることが立証された。

〈実施例２〉 実施例１で得たＢＵＦ−３の精８！！溶液とフロイント
・コンプリート・アジ−パントを同量混合、乳濁化させ
、ニューシーラントホワイトラビット（雌２．５に９、
日本チャールズリパー（株））２羽の皮下にＢＵＦ−３
８０μｍ／匹を投与し免疫を行なった。

２週、３週、４週間後に、同様にＢＵＦ−３をそれぞれ
１２５μｐ、１０５μ７，１５０μ？投与したあとさら
に１週間の間隔をあけてＢＵＦ　−３精製溶液を耳静脈
から１５μｍずつ２回にわたって静注した。最終免疫後
１１日目に全採血し、静置後遠心分離して抗血清を得た
。

このようにして得たウサギの抗血清６　ｍｌを４０チ飽
和硫安で沈澱させ、遠心分離した沈澱を３−のリン酸緩
衝食塩水（以後ＰＢＳと記す）に溶解し、ＰＢＳで２４
時間透析した後、ＤＥＡＥセファロースカラムにかけ１
０ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ７，２）で溶出する両分
（ｘｇｃ、画分）を再び４０チ飽和硫安で沈澱させ、Ｐ
ＢＳに渚かし３．６■／ゴのＩｇＧ溶液とした。

前述のＥＩＪＳＡ法固相サンドイッチ法を用いてこのＩ
ｇＧ溶液の抗ＢＵＦ　−３活性を測定したところその力
価は１：１０’であった。

また、このウサギのｒｇａＨ液３．６■／−と西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ５Ｉｎｇを混合し、４℃でＰＢＳに
透析した後２５チグルタルアルデヒドを最終濃度０．２
チになるよう滴下し、混合した。これを４℃でＰＢＳに
透析し約１８０μｌｉ’／ｄの４ルオキシダ一ゼ標識Ｉ
ｇＧ溶液を得た。

〈実施例３〉 ＢＵＦ　−３の精製溶液とフロイントコンプリートアジ
−パントを同量混合、乳濁化させＢＡＬＢ／ｅＡｎＮｃ
ｒｊマウス（雌、４退会１日本チャールズリパー＠））
の皮下に１週間の間隔をあけて３回にわけて１回当ｐ　
ＢＵＦ−３が３０μｆ！／匹となるよう投与し免疫を行
なった。さらに１週間後に５μｍ０ＢＵＦ−３溶液のみ
を静注し、最終免疫を行なった。最終免疫の４日後に同
マウスを殺し、牌臓を取り出した。これを細断した後ス
テンレス・メツシーを通しイーグルのミニマム・エッセ
ンシャル培地（ＭＥＭ　）に浮遊させ、肺細胞浮遊液を
得た。この牌細胞とマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａ
ｇ８−６．５．３）をそれぞれＭｌｌｍＭで３回洗浄し
、牌細胞とミエローマ細胞を４：１の割合で混合して遠
心（１４００ｒｐｍ　８分）した。得られた沈澱に４０
チポリエチレングリコー／Ｌ／４０００．１０％ジメチ
ルスルフォキサイド（ＤＭＳＯと略する）ｐＨ７，２，
１０μｍ〜ポリーＬ−アルギニン／　ＰＢＳ溶液１−を
徐々に加え１分間室温放置し細胞融合を行なった。次い
でＭＥＭ　２−を２分間で加え、さらに口１−を３分間
で添加し計１０−とじた後遠心（８００ｒｐｍ　５分）
を行った。この沈澱を１０％牛脂児血清（Ｆｅ２　）含
有ＲＰＭＩ　１６４０培地に２　Ｘ　１０５（ＩＬ／ｄ
になるように懸濁し９６穴マイクロプレートに１ウェル
当、９０．２　ｔｄ植えつけた。翌日ＨＡＴ　（ヒポキ
サンチン１ｘｌＯＭ、アシノプテリン４Ｘ１０−’Ｍ、
チシジン１．６　Ｘ　１０’−５Ｍ　）を含んだＲＰＭ
１１６４０−１０チＦＣ８培地（ＨＡＴ培地）を各ウェ
ルに５−ピペットで１滴ずつ添加した。その後３〜４日
毎に半分量を）（ＡＴ培地で交換したところ７日目から
ハイプリドーマ細胞の生育がみとめられた。

ハイプリドーマ細胞の培養上清中のＢＵＦ　−３に対す
る抗体について（ＥＬＩＳＡ法）によシスクリーニング
を行なった。スクリーニングに用いた抗原ハ、精［ＢＵ
Ｆ−３、第２抗体はアルカリフォスファターゼ標識材の
ヒツジ抗マウスであった。

ン ・総数１６５個のウェルのうち７個がＥＬＩＳＡ法によ
＃）陽性であり、ＢＵＦ−３に対する抗体を産生じてい
るという結果が得られた。

細胞数がおよそ１０４個以上にふえたところでＨＴ培地
を加えた。３日〜４日毎に計３回ＨＴ培地を用いて培地
交換を行ないその後は通常の１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ　
−１６４０培地を用いて培養した。

ＢＵＦ　−３に対する抗体の活性試験において陽性の結
果を示した７株のハイブリドーマ細胞を９６穴マイクロ
プレート（平底）の１ウエルあたり３個。

１個、０．５個となるよう希釈し、ＢＡＬＢ／ｃマウス
胸腺細胞をフィーダー細胞として加え、プレートに分配
し１０チＦＣ８−ＲＰＭＩ　−１６４０培地で培養した
。顕微鏡下で観察し確実にシングルセルコロニーである
ウェルを選択し、最も高い活性をもつハイプリドーマ細
胞をＥＬＩＳＡ法によシスクリーニングしてクローン化
した。

７株のハイプリドーマ細胞からクローン化した総数１０
個のウェルがＥＬＩＳＡ法によシ陽性でありＢＵＦ−３
に対するモノクローナル抗体を産生じていた。

次に大量にＢＵＦ−３に対するモノクローナル抗体を産
生させるために約１０　個のハイブリドーマ細胞をプリ
スタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し
た。９日目に採取した腹水液を遠心分離し、上清を一８
０℃で凍結した後融解し、１１００００ｒｐ　１０分間
遠心分離して抗体を得た。

このようにして得たモノクローナル抗体のクラスをクラ
ス特異性抗マウス抗血清を使用してオフタロニーグル拡
散試験で決定した。その結果、ＢＵＦ−３に対するモノ
クローナル抗体のクラスはＩｇＭとＩｇＧであった。

〈実施例４〉 ＥＬＩＳＡ法において、　ＢＵＦ−３を抗原として得ら
れた抗体を用いるＦＲＰの定量を以下に示した。　　′
各１ｉ　ＥＬＩＳＡ法の内固相サンドイッチ法について
まず、以下に記載した。

固相サンドイツチ法によるＦＲＰの定量は以下のように
行なった・ ９６穴ＥＬＩＳＡ用プレー）　（ＮＵＮＣ社イムノプレ
ー）ＩＩ）に実施例２で得たウサギのＢＵＦ　−３に対
するｉ体のＩｇＧ　溶液をＰＢＳで１００倍希釈したも
のを１ウエルあたシ５０μｊずつ入れ室温で２時間静置
した。Ｔｗｅｅｎ　−２０含有リン酸緩衝食塩水（以下
ＰＢＳ　Ｔｖｅｅｎと記す）　（５０％Ｔｗａ＠ｎ−２
０−０，１％　ＮａＮ３　）溶液で各ウェルを５回洗浄
し、　ＦＲＰ含有ＰＢＳ　Ｔｖｓｅｎ溶液を各ウェルに
５０μ！ずつ添加し１時間静置した。ＰＢＳ　Ｔｗｅｅ
ｎ溶液で５回洗浄した後実施例１で得たペルオキシダー
ゼで標識したウサギのＢＵＦ−３に対する抗体を６μｍ
／−の濃度にＰＢＳ　Ｔｗｅｅｎで希釈し各ウェルに５
０μｊずつ添加し１時間静置した。これをＰＢＳ　Ｔｗ
ｅｅｎで５回洗浄しペルオキシダーゼ発色基質（オルト
フェニレンジアミン３４ｍりＸ１００−リン酸クエン酸
バッファーｐＨ５、３０ｔｔｌ、３０９ｂＨ２０２”）
を各ウェルＫ　１００μ！ずつ加えた。３０分後４Ｎ硫
酸を各ウェルに５０μｊずつ添加し反応を止め４９２　
ｎｍの吸光度があシ、ＦＲＰの濃度０．０５〜５．０μ
ｍ／−の間で直線性が得られた。

〈実施例５〉 固相競合法によるＦＲＰの定量は以下のように行った。

９６穴ＥＬＩＳＡ用プレー）　（ＮＵＮＣ社イムノデレ
ー）Ｉｔ）に実施例１で得たＢＴＪＦ−３を４μｆ／ｍ
ｅ　ＰＢＳ溶液にして各ウェルに５０μ！ずつ入れ２時
間放置した。ウェルをＰＢＳＴｖｅ＠ｎ溶液で５回洗浄
した後実施例２で得たペルオキシダーゼ標識抗体６μ７
／ｄＰＢＳＴｗｅｅｎ溶液で希釈したＦＲＰ含有液（被
験液）を１ウエルあたυ５０μにずつ添加し、１時間後
にＰＢ８Ｔｗｓｅｎで５回洗浄し、実施例４で示したペ
ルオキシダーゼ発色基質を用いて反応させた。反応は被
験液中のＦＲＰの濃度２〜０．５μＰＡＩＩ７！の間で
相関があった。

〈実施例６〉 固相直接法によるＦＲＰの定量は次のように行なった。

９６穴ＥＬＩＳＡ用プレー）　（ＮＵＮＣ社イムノプレ
ートＩＩ）にＦＲＰ含有ＰＢＳ溶液を１ウエルあたシ５
０μｌ入れ室温で２時間静置しプレート面に吸着させた
。ＰＢＳ　Ｔｗｅｓｎ　（５０％Ｔｖｅｅｎ　−２０ｐ
　０．１％　ＮａＮ、　／　ＰＢＳ　）　ｍ液で各ウェ
ルを５回洗浄し、次に実施例２で得たＢＵＦ−３に対す
るウサギの抗体ＩｇＧ溶液をＰＢＳ　Ｔｗｅｅｎで１０
０倍希釈したものを１ウエル当シ５０μｌずつ添加した
。室温で１時間静置後ＰＢＳ　Ｔｗｓ　ｅ　ｎで洗浄し
、ペルオキシダーゼ発色基質（オルトフェニレンジアミ
ン３４■／１０〇−リン酸クエン酸バッファーｐＨ５，
３０μ！３０％　Ｈ２Ｏ２）を各ウェルに１００μｊず
つ添加した。

３０分後４Ｎ硫酸を各ウェルに５０μ！ずり加えて反応
を停止し４９２　ｎｍの吸光度をタイターチックマルチ
スキャンで測定した。反応はＦＲＰ濃度と相〈実施例７
〉 実施例３で得たマウスのＢＵＦ−３に対するモノクロー
ナル抗体を用いてＢＵＦ−３の精製を以下のように行な
った。

アフィーｙル１０　（ＢｉｏＲａｄ社）２−をフフナー
ロートにセットしたガラスフィルターにとシ冷ＤＷ２（
２段蒸留水）で３回洗った後、試験管に移し、実施例３
で得たＢＵＦ−３に対するモノクローナル抗体１ｒｎｔ
を加え、４℃で４時間混合した。次に０、１　Ｍ　Ｎａ
ＨＣＯｘ　／　０．１５　Ｍ　ＮａＣｔ液でグルを２回
洗浄し、２−の０．１　Ｍエタノールアミン・ＨＣｌ　
（ｐＨ８）を加えて１時間室温で反応させた。とれをカ
ラム（２，５Ｘ　３．５副）につめｐＨ２でよく洗った
後溶出バッファー（０，２Ｎ酢酸０．１５　Ｍ　ＮａＣ
ｔｅＯ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００ｐＨ２，５
）で洗った。さらに開始バッフｙ　　（０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣｔｅ　０．１　％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００）で
平衡化し、ＢＵＦ−３混合液をカラムに重層し、開始バ
ッファーをカラムの体積の５倍量流した後溶出バッファ
ーで溶出し、その溶出画分を集めた。以上の操作によっ
てＢＵＦ−３は良好に精製、回収された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ヒト分化誘導因子ＢＴＪＦ−３のプチ
ルトーヨーノや一ルによる疎水クロマトグラフィーの溶
出パターンである。 第２図は、本発明のヒト分化誘導因子ＢＴＪＦ−３のグ
ル濾過クロマトグラフィーの溶出／ｆターンである。 第３図は本発明ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３の逆相高速
液体クロマトグラフィーの溶出パターンであ６゛り ′第４図は本発明ヒト分化誘導因子ＢＴＪＦ−３のトリ
プシン分解物のハイポアカラムによる溶出パターンであ
る。 第５図は本発明のヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３のブロム
シアン分解物のノ・イＩアカラムによる溶出・母ターン
である。 第６図は固相サンドイツチ法によるＦＲＰの定量である
。 第７図は同相直接法によるＦＲＰの定量である。 手続補正書 昭和６１年１２月１０日 ２、発明の名称 ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３抗体及び それを用いる定量法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　東京都中央区京橋−丁目５番８号４、補正指
令の日付　　　自発 ５、補正により増加する発明の数　　　なし？、補正の
内容 （１）明細書２３頁９行目「・・・の調節と通して」を
「・・・の調節玄通して」と訂正する。 （２）明細書第７頁１０行目「シエロースを」を「□ミ
」＝９二二５−を」と訂正する。 （３）明細書第７頁最下行「β−ガラクトシダーゼ等」
を「β−ガラクトシダーゼ等」と訂正する。 （４）明細書第２頁下行目「２５〜３５万」をｒｕ万」
と訂正する。 （５）明細書第２頁下行目「５〜７万」を「上】万」と
訂正する。 （６）明細書第２３頁５行目「ピリジルエチル化した後
、」を「ピリジルエチル化」よ、」と訂正する。 （７）明細書２３頁下から５行目「アミノプテリン」を
「アミノプテリン」と訂正する。 （８）明細書第２３頁下から４行目「チシジン」を「チ
支ジン」と訂正する。 （９）明細書２３頁３行目「・・・について（ＥＬＩＳ
Ａ法）により」を「・・・について１１ユ旦」−法によ
り」と訂正する。 （１０）明細書第２４頁８〜９行目「産生じているとい
う結果が得られた。」を「産生−し工ｙニー、」と訂正
する。 （１１）明細書第２４頁下から９・〜８８行目１０％Ｆ
Ｃ８−ＲＰＭＩ−１６４０培地」をｒＲＰＭＩ］Ｍｌ−
１６４０培地」をｒＲＰＭ１１６４０−１０％ＦＣ８培
地」と訂正する。 （１３）明細書２３頁２行目ｒ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法
の内固相・・・」をｒＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の１方同相・・
・」と訂正する。 以　　上

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウス白血病細胞を正常細胞に分化成熟せしめる
   活性を有するヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３に対する抗体
   。
2. （２）酵素標識免疫測定法において、マウス白血病細胞
   を正常細胞へ分化成熟せしめる活性を有するヒト分化誘
   導因子ＢＵＦ−３を抗原として得られる抗体を用いるこ
   とを特徴とする卵胞刺激ホルモン放出蛋白質の定量法。