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JPS63135861A - 核酸の雑種の検出法 - Google Patents

核酸の雑種の検出法

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Publication number
JPS63135861A
JPS63135861A JP62284400A JP28440087A JPS63135861A JP S63135861 A JPS63135861 A JP S63135861A JP 62284400 A JP62284400 A JP 62284400A JP 28440087 A JP28440087 A JP 28440087A JP S63135861 A JPS63135861 A JP S63135861A
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JP
Japan
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nucleic acid
gold
dna
metal
biotin
Prior art date
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Pending
Application number
JP62284400A
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English (en)
Inventor
ナニブフシヤン・ダツタグプタ
ボルフ−デイーター・ブツセ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Molecular Diagnostics Inc
Original Assignee
Molecular Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Diagnostics Inc filed Critical Molecular Diagnostics Inc
Publication of JPS63135861A publication Critical patent/JPS63135861A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化された核酸の雑種を検出する非放射線
的方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、蛋白質、
例えば、抗ビオチン抗体被覆金粒子を使用して、ニトロ
セルロース紙上の核酸の雑種を検出する方法に関する。
現在、核酸のハイブリダイゼーションは、遺伝子の構造
を決定するための最も強力な方法である。
それは研究のための広く使用されており、そしてＤＮＡ
プローブ技術は、次の分野において絶えず増加する役割
を演じている：遺伝の疾患の胎児期の診断［Ｅ、Ｍ、ル
ピン（Ｒｕｂｉｎ）およびＹ、Ｍ。
カン（Ｋａｎ）　、ｉ二５７’ｅｙ　）（Ｔｈｅ　Ｌａ
ｎｃｅｔ）、７５−７７（１９８５）：　Ｍ、Ｅ、ペン
プレイ（Ｐｅｕｂｒｅｙ）　、Ｊ、　Ａ　　Ｉ、　Ｍｅ
ｄ　　、　　１０．２１３−２２１（１９８４）］お上
り他の臨床学的アッセイ［Ｋ、−〇、ヘイバーメール（
Ｈａｂｅｒｍｅｈ　Ｉ　）ｒ’）　、スプリンｆｆ−フ
ェノレラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖ　ｅｒｌａｇ）
　、ベルリン、３０−８２ページ（１９８５）；　Ｒ，
に、サイキ（５ａｉｋｉ）　、Ｓ。
シ＋−７（５ｃｈａｒｆ）　、　Ｆ、　フッルーナ（Ｆ
ａｌｏｏｎａ）　、Ｋ、Ｂ、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）　
、Ｇ、Ｔ、ホーン（Ｈｏｒｎ）およびＮ、Ａ、　エール
リッヒ（Ｅｒ１ｉｃｌ＋）、サイエンス（５ｃｉｅｎｃ
ｅ）　、２３０．１３５０−１３５４（１９８５）およ
びＮ、カルセカー（Ｋ　ａｌｓｈｅｋｅｒ）　、　Ｄ　
、チスウエル（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ）、Ａ、ｖ−クハム（
Ｍａｒｋｈａｍｍ）　、Ａ、イマン（Ｉｎ＋ａｍ）　、
Ｓ、　’７リス（Ｗａｌｌｉｓ）　、Ｒ−ウィリアムス
ン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）　、アナレス・オブφクリ
ニカル番バイオケミストリー　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　
ＢｉｏｃＩも−）、影影、２５−３２（１９８５）１゜
基本的方法は、ＤＮＡプローブを雑種の決定のために検
出可能なマーカー（ｍａｒｋｅｒ）で標識することを必
要とする。最も感受性のある標識法は、検出可能な標識
としてラジオアイソトープのリン−３２を使用する。ラ
ジオアイソトープに関連する危険およびリン−３２の比
較的不安定性のために、いくつかの他の標識法が開発さ
れてきている［　Ａ、Ｃ，７＊−スター（Ｆｏｒｓｔｅ
ｒ）　、Ｊ、　Ｌ。
マクインネス（ＭｃＩｎｎｅｓ）　、Ｄ、Ｃ，スキング
ル（Ｓ　ｌ（ｉｎｇｌｅ）お上りＨ，Ｒ，、サイモンス
（Ｓｙｍｏｎｓ）　ｓ　ｇ５　　の研　　Ｎｕｅｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、−Ｖ」−１７４３−７６
１（１９８５）：Ｐ、Ｒ，ランＷ−（Ｌａｎｇｅｒ）　
、Ａ、　Ａ、　ワルドロ−）ブ（ＷａＩｄｒｏｐ）およ
びり、Ｃ，ワード（Ｗａｒｄ）　、プロシＭジと１．η
」−１６６５３−６６３７（１９８１）：Ｊ、Ｊ、　　
レアリー（Ｌｅａｒｙ）　、Ｄ、Ｊ、プリ〃チ（Ｂ　ｒ
ｉｇａｔｉ）およびり、Ｃ，ワード（Ｗａｒ４０４９（
１９８３）；　Ｐ、チェ２（Ｔｅｈｅｎ）　、Ｒ。
Ｐ、Ｐ、７シユ（Ｆｕｃｈｓ）　、Ｅ、セイノ（Ｓａｇ
ｅ）およびＭ、レンゲ（Ｌ　ｅｎｇ）　、７’　３Ｌｙ
−−デー＜７７−ジ戊、影１．３４６６−３４７０（１
９８４）；Ｍ　　しｙデ（Ｒａｎ、）＋ｚ　）　ｆｌ　
／’　　ｈ　ｎ−ｆ（Ｖ、−−−１酸の研　（Ｎｕｅｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）　、１２−１３４３５
−３４４４（１９８４）］　　。
最も有望な別法は、標識としてビオチンを使用虹る。標
識は、最も頻繁には、ビオチニル化ヌクレオシドトリホ
スフェートおよびニック翻訳を経て導入される［ランＮ
　−（Ｌ　ａｎｇｅｒ）ら、肛犯１；レアリー（Ｌｅａ
ｒｙ）　ら、基且ひ−１゜ハイブリグイゼーション後、
酵素が結合する、ビオチン結合性蛋白質（アビジンまた
はストレプトアビジン）を使用して、ハプテン（ビオチ
ン）を比色的に検出する。基質とのインキュベーション
はビオチニル化雑種を可視化する。このような系の最も
感度のあるものは商業的に入手可能である［エンゾ（Ｅ
ｎｚｏ）　、ＢＲＬ、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
）　］　。
最近、化学ルミネセンス検出を使用する同様な酵素結合
系は記載された（　Ｊ、Ａ、マシュース（Ｍａｔｔｈｅ
ｗｓ）　、Ｂ、アーマイチ（Ａｒｕａｉｔｉ）、Ｃ，ヒ
ンス（Ｈｙｎｓ）およびり、Ｊ、クリツカ（Ｋｒ１ｃｋ
ａ）　、アナリテイカル・バイオケミス止り−Ａｎａｌ
、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１５１．２０５−２０９
（１９８５）］　。
前述の系のすべては、それらの感受性のために酵素を要
求し、そして、期待されるように、バックグラウンドの
問題、試薬の安定性および感度は、これらの系を臨床学
的研究室において非理想的とする。
従来、金粒子は、ニトロセルロース紙へ移された、ある
いは固定化された蛋白質の着色および免疫検出において
使用されてきている［Ｍ、メレマンス（Ｍｅｒｅｍａｎ
ｓ）　、Ｇ、ダニールス（Ｄａｎｅｅｌｓ）、Ａ、パン
・ジジク（Ｖａｎ　　Ｄｉｊｉｃｋ）　、Ｇ、ラン〃ン
ガー（Ｌ　ａｎｇａｎｇｅｒ）お上りＪ、デ・メイ（Ｄ
ｅ　　Ｍｅｙ）　、ジャーナルφオ　・イムノロジカル
・メソッズ　Ｊ　　Ｉ　Ｉｌｌｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　、　７支、３５３−３６０（１９８４）：　
Ｂ、スレク（Ｓ　ｕｒｅｋ）およびＥ、ラズ：ｌ（Ｌａ
ｔｚｋａ）　、　旦Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　）　
、１２１．２８４−２８９（１９８４）お上りＹ、７ス
（Ｈｓｕ）　、アナリティヵル・バイオケミストリー　
Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　）、１４２．２２
１−２２５（１９８４）］、Ｌかしながら、金粒子は、
従来、ニトロセルロース紙上で実施される核酸のハイブ
リダイゼーションにおいて利用されてきていない。
核酸の雑種のための、効率よく、感受性がある、非放射
性および非酵素の検出系を有することは有利であろう。
本発明の目的は、核酸の雑種の絹糸津のための、非放射
性、非酵素の、高度に効率的な、感受性の系を提供する
ことである。この目的および他の目的および利点は、本
発明によって提供される６本発明によれば、工程： （ａ）固体の支持体の上に第１核酸を固定化し、（ｂ）
ハイブリダイゼーションの条件下に、工程（ａ）の固定
化された第１核酸を、前記第１核酸の対して相補的であ
ることが疑われる、標識した！Ｍ２核酸と接触させ、そ
して （ｃ）工程（ｂ）から得られる物質を、前記！′：、識
に特異的に結合できる蛋白質を被覆した金属と接触させ
、前記金属は蛋白質を吸収できる、を含んでなることを
特徴とする核酸のハイブリダイゼーションを検出する方
法、が提供される。
核酸成分は、一本領または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ
またはそれらの断片、例えば、制限酵素によって生成さ
れたもの、あるいは比較的短いオリゴマーでさえあるこ
とができる。
核酸が二本鎖の形態である場合、それらは７％イブリグ
イゼーシラン前に変性しなくてはならない。
変性は、加熱、例えば、沸騰水浴中の加熱によって、あ
るいはアルカリおよび酸によって、あるいは有機溶媒、
例えば、ツメチルスルホキシドによって実施することが
できる。酸またはアルカリの変性を実施する場合、ハイ
ブリダイゼーション前の中和は酸（アルカリのために）
またはアルカリ（酸のために）の添加によって実施する
。加熱して変性された試料は、通常、水中で急冷する。
有用な固体の支持体は、この分野においてよく知られて
おり、そして、核酸を共有的にまたは非共有的に結合す
るものを包含する。非共有的支持体は、一般に、疎水性
結合を含むと理解され、そして天然に産出するポリマー
材料および合成のポリマー材料、例えば、ニトロセルロ
ース、誘導化ナイロンおよび７ツ化ポリ炭化水素を包含
し、これらは種々の形態、例えば、フィルター、ビーズ
または充実シートの形態であることができる。共有結合
性支持体（フィルター、ビーズまたは充実シートの形！
！りは、また、有用であり、そして化学的に反応性の１
または２以上の基を有する材料、例えば、ノクロロトリ
７ノン、ジアゾベンノルオキシメチルなどからなり、ポ
リヌクレオチドへの結合のために活性化することができ
る。
典型的なハイブリダイゼーション条件は、次の使用を包
含する： （１）緩衝液、例えば、５ｘｓｓｃ（４４ｇのＮａＣｌ
、２２ｇのクエン酸ナトリウム、１リツトルの水中のほ
ぼ０．２５ｍ１のＨＣＩ　＞、（２）有機溶媒、例えば
、０〜５０％のホルムアミド、 （３）デン２、ルト（Ｄｅｎｂａｒｄｔ）の溶液（０゜
０２％Ｖ、／Ｖの［フィコール（ＦＩＣＯＬＬ＞４００
」、ポリビニルピロリドンおよびＢＳＡ）、（４）促進
剤、例えば、１０％の硫酸デキストランまたはポリエチ
レングリコール。
特定の組成を、次の例においで記載する。
５識は蛋白質と適合性であるべきである０本発明におい
て使用できる標識および／または蛋白質の組み合わせの
非限定的例は、次のものを包含する： 探ｉｔ　　　　　　　Ｌ［ＩＪＬ ハプテン　　　　　抗体 抗原　　　　　　　抗体 ビオチン　　　　　アビノン ＦＡＤ　　　　　　　グルコースオキシダーゼビオチン
　　　　　抗ビオチン抗体 本発明において使用するための金属の非限定的例は、金
、銀、鉄、ニッケル、コバルトおよび水銀を包含する。
金はとくに好ましい。
本発明は、次の利点を有する： （１）高い効率（４時間までに比べて１時間）、（２）
非常に高い感受性、 （３）放射性部分または酵素の使用を必要としない、 （４）実施が比較的簡単である。
本発明を、次の非限定的実施例を参照して説明する。
叉ＩＬ 材」Ｌ 以下に記載する実施例において利用した材料は、次の源
から入手した：ヤギ抗ビオチン抗体は、ジグｖ−ケミカ
ル拳カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
ｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｓ＋　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
＊　Ｕ、　Ｓ。
Ａ、）、Ｇ−２０コロイド状金ゾルおよび銀増強キット
（５ｉｌｖｅｒ　　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　　ｋｉｔ
）　ＷＡは、ノヤンセン・ライフ・サイエンシズ・プロ
ダクツ（Ｊａｎｓｓｅｎ　　Ｌｉｆｅ　　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、
　　Ｎｅｗ　　Ｊｅｒｓｅｙｓ　Ｕ、　　Ｓ、　　Ａ、
　）から購入した。７７−ノ・ラムダＤＮＡ、比色ＤＮ
Ａ検出系お上りハイプリースロット・マニアオールド（
Ｈｙｂｒｉ　−Ｓ　ｌｏｔ　　Ｍａｎｆｏｌｄ）は、ベ
チェスグ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ″）（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓｖ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｙ　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）から購入した。使用
したニトロセルロースフィルターは、０．２μｍの孔大
きさであり、そしてシュレイチャーφ７ンド會シュエル
（Ｓ　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄＳｃｂｕｅｌｌ　
　Ｉｎｃ、、　ＫｅｅｎｅＩＮｅｗ　　Ｈａｐｍｓｈｉ
ｒｅｗＵ、Ｓ、Ａ、）から入手した。光化学的標識試薬
、Ｎ−（４−アジド−２−二トロフェニル）−Ｎ゛−（
Ｎ−ｄ−ビオチニル−３−アミノプロピル）−Ｎ’−メ
チル−１，１，３−プロパンジアミン（７オトビオチン
）は、７オースター（Ｆ　ｏｒｓｔｅｒ）ら、封止１の
方法の変法によって７に４製した。
実施例１：　灸反尤プローブの調製 このプローブは、コロイド状金ゾルと一緒に供給された
ノヤンセンの指導小冊子に記載されるようにして本質的
に調製した（Ｗ、Ｄ、デオデ〃ン（Ｇ　ｅｏｇｈｅｇａ
ｎ　）およびＧ、Ａ、アッカーマン（Ａ　ｃｋｅｒＩＩ
ｌａｎ）　、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・
アンド・サイトケミストリー（Ｌ−−Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍ、　　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　　）　、２５−１１１８
７−１２００（１９７７）およびＷ、Ｐ、７オーク（Ｆ
ａｕｌｋ）およびＧ、Ｍ、タイラー（７６ｙｌｏｒ）、
イムノサイトケミストリー　Ｉ　ｍｉ＊ｕｎｏｃ　ｔｏ
ｃｈｅ−ｉ復ｌ）、−針、１０８０−１０８３（１９７
１）］。
親和性分離ヤギ抗ビオチン抗体を、２ミリモルのナトリ
ウムテトラボレート、ｐＨ９、に討して一夜透析した。
次いで、この抗体溶液を１００゜０００Ｘｇで１時間遠
心し、そして上澄みの上の３／４を保持した。抗体喉は
、１４の吸光係数を使用して決定し、そして２ミリモル
のボレートで希釈して０　、２　ｗｒｇ／　ｍｉの濃度
にした。
蛋白質の最小保ＷＩ量（コロイド状金への吸着のための
抗体の最適濃度）を決定するために［ゲオデ〃ン（Ｇｅ
ｏｇｈｅｇａｎ）　ｓ　世ｒａ：　７　ｔ−り（Ｆａｕ
ｌｋ）　、胛μｍおよびＪ、ロス（Ｒｏｔｈ）　、　チ
ェ丘：−プａ７り（Ｂｕｌｌｏｃｋ）およびＰ、ベトル
スズ（Ｐｅｔｒｕｓｚ）　Ｊｉ）　、Ｖｏｌ、　２．２
１？−２８４べ−ノ、アカデミツク・プレス、ロンドン
（１９８３）１．１０の抗体の直線希釈物を１００μｍ
の２ミリモルのボレー）％ｐＨ９、中の２０μｇ〜２μ
ｇから調製した。各抗体希釈物に、１ｍｌのＧ−２０コ
ロイド状金ゾル（ｏ、ｉモルのＫ　２　ＣＯ３でｐＨ９
に前もって調節した）を添加し、得られる混合物をかき
まぜた。２分の吸着期間後、１００μｍの１０％ＮａＣ
１を容管に添加し、そして５８０ｎｍにおける光学濃度
（０，Ｄ、）を決定した。
安定化しない（保護しない）コロイド状金は塩の添加の
ときに赤から青にかわり、そして抗体の最小保護量は、
塩の添加後この色変化を防止する最低濃度であった。ヤ
ギ抗ビオチン抗体の最小保護量は８μｇ／ｍ１Ｇ−２０
コロイド状金ゾルであることがわかった。
こうして、ヤギ抗ビオチン抗体をｐＨｇ節金ゾルと８μ
Ｈ／ａ＋１の濃度で混合することによって、プローブを
１１３１！ｌだ、２分の吸着期間後、０．１モルのに２
ＣＯ３でｐＨ８，５に調節したＰＢＳ中の１０％のＢＳ
Ａを１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）の最終濃度に添加した。プ
ローブを１２　ｒ　ＯＯＯＸｇで３０分間３回遠心する
ことによって洗浄し、そしてこのゆるい沈殿物をＰＢＳ
中の１％のＢＳＡ（ｐＨ８，５）でもとの体積に再懸濁
した。最後の洗浄後、ゆるい沈殿物を再懸濁し、５２０
ｎｍにおける光学濃度を５．０にした。このプローブを
４℃で貯蔵し、そして使用前、ＰＢＳ中の０．００５％
のＢＳＡで５２０ｎＩ１１において０．５の光学濃度に
希釈した６ ニトロセルロースフィルターを蒸留水で水和し、次いで
５ＸＳＣＣで１５分間ソーキングした。次いで、フィル
ターを空気乾燥し、ハイビースロット・マニホールド中
に締結した。７アージラムダおよびファー７Ｍ１３ｍｐ
７　　ＤＮＡの希釈物を、１モルのＮａＣｌ、０．１モ
ルのＮａＯＨおよＶ５ミ１７モルのＥＤＴＡでつくった
。希釈した試料を１００℃に５分間加熱し、次いで等体
積の２モルの酢酸アンモニウムで中和した。適当なりＮ
Ａ希釈物の２μｍを、各試料の位置にピペットで移し、
１５分の期間後、フィルターを除去し、そして８０℃で
４５分間ベーキングした。こうして調製したフィルター
をシールしたプラスチック袋中で４℃において貯蔵した
。
実施例３：　１凡りの標↓１史 フッーノラムダＤＮＡを、光化学的結合試薬である７オ
トビオチンを使用してビオチンで標識した。ＴＥ４１衝
液中のラムダＤＮＡ（２５０μｍ７ｍ１）を蒸留水中の
等量（ｗ／ｗ）の７オトビオチンと混合し、３００Ｗの
タングステン−ハロゲンランプを装備した「コダック（
ＫＯＤＡＫ）Ｊのスライド用プロジェクタ−のビーム中
で１時間照明した０次いで、標識したＤＮＡをエタノー
ル沈殿により回収した。
実施例４：　ハイプリダイゼーシａン 固定化したラムダおよびＭ１３ｍｐ７のＤＮＡの試料を
含有するニトロセルロースフィルターを、１０１の４５
％ホルムアミド、５０ミリモルのす×デンハルトの溶液
および２５０μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ中で
４２℃において４時間予備ハイブリダイゼーシシンした
。ハイブリダイゼーションは、５ｍ１の４５％ホルムア
ミド、２０ミリモルのリン酸ナトリウム　ｐＨ６，５，
５ＸＳｓｃ、ｓｘデンハルトの溶液、１００μｇ／ｍｌ
の変性したサケ精子ＤＮＡおよび２５０μｇ／ｍｌの沸
騰した（１０分）ビオチニル化ラムダＤＮＡを含有する
、シールしたプラスチック袋中で４２℃において一夜実
施した。
ハイブリダイゼーシタン後、フィルターは、２ｘｓｓｃ
中で２ＸＳ分間、希釈した５ＳＣ（１部のＳＳＣおよび
４部の８２０）　、０．１％のＳＤＳ中で２ＸＳ分間、
そして希釈した５ＳＣ（１部のＳＳＣおよび６部の８．
０）　、０．１％のＳＤＳ中で２×１５分間洗浄した。
すべての洗浄は５０℃で実施した。次いで、フィルター
を、室温において１時間、３％のＢＳＡを含有する０、
１モルのトリス／ＨＣＩ　　ｐＨ７，５，０，１モルの
ＮｉＣｌ、２ミリモルのＭｉＣＩ、中でプロッキングし
た。
実施例５：　ハイブリダイゼーションしたＤＮＡの検出 ビオチニル化ハイプリダイゼーシシンしたＤＮＡの検出
に２つの方法を用いた。ＢＲＬの比色のＤＮＡ検出系は
、ＢＲＬキットと一緒に供給された指示に従って使用し
た。簡単に述べると、ブロッキングしたフィルターをス
トレプトアビジンとともにインキュベーションし、洗浄
し、ビオチニル化ポリ−アルカリ性ホスファターゼとと
もにインキュベーション、洗浄し、そしてニトロ−ブル
ーテトラゾリウムおよび５−プロモー４−クロロ−３−
インドリルホスフェートを含有する色素溶液で可視化し
た。色の発現は３時間進行させた。
本発明による抗ビオチン金プローブを使用する検出は、
ブロッキングしたフィルターを、１／１０希釈の調製し
たプローブとともに、室温において１時間インキュベー
ジシンすることによって達成した。次いで、フィルター
を蒸留水中で２Ｘ３分間洗浄し、そして供給された指示
に従ってノヤンセン銀増強キットを使用して銀増強した
［モエレマンス（Ｍ　ｏｅｒｅｍａｎｓ　）ら、ｕｙ１
］　。
フィルターは、反射のモードにおいて、ノ９イス費レー
プルークロモスキャン（Ｊ　ｏｙｃｅ　　Ｌ　ｏｅｂｌ
Ｃｈｒｏｍｏｓｃａｎ）走査デンシトメーターを使用し
て走査した。この装置は高電力のアークランプを装備し
ており、そして光学的フィルターは走査の間使用しなか
った。
ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡハイフリダイゼ
ーシ１ン７ツセイは、免疫金プローブをイ史用するハイ
ブリダイゼーションしたビオチニル化ＤＮＡの検出の直
接法を評価するために実施した。定量的比較はＢＲＬ比
色ＤＮＡ検出系を使用して実施し、この方法はアイソト
ープの標識つけによる検出の代替法として広く使用され
ている。
２枚のニトロセルロースフィルターの反ｆｆｌ実験した
組（２μｍ）上に、第１図に示す量で７アーノラムグお
よびファージＭ１３ｍｐ７のＤＮＡを固定化した。ビオ
チニル化うムグＤＮＡとともに一夜ハイプリグイゼーシ
１ンした後、１組のフィルターは比色ＢＲＬ系を使用し
て検出し、そして他方の組を免疫金プローブ（２０ｎｍ
の直径の金粒子に吸着したヤギ抗ビオチン抗体）を使用
して検出した。固定化したＭ１３＋ｏｐ７のＤＮＡを含
有するフィルターを、非特異的ハイブリダイゼーション
のための対照として含めた。これらのフィルターをビオ
チニル化うムグＤＮＡとともにハイブリダイゼーション
したとき、いずれの検出法もシグナルを明らかにしなか
った。
ＤＮＡのニトロセルロースへの固定化、予備ハイブリダ
イゼーションお上びハイブリダイゼーションに使用した
条件は、ＢＲＬ検出系による最大の感度のために最適で
あることが決定された。
第１図は、両者の検出法を用いて得られた７ツセイの結
果を示す。金プローブによる検出のために使用した条件
は、上に記１１されている。會プローブのインキュベー
ジコン緩衝液中の０．０５％のＢＳＡより高い濃度は感
度を低下させ、そしてＢＳＡのより低い濃度は、金プロ
ーブのニトロセグラウンドを与えた。フィルターと金プ
ローブとのインキュベージタンの間における、イムノア
ッセイにおいて普通に使用されている洗浄剤の［ツイー
ン（ＴＷＥＥＮ）Ｊの存在は、得られるシグナルを者し
く減少することがわかった。
ニトロセルロースフィルターを金プローブとともに１時
間インキュベージシンし、そして３時間までの期間は感
度を増加しなかった。しかじなから、記載する濃度にお
ける金プローブを使用する、より長い期間はバックグラ
ウンドを増加した。
ニトロセルロースフィルターと金プローブのインキュベ
ージジン後、３０ｐ、の固定化ＤＮＡヘノ１イブリダイ
ゼーシ１ンしたビオチニル化ＤＮＡを検出できた。８ｐ
ｇまで低下する検出は銀の増強後に達成され、その後ハ
イブリダイゼーションした　　　　′ＤＮＡは、白いパ
ックグラウンドと良好な対照をなす、黒いスポットとし
て可視化した。銀の増強前、フィルターを蒸留水中で２
Ｘ３分間洗浄した。
より短い洗浄期間は、増強後、より高いバックブラウン
ｙを牛することがあり、そしてより長い洗浄期間はシグ
ナルの強度を減少することがある。
金プローブは、０．０１％のアジ化ナトリウムとともに
４℃で貯蔵した場合、感度への悪影響を見ることができ
る前に、数回再使用することができる。
ＢＲＬＭを使用して検出したフィルターを、色素溶液中
で３時間発色させた。この時間の長さはシグナルとパッ
クグラウンドとの間のコントラストを最大にするために
最適であることがわかった。
第１図に示す結果は第２図に定量的に示されている。第
２図において、フィルターは、光学的フィルターを使用
しないで、０．１ｍｍの開口幅で反射光を測定すること
によって走査した。第３図は、シグナルの強度と適用し
たＤＮＡ２１１度との闇の関係が両者の検出法に類似す
るように思われ、そして両者がｓｐｇの適用ＤＮＡまで
の低下を検出する感度に関して匹敵することを示す、第
３図において、フィルターのデンシトメチリフクスキャ
ンからのピークの積分面積は適用したＤＮＡの関数とし
て描かれている。
しかしながら、ＢＲＬ法を使用して検出したフィルター
は、金プローブを使用して検出したものより、絶えず高
いパックグラウンドを与え、そして結果を定量化する手
段を用いないと、より低い適用ＤＮＡ濃度においてパッ
クグラウンドを越える正のシグナルを決定ことがしばし
ば困難であった。
上の結果から明らかなように、金粒子を使用する非酵素
的ビオチン検出系は酵素結合系と同定度に感受性である
。金ブａ−プの検出法、ならびに酵素検出法よりかなり
速い外に、労力を要する程度が非常に少ない。それは、
単に、１回のインキュベージ９ン工程、および引続く１
０分の銀増強工程から成るにすぎない。金プローブのイ
ンキュベージタンの間、より高い濃度の固定化ＤＮＡを
もつビオチニル化ＤＮＡは、わずかに１０分後に、見る
ことができる。
この明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、そ
して限定を意味するものでないこと、および本発明の精
神および範囲を逸脱しないで、種々の変更および変化が
可能であることが、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ニトロセルロースフィルター上のハイブリダ
イゼーションしたＤＮＡの検出を示す。 パネル（ａ）は本発明に従い銀で増強した、ヤギ抗ビオ
チン抗体標識金プローブのためのものであり、そしてパ
ネル（ｂ）はＢＲＬ比色ＤＮＡ検出系（先行技術）のた
めのものである。 ハイブリダイゼーションしたフィルターのデンジトメト
リックスキャンである。 第３図は、本発明による金プローブ検出（Ｘ）およびＢ
ＲＬ検出（０）（先行技術）についての相対的シグナル
密度対固定化ＤＮＡ濃度のグラフである。 代　理　人　弁理士　小田島　平　吉１ｇ　ＤＮＡ ｂ ｐｃｌ　ＤＮＡ ＦＩＧ、　３

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）固体の支持体の上に第１核酸を固定化し、（ｂ）
    ハイブリダイゼーションの条件下に、工程（ａ）の固定
    化された第１核酸を、前記第１核酸の対して相補的であ
    ることが予想される標識した第２核酸と接触させ、そし
    て （ｃ）工程（ｂ）から得られる物質を、前記標識に特異
    的に結合できる蛋白質を被覆した金属と接触させる、前
    記金属は蛋白質を吸収できる、を含んでなることを特徴
    とする核酸のハイブリダイゼーションを検出する方法。 ２、前記金属は、金、銀、コバルト、鉄、ニッケルおよ
    び水銀から成る群より選択される特許請求の範囲第１項
    記載の方法。 ３、前記金属は金である特許請求の範囲第２項記載の方
    法。 ４、前記第２核酸のための標識は、ハプテン、抗原、ビ
    オチンおよびＦＡＤから成る群より選択される特許請求
    の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、蛋白質は、抗体、アビジンおよびグルコースオキシ
    ダーゼから成る群より選択される特許請求の範囲第１〜
    ４項のいずれかに記載の方法。 ６、前記金属は金であり、そして前記金は抗ビオチン抗
    体で被覆されている特許請求の範囲第１〜５項のいずれ
    かに記載の方法。 ７、前記固体の支持体は、ニトロセルロース、誘導化ナ
    イロンおよびフッ化ポリ炭化水素から成る群より選択さ
    れる特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法
    。 ８、前記固体の支持体は、フィルター、ビーズまたは充
    実シートの形態である特許請求の範囲第１〜７項のいず
    れかに記載の方法。
JP62284400A 1986-11-12 1987-11-12 核酸の雑種の検出法 Pending JPS63135861A (ja)

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DK590587A (da) 1988-06-13
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ZA878464B (en) 1988-05-09
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FI874961L (fi) 1988-05-13
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