JPS63119498A - 新規なモノクロナル抗体、その製造及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクロナル抗体及びその！ｌ！遣及び使用に
関する。

リウマチ様関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）にかかっている成る患者は、Ａ群の連鎖球菌
（Ｇｒｏｕｐ＾５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の細胞壁の
多糖／ペプチドグリカン複合体に対する上昇したレベル
の抗体を持っていることが報告された〔ノランソン等、
クリニカル、アンド、エクスベリメンタル、イムノロノ
ー。

、ｔ！Ｓ５５巻、１１５及び第６１巻、３７３　（Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｃ１１ｎ　ｅｘｐ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、　５５ｖ　１１５　ａｎｄ６１、３７
３．）。精製したりウマトイド因子、即ち、リウマチ様
関節炎患者からの免疫グロブリンで免疫さにたマウスは
Ａ群の連鎖球菌に対する抗体を発現することも報告され
ている〔ノタンソン等、クリニカル、アンド、エクスベ
リメンタル、イムノロノー９．第６１巻、３７３　（Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、、Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、
　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６１．３７３）］　。

ＩＪウマチ様関節炎患者から採取された免疫グロブリン
の糖残基は、普通の免疫グロブリンよりも有意に多い頻
度で末端にＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｌ　ｃ　ＮＡ
ｃ　）を持っている　ことが最近示された〔バンク等。

ネイチャー、第３１６巻、４５２　（Ｐａｒｅｋｈ　ｅ
ｔ　ａｌｌ、　Ｎａｔｕｒｅ＋　３１６？　４５２）　
］　。

ポリラムノースに結合したＮ−アセチルグルコサミンは
Ａ群連鎖球菌の主要抗原決定基であることが知られてい
る。

Ａ群述頻球菌の細胞壁に存在するＮ−アセチルグルコサ
ミンは、リウマチ様関節炎にががっている患者の異常な
免疫グロブリンに存在するＮ−アセチルグルコサミンと
本質的に同じ配置（ｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に
あることを我々は見出だした。結果として、Ａ群連Ｍ球
菌の細胞壁に対して発生した抗体は、生物学的物質、例
えば、＋７７マチ補間節炎患者の異常な免疫グロブリン
のＮ−アセチルグルコサミン残基に結合することができ
そして、このような物質の検出及び評価のためのアッセ
イ方法に使用することができる。

この発見を利用して、我々は、Ａ群連鎖球菌の細胞壁に
対するモノクロナル抗体、又はより特定的には、そこに
存在する未ｌＮ−アセチルグルコサミン残基に対するモ
ノクロナル抗体を今回製造した。このような抗体は、生
物学的物質、例えば、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残
基を含有する免疫グロブリンに対して特異的である。こ
のようなモノクロナル抗体を生産することができる冬ズ
ミハイブリド−？　（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ）も又本発明の一部を形成する。このようなモノク
ロナル抗体は下記する目的のアッセイ方法に使用するこ
とができる。異常な免疫グロブリンに対する抗体を、そ
の免疫グロブリン自体ではない抗原を使用して、製造す
ることができることは特に有利である。その理由は、本
発明のモノクロナル抗体は、免疫グロブリンの他の部分
に結合する能力を持たず、しかも、末端Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基を含有する異常な免疫グロブリンに対し
て高度に特異的ならしめることができるからである。

本発明のモノクロナル抗体は、一般に公知の方法に従っ
て製造することができる。例えば、ニー、ロブボーグ（
１９８２）、ツイリアムハイネマンメディカルブック、
ロンドン（ＩＪ、　Ｌｏｖｂｏｒｇ（１９８２）、　　
Ｗｉｌｌｉａｍ　　Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ　　Ｍｅｄｉｃ
ａｌ　　Ｂｏｏｋｓ＊　　Ｌｏｎｄｏｎ）による“モノ
クロナル抗体：製造及び保存”（“Ｍｏｎ。

ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｅｅ”）参照。

例えば、マウスをＡ群連鎖球菌細胞壁に関して免疫する
。この細胞壁物質をこのマウスに注射する０次いで、こ
のマウスからの＃臓＃ｌ胞を、骨ｗｔｍ細胞（ｍｙｅｌ
ｏｍａ　ｃｅｌｌｓ）、例えば、マウス・骨髄踵細胞系
統（ｍｏｕｓｅ　ｍｙｅｌｏ＋ａａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎ
ｅ）と融合する。このようにして作られたハイプリドー
マを、正確な特異性を持っている抗体を生産するハイプ
リドーマのスクリーニングにかける。これは、Ｎ−アセ
チルグルコサミンに結合したウシ血１アルブミン（ＢＳ
Ａ−Ｎ−ＡＧ）、　＃索で処理したフヱチュイン（ＥＴ
Ｆ）及ｖフェチュインに対する酵素結合免疫吸着剤アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により抗体なスクリーニングするこ
とにより達成することができる。フェチュインは、普通
はその構造が隠されているＮ−アセチルグルコサミンを
含んだ血清中に見出だされた糖タンパク質である。

シアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる処理はこの分
子を開裂させてＮ−アセチルグルコサミンを露出させそ
してＥＴＦを与える。ＢＳＡ−Ｎ−ＡＧ及びＥＴＦに対
して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるがフェチュインに
対しては陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）である抗体を生産す
るハイプリドーマが保存される。

本発明に従って製造されるＮ−アセチルグルコサミンに
対する新規なモノクロナル抗体は、多様な重要な有用性
を持っている。より特定的には、それらは生物学的物質
、即ち、細胞起源の物質、通常、露出したＮ−アセチル
グルコサミン残基を持っているタンパク質、例えば、リ
ワマチ様関節炎、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、
らイ＠　（ｌｅｐｒｏｓｙ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ
’　ｓ　ｄｅｓｅａｓｅ）及びマウスの如き実験動物に
おける同様な病気、に懸かっている又はかかる恐れのあ
る患者から採取した体液中の異常にグリコジル化された
免疫グロブリンを検出及びアッセイするのに使用するこ
とができる。本発明のモノクロナル抗体は、このような
症状と関連していると思われる異常免疫グロブリンの存
在を検出及び評価する重要な方法を提供する。

この新規なモノクロナル抗体は、成る種の腫瘍の鑑別に
使用することもできる。末端Ｎ−アセチルグルコサミン
残基な持つ腫瘍は免疫応答の細胞による認識に灯してよ
り鋭敏であることができそして、このような細胞から細
胞毒性分子の放出を誘発することができるという証拠が
ある〔デニス等、ヨーロピアン、ジャーナル、オプ、バ
イオケミストリー、（１９８６）第１６１巻：　　３５
９−３７３　（Ｄｅｎｎｉｓ　　ｅｔ　　ａｌｌ、Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８６）ｌ土：　３５９
−３７３）］　。Ｇｌ　ｃ　ＮＡｃを認識することがで
きる受容体が骨［Ｈ胞（Ｂｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ）に
存在すると思われる〔ロス等、（１９８５）、７ヤーナ
ル、オプ、イムノロシー０．第１３４巻：３３０　７　
−　３　３　１　５　　（Ｒｏｓｓ　　ｅｔ　　ａｌｌ
、ｅ　　Ｊ、　　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．＊　　１３先：　
３３０７−３３１５）　；ハルチワン〃−及びヒル、１
９８６、ジャーナル、オプ、バイオロジカル、ケミスト
リー０．第２６１巻：　　７４４０−７４４４（Ｈａｌ
ｔｉｗａｎｇｅｒ　＆　Ｈｉｌｌｓ　１９８ｆＬ　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６１ニア４４０−７４
４４）］　、このような細胞による７、？？クトシル腫
瘍（ａｇａｌａｃｔｏｃｙｌ　ｔｕｍｏｕｒｓ）の認識
の結果は、このような腫瘍が転位する（ｍｅｔａｓＬａ
ｓｉｚｅ）傾向をａＳに減少させることができる。これ
はデニス等（Ｄｅｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌｌ、）によりネ
ズミモデル（＋ｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ）で証明された
。それ故、本発明のモノクＯナル抗体は、例えば、生検
材料（ｂｉｏｐｓｙ　ｍａｔｅｒｉａｔ）又は手術で除
去されたｍ瘍（例えば、乳癌の場合に）からの癌細胞（
ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ｃｅｌｌｓ）に対して使用して、
起こりそうな予後（即ち、それらが転位する傾向）を予
測することができる。本発明のモノクロナル抗体は、普
通の組織の細胞膜には結合しないが、表面に末端Ｎ−ア
セチルグルコサミン残基を持ったＭ癌細胞の細胞膜には
強く結合し、そして、適当な着色性標識により現される
と、このような細胞の強い膜染色を与える。これは、ネ
ズミ腫瘍（Ｌ９２９）が接触するマクロファージからの
細胞毒素放出によりそれ自身の破壊を誘発するネズミ腫
瘍（Ｌ９２９）に対して証明された。

臨床的使用においては、本発明のモノクロナル抗体は、
異常にグリコジル化された免疫グロブリンのレベルの変
動を７フセイすることを可能とする。これは、クローン
病における急性腹部発症（ａｃｕｔｅ　ａｂｄｏｍｉｎ
ａｌ　ａｒｉｓｅｓ）の性質の予測、リウマチ様関節炎
の治療の効果の評価、結核菌（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　・　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（変種Ｂ　Ｃ
Ｇ　（ｖａｒ　　ＢＣＧ）］を使用する膀胱癌の免疫治
療の効果の監視、結核においてみられる免疫ｔ４理学的
機構の免疫治療による矯正の監視を助長する。新規なモ
ノクロナル抗体は、例えば、結核についてアナグマをス
クリーニングするために、獣医学的実施の際にも有用で
あることができる。周知のとおり、野性のアナグマは、
ウシ結核の保有者として作用し、それから畜牛が感染さ
れる。ウシ結核を持っている恐れのあるアナグマを無差
別に屠殺するのを防止するために、簡単なアッセイ方法
が望ましく、本発明のモノクロナル抗体はこれを可能と
する。

これらの目的で、本発明の新規なモノクロナル抗体は、
例えば、公知のモノクロナル抗体と同じ方法で、しかし
、この新規な抗体が一般にＮ−７セチルグルフサミン残
基、特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に存在するこの上
うな残基との特異的に結合する能力に基づいて、酵素結
合イムノアッセイにおいて使用することができる。酵素
結合イムノアッセイは周知の技術であり、これについて
は、例えば、ロック及びカメロン、（１９８１）、ツヤ
−ナル、オプ、イムノロジカル、メソッド。

第４０巻、１０９−１１４　（Ｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｃａ
ｍｅｒｏｎ＊　（１９８１）、　Ｊ、ＩＩｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓｗ　４０ｗ　１０９−１１４
）を参照されたい。リウマチ様関節炎患者の異常な免疫
グロブリンからではなくて、Ａ群連鎖球菌の細胞壁から
この新規なモノクロナル抗体をつくることによって、他
の７フイニテイからの妨害なしにＮ−７セチルグルフサ
ミンに対する作用のはるかに高い特異性を達成すること
が可能である。

一般に、本発明のモノクロナル抗体は、末端Ｎ−アセチ
ルグルコサミン残基を持った生物学的物質を、このモノ
クロナル抗体に結合させ、そして結合した又は結合して
いない標識が該生物学的物質の目安を与えるような条件
下に、標識に結合させ、該結合した又は結合していない
標識を検出又は評価することによって、末端Ｎ−アセチ
ルグルコサミン残基を持った生物学的物質を検出及び／
又は評価するのに使用することができる。この標識は、
放射性標識、蛍光８（識及び酵素標識を包含するイムノ
アッセイ法において最近使用される標識のいずれであっ
てもよい。好ましくは、酵素標識は、該酵素により触媒
される発色反応を受ける着色性物質と共に使用される。

ヘテロツェナウスアッセイ法が通常好ましい。

アッセイされるべき免疫グロブリン又は池の生物学的物
質は、例えば、適当な表面への吸着により、固体支持体
に結合され、モノクロナル抗体は、固体支持体上の生物
学的物質に結合され、標識は、該モノクロナル抗体に直
接又は間接に結合され、次いでこの標識が７フセイされ
る。

生物学的物質が、例えば、前記した理由で研究下の腫瘍
からの、哺乳動物細胞である場合には、別個の固体支持
体は必要ではなく、モノクロナル抗体は、細胞それ自体
に、即ち、この細胞の表面に存在する末端Ｎ−アセチル
グルコサミン残基に結合せしめられ、標識は、結合した
モノクロナル抗体に直接又は間接に結合され、次いで、
標識が観察され又はアッセイされる。このようにして、
顕微鏡下に単一の細胞を検査することができる。

適当な酵素には、ベルオキシグーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホス７アター　ゼ、及びグルコースオキ
シグーゼが包含される。各場合に、結合した酵素標識を
現すか又は決定するための手段は、この酵素のための適
当な基質、例乏ば、過酸化水素と、この酵素の作用下に
過酸化水素により酸化されると色を発生する化合物、例
えば、０−フェニレンジアミン又は４−クロロ−ナフト
ールとの組み合わせの形態で提供される６標識は、この
標識に共有結合により結合した抗−マウス免疫グロブリ
ンによりモノクロナル抗体に結合させることができる。

別法として、且つ好ましくは、本発明のモノクロナル抗
体は、公知の方法でビオチニル化され（ｂｉｏｔｉｎｙ
ｌａｔｅｄ）、そして標識はこの標識に共有結合により
結合したアビジンを使用してそれに結合される。

下記実施例により本発明を説明する。

及１九 ７０インドの不完全７ジユパント中に乳化されたＡ＃連
鎖球薗細胞壁〔ジａンソン等、、（１９８４）　　クリ
ニカル、アンド、エクスペリメンタル。

イムノロノー、第５５巻、１１５　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　
ｅｔ　ａｔＩ、、　　（１９８４）　　Ｃ１１ｎｉｃａ
ｌ　　＆　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｓ＋ｕ
ｎｏｌ。

ｇｌｅ肱、　１１５）］　５０μｇの腹腔内注入によっ
て、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを免疫した。注入を３週問後に
繰り返し、更に、マウスを殺す４日前に、追加注入を静
脈内に行った。（ｅ課内投与は、リン酸緩衝溶液＋Ｔ＊
ｅｅｎ　８０）１駿ｌ当たりスクアレン１０μｇを含有
する水中油型エマルジ１ンにおいてであった）０次いで
、免疫したマクスからの＃臓細胞を、ＪＫ非分泌性マウ
ス骨髄踵細胞系統（ＪＫ　ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ
　１ｌＩｏｕｓｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎ
ｅ）（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ　８、ケアーニイ等（１９７
９）、ジャーナル、オブ、イム／ロノー、第１２３巻、
１５４８　（Ｋｅａｒｎｙ　ｅｔ　ａｌｌ　（１９７９
）＊　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２ユ、　１５４８）参
照］の細胞と融合した。交雑した細胞を下記の抗原を使
用する酵素結合免疫吸着剤アッセイにより、所望の抗体
の生産についてスクリーニングした： （１）ウシ血清アルブミンをノアゾ化アミ７−フェニル
　Ｎ−アセチルグルコサミンと結合させることによりＮ
−アセチルグルコサミンが結合したウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ−Ｎ−ＡＧ）（シブ７等（１９７８）アーチブ
ス、オプ、バイオケミストリー、アンド、バイオフィジ
ックス、第１８５巻、６１−７１　（Ｚｏｐｆ　ｅｔ　
ａｌｌ　（１９７８）＾ｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｂ
ｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｂｙｓ
ｉｃｓｗ　　１β’３−、　６ｌ−７１）Ｊ及び （２）Ｎ−アセチルグルコサミンが末端糖となるように
シアリグーゼ及Ｖがフクトシグーゼで処理されたフェチ
ュイン（Ｅ’ｒＦ）。フェチュインは、０．１Ｍリリン
カリウム中９８７．４で平衡化３れた５ミクＯン”ｒｓ
Ｋ−２５０（２１，ｓｘ６００ｍｍ）ゲルろ過クロマト
グラフィーカラムを通過させることによって精製した０
次いで、ＨＰＬＣ精Ｍ７精子フェチュイン（１０ｍｇ／
ｍｊりを、ＤＨ４，０の０．１Ｍクエン酸ナトリッム中
で、アースぴバクター・ウシ７アシェンス（＾ｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　１ｕｒｅｆａｅｉｅｎｓ）　（ベーり
ン〃−マンハイム社（ＢｏｅｈｒｉｎＦｌｅｒ　Ｍａｎ
ｎｌ＋ｅｉａ＋）からの）］からのフイラミニグーゼ（
シアリダーゼ）及びタチナタマメβ−ガラクトシダーゼ
（Ｊａｃｋ　Ｂｅａｎｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
）　（リー及びり−１“／７？ド、イン、エンザイモロ
ノー”、（１９７２）第２８巻、７゜２　−　７　１　
３　　（Ｌｅｅ＆Ｌｅｅ、　　　“Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙ＋ｅｏｌｏｇｙ″！（１９７２）、
岨、　７０２−７１３＞に基づいた、アール、パレク博
士、テーノイス、オックス７才一ド、１９８７　（Ｒ，
Ｐａｒｅｋｈ、Ｄ、Ｐｈ１ｌ、Ｔｈｅｓｉｓ、０ｘｆｏ
ｒｄ、１９８７）により記載された如き、タチナタマメ
粉から精製した］、１０単位／ωｌと、トルエン下に３
７℃で２４時間インキュベージａンした。アジア０−、
ア〃ラクト−７ヱチユイン（ａｓｉａｌｏ−、ａｇａｌ
ａｃｔ。

−ｆｅｔｕｉｎ）を、前記の如きゲルろ過により最終的
に精製した。

次いで、上昇したレベル（ｒａｉｓｅｄ　１ｅｖｅｌｓ
）のＮ−アセチルグルコサミンを示すことが知られた免
疫グロブリンを使用して、これらの方法により同定され
た最も活性な細胞系統を更にスクリーニングした。この
目的で、この異常な免疫グロブリンを、１２モル尿素溶
液中、４０℃で１６時ｌｌｌ０゜６モル２−メルカプト
エタノールにより変性し、続いてヨード７セタミドに対
して透析して、！！離したメルカプト基をブロックした
。この処理は、免疫グロブリンの完全な巻き戻しく　ｕ
ｎｗｉｎｄｉｎｇ）をもたらしモして糖残基の露出を高
める。このようにして得られた変性した免疫グロブリン
を、炭酸塩／炭酸水素塩ａ衝液中１０μｇ　／　ｍ　１
の濃度でマイクロタイタープレートのポリスチレン壁に
被覆した。対照の目的で、マイクロタイタープレートの
他のウェルな同じ量の既知の正常な免疫グロブリンで被
覆した。０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸４
１衝溶液で希釈した、選ばれた細胞系統からのモノクロ
ナル抗体を、マイクロタイタープレートの免疫グロブリ
ンで被覆したウェルにおいてインキュベージ９ンした６
次いで、結合したモノクロナル抗体の量を、ペルオキシ
ダーゼの結合したウサギ抗マウスＩ　ｇ　Ｇ　（ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓｅ−ｃ。

ｎｊｕｇａｔｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓ
ｅ　ＩｇＧ）を加え、続いてＵ素基質及び発色源を加え
ることによりアッセイした。試験細胞及び対照細胞が等
しい量の免疫グロブリンを含有していることをチェック
するために、全結合免疫グロブリンを評価することがで
きるように、免疫グロブリン被覆ウェルの幾らかに抗ヒ
トＩｇＧを加えた。

このようにして、ＢＳＡ−Ｎ−ＡＧ及びＥＴＦの両方に
対して陽性であるが、フェチュインに対しては陰性であ
るモノクロナル抗体を生産する６つのハイプリドーマを
突き止めた。もちろん、フェチュインに対するパックグ
ラウンド結合と比較してＥＴＦに対する最も大きい結合
比を持った２つが選ばれた。

マウス細胞系統をスクリーニングするためのこの方法は
、イムノアッセイにおいて本発明のモノクロナル抗体を
使用するのに適合させることができる。例えば、患者か
ら採取された血清試料の形態にある、測定されるべき免
疫グロブリンを、タンパク質を結合することができるポ
リスチレン又は他のポリマーからつくられたマイクロタ
イタープレートの壁に適当な希釈率で被覆する０本発明
のモノクロナル抗体をマイクロタイタープレートの免疫
グロブリン被覆ウェルにおいてインキュベージ９ンする
。次いで、ペルオキシダーゼの結合したウサギ抗マウス
ＩｇＧを各ウェルに加え、続いて酵素基質（例えば、過
酸化水素）及び発色源（例えば、ｏ−フェニレンジアミ
ン）を加える。

生成した色は、結合した酵素の量に依存しており、結合
した酵素自体は、！ＬｇｉＮ−アセチルグルコサミン残
基を持った、従って本発明のモノクロナル抗体に結合す
ることができる、最初の試料中の免疫グロブリンの量に
依存している。

しかしながら、好ましくは、新規なモノクロナル抗体を
使用するアッセイは下記の如くして行なわれる： 毘作はすべて室温で行なわれる。アッセイされるべき試
料中の末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を持っている
可能性がある生物学的物質をニトロセルロースシートに
吸着させる。この物質（糖を結合していない）に対する
、タンパク質性の（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｃｏｕｓ）生物
学的物質の高いアフイニティは、存在する糖残基の高め
られた露出をもたらす。

ＭＳ１段階において、リン酸Ｉｔｃ衝溶液５μ！中の生
物学的物質の各試料（例えば、ＩｇＧの場合にタンパク
質Ａへの吸着により、予め精製した）０゜５μｇをニト
ロセルロース上にスボッティンクスる。各スポットの寸
法及び濃度を一定に保つように条件を制御する。１時間
乾燥した後、ニトロセルロースを５分間煮沸する。これ
は、糖残基の露出を高めそしてリウマトイド因子活性又
は試料中の他の抗体活性により引き起こされる非特異的
効果を排除する。次いで、ニトロセルロースをＴ智ｅｅ
ｎ２０．０．０５％を含有するｐＨ７，０のリン酸緩衝
溶液中の１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔ
ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　）中でインキュベーションして、他の
タンパク質結合部位をブロックする。

次いで、各試料スポットの末端ＧｌｃＮＡｅ’Ｓの数が
、モノクロナル抗体の結合を定量的に決定することによ
って現される。これを行うために、モノクロナル抗体は
、公知の方法で、例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイ
ミドビオチン（シグマ社、カタログＰＩＳ１１−１７５
９）を含有するｐＨ７，０のリン酸緩衝溶液中で一夜イ
ンキエベーションすることによってビオチン化される。

結合は自発的に起こる０次いで、ニトロセルロースをビ
オチン化モノクロナル抗体（Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｂ　Ｓ　
Ａ　／　Ｔ　ｗｅｅｎ中１：　２０００に希釈された）
中でインキュベーションし、次いで、アビジン−ペルオ
キシダーゼ複合体〔アマ−ジャム　インターネーション
ピーエルシー、英国（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎ　ｐｌｃ、　ＣＢ）からのもの；　ＰＢＳ／
ＢＳＡ／Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ中１＝５００に希釈された；
ヨルケン等、ジャーナル、オブ、イム／ロジカル、メソ
ッド（１９８３）、第５６巻、３１９−３２７　（Ｙｏ
ｌｋｅｎ　ｅｔ　ａｌｌ＊Ｊ、　　Ｉ＋ｓｍｕｎｏｌ、
　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　（１９８３Ｌ　　５６．　３１
９−３２７）参照］及び最後に過酸化水素及び４−クロ
ロナフトール加える。これは、青色のスポットを生じ、
このスピットの強度は試料中に存在する末ｊｌＧＩｃＮ
Ａｃ’ｓの量に関係する。

青色スポットは、適当な増幅器に連結された、赤色発光
ダイオードと７オトダイオードとの間にニトロセルロー
スをはさむことにより測定される。

この装置〔ルック及びカメロン（１９８１）、ツヤ−ナ
ル、オプ、イムノロジカル、メソッド第４０巻、　１　
０　９　−　１　１　４　（Ｒｏｏｋ　　ａｎｄ　　Ｃ
ａｍｅｒｏｎ　　（１９８１）。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　４
０＊　１０９Ｊ１１４）により記載の装置に基づいた】
は、既知の末端Ｎ−７セチルグルフサミン含有率のＩｇ
Ｇの試料を使用して校正することができる。

別の方法においては、例えば、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ
）中のタンパク質Ａ１００μｇ／１１中で２１？ＩＩＪ
］ニトロセルロースをインキュベーションすることによ
って、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇをニトロセルロー
スに先ず吸着させる０次いで、残りのタンパク質結合部
位をＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中で一夜インキュ
ベーションによりブロックする０次いで、タンパク質Ａ
のＩｇＧ結合部位なＩｇＧで飽和させるために、タンパ
ク質Ａｌｌっているニトロセルロースを、ＰＢＳ中１：
２に希釈された血清中で２時間インキュベージタンする
０次いで、それをＰＢＳ中で４回洗浄し、ＰＢＳ中の０
．５％グルタルアルデヒド（電子顕微鏡銘柄）中に４℃
で３０分間固定して、タンパク質Ａに対するＩｇＧの恒
久的結合を確実にする。

次いで、今やタンパク質Ａとタンパク質Ａに結合したＩ
ｇＧの両方を担持するニトロセルロースを、ＰＢＳ中の
０．１モルのりシン（ｌｙｓｉｎｅ）中でインキュベー
ションして、残存するアルデヒド基をブロックする。

次いで、ニトロセルロースを乾燥し、煮沸し、そして前
記したニトロセルロースペースのアッセイについて正確
に処理する。

特許出願人　ユニパーシティ・カレッジ・ロンドン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したウシ血清アル
   ブミンに対して陽性であり、且つシアリダーゼ及びガラ
   クトシダーゼで処理されたフェチュインに対して陽性で
   あるが、フェチュインに対して陰性である、末端Ｎ−ア
   セチルグルコサミン残基を含有する生物学的物質に対し
   て特異的なモノクロナル抗体。 ２、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を持つＡ群連鎖
   球菌の糖タンパク質に対して生じさせた特許請求の範囲
   第１項記載のモノクロナル抗体。 ３、特許請求の範囲第１項又は２項記載のモノクロナル
   抗体を生産することができるネズミハイブリドーマ。 ４、ネズミ骨髄踵細胞と、Ａ群連鎖球菌細胞壁で免疫さ
   れたマウスからの抗体生産性マウス膵臓細胞とを融合す
   ることにより得られる特許請求の範囲第２項記載のネズ
   ミハイブリドーマ。 ５、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を持った生物学
   的物質を、特許請求の範囲第１項又は２項に記載のモノ
   クロナル抗体に結合させ、そして結合した標識又は結合
   していない標識が該生物学的物質の目安を与えるような
   条件下に標識に結合させ、該結合した標識又は結合して
   いない標識を検出又は評価することを特徴とする、末端
   Ｎ−アセチルグルコサミン残基を持った生物学的物質を
   検出又は評価する方法。 ６、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を持った生物学
   的物質を固体支持体に結合させ、この固体支持体上の該
   物質に前記モノクロナル抗体を結合させ、該モノクロナ
   ル抗体に標識を直接又は間接に結合させ、次いで該標識
   をアッセイする、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、生物学的物質が免疫グロブリン又は細胞壁タンパク
   質である特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、生物学的物質が、前記支持体にそれ自体結合せしめ
   られているタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇとの反応によ
   り前記固体支持体に結合せしめられている免疫グロブリ
   ンである特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、生物学的物質が哺乳動物細胞であり、前記モノクロ
   ナル抗体をこの細胞の表面の末端Ｎ−アセチルグルコサ
   ミン残基に結合させ、結合したモノクロナル抗体に直接
   又は間接に標識を結合させ、次いで、該標識を観察又は
   アッセイする、特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、前記標識が酵素であり、この酵素は該酵素により
   触媒される発色反応によりアッセイされる特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 １１、前記標識に共有結合的に結合した抗マウス免疫グ
   ロブリンにより、前記標識を前記モノクロナル抗体に結
   合させる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記モノクロナル抗体に共有結合的に結合したビ
   オチン残基及び前記標識に共有結合的に結合したアビジ
   ン残基を介して該モノクロナル抗体に該標識を結合させ
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 １３、特許請求の範囲第１項又は２項記載のモノクロナ
   ル抗体と、該モノクロナル抗体に結合することができる
   標識試薬を含んで成ることを特徴とする、特許請求の範
   囲第５項乃至第１２項のいずれかに記載の方法に有用な
   試験キット。 １４、前記標識試薬が酵素を含み、そして前記キットが
   該酵素を検出又は評価するための着色性試薬を含む特許
   請求の範囲第１３項記載のキット。 １５、前記標識試薬が前記酵素に共有結合的に結合した
   抗マウス免疫グロブリンである特許請求の範囲第１４項
   記載のキット。 １６、前記モノクロナル抗体がビオチン化されており、
   そして前記標識試薬が前記酵素に共有結合的に結合した
   アビジンを含んで成る特許請求の範囲第１４項記載のキ
   ット。 １７、検出又は評価されるべき生物学的物質に結合する
   ことができる固体支持体も含んで成る特許請求の範囲第
   １３項乃至第１６項のいずれかに記載のキット。 １８、固体支持体がニトロセルロース又は前記生物学的
   物質に結合することができる他のポリマーである特許請
   求の範囲第１７項記載のキット。 １９、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含有する生
   物学的物質の検出又は評価における、特許請求の範囲第
   １項又は２項記載のモノクロナル抗体の使用。