JPS63105694A - 組換え腫瘍壊死因子の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝的に修飾された微生物が産生ずる腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）の単離と精製に関する。

組換え体ＤＮＡテクノロジーが最近発達しているので、
非常に多くの有効なポリペプチドの微生物による産生の
制御が可能になった。例えばヒト成長ホルモン、白血球
インターフェロン、ヒトインシュリンおよびヒトプロイ
ンシュリンのような多くの真核ポリペプチドがすでに微
生物によって産生されている。すでに存在する技術の連
続使用によって、この他の有用な種々なポリペプチド産
物の微生物による産生が今後可能になると期待される。

このような有用なポリペプチド産物の１つはヒト腫瘍壊
死因子である。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　）は２つの定序事象において微
生物産物によって処理された動物の血清中に発見される
抗腫瘍性物質である。最初の事象はマクロファージの活
性化と増殖とをもたらし、かつ肝臓および肺臓内の細網
内皮要素の膨張に関連する始動事象（ｐｒ匈ｉｎｇ　ｅ
ｖｅｎｔ）である。この始動事象には、カルメットーゲ
ラン杆菌（ＢａｃｉｌｌπＳＣａ１ｍｅｔｔｅ　Ｇｕｅ
ｒｉｎ　）　（ＢＣＧ　）のようなミコバクリアおよび
チモサン（酵母細胞壁）が有効である。

第２事象は血液中にＴＮＦが出現するために必要な顕現
事象（ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ　ｅｖｅｎｔ）である。

これはリポ多糖体（ＬＰＳ−内毒素または細菌性発熱物
質としても知られている、ダラム陰性菌の細胞壁の主要
成分）による感作動物の次の処置を必要とする。これら
の方法を用いて、マウス、ラットおよびウサギから同様
な抗腫瘍性と細胞毒性を有する血清が得られる。

ＴＮＦの細胞起源はマクロファージ（単球）であるので
、ＴＮＦはモノカイン（ｍｏｎｏｋｉｎｅ　）とも呼ば
れる。ＴＮＦは出血性壊死を惹起し、時にはマウスに郡
植した特定腫瘍の完全な退行をもたらし、特定の腫瘍細
胞ラインに対する細胞毒性活性を示すが、正常な細胞に
対しては細胞毒性活性を示さない。

ＴＮＦ活性を有するペプチドをコードしているＤＮＡを
細胞に導入してＴＮＦ−４たはＴＮＦ同族体を発現させ
る組換えＤＮＦ技術は多量のＴＮＦを安価に生産する最
も有望な方法であると考えられる。

ＴＮＦアミノ酸配列配列−ドするＤＮＦにょって適当な
宿主生物体を形質転換（ｔγαｎｓ　ｆ　ｏｒｍｉ？Ｌ
ｇ　）することによって、遺伝的に修飾された微生物を
用いて有意な量でＴＮＦを生産することができる。

ＴＮＦの営利的生産に組換え体ＤＮＦテクノロジーを用
いることに対する１つの障害は、望ましいＴＮＦを産生
ずる遺伝的に修飾された微生物からＴＮＦを生物学的に
活性な形で迅速かつ効果的に回収できることが必要であ
ることである。

従って、本発明では遺伝的に処理された微生物が産生ず
る腫瘍壊死因子の単離と回収の方法を提供する。本発明
の方法は組換え酵母菌株が産生ずるＴＮＦの回収に特に
有用である。我々が開発した方法は分離しているがまた
共同作用する３つの接触段階の使用を含む、これらの段
階は第１接触段階からの流出液を第２接触段階の供給材
料として直接用いることができ、第２接触段階からの流
出液を第３接触段階の供給材料として直接用いることが
できるように、特定の順序で実施される。

本発明の実施によって、一連の接触段階中にサンプル濃
縮および再配合を行う必要なく、高純度組換えＴＮＦの
生産が可能になる。本発明の簡単化した精製方法の結果
として、例えば目的の組換え生成物の取扱い損失が最少
；サンプル精製に必要な試薬量が少ない：およびＴＮＦ
精製に必要なサンプル取扱い量が少ないために精製中の
サンプル分解が最少といったような多くの利点が実現す
る。

本発明によって、我々は遺伝的に修飾した微生物が産生
ずる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の単離、精製方法であって
： （ａ）表面積の大きい多孔質ガラス材料にＴＮＦを含有
する粉砕澄明化した発酵ブイヨンを塗布する； （ｂ）段階（ＬＬ）によって負荷した表面積の太きい、
多孔質ガラス材料を適当な緩衝液で洗浄する；（ｃｌ　
　段階（ｂ）によって洗浄した表面積の太きい、多孔質
ガラス材料から、適当な溶離剤を約０．０１〜１０　ｖ
／ｖ％までの範囲で含有する溶液によって第１ＴＮＦ含
有分画を溶離する； （ｄｌ　　段階（ｃｌから得られた第１ＴＮＦ含有分画
な陰イオン交換樹脂と接触させる； （ｅ）　　緩衝液中に塩を含む溶液によって、前記陰イ
オン交換樹脂から第２ＴＮＦ含有分画を溶離する、この
場合前記溶液の塩濃度とｐＨは前記陰イオン交換樹脂か
ら第２ＴＮＦ含有分画を溶離させるために充分であるが
第２　ＴＮＦ含有分画中のＴＮＦが段階（ｆｌに用いる
色素親和性材料に結合するのを阻害するためには不充分
である； （ｆ）　前記陰イオン交換樹脂からの第２ＴＮＦ含有分
画を固定化色素親和性材料に接触させる；（ｅ）　　段
階（ｆ）によって調製されたＴＮＦ含有固定化色素親和
性材料を適当な緩衝液によって、約２８０ｎｍにおいて
紫外線吸収を示す物質が本質的に全く溶離されなくなる
まで洗浄する；および （Ａｌ　　洗浄したＴＮＦ含有固定化色素親和性材料か
ら、緩衝液中に充分な濃度の塩を含み６．５〜１０の範
囲内のｐＨを有する溶離剤によって、精製ＴＮＦを溶離
し、前記色素親和性材料からＴＮＦの分解を惹起するこ
となくＴＮＦを脱着させる 各段階から成る方法を開発した。

上記処理の全ては蛋白質分解の発生を最少にし、ＴＮＦ
の熱不活化を最少にするために典型的に約４℃において
実施される。上記処理が約４〜２５℃の範囲内の種々な
温度において実施可能であることが判明した。

本発明の好ましい実施態様では、用いる各固体接触材料
すなわち表面積の大きい多孔質ガラス材料、陰イオン交
換樹脂、および固定化色素親和性材料は充てんカラム構
成中に含まれる。このような構成によって、ＴＮＦ含有
溶液と固体接触材料がさらされる他の処理溶液とは適当
な固体接触材料の充てんカラムを簡単に通過することが
できる。

さらに、この充てんカラム形式での本発明の実施は溶離
剤の表面積の大きい多孔質ガラス材料光てんカラムから
陰イオン交換樹脂充てんカラムまでの直接の通過ならび
に溶離剤の陰イオン交換樹脂充てんカラムから固定化色
素親和性材料光てん力ラムまでの直接の通過を可能にす
る。従って、充てんカラム構成は本発明の実施のために
非常に効果的な手段である。この明細書で用いるかぎり
、「腫瘍壊死因子」なる用語は、自然発生の腫瘍壊死因
子α（Ｔ、ＮＦα、この明細書では一般的に単に「ＴＮ
Ｆ」と呼ぶ）分子に見られる抗腫瘍性を有する、自然発
生と合成の両方による、全ての蛋白質を包含するように
意図する。従って、多様な自然発生源からのＴＮＦなら
びにその同族体と誘導体は本発明の範囲内に含まれると
解釈される。

本発明は遺伝的に修飾された微生物が産生ずる腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）の単離と精製に関する。異種（ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇｏｓｓ　）蛋白質産物を産生しうる微生物は
全て本発明の実施に有用である。酵母菌株は高レベルで
かつ生物学的に活性な形で異種蛋白質を産生じうろこと
が実証されているため、現在特に好ましい。ピチア　パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉαｐα５ｔｏｒｉｓ　）　トサツ
力ロマイセス　セレグイシエ（ＳａＣＣんａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の菌株は高レベルの生
物学的に活性な組換え蛋白質を産生しうることか確認さ
れているため、特に好ましい。

米国特許出願第９０９５２８号明細書（出願臼、１９８
６年９月２２日）ではスリークリシュナ（５ｒｅｅｋｒ
ｉｓｈｎａ）氏、フーク（Ｆ％＆６）氏およびポテンツ
（Ｐｏｔｅｎｚ）氏によってピテア　バストリスにおけ
る非常に高レベルのＴＮＦ産生が述べられている。この
特許出願から、ＴＮＦの組換え体生産についてさらに詳
細に知ることができる。

本発明の精製方法の第１段階は表面積の大きい多孔質ガ
ラス材料に粉砕澄明化した発酵ブイヨンを塗布すること
である。上述したように、本発明の好ましい英施態様で
は充てんカラムの構成にこの表面積の大きい多孔質ガラ
ス材料が用いられる。

充てんカラムに含まれる多孔質ガラス材料はＴＮＦ　’
精製の組繊化された多重接触段階の第１接触段階に用い
る材料であるので、「第１カラム」と呼ばれる場合もあ
る。

この第１カラムに用いられるカラム充てん物は均一で正
確に制御されたサイズ（すなわち３０〜３００　ｎｍ）
の相互連絡孔が分布する高シリカガラスの多孔質顆粒か
ら成る。約３００〜３０００オングストローム（平均孔
径として表現）の範囲内の孔度が本発明の実施に用いる
ために適しており、特に約５００〜１０００オングスト
ローム（５０〜１００　ｎｍ）の範囲内の孔度が好まし
い。第１カラムに用いる充てん物は均一な孔度である他
に、内部と表面近くとで同じ孔度を有している。従って
、用いる充てん物のメツシュサイズは比較的重要ではな
く、広い範囲内で変化しうる。粒子が大きいと物質がカ
ラムを典型的に迅速に通過することができ、粒子が小さ
いと典型的により効果的なカラム充てん（すなわち空隙
率が小さい）が可能になることは当業者が知っているこ
とである。第１接触物質の表面積は広い範囲内で変化す
ることができ、用いる粒子の平均孔径の関数として変化
する。この第１接触段階に用いる材料は典型的に約１０
〜１００　ｍ２／　Ｖの範囲内の表面積を有し、特に約
２０〜５０　ｍ２／　Ｓ’の範囲内の表面積が好ましい
。

この第１カラムにＴＮＦ含有ブイヨンを負荷させる前に
、当業者に周知の方法を用いてカラムを典型的に平衡化
させる。約６．５から７．５位貫での範囲内のｐＨを維
持できる緩衝液は全て、このような平衡化の実施に適し
ている。約０．０２から０．１Ｍ−！！での範囲内の濃
度を有する緩衝液が適切である。これより高い緩衝液濃
度は汚染蛋白質の溶離を抑制する傾向があるため避ける
べきである。

実際には、リン酸塩緩衝液を用いることが好ましく、こ
のような緩衝液の１例は約７．５のｐＨを有する０、０
１Ｍリン酸カリウムである。

表面積の大きい多孔質ガラス材料と接触するＴＮＦ含有
発酵ブイヨン量は広い範囲内で変化しうる。適当な負荷
レベルはブイヨン中のＴＮＦ濃度、ＴＮＦ産生微生物が
その上で増殖する基質、その他の蛋白質と可溶な非蛋白
質様成分との濃度、用いる特に表面積の大きい多孔質ガ
ラス材料の性質等の関数として変化する。負荷レベルが
上記要素の結果として広範囲に変化することが知られて
いるので、本発明の各接触段階に対して第１表に示した
値は単に当業者に指針を与えるために記載したものであ
る。

第１表 第１段階”　　　＜１０　　１〜４　　　〜２第２段階
”　　〈６　１〜４　　　〜２第３段階””＜１０２〜
８　　４〜５ 畳　第１接触段階は表面積の大きい、多孔質ガラス材料
を用いる。

軸　第２接触段階は強陰イオン交換樹脂を用いる。

→　第３接触段階は固定化色素親和性材料を用いる。

第１表に述べた望ましい負荷レベルは特定時間に特定接
触材料と接触するブイヨン量を調節することによって、
または一定量（または一定濃度）のブイヨンに対する接
触材料使用量を調節することによって得られる。本発明
のＴＮＦ精製方法の種々な段階に用いる各接触材料は一
般に異なる負荷容量を有するので、精製系列の各段階に
用いる接触材料量を変えることが時には必要である。

表面積の大きい多孔質ガラス材料に塗布するＴＮＦ含有
発酵ブイヨンは、例えば加圧分解、ガラスビーズ存在下
での激しい攪拌、例えばチモリアーゼによる細胞壁の酵
素消化、例えば塩化メチレンによる化学分解等のような
、当業者が周知の方法を用いて粉砕澄明化することがで
きる。細胞の粉砕は粉砕後ｐＨが約６〜８の範囲内にな
るように、また目的のＴＮＦが安定な形で残留する培地
を形成するように、充分に高いｐＨにおいて実施するの
が好ましい。

粉砕したならば、粉砕細胞を含むブイヨンから当業者が
周知の方法を用いて細胞破片を除去する。

細胞を含まない澄明化発酵ブイヨンの製造に用いられる
方法には、例えば遠心分離、ミクロ濾過等がある。

粉砕した後に、澄明化発酵ブイヨンを表面積の大きい多
孔質ガラス材料に塗布し、次にこのガラス材料を少なく
とも３倍量（ガラス材料の体積あたりの洗浄溶液の量）
の適当な緩衝液によって洗浄して、第１接触段階で用い
た表面積の大きい多孔質ガラス材料に付着しないような
ブイヨン成分を除去する。このような洗浄には、１０倍
量以上までの緩衝液を用いることができる。適当な洗浄
量に関する上限はさらに、例えば加える緩衝液のコスト
、付加的な洗浄に要する付加的時間、廃棄すべき流出液
量の増加等の便利さと実用性の考察によって定められる
。当業者はこのような目的に用いる適当な緩衝液の性質
を容易に知ることができる。この洗浄のためにｐＨ約７
．５において０．０１Ｍ　ＩＪン酸カリウム含有緩衝液
が典型的に用いられるが、約６゜５から７．５位までの
範囲内のｐＨを維持できる緩衝液は全てこの洗浄段階に
適している。

約０．００２Ｍから０．　Ｉ　Ｍまでの範囲内の濃度を
有する緩衝液がこのために適している。

表面積の大きい、多孔質ガラス材料を充分に洗浄したな
らば、表面積の大きい多孔質ガラス材料からＴＮＦを脱
着させるが、第２接触段階で用いる陰イオン交換樹脂へ
のＴＮＦの結合を妨げないような、適当な溶離剤を約０
，０１〜１０φ％までの範囲内で含む溶液によって、Ｔ
ＮＦ含有分画がこのガラス材料から溶離される。このよ
うな溶離剤は典型的に、溶離液に塩基性ｐＨを与えるお
よび／または少なくとも１個のヒドロキシル基を含む化
合物である。溶離剤の例には、 （ａ）式： ％式％ 〔式中？Ｌ−０，１または２；各Ｒは独立的にＨまたは
・メチルであり；ＸはヒドロキシルまたはＲであるが、
少なくとも１個のＸはヒドロキシルである〕 で示される化合物； （ｂｌ　式： ％式％ 〔式中ｚ＝１．２または３；各Ｒ′は独立的にＣ２〜Ｃ
６アルキルまたばＣ３〜Ｃ６シクロアルキルラジカルで
あり、前記Ｒ′は任意に１個以上のヒドロキシル置換基
を含有する〕で示される化合物；および ＋６１　　約８〜１１までの範囲内のｐＨを有する緩衝
化溶液を形成しつる、例えば炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸
塩等のような化合物の組合わせがある。

上記の式を満たす化合物の例には、 エチレングリコール、グリセロール、フロピレンゲリコ
ール、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、
トリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノール
アミン等ならびにこれらの２種類以上の混合物がある。

好ましい形式のカラム構成で実施した場合に、表面積の
大きい多孔質ガラス材料含有第１カラムの流出液を蛋白
質の存在に関して適当な手段によって監視する。このよ
うな目的の適当な手段は当業者が容易に定めることがで
きる。例えば、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収の監視
が便利である。このような監視が第１カラムから蛋白質
が溶離し始めたことを明らかにしたならば、第１カラム
からの流出液を次に陰イオン交換樹脂含有第２カラムに
直接供給する。第］カラムからの流出液の監視が第１カ
ラムからもはや蛋白質が溶離されないことを示すまで、
第１カラムからの流出液のこのような監視を続ける。

本廃明のとの好ましい実施態様によると、第１カラムか
らの蛋白質含有分画を直接第２カラムに導入することに
よって、ＴＮＦ含有サンプルに対するサンプル取扱い量
を最少にし、付加的な精製が達成される前にサンプル修
正を行う必要性を回避する。

本発明の実施への使用が予定される陰イオン交換樹脂は
例えば第四アンモニウム陰イオン交換樹脂のような、強
陰イオン交換剤である。このような樹脂は例えばシリカ
、セルロース、ポリスチレン等の多様な支持体上に形成
される。

当業者が認識しているように、陰イオン交換樹脂はＴＮ
Ｆ含有液体を負荷する前に、適当な緩衝液によって平衡
化させる。０．０２Ｍ）リスＨＣｔ（ｐＨｓ、３）を含
む緩衝液が便利で効果的であることが判明しているが、
約７，８から１０までの範囲にｐＨを維持できる緩衝液
は全て適している。用いられる緩衝液は典型的に約０．
００２Ｍから０．ＩＭまでの範囲内の濃度を有する。

表面積の大きい多孔質ガラス材料からのＴＮＦ含有流出
液を陰イオン交換樹脂と接触させた後の陰イオン交換樹
脂からＴＮＦを溶離する前に、ＴＮＦ含有液体を負荷す
る前に樹脂を平衡化さぜるために用いた緩衝液と同じ緩
衝液の付加的量によってＴＮＦ負荷樹脂を洗浄する。１
〜２倍量以上の範囲陰イオン交換樹脂量あたりの洗浄緩
衝液量）の緩衝液を用いる。最小必要量は陰イオン交換
樹脂からの流出液のｐＨをＴＮＦ含有溶液を負荷する前
の樹脂のｐＨに大体戻すような量である。

この洗浄／平衡化段階に用いる緩衝液量の上限は主とし
て便宜上の問題である。本発明の現在の好ましい実施態
様では、陰イオン交換樹脂からＴＮＦ含有分画を溶離す
る前に樹脂に付加的量の０．０２ＭトリスＨＣｌ（ＰＨ
８．３）を通して陰イオン交換樹脂を約８．３のｐＨに
平衡化させるが、このためには約７．８から１０までの
範囲のｐＨを維持できる緩衝液は全て適している。用い
られる緩衝液は典型的に約０．００２Ｍから０．１　Ｍ
までの範囲内の濃度を有する。

好ましいカラム構成で実施する場合に、陰イオン交換樹
脂含有第２カラムに第１カラム（表面積の大きい多孔質
ガラス充てん物を含有）からのＴＮＦ含有流出液を負荷
させてから洗浄する。次に、適当な緩衝液中に少なくと
も約０．２Ｍ濃度の可溶性金属塩を含む溶液によって、
第２カラムからＴＮＦ含有分画を溶離する。適当な可溶
性塩はハロゲン化物、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸
塩等の陰イオンの塩がある。安価であり入手が容易であ
ることから、塩化ナトリウムが現在特に好ましい。適当
な緩衝液は溶離液のｐＨを約７．８から１０までの範囲
内に維持できるような緩衝液である。約０．１　Ｍから
０．５Ｍまでの範囲内の塩濃度が適切であるが、濃度が
高いと一般に第２カラムからＴＮＦを溶離しやすい。一
般に、高いｐＨ値においてＴＮＦを溶離するには高い塩
濃度が必要であり、低いｐＨ値におけるＴＮＦ溶離には
低い塩濃度が適している。実際には、０．ＯＩＭＩＪス
ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ８，３）中に塩化ナトリウムを含む
溶液を用いることが好ましい。この溶離は例えば低濃度
（例えば、０．１　Ｍ　）から高濃度（例えば０．３Ａ
ｆ）−ｊでの線形勾配で塩化ナトリウムを含む溶離剤ま
たは零から高濃度（例えば０．２Ｍ）まで段階的勾配で
塩化す）　ＩＪウムを含む溶離剤を用いるような、種々
な方法で実施される。

好ましいカラム構成で実施した場合には、第２カラムか
らの流出液を例えば約２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を監
視する等の適当な手段によって蛋白質含有液体の溶離に
関して監視することが便利である。蛋白質含有液体が第
２カラムから溶離し始めたならば、この流出液を固定化
色素親和性クロマトグラフィカラムから成る第３カラム
に直接通す。

第２カラムからの蛋白質含有流出液を第３カラムに直接
導入することによって、例えば濃縮、再配合等のような
サンプル修正を行う必要は回避される。

「固定化色素親和性クロマトグラフィカラム」なる用語
は、この明細書で用いるかぎり、固定化リガンドとして
一般に用いられる天然基質、補因子またはエフェクター
の代りに合成トリアジン色素を用いた、アフイニテイク
ロマトグラフイの変形である。当業者は本発明の実施に
適した多（の色素リガンドについて充分に知っている。

リガンドの例にはレッド、オレンジ、グリーンおよびブ
ルー色素があり、これらのリガンド成分は下記に示すニ プル−色素 レッド色素 オレンジ色素 グリーン色素 支持体 これらのりガントは例えばシリカ、ガラス、セルロール
、セファロース、セファデックス等のような、多様な支
持体に固定化することができる。

ブルーＡ色素リガンドはすぐれた結果をもたらすことが
判明しているので、本発明のＴＮＦ精製方法に用いる第
３接触段階の接触材料として現在好ましいリガンド（固
体支持体付き）である。

当業者が認識しているように、本発明の実施に用いる固
定化色素親和性材料は陰イオン交換樹脂の流出液を負荷
する前に、適当な緩衝液と一般に平衡化させる。実際に
、固定化色素親和性材料の０．０２Ｍ）リスＨＣｔ（ｐ
Ｈ８，３）含有緩衝液による平衡化がこのために有効で
あることが判明しているが、約６．０から８．５までの
範囲内のｐＨを維持できる緩衝液は全て適している。用
いられる緩衝液は典型的に約０．００２Ｍから０．１Ｍ
までの範囲の濃度を有している。

好ましい形式のカラム構成で実施する場合に、第２カラ
ム（陰イオン交換樹脂光てん物含有）から溶離される蛋
白質含有物質の実質的に全てが固定化色素親和性材料を
充てんした第３カラムに負荷される。次に第３カラムを
充分な量の適当な緩衝液によって、約２８０７Ｌ９ｒＬ
の範囲にＵＶ吸収を示す物質が本質的に溶離されなくな
るまで洗浄する。このために有用であることが判明した
緩衝液系は０．０２Ｍ）リス−１１Ｃｔ　（ｐＨ８，３
）を含むが、当業者は例えば約６．０から８．５マでの
範囲内のｐＨを維持しつる緩衝液のような、他の緩衝液
がＴＮＦ溶離前の第３カラムの洗浄に適していることを
認識している。用いられる緩衝液は典型的に約０．００
２Ｍから０．１Ｍｔでの範囲内の濃度を有する。

２８０？Ｌ？７Ｌにおいて吸収を示す物質の全てが負荷
第３カラムから洗浄されたならば直ちに、任意に高い塩
濃度を有する適当な緩衝液から成る溶離剤によって、カ
ラムからＴＮＦ含有液体を溶離する。塩の例には、ノ・
ロゲン化物、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、チオ
シアン酸塩等の陰イオンの可溶性塩がある。当業者は用
いるカラムのサイズ、カラムに吸着されたＴＮＦ量等の
ような要素に依存して、このような溶離に用いるための
適当な塩濃度を容易に決定することができる。約０．３
ＭからＩＭ以上壕での範囲内の塩濃度がＴＮＦの溶離に
適している。用いる塩は適当な緩衝液に溶解して、生成
する溶液がＴＮＦの分解を惹起することなく第３カラム
からＴＮＦを脱着させうるようにする。従って、約６．
５から１０までのｐＨ範囲の緩衝液が適切である。極度
に高いｐＨでは、ＴＮＦを溶離させるために塩の添加は
殆んど必要ない。例えば、非イオン洗剤のような、第３
カラムからのＴＮＦ脱着を促進させる任意の添加試薬を
溶離剤に含めることができる。実際に、０．０２Ｍトリ
スＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ８，３）中に約１，０Ｍ塩化ナ
トリウムを含む溶離剤溶液が適していることが判明して
いる。

第３カラムからの流出液を適当な手段で監視して蛋白質
含有分画を確認する、この分画はプールして、好ましく
ない塩を除去するためおよびＴＮＦ含有分画を濃縮する
ための他の処理を行うことができる。透析、真空透析、
限外濾過、凍結乾燥、等のような、周知の技術を用いる
ことができる。

本発明とその利点をさらに理解するには、次の非限定的
実施例を参照されたい。

実施例■ 統合的なメタノール反応性ＴＮＦコード化発現カセット
を含み、ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５と名づけられた
ピチア　パストリスの菌株〔米国農業省北部地方調査セ
ンター（ＮｏｒｔｈｅｒｔＬＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵＳ　Ｄｅｐ
ａｒｔｔｒｂｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｘｌｔｗｓｅ　）
　　イリノイ州ペオリアから受入れ番号ＮＲＲＬ　　Ｙ
−１８１１６によって入手可能）を２０　ｗ／ｖ％グリ
セロール上で１０８　？／を乾燥細胞重量の定常状態増
殖収率に達するまで増殖させた。３０分間の飢餓期間後
に、培養基２０００−にメタノール２０ｍ１を加えた。

Ｄ、Ｏ。

とｐＨが直ちに低下するのが認められた。全体で２７５
−（２１７ｆ）のメタノールを培養基に１８９時間にわ
たって加えた。この期間に１９回のメタノール添加が必
要であった。メタノールの殆んど全てが酸化された。

ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５細胞におけるＴＮＦ産生
はメタノール条件をシフトした場合に迅速に誘導され、
４８時間以内に１００ＸＩＯ’　より大きい飽和値に達
するように思われた。ＴＮＦレベルは約１８９時間実施
されたランの終了壕で一定であった。

１００　？／Ｌまでのピチア　ブイヨンを実施例■に述
べた通りに調製し、使用するまで一２０℃に凍結し７た
。解凍した細胞ブイヨンを０．　Ｉ　ＮＮａＯＨによっ
てｐＨ８に調節し、ウォータージャケラト付きプレンダ
ー内でガラスビーズと共に３〜５分間攪拌することによ
って粉砕し、３０，０００ＸＧでの１５分間の遠心分離
によって澄明化した。

孔度調節ガラス（ＣＰＧ；表面積−３６，４ｍ２／　ｌ
ｉ’、平均孔径−６５４λ、孔隙率０．９１ｃｅ／ｆ　
）　６０−を含有するカラムに直接塗布した。ピチア蛋
白質の大部分は約カラム５倍量の０．０ＩＮＩＪン酸カ
リウム（ｐＨ７，５）によって溶離した。次にＴＮＦを
５％トリエタノールアミン水溶液によって溶離した。Ｃ
ＰＧカラムからの蛋白質ピークが出現したときに、ＣＰ
Ｇカラム流出口を樹脂（第四メチルアミンイオン交換基
が結合した孔度５００λの非圧縮性シリカの３７〜５５
ミクロン粒子）６０−を含有するアクセルＣＡｃｃｅｌ
ｌ　）　　Ｑ　Ａ陰イオン交換カラムの供給口に連結し
た。次に、ＣＰＧカラムを離し、陰イオン交換カラムか
らＴＮＦ含有蛋白質ピークの溶離に充分な量の０．０２
Ｍ）ＩＪス−ＭＣ１，（ｐＨ８，３）中０．２ＭＮαｃ
ｔ　によってＴＮＦを溶離した。

陰イオン交換カラムから蛋白質ピークが出現しく３８） たときに、陰イオン交換カラム流出口を充てん物（ブル
ー色素のトリアジン環へのエーテル結合を介して架橋し
た５％アガロース支持体マトリックスに結合したブルー
色素）２０１ｎ！、を含有するブルーＡ色素カラムの供
給口に連結し、約カラム４倍量の０．０２Ｍ）リス−Ｈ
Ｃｌ　（ｐＨ８，３）含有緩衝液によって洗浄した、す
なわち２８０ｔＬｍ紫外線吸収物質の全てが溶離するま
で洗浄し、最後に０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，
３）中に１．　ＯＭ　ＮａＣＬを含有する溶液によって
精製ＴＮＦを溶離した。

ピチア　パストリスから得られた典型的な精製ＴＮＦＯ
比活性（ｕ／ｍ９）は凍結サンプルに対して２．６Ｘ１
０７であり、凍結乾燥サンプルに対しては３．０Ｘ１０
７であると測定された。

第１カラムに最初に負荷したＴＮＦの単位数を基準にし
たＴＮＦ収率は７８％であった。本発明の方法によって
得られたＴＮＦの純度はクーマシーブリリアントプルー
Ｒ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉ−ａｎｔ　Ｂｌ
ｕｅ　Ｒ）によって染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルによ
って約９８％であると測定された。精製段階は全て２４
時間以内に終了した。

これらの実施例は単に本発明の詳細な説明するだめのも
のであり、本発明の範囲すなわち特許請求の範囲を限定
するように解釈すべきではない。

本発明の本質および精神から逸脱することのない妥当な
変化および改良が請求された特許請求の範囲に含まれる
と考えられる。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む粉砕澄明化
   した発酵ブイヨンから同因子を精製する方法において： （ａ）表面積の大きい多孔質ガラス材料にＴＮＦを含有
   する粉砕澄明化した発酵ブイヨンを塗布する； （ｂ）段階（α）によつて負荷した表面積の大きい多孔
   質ガラス材料を適当な緩衝液で洗浄する；（ｃ）表面積
   の大きい多孔質ガラス材料から、前記ガラス材料を脱着
   させうるが、段階（ｄ）に使用される陰イオン交換樹脂
   へのＴＮＦの結合に有意に影響しない適当な溶離剤を約
   ０．０１〜１０υ／υ％までの範囲で含有する溶液によ
   つて、第１ＴＮＦ含有分画を溶離する； （ｄ）段階（ｃ）から得られた第１ＴＮＦ含有分画を陰
   イオン交換樹脂と接触させる； （ｅ）緩衝液中に塩を含む溶液によつて、前記陰イオン
   交換樹脂から第２ＴＮＦ含有分画を溶離する、この場合
   前記溶液の塩濃度とｐＨは前記陰イオン交換樹脂から第
   ２ＴＮＦ含有分画を溶離させるために充分であるが、第
   ２ ＴＮＦ含有分画中のＴＮＦが段階（ｆ）で用いる色素親
   和性材料に結合するのを阻害するには不充分である； （ｆ）前記陰イオン交換樹脂からの第２ＴＮＦ含有分画
   を固定化色素親和性材料に接触させる；（ｇ）段階（ｆ
   ）によつて形成されたＴＮＦ含有固定化色素親和性材料
   を適当な緩衝液によつて、約２８０ｎｍの紫外線吸収を
   示す物質が本質的に溶離されなくなるまで洗浄する；次
   に （ｈ）洗浄したＴＮＦ含有固定化色素親和性材料から、
   緩衝液中に充分な濃度の塩を含み、約６．５〜１０の範
   囲内のｐＨを有する溶離剤によつて、精製ＴＮＦを溶離
   し、前記色素親和性材料からＴＮＦの分解を惹起するこ
   となく、ＴＮＦを脱着させる 各段階から成る方法。
2. （２）前記発酵ブイヨンが酵母発酵ブイヨンである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記酵母発酵ブイヨンが￥ピチア　パストリス￥
   （￥Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）種の細胞を含
   有するブイヨンである特許請求の範囲第２項記載の方法
   。
4. （４）前記￥ピチア　パストリス￥種が￥ピチア　パス
   トリス￥ＧＴＳ１１５−ｐＴＮＦ６−５ＮＲＲＬ　Ｙ−
   １８１ １６である特許請求の範囲第３項記載の方 法。
5. （５）前記表面積の大きい多孔質ガラス材料、前記陰イ
   オン交換樹脂および前記固定化色素親和性材料がそれぞ
   れ、第１カラム、第２カラムおよび第３カラムに含まれ
   る特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方
   法。
6. （６）さらに、前記第１カラムを段階（α）の前に適当
   な緩衝液と平衡化させることを含む特許請求の範囲第５
   項記載の方法。
7. （７）前記表面積の大きい多孔質ガラス材料を洗浄する
   ために段階（ｂ）で用いる前記の適当な緩衝液がｐＨを
   約６．５から７．５までの範囲に維持しうる緩衝液を含
   む特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の方
   法。
8. （８）さらに、前記第２カラムを段階（ｄ）の前に、ｐ
   Ｈを約７．８から１０までの範囲に維持しうる緩衝液と
   平衡化させることを含む特許請求の範囲第５項記載の方
   法。
9. （９）前記第２カラムから７．８から１０までの範囲内
   のｐＨを有する付加的な緩衝液を通すことによつて前記
   ＴＮＦ含有分画を溶離する段階（ｅ）の前に、前記第２
   カラムを約７．８から１０までの範囲内のｐＨに平衡化
   させることをさらに含む特許請求の範囲第５項記載の方
   法。
10. （１０）前記第３カラムを段階（ｆ）の前に、約７．８
    から１０までの範囲内のｐＨを有する緩衝液と平衡化さ
    せることをさらに含む特許請求の範囲第５項記載の方法
    。
11. （１１）前記固定化色素親和性材料を洗浄する前記段階
    （ｇ）のための前記の適当な緩衝液が約７．８から１０
    までの範囲のｐＨを有する緩衝液を含む特許請求の範囲
    第１項〜第１０項のいずれかに記載の方法。
12. （１２）（ｉ）粉砕後ｐＨが約６から８までの範囲内で
    あるように充分に高いｐＨに調節した発酵ブイヨンの細
    胞を粉砕する；および （ｉｉ）粉砕した細胞を澄明化する 各段階によつて、前記粉砕澄明化発酵ブイヨンを製造す
    る特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の
    方法。
13. （１３）前記の表面積の大きい多孔質ガラスビーズ充て
    ん物が約３００〜３０００オングストロームの範囲内の
    均一サイズの相互連絡孔が分布した高シリカガラスの多
    孔質顆粒から成る特許請求の範囲第１項〜第１２項のい
    ずれかに記載の方法。
14. （１４）前記陰イオン交換樹脂が第四アンモニウム型の
    強陰イオン交換樹脂である特許請求の範囲第１項〜第１
    ３項のいずれかに記載の方法。
15. （１５）前記固定化色素親和性材料が支持体付き色素を
    含み、前記色素が レッド色素 オレンジ色素 グリーン色素および ブルー色素 から成る群から選択したものである特許請求の範囲第１
    項〜第１４項のいずれかに記載の方法。
16. （１６）前記の適当な緩衝液が０．０１Ｍリン酸カリウ
    ム（ｐＨ７．５）を含む特許請求の範囲第７項記載の方
    法。
17. （１７）前記平衡化に０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
    ８．３）を含む緩衝液を用いる特許請求の範囲第８項記
    載の方法。
18. （１８）前記平衡化に０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
    ８．３）を含む緩衝液を用いる特許請求の範囲第１０項
    記載の方法。
19. （１９）前記の適当な緩衝液が０．０２ＭトリスＨＣｌ
    （ｐＨ８．３）を含む特許請求の範囲第１１項記載の方
    法。
20. （２０）段階（ｃ）で用いる前記の適当な溶離剤が（１
    ）式； ＣＲ＿２Ｘ（ＣＲＸ）＿ｎＣＲ＿２Ｘ 〔式中ｎ＝０、１または２；各Ｒは独立的にＨまたはメ
    チルであり；ＸはヒドロキシルまたはＲであるが、少な
    くとも１個のＸはヒドロキシルである〕 で示される化合物 （ｉｉ）式： ＮＲ′＿ｘＨ＿３＿−＿２ 〔式中、ｘ＝１、２または３；各Ｒ′は独立的にＣ＿１
    〜Ｃ＿６アルキルまたはＣ＿１〜Ｃ＿６シクロアルキル
    基から選択するが、各Ｒ′は任意に１個以上のヒドロキ
    シ基を含有する〕 で示される化合物；および （ｉｉｉ）約８から１１までの範囲内のｐＨを有する緩
    衝化溶液を形成しうる化合物の組合わせ から成る群から選択した少なくとも１種類の溶離剤であ
    る特許請求の範囲第１項〜第１９項のいずれかに記載の
    方法。
21. （２１）前記溶離剤が、 エチレングリコール、 グリセロール、 プロピレングリコール、 エチルアミン、 プロピルアミン、 ブチルアミン、 トリエチルアミン、 エタノールアミンおよび トリエタノールアミン から成る群から選択した少なくとも１種類の溶離剤であ
    る特許請求の範囲第２０項記載の方法。
22. （２２）段階（ｅ）で用いる、緩衝液中の塩から成る前
    記溶液が約７．８から１０までの範囲内のｐＨを有する
    緩衝液に溶解した、 ハロゲン化物 リン酸塩 硫酸塩 酢酸塩および 硝酸塩 から成る塩の群から選択した、少なくとも約０．２Ｍ濃
    度の可溶な金属塩から成る特許請求の範囲第１項〜第２
    １項のいずれかに記載の方法。
23. （２３）段階（ｈ）に用いる前記溶離剤が次の陰イオン
    の可溶な塩： ハロゲン化物 リン酸塩 硫酸塩 酢酸塩 硝酸塩および チオシアン酸塩 から成る群から選択した、少なくとも０．３Ｍ濃度の塩
    を含む特許請求の範囲第１項〜第２２項のいずれかに記
    載の方法。
24. （２４）第１カラムからの流出液の監視が同流出液中の
    蛋白質の存在を検出した場合には、前記第１カラムから
    のＴＮＦ含有分画を第２カラムに直接供給し、前記第２
    カラムの流出液の監視が同流出液中の蛋白質の存在を検
    出した場合には、前記第２カラムからのＴＮＦ含有分画
    を直接第３カラムに供給する特許請求の範囲第５項記載
    の方法。
25. （２５）粉砕澄明化発酵ブイヨンから組換え腫瘍壊死因
    子（ＴＮＦ）を精製する方法において： （ａ）表面積の大きい多孔質ガラスビーズ充てん物含有
    第１カラムに粉砕澄明化発酵ブイヨンを塗布する； （ｂ）段階（ａ）によつて負荷した第１カラムをｐＨ約
    ７．５の０．０１Ｍリン酸カリウムを含む少なくともカ
    ラムの３倍量の緩衝液によつて洗浄する； （ｃ）約０．０１〜１０υ／υ％の範囲でトリエタノー
    ルアミンを含有する溶液によつて、前記第１カラムから
    第１ＴＮＦ含有分画を溶離する；（ｄ）第１カラムから
    の第２流出液の監視が同流出液が蛋白質を含むことを検
    出した場合には、前記第１カラムからのＴＮＦ含有分画
    を陰イオン交換樹脂含有第２カラムに通す； （ｅ）少なくとも１カラム量の０．０２ＭトリスＨＣｌ
    （ＰＨ８．３）を前記第２カラムに通すことによつて前
    記第２カラムをｐＨ８．３に平衡化させる； （ｆ）０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ＰＨ８．３）緩衝液
    中に０．１Ｍ−０．３ＭＮａＣｌを含む溶液によつて前
    記第２カラムから第２ＴＮＦ含有分画を溶離する； （ｇ）第２カラムからの流出液の監視が同流出液が蛋白
    質を含むことを検出した場合には、前記第２カラムから
    のＴＮＦ含有分画を固定化色素親和性クロマトグラフィ
    カラムから成る第３カラムに通す；および （ｈ）約２８０ｎｍのＵＶ吸収を示す物質が本質的に溶
    離されなくなるまで、前記第３カラムを適当な緩衝液に
    よつて洗浄する；および （ｉ）０．０２ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中
    に１．０ＭＮａＣｌを含む溶離剤によつて精製ＴＮＦを
    溶離する 各段階から成る方法。