JPS62502193A

JPS62502193A - Antigens, antibodies and their uses

Info

Publication number: JPS62502193A
Application number: JP61501599A
Authority: JP
Inventors: スターキー，セルビー・ジヨン; ウイリアムス，グウインフオー・リーズ
Original assignee: コラル・ソシエダデ・ブラシレイラ・デ・ペスキサス・エ・デセンボルビメント・リミタダ
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-12
Publication date: 1987-08-27
Also published as: WO1986005400A1; GB8506373D0; EP0214265A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗原、それに関連ある疾病に罹患している叡者からのその単離、該抗原に対する抗体、および治療および診断に於けるその各々の利用に関するものである。[Detailed description of the invention] The present invention provides an antigen, its isolation from a person suffering from a disease related to the antigen, and the antigen. relating to antibodies against the pathogen and their respective uses in therapy and diagnosis. be.

カンジダは、免疫抑制されているヒトに於いて病原となる菌である。Candida is a pathogenic bacteria in immunosuppressed humans.

全身性カンジダ症は、周知の病気である。この病気は、血流を通じてのカンジダ種の伝播および深部の組織への侵入に関係がある。この病気は、原リンパー増殖異常または手術後の患者に発症する。診断上の基準は、（１）死体解剖における、または生存中の深部器官の生検からの培養上および組織学上の徴候、−および（２）血液培養が陽性であることである。Systemic candidiasis is a well-known disease. This disease is caused by candida through the bloodstream. Involved in seed dissemination and deep tissue penetration. This disease is prolymphatic hyperplasia Occurs in abnormal or post-surgical patients. Diagnostic criteria are (1) in cadaver autopsy; , or cultural and histological signs from viable deep organ biopsies, - and (2) Blood culture must be positive.

ＥＰ−Ａ−０１４１６１６およびＷＯ−Ａ−（ＰＣＴ／ＧＢ８５１００４７６）は、カンジダ属の抗原に対するモノクローナル抗体を開示している。この属に含まれる様々な種は後者に記載されており、その内の関係のある内容は本明細書の一部を構成する。EP-A-0141616 and WO-A-(PCT/GB85100476) discloses monoclonal antibodies directed against Candida antigens. Included in this genus The various species that occur are listed in the latter, the pertinent content of which is included herein. constitute a part.

本発明の第２の態様は、治療または診断用の、例えば上の抗原の様なカンジダ症抗原に対する抗体、より好ましくはヒト抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体、およびこの様なヒトモノクローナル抗体それ自体である。A second aspect of the invention provides a method for treating or diagnosing candidiasis, such as the above antigens. Antibodies against antigens, more preferably human antibodies, most preferably human monoclonals antibodies, and such human monoclonal antibodies themselves.

発明の詳細な説明本発明の抗原は、一連のカンジダ症に罹患している患者から入手し、次いで精製した血液サンプルの精製によって得ることができる。本発明の抗原は、治療または診断に好適な形、例えば実質上純粋な形および／または１またはそれ以上のその他の試薬を含有するキットの一部として提供することができる。この抗原は、例えばヒトの患者に対する静脈内または経皮投与用のワクチンの形で使用に供されるのが好ましい。本発明の抗原は、４５〜５５ｋＤ、より具体的には約４７ｋＤの分子量によって特徴づけられる。Detailed description of the invention The antigen of the invention is obtained from a series of patients suffering from candidiasis and then purified. can be obtained by purification of a blood sample. The antigen of the invention may be used for therapeutic or is in a form suitable for diagnosis, e.g. in substantially pure form and/or in one or more of its forms. can be provided as part of a kit containing other reagents. This antigen is For example, for use in the form of a vaccine for intravenous or transdermal administration to human patients. Preferably. The antigen of the invention is 45 to 55 kD, more specifically about 47 kD. It is characterized by the molecular weight of D.

本発明の抗原を使用し、例えばウサギの様な動物の血清を得ることができる。次いでこのウサギ抗−血清を、ヒト血清中のカンジダ抗原を検出するために使用することができる。本発明の抗原は、通常、診断用の試薬として、即ち、全身性カンジダ症のための抗原試験の生薬として使用することができる。本発明の抗原を、所望により再分画し、Ｗ　Ｏ−Ａ−８６００９２７に記載の発明に使用することができる。The antigens of the invention can be used to obtain serum from animals such as rabbits. Next This rabbit antiserum was then used to detect Candida antigen in human serum. can be done. The antigens of the invention are typically used as diagnostic reagents, i.e. It can be used as a crude drug in antigen testing for candidiasis. The antigen of the present invention , if desired, and used in the invention described in WOA-8600927. I can do it.

本発明の抗体を使用するに際しては、医薬組成物の形で提供される。When using the antibodies of the present invention, they are provided in the form of pharmaceutical compositions.

これらは、全身性カンジダ症の治療に使用することができる。これらを、直接、または例えばアンフオテリシンＢまたは５−フルオロシトシン等の抗−カンジダ症剤の様なある種の薬物と組み合わせて投与してもよい。These can be used in the treatment of systemic candidiasis. these directly, or anti-Candida, such as amphotericin B or 5-fluorocytosine. It may also be administered in combination with certain drugs such as anti-inflammatory agents.

以下に実施例１，２．３および５を挙げ、本発明を説明する。これらの実施例では、以下の略号を使用する：　ＰＢＳ−リン酸緩衝食塩水；ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ＢＳＡ−）リス＝３％のＢＳＡを入れたトリス−緩衝食塩水、ｐ）（７，４゜パーセンテージは重量、または液体については容量による。（“ミリボア（Ｍ　ｉｌｌ　１ｐｏｒｅ）”、“ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）”、“セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）”および“ツウィーン（Ｔｖｅｅｎ）”は登録商標で本実施例により、イーストからの本発明の抗原の製造方法を説明する。Examples 1, 2.3 and 5 are listed below to illustrate the present invention. In these examples uses the following abbreviations: PBS - phosphate buffered saline; BSA = bovine serum acid Rubumin; BSA-) Lis = Tris-buffered saline with 3% BSA, p) ( 7.4° Percentages are by weight or, for liquids, by volume. (“Miribo Mill 1pore”, “Millex”, “Sepha” “S epharose” and “Tveen” are registered. This example describes a method for producing the antigen of the invention from yeast.

ロー寒天中またはアミノ酸添加した規定の最少培地中で一夜増殖させた。Grown overnight in low agar or defined minimal medium supplemented with amino acids.

これらを蒸留水中に集め、圧縮器を使用して圧搾した。即ち、“Ｘプレス”（ＬＫＢ、Ｂｒｏｍｎｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中、２００ｍＰａの圧力で破砕することによって“圧縮物”を調製した。圧縮器の代わりに、適当な形の機械的な破壊を使用してもよく、例えばガラスポールを使用してもよい。These were collected in distilled water and pressed using a compressor. That is, "X press" (L KB, Bromnia, Sweden) at a pressure of 200 mPa. A "compressed product" was prepared by. Instead of a compressor, use a suitable form of mechanical destruction. For example, glass poles may be used.

圧縮物を−７００で一夜、凍結させ、次いでイーストを加えた。次に、この生成物をプラスチックの袋に入れ、カーディス（ｃａｒｄｉｃｅ）を含有している７０％メタノール浴に３０分間、入れた。このプラスチック袋によって、イーストを含んでいる圧縮物にメタノールが侵入するのを防止した。圧縮物を浴から取り出し、プラスチック袋を除き、２００ｍＰａの圧力をかけた。The compresses were frozen overnight at -700 and then the yeast was added. Then generate this Place items in plastic bags containing cardice7 Placed in 0% methanol bath for 30 minutes. By this plastic bag, yeast This prevents methanol from entering the compressed material containing. Remove the compress from the bath The plastic bag was removed and a pressure of 200 mPa was applied.

この工程を３回繰り返し、９０％またはそれ以上の細胞を破壊した。This step was repeated three times to destroy 90% or more of the cells.

破壊された細胞を圧縮器から取り出し、４ｃにて３８，０００ｇで１．５時間遠心した。上清を０．２２μむリポアの膜（ミレックス）を通して濾過し、確実に無菌状態にした。The disrupted cells were removed from the compactor and centrifuged at 38,000 g for 1.5 hours at 4c. I was concerned. Filter the supernatant through a 0.22μ Lipore membrane (Milex) to ensure It was kept sterile.

実施例２本実施例により、ヒト血清からの抗原の製造を説明する。Example 2 This example describes the production of antigens from human serum.

全身性カンジダ症に罹患している患者から血清を得、脱塩した。この脱塩血清をイムノブロッティングシステムにおける抗原標本として使用した。この血清をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルにがけ、血清のその他の成分から分離した。トランスブロッティングセットを使用し、それをゲルからニトロセルロース紙に移した。イースト“圧縮物”（上を参照）に対して惹起したウサギ抗−血清を使用し、改良酵素−結合免疫吸着検定によってこれを検出した。バイオ−ラド・トランス−プロット（Ｂ　ｉｏ　−Ｒａｄ　Ｔ　ｒａｎｓ　−Ｂ　１ｏｔ）セル中、３５０＋ｎＡの電流を１．５時間使用し、室温で移動させた。３％のＢＳＡを入れた緩衝食塩水（０，９％ＮａＣＮａＣ１−１Ｏリス、ｐＨ７，４）中、４Ｃで一夜インキユベートすることによって、遊離のタンパク質部位を飽和させた。Serum was obtained from patients suffering from systemic candidiasis and desalted. This desalted serum It was used as an antigen specimen in an immunoblotting system. This serum is S Separated from other serum components by running on a DS polyacrylamide electrophoresis gel. . Use a transblotting set and transfer it from the gel to nitrocellulose paper Moved to. Rabbit antiserum raised against yeast “compact” (see above) This was detected by a modified enzyme-linked immunosorbent assay. Bio-Rad Trans-plot (Bio-Rad T rans-B1ot) cell During the transfer, a current of 350+nA was used for 1.5 hours and the transfer was carried out at room temperature. 3% BSA in buffered saline (0.9% NaCNaC1-1Olis, pH 7.4) containing Free protein sites were saturated by incubating overnight at C. .

次いで、緩衝食塩水中３％ＢＳＡ−０，０５％ツウィーン２０で１＝５０に希釈した、イースト“圧縮物”に対して惹起した抗−血清を加え、この０トロセルロースを２５０で２時間インキュベートした。０．９％食塩水−０，０５％ツウィーン２０に入れ、３０分間、５回洗浄した後、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗−ウサギＩｇＧを加え、２５Ｃで１時、間インキュベートした。このコンジュゲート体を、使用直前に、３％のＢＳＡを入れた緩衝食塩水でｌ：１０００に希釈した。洗浄後、新たに調製して濾過した等容量のナフトールＡＳＭＸホスフェートとファースト・レッド・ＴＲ塩の混合物中、ニトロセルロースを２５０にて１５分間インキュベートした。Then diluted 1=50 with 3% BSA-0,05% Tween 20 in buffered saline. Add antiserum raised against the yeast "compress" prepared by The sample was incubated at 250 °C for 2 hours. 0.9% saline - 0.05% Tzuyu After washing 5 times for 30 minutes, add alkaline phosphatase and conduit. Add conjugated goat anti-rabbit IgG and incubate for 1 hour at 25C. Ta. Immediately before use, the conjugate was added to buffered saline containing 3% BSA. Diluted to l:1000. After washing, an equal volume of freshly prepared and filtered naphthol Nitrocellulose in a mixture of ASMX phosphate and Fast Red TR salt. The sample was incubated at 250° C. for 15 minutes.

実施例３本実施例により、ヒト血清から実施例２の様にして得た抗原を更に精製する方法を説明する。Example 3 According to this example, a method for further purifying the antigen obtained from human serum as in Example 2 Explain.

カンジダ症に罹患している患者から血清を得、実施例１および２の様にして製造した抗原に対する酵素免疫検定を行なったところ、前記の４５〜４７ｋＤの抗原を含むカンジダ・アルビカンス抗原に対する抗体を含有していることがわかった。血清からのイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）を、プロティンＡ’（ＩｇＧに特異的な親和力を有する）に吸着させ、次いで溶離することによって精製した。これによって１１０ｍｇのＩｇＧを得、これはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって純粋であることがわかった。Serum was obtained from a patient suffering from candidiasis and produced as in Examples 1 and 2. When enzyme immunoassay was performed on the antigen, the 45-47 kD antigen was detected. was found to contain antibodies against Candida albicans antigens, including . Immunoglobulin G (IgG) from serum is converted into protein A' (IgG-specific It was purified by adsorption to a protein (having a similar affinity) and then elution. this 110 mg of IgG was obtained by polyacrylamide gel electrophoresis. I found it to be pure.

このＩｇＧを、臭化シアンを使用して２０ｍ１のセファロースＣＩ、６Ｂに結合させた（標準法）。ＩｇＧ−セファロース複合体をカラムに充填し、ますカラムの３倍容量のグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，８）で、次いでカラムの５倍容量のＰＢＳで洗浄した。The IgG was coupled to 20 ml of Sepharose CI, 6B using cyanogen bromide. (standard method). Pack the IgG-Sepharose complex into a column, then fill the column with of glycine-HCl buffer (pH 2,8) and then 5 volumes of the column. of PBS.

脱塩した血清（実施例２からと同様に）２−３ｍｌを０　、５　ｍ１７分の流速でカラムに通し、次いで、２８０ｎｍで測定した濾液の光学密度がゼロになるまでＰＢＳでカラムを洗浄した。2-3 ml of desalted serum (as from Example 2) was added at a flow rate of 0, 5 ml and 17 min. The column was then filtered until the optical density of the filtrate, measured at 280 nm, was zero. The column was washed with PBS.

次ぎに、グリシン−ＨＣ１＠衝液、ｐ）［２、８を通してカラムを洗浄し、ＩｇＧ−セファロースに特異的に結合しているカンジダ抗原を溶離した。Next, wash the column through glycine-HC1@ buffer, p) [2, 8, Candida antigen specifically bound to G-Sepharose was eluted.

固形のトリスを入れた容器に溶出液を集め、Ｉ）Ｈを８．０に高めた。カラムを再びＰＢＳで洗浄し、脱塩血清の次のサンプルに備えた。The eluate was collected in a container containing solid Tris and the I)H was increased to 8.0. column Washed again with PBS and prepared for the next sample of desalted serum.

溶出した抗原の各サンプルを透析用の袋に入れ、固形のスクロースで覆って抗原を濃縮した。次いで、抗原を蒸留水に対して透析した。Place each sample of eluted antigen in a dialysis bag and cover with solid sucrose to remove the antigen. was concentrated. The antigen was then dialyzed against distilled water.

実施例４本実施例により、実施例１．２および３に記載の方法のいずれかによって得られた抗原のための検定法を説明する。Example 4 According to this example, the Describes assay methods for antigens.

常法に従い、ドデシルポリアクリルアミドナトリウム・ゲルを調製した。蒸留水に入れた抗原液（０，Ｏ’２５ｍ１）をゲルのサンプルスロットに置き、ゲルの一端から他端に１５０ボルト、５０ｍＡの電流を６時間流した。この時間内に、サンプルの成分は、その分子サイズにおおよそ比例した速度でゲル中を移動した。A sodium dodecyl polyacrylamide gel was prepared according to a conventional method. Distilled water Place the antigen solution (0, O’25ml) in the sample slot of the gel, and A current of 150 volts and 50 mA was passed from one end to the other for 6 hours. Within this time, The components of the sample moved through the gel at a rate roughly proportional to their molecular size. .

電流を停止させた。ゲルをそのガラス製支持プレートから取り出し、ニトロセルロース紙のシートと一緒にバイオ−ラド・トランスプロット・セルに載せた。３５０ｍＡの電流を１．５時間流し、抗原をゲルから紙に移した。次いで紙を取り出し、ＢＳＡ−トリス中、４ｃで一夜浸漬し、紙上の遊離の結合部位を飽和した。The current was stopped. Remove the gel from its glass support plate and place it in a nitrocell. It was placed on a Bio-Rad Transplot cell along with a sheet of loin paper. 3 A current of 50 mA was applied for 1.5 hours to transfer the antigen from the gel to the paper. Then take the paper and soaked overnight in 4c in BSA-Tris to saturate free binding sites on the paper. .

次いでニトロセルロース紙を、実施例３と同様に（またはカンジダ症に罹患者している、または回復した患者から）調製し、０．０５％のツウィーン２０を加えたＢＳＡ−トリスでｌ：５０に希釈した抗−血清と一緒に、２５Ｃで２時間インキュベートした。次いでこの紙を０．０５％のツウィーン２０を加えた生理食塩水で５回洗浄した後、アルカリオスファターゼとコンジュゲートさせ、ＢＳＡ− ）リスで１：１０００に希釈したウサギまたはヒト（適宜）イムノグロブリンに対するヤギ抗体を加えて２５Ｃで１時間インキュベートした。前と同様にして紙を洗浄し、新たに調製して濾過した等容量のナフトール・ＡＳＭＸ・ホスフェートとファースト・レッド・ＴＲ塩の混合物中、２５Ｃで１５分間インキュベートした。染色された免疫複合体の特徴あるバンドが紙上に見られた後、前と同様にして紙を再び洗浄し、風乾した。The nitrocellulose paper was then coated in the same manner as in Example 3 (or (from a patient who has or has recovered) and added 0.05% Tween 20. Incubate for 2 hours at 25C with antiserum diluted 1:50 in BSA-Tris. Cubated. This paper was then soaked in physiological saline containing 0.05% Tween 20. After washing five times with water, conjugate with alkaline osphatase and BSA- ) to rabbit or human (as appropriate) immunoglobulin diluted 1:1000 in squirrel. A goat antibody against the protein was added and incubated at 25C for 1 hour. Paper as before Equal volumes of freshly prepared and filtered naphthol/ASMX/phosphate Incubate for 15 minutes at 25C in a mixture of salt and Fast Red TR salts. did. After the characteristic bands of stained immune complexes are seen on the paper, repeat as before. The paper was washed again and air dried.

抗−血清の代わりに、その内容が本明細書の一部を構成するＷＯ−Ａ−８６００９２７またはＷＯ−Ａ−８６００９２８のいずれかに記載の方法に従って調製したモノクローナル抗体を使用することもできる。抗体を緩衝化ＢＳＡで１ニアに希釈してもよい。Instead of anti-serum, WO-A-8600, the contents of which form part of this specification 927 or WO-A-8600928. Monoclonal antibodies can also be used. Antibodies were brought to 1N with buffered BSA. May be diluted.

実施例１の方法に従って得た抗原性の上清を使用し、ニューシーラント白ウサギにおいて高免疫性の血清を得る。次いで、このウサギ抗−血清を使用し、実施例４に記載のヒト血清におけるカンジダ抗原を検出する。直接静脈内注射するか、または抗体をフロイントの完全アジュバントと結合させ、経皮的に免疫することによってウサギを免疫する。Using the antigenic supernatant obtained according to the method of Example 1, New Sealant white rabbit Obtain hyperimmune serum. This rabbit anti-serum was then used in the Example Detecting Candida antigen in human serum as described in 4. Direct intravenous injection or or by conjugating the antibody with complete Freund's adjuvant and immunizing transdermally. immunize rabbits with

国際調査報告ｌｓｌ＃ｌ＋ｕ１１６ＲＩＩＭ＃１ｌｅｌ１１６ｆｉＮａ　ＰＣＴ／ＧＢＢＧ１０（１１４２ＡＮＮ三Ｘτ０τＨＥ　ｎ＋ｒ＝虹ＩＡＴｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＦ、ＲＥＰＯＲＴ　０Ｎ９１に昭６２−５０２１９３　（５）international search report lsl#l+u116RIIM#1lel116fiNa PCT/GBBG1 0(1142ANN3Xτ0τHE n+r=Rainbow IATrONAL 5EARC F, REPORT 0N91 1986-502193 (5)

Claims

[Claims]

1. Candidiasis antigens for treatment or diagnosis.

2. Virtually pure candidiasis antigen.

Antigen according to paragraph 1 or paragraph 2 having a molecular weight of 3.45 to 55 kD.

4. An antigen according to paragraph 1 or paragraph 2 having a molecular weight of about 47 kD.

5. Human antibodies against candidiasis antigens for therapeutic or diagnostic use.

6. Human monoclonal antibody against candidiasis antigen.

7. Human monoclonal antibodies against candidiasis antigens for therapeutic or diagnostic use.

8. Any of paragraphs 5 to 7, wherein the antigen is as defined in paragraph 3 or paragraph 4. Antibodies described in Crab.

9. A vaccine containing the antigen according to any one of items 1 to 4.

10. A pharmaceutical composition containing the antibody according to any one of items 5 to 8.

11. 11. The composition according to clause 10, further comprising an anti-candidiasis agent.

12. In paragraph 11, the drug is amphotericin B or 5-fluorocytosine. Compositions as described.

13. Humans or other animals susceptible to or suffering from candidiasis A method for treating a subject, comprising administering to the subject an anti-candidiasis effective amount of items 1 to 4. The antigen according to any one of items 5 to 8, the antibody according to any one of items 5 to 8, and the antibody according to any one of items 9 to 9. administering the vaccine or the composition according to any of paragraphs 10 to 12. A method consisting of