JPS62501121A

JPS62501121A - ヌクレオチド配列を検出するためのサンドイッチハイブリッド形成改良法

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Publication number: JPS62501121A
Application number: JP61500386A
Authority: JP
Inventors: マルコム、アラン　デビツド　ブライア−; ラングデール、ジエーン　アリソン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-12-19
Filing date: 1985-12-19
Publication date: 1987-05-07
Also published as: WO1986003782A1; EP0205532B1; DE3574994D1; AU5310586A; EP0205532A1; GB8432118D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオチド　め”１１　るためのサンドイーチハイブリード／−゛４駐」１本発明はＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を含むヌクレオチド配列の検出に関する。

１及亙又豆上３例えば臨床的に得たサンプルまたは標本のようなサンプル中の特定のＲＮＡまたはＤＮＡの存在（または不在）を検出できることは人類にとって非常に有利であると思われる。しかし、既存の検出方法は極度に時間のかかる上に非常に労力を要するものであるので。

非常に限定された規模で用いられるものであった。さらに、多くの場合に感度も不利に低い０例えば、一般に用いられる１つの方法では、適当な制限エンドヌクレアーゼによってサンプルを消化し１次にゲル電気泳動によるサイズ分画化を行い、サイズ分類した両分をゲルからニトロセルロースまたはその他の適当な膜に移し、放射能標識プローブ（通常、３２Ｐ標識プローブ）とハイブリッド形成させ、最後にオートラジオグラフィすることによって、複雑な混合物における特異的なりＮＡ配列を検出する。このような方法は固有に面倒であり、自動操作に適していない、また、非常にしばしば、股上に移す被膜ＤＮＡまたは他のヌクレオチド配列の量が非常に少なく、ハイブリッド形成後に検出可能なシグナルを得るには、高度に放射性のプローブを用いなければならない、このことは処理の見地からち、また選択した放射能標識（すなわち、Ｐ）が比較的短い半減期であり、ストック試薬としての使用に不適切であるという見地からも不利である。

上述の方法に替り得る方法が、Ｄｕｎｎ　Ａ、　Ｒ，とＨａｓｓｅｌｌＪ、　Ａ、がＣｅ１ｌ　１２巻、２３〜２Ｂ頁（＋９７７）に発表したサンドイッチハイブリッド形成法である。この方法では、被検ヌクレオチドを含むサンプルを膜（例えば、ニトロセルロースフィルター）に固定した相補的フラグメントと接触させて、被検配列を１次ハイブリッド形成段階でこのフラグメントとハイブリッド形成させ、標識プローブによる二次ハイブリッド形成段階に利用する非ハイブリッド化末端部を残しておく。

ヨーロッパ特許第００７９１３９号では、上記のサンドイッチハイブリッド形成方法をサンプル中の微生物の確認に利用することが提案されている。この提案によると、被検微生物からの一重鎖核酸配列を含むサンプルを問題の微生物のゲノムから得た２個の−′？、鎖フラグメントと直接または組換えＤＮＡ法によって接触させる。これらのフラグメント被検配列の異なる位置に相補的に結合しく相互にではなく）、１つは固体キャリア（好ましくはニトロセルロースフィルター）に固定され、他方は標識されている。放射能標識以外の標識によるラベリングも示唆されるが、放射７１標識（特に１２５■による標ｍ）のみが開示されている。被検−重鎖核酸配列が存在する場合には、被検配列は固定フラグメントと標識フラグメントの両方によってハイブリッド化し、標識フラグメントがキャリヤに結合して、オートラジオグラフィによって検出される。このようにして、その −重鎖配列の入手源である微生物が明確に確認されることになる。

サンドイッチハイブリッド形成法は最初に述べた方法を凌駕する利点を有するが、特にニトロセルロースフィルターまたはその他の膜上に固定され得る核酸の量が制限され、全く限定されるために、固有の欠点がまだ残されている。特定の場合に、このことがこの検出法の速度と感度の両方を限定する。また、特に二次段階におけるハイブリッド形成効率が非常に低く、この方法の感度をさらに減じているように思われる。

ヨーロッパ特許第００７０８８７号では、固定したサンプルの一重鎖ボリヌクレオチドとのハイブリッド形成のために光標識−重鎖ポリヌクレオチド試薬を用いるハイプリー２ト形成診断方法が提案されている。固定したサンプルの一重鎖ポリヌクレオチドに対して、活性化したガラスピーズ、ポリアクリルアミド、アガロースまたはセファデックスビーズおよびセルロースを含めた１種々な固体サポートが示唆されている。サンプルのポリヌクレオチドをサポートに結合する方法としては、発表されている文献を広く参照して、種々な方法が示唆されており、例えば、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ＸＸＸＩＶ巻、パー　トＢ、　４Ｅｉ３〜４７５頁（１８７４）オヨびＸＬＩＶ巻、・８５９〜８８６頁（１９７６）の方法が示されているが、操作方法の特別な実施例は記載されていない、光標識したポリヌクレオチド試薬とのハイブリッド形成のために必要なサンプルポリヌクレオチド部分とは異なる。サンプルポリヌクレオチド部分と相補的な、固定した一次一重鎖ボリヌクレオチド試薬とサンプルをハイブリッド形成条件下で接触させることによって、サンプルの一重鎖ポリヌクレオチドが固定されることも示唆されている（いわゆるサンドイッチハイブリッド形成法）、この場合にも、この方法すなわち一次ボリヌクｌ／オチド試薬を最初にサポートに付着させる方法の特別な実施例は記載、されていない。

先九五１１本発明の１態様によると、固定した核酸フラグメントのキャリヤとしてマクロ孔質樹脂の固体粒子またはビーズを用いることによって、サンドインチ／Ｘイブリフト形成反応の特に二次段階の速度と効率が実質的に高められ、感度が非常に改良された、核酸フラグメンＩ・の検出方法を提供できることが発見された。特にセファクリルのような、架橋したマクロ孔質樹脂の粒子またはビーズの使用がポリヌクレオチド試薬のサポートに対する共有結合を実質的に改良するように［、！Ｌ＋、われる。

本発明の第二態様では、異常なヒト（踵状赤血球）β−グロビン遺伝子を検出するための特に敏感な方法を開発した。この方法は固体の樹脂粒子またはビーズに共有結合した固定ポリヌクレオチド試薬と正常な遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ処理によって得られた、異常な遺伝子のＤｄｅ　１消化物内に含まれる、異常な（踵状赤血球）β−グロビン遺伝子に特徴的なβ−グロビン遺伝子の第六コドンの単一塩基変化を含む制限フラグメントの異なる部分に対して、相補的なポリヌクレオチド配列から成る第二標識ポリヌクレオチド試薬とによって、異常な遺伝子のＤｄｅ　Ｘ消化物をサンドイッチハイブリッド形成するものである。

従って、本発明によると、サンプル中の特定の核酸配列を検出する方法であって、サンプルをハイブリッド形成条件下で、被検配Ａの１部と相補的な配列を含む一重鎖核酸フラグメン）・を固定した固体粒子またはヒースから成る第一試薬と、固定されたフラグメントとは非相補的な、被検配列の異なる部分に対して相補的な配列から成る標識−重鎖核酸フラグメントから成る第二試薬とに接触させ、それによって両試薬とハイブリッド形成した、被検配列から成るハイブリッド形成二重体を形成し、このハイブリッド形成二重体を残りの非結合標識から分離し、ハイブリッド形成二重体に結合した標識の存在（もし存在する場合には）を検出することから成る方法を提供する。

正直立１」本発明の方法に用いる第一試薬は核酸フラグメントの反応性基（例えばアミ７基）と固体粒子内または固体粒子上の反応性基との間の共有結合によって、固体粒子またはビーズ上に固定された一重鎖核酸フラグメントから成るものであることが好ましい。このために本発明の方法に用いる好ましい固体粒子は、ポリマー鎖に結合した反応性基（例えばアミンまたはヒドロキシル基）を有する天然または合成のポリマーから成るポリマービーズである。最も好ましいものは、商品名５ｅｐｈａｄｅｘおよびＣｅ１ｌａｘで収光されているような、セルロースポリマービーズおよび特に、５ｅｐｈａｒａｓｅおよび５ｅｐｈａｃｒｙｌ　のようなマクロ孔質セルロース材料である。

このようなポリマービーズに核酸フラグメントな共有結合させる方法としては、末端ホスフェート基を介したカルボジイミドとの結合および臭化シアンを介する結合を含めて１種々の方法が存在し５．知られている。しかし、ポリマーマトリックスに結合した芳香族アミン基のジアゾ化による結合が特に挙げられる。この方法はＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、（１８８２）　１０巻、２２号、１７８９〜１８１０頁と７１６３〜７１９６頁に詳細に述べられている。

ポリマービーズは５〜５０ミクロン、特に１０〜２０ミクロンの範囲の粒度を有するものが好ましい。

本発明の方法に用いる第二試薬を得るための−・重鎖核酸フラグメントの標識に関しても同様に種々な方法が存在し、知られている。　Ｐおよび　Ｉのような放射性同位体による標識についてはすでに述べたが、これらの標識は本発明に用いることができる。しかし、本発明によると高感度が実現されるために、これらよりも低放射性の同位体、特にトリチウムが標識として用いられると考えられる。

さらに、非放射性標識、例えば酵素、蛍光および化学発光による標識も適しており、多くの場合に好ましいと考えられる。

試薬を調製し、これらの試薬をキットとして利用することを考えるならば、本発明の方法は特に実施が簡単になり、自動装置または半自動装置に適合しやすくなると思われる。被検制限フラグメントと２種類の試薬をハイプリント化することから成るハイブリット化゛二毛体の形成を可能にし１′）るような条件下で、２種類の試薬とサンプルを同時にまたは連続的に混合することだけが、木質的に必要である。ハイブリッド形成は迅速であり、ヨー口・ンパ特許第００７８１３８号のサンドイッチハイブリッド形成方法に比べて、第一（固定）試薬と第二（標識）試薬の両方を単に使用量を増加させるだけで無限に過剰に用いることができるので、結合する標識量を最大化して、次の検出のために最大のシグナルを与えることができる。従って、本発明の方法は高感度であるが、この感度は実際に無限に可能である試薬の濃度によって決定されるのではなく、サンプル中の被検配列の濃度によって決定される。このことはヨーロッパ特許第００７９１３９号の方法と明らかに対照的である。このヨーロッパ特許の方法では、固定試薬の濃度が限定されており、かなり低いために、二重体に結合する標識量ち同様に低く、この標識量は固定試薬のψよりも通常はるかに過剰に存在するサンプル中の被検配列の量によって決定されるのではなく、固定試薬の樋によって決定される。本発明の方法では、サンプル中に存在する被検配列のかなり高い割合がハイブリッド化され、その結果として標識されることになる。このことだけではなく、すでに述べたように、例えばセルロースニトレートのフィルターまたは膜に対照するものとして、ビーズをキャリアとして用いるハイブリッド形成反応の効率が実際に、意外に上昇する。

本発明の方法に用いるサンプルは固定すべきポリヌクレオチドフラグメント（複数の場合も）を−重鎖型で含む精製したおよび／または分画化したサンプルであるが、被検゛配列をサチンブロッティング法のように、標識前にサンプルから分離する必要がないことは、本発明の大きな利点である。従って、本発明によると、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含む臨床サンプルのような、オリジナルサンプルの制限エンドヌクレアーゼにより消化し、次に変性によって制限フラグメントを一重鎖型に変えることによって得られるポリヌクレオチドの粗混合物中の特定のポリヌクレオチドを検出することも可能である。

ハイブリッド形成後に、標識されたハイブリッド形成二重体を支持するポリマービーズまたはその他の粒子を例えば遠心分離および洗浄によって、結合していない過剰の標識から分離し、結合標識の存在を適当な方法で、例えば放射能標識の場合にはシンチレーションカウンターによって、酵素標識の場合には酵素活性によってまたは蛍光もしくは化学発光標識の場合には光検出手段によって検出する。

本発明の方法は、サンプル中の特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を迅速に確認できるために、広範囲な用途を有している。従って本発明の方法はサンプル中の病原性微生物、遺伝子異常等の確認ならびに遺伝子地図作成の簡単化に用いることができる。特別な用途の実例を挙げると、鎌状赤血球疾患の検出である。

　鎌状赤血球疾患はヒトβ−グロビン遺伝子の第六コドン中の単一１訂基突然異変（Ａ−Ｔ）によって生ずる。第六コドン中のＧＡＧからＧＴＧへのこの変化が、生成するヘモグロビンの遺伝子によってコード化される性質を変え、グルタミンではなくバリンが蛋白質中に挿入されるばかりでなく、β−グロビン遺伝子の５′末端にＤｄｅ　ＩとＭｓｔｌ＋認識部位の欠損が生ずることになる。このことは、β−グロビン遺伝子の５゛末端におけるＤ’ｄｅｌとＨｉｎｆＩ部位の制限地図である添付図面に図示する。そのため、異常なしく組状赤血球）β−グロビン遺伝子のＤｄ’ｅｌ消化によって、正常なβ−グロビン遺伝子のＤｄｅ　Ｉ消化によって生ずる２０１ｂｐ（フラグメントβ）と１８０　ｂｐ　（フラグメントＣ）の２種類のフラグメントとは対照的に、単独の連続長さにフラグメン）ＢとＣの両方を含ム＄−ｙ３８１ｂｐフラグメントが生ずる。フラグメントＢまたはフラグメン）Ｃのいずれかをポリマービーズに固定し、他方を標識する前述の方法を用いると、サンプル中の異常な組状赤血球の存在を迅速に検出できる２種類の試薬が提供される。Ｄｄｅ　Ｉによる正常なβ−グロビン遺伝子の消化は２種類のフラグメントを生ずるが、このいずれも２種類の試薬と「サンドイッチ」を形成しない、これにダして、Ｄｄｅ　Ｔによる異常な（組状赤血球）β−グロビン遺伝子の消化は２種類の試薬と「サンドイッチ」を形成し得る単一のフラグメントを生ずる。Ｄｄｅ　Ｉ消化物をハイブリッド形４条件下（すなわち、消化物を変性した後に）で２種類の試薬と接触させると、異常な（組状赤血球）β −グロビン遺伝子が標識と結合し、陽性のシグナルを発するが、正常なβ−グロビン遺伝子はこれをしない。

実際の実験では、ＨｉｎｆｌによるプラスミドβＦ５の消化によって上述の方法を行った。プラスミドβＦ５はベクターＰＡＴＩ５３の単独Ｈａｍ　８１部位にクローン化したヒトβ−グロビン遺伝子の１．９Ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ１制限フラグメンＩ・を含む、　Ｈｉｎｆ　ｌによるプラスミドβＦ５の消化によって、３．４１　Ｋｂフラグメント（フラグメントＡ）を生じ、これは消化産物から電気泳動および電気溶出によって回収される。

変性後に、３４１　Ｋｂフラグメントを５ｅｅｄ　Ｂ、がＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　１０巻、１７９１１−１８１０頁（１９８２）に述べているジアソ化方法を用いて、マクロ孔質セルロースポリマービーズ（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　５００）に固定させた。

第二操作では、プラスミドβＦ５をＭＳｔ　ＩＩによって消化させて、２０１　ｂｐフラグメント（フラグメントＢ１図１参照）を生じ、同様に消化物から回収した。

次に、フラグメントＢをＲｅｇｂｙ等（＋９７？）がＪ、　ｌＩ！ｏｆ、　Ｂｉｏｌ。

１１３巻、２３７〜２５１頁に述べている方法を用いた二・ンク・トランスレーションによつも１．５　ＸＩＯｃｐＩＩｌ　用ｇ−１の比活性になるまで３２Ｐで標識した。

他の２回の操作で、プラスミドβＦ５をＤｄｅ　ＩとＨａｍ　ＨＩによって消化させた。Ｄｄｅｌによる消化では、フラグメントＡとＢによって「サントイ・ンチ」／＼イブリッド形成することのできない短いフラグメントが生ずるが、Ｂａｇ　Ｈｌによる消化では「サンドイッチ」ハイブリッド形成することのできる単一の長１．）フラグメントが生ずる。各場合に、消化の後に変性を行って、−＠　ｆＱ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを得た。

本発明の方法によってサンドイッチｌ＼イブリッド形成を行う前に、固定したフラグメントＡを１ｍ文の４０　ｍ　Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐ）！８．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡｏ、８１４ＮａＣＥＬ、０．１％ＳＤＳと２５０ｇｇｍ１　の音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ中で６５°Ｃにおいて１晩、プレノーイブ１ノツト化した。プレ／＼イブリッド形成後しこ、変性したＤｄｅ　ＩまたはＢａｍＨＩβＦ５消化物のいずれかを固定３４１　ｂｐフラグメントＡおよび標識２０１ｂρフラグメントＢと同緩衝液５０ｇ文中で混合し、混合物を１晩放置することによって、サンドイッチ／＼イブリ・ンド形成を行った２次に、ビーズを分離し、サケ精子ＤＮＡを含まない同緩衝液１ｍＭによってそれぞれ８５°Ｃにおいて３回、ｌＯ分間洗節してから、計数した。この結果は表１に示す。これらの結果は、１００　ａｔｔａｍｏｌｅ（１０−’モル）以上のプラスミドβＦ５量では、Ｂａｍ　Ｈ１消化物とＤｄｅ　Ｅ消化物との間に明確な区別があることを明らかに示している。表１に記載した数値では、ｒサンドイッチ充填」を省略した、またはこの代りに音波処理したウシ胸腺ＤＮＡを用いた場合に得られた低いバックグランド値を控除していない。

表−一ユ他の実際の実験では、固定した３４１　ｂｐフラグメントＡと標識した２０１ｂＰフラグメンｌ−Ｂを用いた上記サンドイッチハイブリッド形成法を、正常な患者とホモ接合体鎌状赤血球患者の両方からのヒ）ＤＮＡのＤｄｅ　Ｉ消化物ｅｏ　ａｔｔｏ請ｏｌｅを用いてくり返した。結果は明白であった。バックグランド（Ｊを控除した後に、典型的な実験は鐘状赤血球ＤＮＡに対しては４４１カウント（１０分間）を生じ、正常なりＮＡに対しては１５３カウントを生じた、このことは本発明の方法が鐘状赤血球ＤＮＡの存在の確認に有効であることを説明し、立証している。

βＦ５のＢａｍＨＩとＤｄｅ　Ｉ消化物を混合することによって、踵状赤血球ホモ接合体の場合を模倣することも可能である。このような実験では、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　１００　ａｔｔｏｍｏｌｅを用いてカウント（１０分間）を次のように得て：正常１２８、ヘテロ接合体２９６、ホモ接合体７４５、この方法かへテロ接合体ならびにホモ接合体の確認に用いられ得ることを示している。

要約すると、本発明の方法は先行技術を凌駕する次のような利点を有している：１、　本発明の方法は迅速である。電気泳動、プロッティングおよびオートラジオグラフィは省略することができる。８時間程度でサンドイッチ／＼イブリッド形成を実施することができる。重力、遠心分離または磁気によるビーズの分離は数秒を要し、シンチレーションカウンターでの定量は数分間を要するだけである。実際に、血液採取してから４８時間以内に結果が得られ、今後かなりの短縮が可能であることが示唆されている。

２、　未発明の方法は自動操作することが非常に容易であり、そのために多数のサンプルを扱うことが特に容易である。

３　本発明の方法は他のＤＮＡ標識方法に容易に適合する。

４、　本発明の方法は短い制限フラグメントによっても長いフラグメントによると同様に良好に作用し、オリゴヌクレオチドの使用に容易に適合する。このことは可能な用途数を非常に増大する。

５、膜は限られた（低い）ＤＮＡ結合容量を有するが、本発明の方法では固定されたＤＮＡと標識されたＤＮＡの川を単に増すことによって、大量のＤＮＡを容易に処理することができる。このことは分析の感度を高める、または比活性の低い標識ＤＮＡを用いる可能性またはハイブリッド形成時間をさらに短縮する可能性を提供している。

これらの利点によって、ヒト、動物および植物における。細菌、ウィルスおよび遺伝的障害の確認と特徴化のために今後、ルーチンの検査室が組換えＤＮＡ法を迅速に適用できるようになると考えられる。

図面の簡単な説明間際調査報告、＝−、−１１，、、、、、、、、、、＋＋、１１１ｐｃ’ｒ／ｃＢ８５１００５９１ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴ口せＩＡτｌ０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８５１００５９１　（ＳＡ　１１７２０）１Ｎ表昭６２− ５０１１２１　（８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ハイブリッド形成条件下でターゲットポリヌクレオチドを次の要素：（ａ）被検配列の第一部分と相補的であり、前記条件下で前記第一部分とハイブリッド形成可能な一重鎖ヌクレオチド配列から成る固定ポリヌクレオチド、および（ｂ）被検配列の第二の異なる部分と相補的であり、前記条件下で前記第二の異なる部分とハイブリッド形成可能な、マーカーによって標識された一重鎖ヌクレオチドから成る標識ポリヌクレオチドプルーブと接触させることによって、固定ポリヌクレオチド、ターゲット、ポリヌクレオチドおよび標識ポリヌクレオチドから成る固定ハイブリッド形成二重体を形成し、固定二重体を分離し、二重体上のマーカーの存在を検出することから成る、ターゲットポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列の検出方法であって、前記固定ポリヌクレオチドとして架橋したマクロ孔質樹脂の固体粒子またはビーズに共役結合した前記一重鎖の相補的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを用いることから成る改良方法。
２．ハイブリッド形成条件下でターゲットポリヌクレオチドを次の要素：（ａ）被検配列の第一部分と相補的であり、前記条件下で前記第一部分とハイブリッド形成可能な一重鎖ヌクレオチド配列から成る固定ポリヌクレオチド、および（ｂ）被検配列の第二の異なる部分と相補的であり、前記条件下で前記第二の異なる部分とハイブリッド形成可能な、マーカーによって標識された一重鎖ヌクレオチドから成る標識ポリヌクレオチドプルーブと接触させることによって、固定ポリヌクレオチド、ターゲットポリヌクレオチドおよび標識ポリヌクレオチドから成る固定ハイブリッド形成二重体を形成し、固定二重体を分離し、二重体上のマーカーの存在を検出することから成る、ターゲットポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列の検出方法であって、前記固定ポリヌクレオチドとして、架橋したマクロ孔質セルロース材料から成り、５〜５０μ範囲の粒度を有する固体粒子またはビーズに共有結合した前記一重鎖の相補的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを用いることから成る改良方法。
３．固定ポリヌクレオチドが樹脂上の反応性基とポリヌクレオチド上の遊離アミノ基との間のジアゾ化反応によって、樹脂粒子またはビーズに共有結合する請求の範囲第２項記載の方法。
４．固定ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの５′末端におけるホスフエート基と樹脂上の反応性基との間のカルボジイミド結合によって、樹脂粒子またはビーズに共有結合する請求の範囲第２項記載の方法。
５．ポリヌクレオチドプルーブが放射性マーカーまたは標識を含む請求の範囲第２項記載の方法。
６．ポリヌクレオチドプルーブが酵素マーカーまたは標識を含む請求の範囲第２項記載の方法。
７．固定ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプルーブが制限エンドヌクレアーゼポリヌクレオチドフラグメントである請求の範囲第２項記載の方法。
８．異常なヒト（鎌状赤血球）β−グロビン遺伝子の検出方法であって、遺伝子をＤｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化させて、異常な遺伝子の特徴である異常な第六コドン含有３８１ｂｐ制限フラグメントを１成分として含む制限消化物を得、前記フラグメントを含む消化物をハイブリッド形成条件下で次の要素：（ａ）前記フラグメントの第一部分とハイブリッド形成可能である、固体樹脂粒子またはビーズと共役結合した固定一重鎖ポリヌクレオチド、および（ｂ）前記フラグメントの第二部分とハイブリッド形成可能な標識一重鎖ポリヌクレオチドプルーブ（前記一重鎖ポリヌクレオチドプルーブと前記標識一重鎖ポリヌクレオチドの１つは前記３８１ｂｐフラグメントの第一部分と相補的な、正常なヒトβ−グロビン遺伝子のＤｄｅＩ消化によって得た、または得られる１８０ｂｐポリヌクレオチド配列である、または１８０ｂｐポリヌクレオチド配列を含むものであり、他方は前記３８１ｂｐフラグメントの第二の異なる部分と相補的な、正常β−グロビン遺伝子のＤｄｅＩ消化によって得た、または得られる２０１ｂｐフラグメントである、または２０１ｂｐフラグメントを含むものである）と接触させ、固定一重鎖ポリヌクレオチド、前記制限フラグメントおよび前記標識ポリヌクレオチドプルーブから成る、化成した固定ハイブリッド形成二重体を分離して、固定ハイブリッド形成二重体上のマーカーの存在を検出することから成る方法。
９．前記１８０ｂｐポリヌクレオチド配列が正常なヒトβ−グロビン遺伝子のＨｉｎｆＩ消化によって得た、または得られる３４１ｂｐフラグメントの１部である請求の範囲第８項記載の方法。
１０．場合に応じて、前記１８０ｂｐ配列から成る、またはこれを含むポリヌクレオチドと、前記２０１ｂｐフラグメントから成るポリヌクレオチドがプラスミドドβＦ５のエンドヌクレアーゼ制限によって得られるものである請求の範囲第８項記載の方法。
１１．固定一重鎖ポリヌクレオチドが架橋したマクロ孔質セルロース樹脂のビーズまたは粒子に共有結合する請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．第一要素としての、被検ヌクレオチド配列の第一部分と相補的な一重鎖ポリヌクレオチド配列が共役結合した、架橋マクロ孔質樹脂の固体粒子またはビーズから成る固定ポリヌクレオチド試薬と、第二要素としての、被検ヌクレオチド配列の第二の異なる部分と相補的で、マーカーによって標識された、一重鎖ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドプルーブから成る、ターゲットポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列を検出するための診断用キット。
１３．第一要素としての、第一の一重鎖ポリヌクレオチド配列が共有結合した固体の樹脂粒子またはビーズから成る固定ポリヌクレオチド試薬と、第二要素としての、マーカーで標識した第二の一重鎖ポリヌクレオチド配列から成る、ポリヌクレオチドプルーブから成る、異常なヒト（鎌状赤血球）β−グロビン遺伝子を検出するための診断用キットであって、前記配列の１つが正常なヒトβ−グロビン遺伝子のＤｄｅＩ消化によって得られた、または得られる前記１８０ｂｐポリヌクレオチド配列である、またはこの配列を含むものであり、他方が正常なβ− グロビン遺伝子のＤｄｅＩ消化によって得られた、または得られる前記２０１ｂｐフラグメントである、またはこれを含むものである診断用キット。
１４．前記１８０ｂｐポリヌクレオチド配列が正常なヒトβ−グロビン遺伝子のＨｉｎｆＩ消化によって得られた、または得られる３４１ｂｐフラグメントの１部である請求の範囲第１３項記載のキット。
１５．場合に応じて、前記１８０ｂｐ配列から成る、またはこれを含むポリヌクレオチドと、前記２０１ｂｐフラグメントから成るポリヌクレオチドがプラスミドβＦ５のエンドヌクレアーゼ制限によって得られる請求の範囲第１３項記載のキット。
１６．前記第一の一重鎖ポリヌクレオチド配列が架橋マクロ孔質樹脂の粒子またはビーズに共役結合する請求の範囲第１３項記載のキット。
１７．ポリヌクレオチドプルーブが酵素によって標識されたものであり、さらに第三要素として、酵素標識プルーブを検出するための前記酵素の基質から成る手段を含む請求の範囲第１２項記載のキット。
１８．ポリヌクレオチドプルーブが酵素によって標識されたものであり、さらに第三要素として、酵素標識プルーブを検出するための前記酵素の基質から成る手段を含む請求の範囲第１３項記載のキット。