JPS62501071A

JPS62501071A - 成長因子活性を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコ−ドする核酸配列

Info

Publication number: JPS62501071A
Application number: JP60504725A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ジヨゼフ　ピー; トウワーズイク，ダニエル　アール; マーカード，ハンス; トダロ，ジヨージ　ジエイ
Original assignee: オンコゲン
Priority date: 1984-10-30
Filing date: 1985-10-23
Publication date: 1987-04-30
Also published as: PH24603A; ES554628A0; NO862613L; PT81408B; IL76866A0; FI862734L; FI862734A0; PH25794A; PT81408A; EP0199769A4; NO862613D0; ES8802074A1; NZ213984A; ES557145A0; ES8801378A1; AU633377B2; ES557708A0; ES8707741A1; EP0199769A1; ES8801379A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】成長因子活性を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸配列光」Ｌ互」Ｌ景光皿皇分団哺乳類細胞から分泌されるかなりの数のポリペプチドが成長因子活性を有することが知られている。これらの化合物は広範囲の哺乳類にわたって実質的に保存されていることが見出されている。これらの化合物には、その発癌性との関連により大きな関心が寄せられている。成長因子の生産がいかにして制御されるか、及び今度はそれらがいかにして細胞活性を制御するかにも関心が持たれている。

ウィルスによる哺乳類細胞の感染が細胞の成長の増進をもたらすことも注目されている。この発明の目的のため、ポックスウィルス科の構成員、例えばバリオラ、ワクチニア、及び特定の疾患と関連するウィルス、例えばショープ線維腫ウィルス、ヤバ腫瘍ウィルス、及び軟属腫伝染ウィルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ　ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ　ｖｉｒｕｓＨＭｃＶ）に特に関心が持たれる。

感染の後細胞増殖を若起するウィルスが、増殖因子として又は増殖因子のりセブターとして作用する増殖因子に関連するポリペプチドを生産するか否かを決定する。ことが興味深いであろう６次に、これらの化合物を、ウィルス作用の研究において、ウィルスの存在についてのアッセイにおいて、培地においてマイトジェントして、そしてウィルス感染を治療するための療法剤の開発において使用することができるであろう。細胞培養物の増殖において、分裂過程の研究において、そして療法において使用するために成長因子の作動薬又は拮抗薬である化合物を開発することも興味深いであろう。

従来技地夏に藍Ｖｅｎｋａ　ｔｅｓａｎ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８２）４４　：　６３７ −６４６はワクチニアウィルス蛋白質をコードする構造遺伝子のＤＮＡ配列決定を記載している。Ｃｏｏｐｅｒ等、前掲（１９８１）３７　：　２８４−２９４はワクチニアウィルスゲノムの末端逆方向反復配列内でコードされるｍ　ＲＮ　Ａの翻訳を報告している。ポック・スウイルス科の構成員についての増殖性疾患が、ショープ線維種ウィルス［５ｈｏｐｅ、　Ｊ、Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、（１９３２）５６：７９．３−８２２］　：ヤバ腫瘍ウィルス（Ｎｉｖｅｎ等、　Ｊ、Ｐａｔｈ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９６１）８１　：　１−１４）　ｉ及び軟属腫伝染ウィルス（ＭＣＶ）　（Ｐｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ　、Ａｒｃｈ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　ｌ１ｅａｌｔｈ（１９７０）　２１　：　４３２−４５ｇ　）について報告されている。上皮成長因子（ＥＧＦ）の記載がＳｃｏ　ｔｔ等、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８３）　２２１：２３６−２４０、及びＧｒａｙ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０３　ニア２２＝７２５中に見出される。ＥＧＦ及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）中の３個のジスルフィド橋の存在がＳａｖａｇｅ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（１９７３）幻影：　７６６９−７６９２により報告されている。さらに、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０７　：５５Ｂ−５６０を参照のこと。

ＥＧＦ分子のりセプター結合領域が第３及び第４システイン残基の間のループ内に存在するものとして示唆されている。

（Ｋｏｍｏｒｉｙａ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＬＩＳＡ（１９８３）８１：、１３５１−１３５５゜〕ワクチニアウィルス成長因子（ＶＧＦ）の新しい記載がＢｒｏｗｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（１−９８５）３１３　：４９１−４９２　；　Ｒｅ１ｓｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３　：８０１−８０３　；及びＢｌｏｍｑｕｉｓｔ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９８４）８１ニア２６３−７３６７に見出される。これらの開示を引用によりこの明細書に組み入れる。　、昆虫細胞中でのバキュロウィルスベクターを用いる外来性ペプチドの発現がＭａｅｄａ等、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５　：５９２−５９４、及びＣａｒｂｏｎｅｌｌ等、Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　（１９８５）５６：１５３−１６０により記載されている。これらの開示を引用によりこの明細書に組みウィルス蛋白質の断片に類似する新規なポリペプチド化合物が提供され、これらの化合物はマイトジェンとして機能し、そして培地中で、成長因子リセブター又は成長因子の存在の検出のための試薬として、並びに形質転換成長因子及び上皮成長因子に対する競争物質として使用することができる。これらの化合物は療法用として使用され、例えば上皮形成並びに熱傷及び創傷の治癒を促進するために使用される。この新規な化合物は合成することができる。この対象ペプチドは、広範囲の種類の宿主において組換技法を用いてオリゴペプチド又は融合蛋白質として形成することができる。

剥ｌｊ１■１慢１哩第１図はワクチニアウィルス蛋白質と既知の成長因子とのアミノ酸配列の比較であり、ここでＶＶＦの最初のアミノ酸は２０位のアスパラギン酸（Ｄ）である。

第２図はアミノ酸４４から妬まりアミノ酸９０で終るワクチニアウィルス蛋白質の断片であり、このポリペプチド断片、ｍ　Ｅ　ＣＦ　−、ｈ　ＥＧ　Ｆ及びｒ ’ＴＧＦにおいて同一の残基は平行斜線が付されている。

立定恵皿盪至附戴上皮成長因子（ＥＧＦ’）又は形質転換成長因子（ＴＧＦ）の作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）又は拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として機能し得る新規な化合物が提供され、これらは細胞培養、診断、インビボｉ法、及び他のペプチド履の組合わせにおける抗体を生産するための免疫原としてのバイブリドポリペプチドの形成において、種々の用途を提供する。目的化合物の発現のための発現ベクターに導入することができるポリヌクレオチド配列を単離することができる。

これらの化合物は、ウィルス蛋白質、特にポックスウィルス蛋白質の断片中に類似性を見る。ポックスウィルス蛋白質は表面膜蛋白質に類似する構造を有する領域を有することが見出される。このポリペプチドをコードする構造遺伝子はリーダー配列及びプロセシングシグナルとして、及びトランスメンプランインチグレーター配列として機能する領域に類似する領域を有し、”リーダニ及びインテグレニタニ配列間に成長因子断片配列を伴う。　′　□ この発明のポリペプチドは架橋を形成するシスティンめ結果として少なくとも１個のループ又はサークル、通常３個のループ又はサークルを有することができることを特徴とし、ここで、成長因子関連活性を分子の生理学的に活性な部分は約１２〜６５個のアミノ酸、通常は１５〜１６個のアミノ酸であろう。

３個のループの内、２個のループはシスティン橋を除き１２〜１５個のアミノ酸（１４〜１７個の環形成アミノ酸）、さらに詳しくは一方は１２個又１３個のアミノ酸（１４個又は１５個の環形成アミノ酸）から成り、そして他方は１５個のアミノ酸（１７個の環形成アミノ酸）から成り、ここでＮ−末端近位ループは通常１２〜１３個のアミノ酸、さらに一般には１２個のアミノ酸から成り、そして中間ループは１５個のアミノ酸から成るであろう。

第３ループ又はＣ−末端ループは８個のアミノ酸（１０個の環形成アミノ酸）から成り、そしてフランキングアミノ酸と共に次の式：この式において、アミノ酸についての１文字の記号はそれらの常用の意味を存し、ここでＣはシスティン、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、そしてＲはアルギニンであり；ＡＩは後でさらに詳細に記載する中性アミノ酸であり、特にＡ　１１は２〜６個、さらに一般には３〜６個の炭素原子を有し０〜１個のヒドロキシル基を有する脂肪族アミノ酸であり、さらに具体的にはセリン、スレオニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、ヒドロキシ置換されたアミノ酸は３〜４個の炭素原子を有し、そして非置換又はアルキル置ａ　ａ　Ｚ　Ｓは、特に３〜４個の炭素原子を有する脂肪族の又は特に９個の炭素原子を有す′る芳香族の中性アミノ酸であって０〜１個のオキシ置換基を有し、例えばアラニン、セリン、スレオニン又はチロシンであり；ａａ２７は中性又は塩基性であって、特に４〜６個の炭素原子を有し、そして中性である場合には０〜１個のカルボキサミド基を有し、例えばアルギニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン又はグルタミンであり；ａａ！９は脂肪族又は芳香族の中性アミノ酸であり、芳香族はヒスチジンにより例示されそして脂肪族は２〜６個、さらに一般的には３〜６個の炭素原子を有し、０〜１個のヒドロキシル基を有し、例えばセリン、スレオニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンであり；ａ　ａ　３　Ｇは脂肪族又は芳香族の中性アミノ酸であり、芳香族の場合にはヒスチジンにより例示されそして脂肪族の場合には３〜６個の炭素原子を有し、水素以外の又は５〜６個の原子の鎖を有し、そして０〜１個のヒドロキシル基を有し、特にセリン、ロイシン及びバリンであり、そしてａ　ａ　２　’ｌとａａ３０は一癲に異っており、そして特に１方がヒスチジンでありそして他方がセリンであり；ａ　ａ、３　％は５〜６個の炭素原子を有する中性又は酸性アミノ酸であり、中性アミノ酸はバリン、ロイシン及びイソロイシンにより例示され、そして酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸により例示され：ａ　ａ　３１１は脂肪族中性置換アミノ酸又は酸性アミノ酸であり、ここで置換基はカルボキサミドでありそして４〜５個の炭素原子を有し、例えばアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；ａ　ａ　２９は芳香族アミノ酸又はヒドロキシ置換基を有する炭素原子３〜４個の中性脂肪族アミノ酸であり、好ましくは芳香族であり、例えばヒスチジン、チロシン、セリン又はスレオニンであり；ａ　ａ　４６は中性非置換脂肪族又は塩基性アミノ酸であり、中性アミノ酸は３〜５個の炭素原子を有し、例えばアラニン、バリン、リジン又はアルギニンであり；ｍ及びｎはＯ又はｌであり：ＰＰ３及びＰＰ’は水素であってポリペプチドの末端を示すか、又は合計１０００個以下、通常合計５００個以下のアミノ酸のポリペプチド鎖であり、好ましくはアミノ酸の９０％以上、さらに好ましくは存在するアミノ酸の約９５％以上が２個のポリペプチド鎖の１個中に存在し；幾つかの場合には、鎖は１個のみのアミノ酸であることができ、そして１００個以下のアミノ酸、しばしば約５０個以下のアミノ酸であり、ポリペプチドの用途及び延長された鎖の役割に依存し；ポリペプチド鎖は、天然成長因子及びポックスウィルス蛋白質と関連する天然ポリペプチド鎖に類似することができ、又は式に具体的に示すポリペプチドと関連する天然鎖又はその断片以外で、通常無関係であることができる。

（非置換とは、グリシン中に存在するアミノ基及びカルボキシル基以外のへテロ置換基が存在しないことを意味する。すべてのアミノ酸は天然り一立体異性体である。）次にアミノ酸の定義を示す。

■（Ｎｅ）脂肪族（ＡＩ）非置換　Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ。

置換芳香族（Ａｒ）非置換　Ｆ。

置換　Ｙ。

複素環　Ｈ、Ｗ　。

ユニ塩基性（Ｂａ）　Ｋ、Ｒ。

酸性（Ａｃ）　Ｄ、Ｅ。

カッコ内の略号は特定のアミノ酸群を意味する。アミノ酸は天然アミノ酸である。

前記の式中、システィン間のループは１個の酸性アミノ酸を有するか又は有さす、好ましくは酸性アミノ酸を有さす、そしてループ外でシスティンに隣接するアミノ酸は少なくとも１個の荷電アミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸を包含し、さらに好ましくは、さらに１個のアミド置換脂肪族アミノ酸を有するであろう。

ループ内のアミノ酸の内、４〜６個、通常５個のアミノ酸は中性の脂肪族アミノ酸であり、そして２個以下、通常２個は芳香族アミノ酸であろう。

ポリペプチドが１３０アミノ酸以下、さらに特定すれば５０アミノ酸以下であって４０アミノ酸以上、好ましくは約４２アミノ酸以上である化合物が特に興味深い。ｖｖＰの第１図に示されるようにアミノ酸４４〜８６個を含むポリペプチドが特に興味深い。

好ましくは、ａａｚ９は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜６個の置換又は非置換脂肪族アミノ酸、特にセリンであり；ａ　ａ　３６は好ましくは、ヒスチジン、セリン、又は炭素原子数５〜６個の非置換脂肪族アミノ酸であり、特にａ　ａ　ｔ　９及びａ　ａ　３０の１方がヒスチジンでありそして他方がセリンであり；Ａｌ’　は好ましくは、１個のヒドロキシル基及び３〜４個の炭素原子を有する置換脂肪族アミノ酸であり；ａ　ａ　３　％は好ましくは、炭素原子数５〜６個の非置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ３８は好ましくは、炭素原子数４〜５個の置換脂肪族アミノ酸であって、置換基がカルボキサミドであり；ａ　ａ　９は好ましくは芳香族であり、さらに好ましくはヒスチジンである。

２個のループが存在し、Ｃ−近位ループが第２ループに連結されており、第２ループのアミノ酸が広範囲に変化し得ることが特に興味深い。第２ループは好ましくはシスティン橋を除き約１４〜１６アミノ酸から成り、さらに好ましくは約１５は７〜９個、さらに好ましくは約８個が置換又は非置換の脂肪族アミノ酸であり、好ましくは約３個以下めが置換されており、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が置換されており；２〜４個の芳香族アミノ酸、さらに好ましくは３個の芳香族アミノ酸、好ましくはヒスチジン及びチロシン・が存在し；２〜４個の酸性アミノ酸、好ましくは３個の酸性アミノ酸、さらに特定すればアスパラギン酸が存在し；そして０〜２個、さらに普通には１個の塩基性アミノ酸、特にアルギニンが存在するであろう。好ましくは、他のループのシスティンに最も近いこのループを構成するシスティンは、０〜２個、さらに普通には０〜１個のアミノ酸、特にアルギニンによりへだてられているであろう。

この発明の化合物について、幾つかの用途のために特に興味あるものは、次の式の化合物である。

ＰＰ’　−ａａ’　−Ｃ−ａａ３−ｏａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’°−ａａ” 　−Ｙ　−Ｃ−ａａＩ′”−ａａ”（ａａ””）、−Ｇ　−ａａ１４−　Ｃ−ａａ”−八ｒ’−ＡＩ”−ａａ”−ａａ”ａ　ａ　ｔ　ｌ　−八ｃ−ａａ”−ａａ ”　−（ａａ！Ｓ−Ｃ−ａａ”Ｃ−ａａ”−ａａコＯＧ　−Ｙ−ＡＩ’　−Ｇ　 −ａａ”　−Ｒ−Ｃ−ａａ””−ａａミコ　、ａ４６）ａａ”　−Ｌ　−ａａ” −ａａ”−ＰＰ”上記の式中、カッコ内の記号’（８８１２ｍを除く）はすでに記載したものであり；ＰＰ１及びＰＰｚは同一であるか又は異っており、水素であって示されているポリペプチドの末端部分を表わすことができ、あるいは合計約１０００個以下のアミノ酸、さらに普通には約５００以下のアミノ酸を有するポリペプチドであることができ、そして合計１個という少数のアミノ酸を有することができ、あるいは個々に又は別々に１〜１００個のアミノ酸、さらに普通には約１〜７５個のアミノ酸、さらに特定すれば約５〜５０個のアミノ酸のポリペプチドであることができ；これらのポリペプチドはあらかじめ定められた目的のため特定して記載された配列を修飾することにおいて特定の用途を有し；ＰＰ１及びＰＰ２は天然ポックスウィルスポリペプチドと同一であるか又は異ることができ、通常異ってあり；＊はワクチニアウィルスペプチド並びにマウス及びヒト上皮成長因子のアミノ酸の保存性を示し、ここでループを定義するシスティン及び他のアミノ酸の列を提供するためにワクチニアウィルスペプチドのアミノ酸５５及び５６の間にスペースが導入されており；ａａ’　は任意のアミノ酸であり、さらに特定すれば脂肪族アミノ酸、塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸であり、好ましくは炭素原子数２〜６個の非置換脂肪族アミノ酸であり、さらに特定すればグリシン及びロイシンであり；定すればグリシン及びプロリンであり；ａａ’は、特に炭素原子数２〜６個の、中性、酸性又は塩基□　性であることができる任意のアミノ酸であり、さらに特定すれば炭素原子数３〜６個のアミノ酸であり、プロリン、アスパラギン酸、セリン及びアルギニンを包含し；ａａ’は酸性又は中性の置換芳香族アミノ酸、特にグルタミン酸、又は炭素原子数３〜４個のヒドロキシ置換アミノ酸、さらに特定すればセリンであり七ａａ’は炭素原子数２〜６個、通常２〜３個の非置換脂肪族アミノ酸、又は芳香族アミノ酸、特にグリシン、ヒスチジン又は千ロジンであり；ａａ’は特に炭素原子数３〜５個、さらに特定すれば４個の酸性又は中性の置換脂肪族アミノ酸、例えばアスパラギン酸及びスレオニンであり；ａａＩ′は炭素原子指数２〜５個、通常２〜３個の、特にカルボキサミドで置換されている（炭素原子数４〜５個）中性非置換脂肪族アミノ酸、例えばグルタミン、特にグリシンであり；ａａ目は、脂肪族又は芳香族、さらに特定すれば脂肪族の特に炭素原子数５〜６個の中性アミノ酸であり、さらに特定すればロイシン又はフェニルアラニンであり；ａ　ａ　ｌ　１は、芳香族アミノ酸又は炭素原子数４〜５個のカルボキサミド置換された脂肪族アミノ酸、特にヒスチジン又はアスパラギンであり；ｐは０又は１であり、ａａ”は、０〜１個のヒドロキシル基を有する、炭素原子数４〜５個の置換又は非置換の酸性アミノ酸又は中性脂肪族アミノ酸、特にアスパラギン酸、スレオニン又はバリンであり；ａ　ａ　Ｉ　＆は炭素原子数４〜６個の置換又は非置換の中性又は塩基性脂肪族アミノ酸、特にイソロイシン、アルギニン又はメチオニンであり；Ａｒ’　は炭素環又は複素環を有することができる芳香族アミノ酸を意図し、そしてヒスチジン、フェニルアラニン又はチロシンを包含し；Ａｌｌ”は炭素原子数２〜６個、好ましくは３〜６個の中性脂肪族アミノ酸、特にアラニン、ロイシン及びイソロイシンであり；ａ　ａ　＋　９は任意のアミノ酸であることができ、特に脂肪族酸性又は塩基性アミノ酸であり、さらに特定すれば４〜６個の炭素原子を有し、さらに好ましくは５〜６個の炭素原子を有し、特にアルギニン、バリン及びグルタミン酸であり；ａ、ｚｏは、置換又は非置換の、３〜６個の、通常３〜５個の炭素原子を有し、０〜１個のヒドロキシル基を有する酸性アミノ酸又は中性脂肪族アミノ酸であり、そしてアスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、又はアラニンであり；ａ　ａ　２１は炭素原子数５〜６個の中性非置換脂肪族アミノ酸又は酸性アミノ酸であり、特に中性脂肪族アミノ酸であり、イソロイシン、ロイシン又はグルタミン酸を包含し；Ａｃは酸性アミノ酸であってアスパラギン酸又はグルタミン酸であり；ａ　ａ　Ｚ　２は炭素原子数２〜６個の中性脂肪族又は塩基性アミノ酸であり、中性の場合には２〜４個の炭素原子及びＯ−１個のヒドロキシル置換基を有し、例えばグリシン又はセリンであり；そして塩基性の場合にはリジン又はアルギニンであり、特にリジンであり；ａａ２４は脂肪族アミノ酸、プロリン又は芳香族アミノ酸、特にチオ置換された脂肪族アミノ酸、さらに特定すればメチオニン、又はチロシンであり；ａ　ａ　４　＋は炭素原子数４〜６個の中性非置換脂肪族又は酸性アミノ酸、特にバリン又はアスパラギン酸であり：ａ　ａ　４２は中性脂肪族又は塩基性アミノ酸、特に置換されていても又は置換されていなくともよい炭素原子数４〜６個の中性脂肪族アミノ酸であり、非置換でもカルボキサミド置換されていてもよく、そしてバリン、ロイシン、アルギニン及びリジンを包含し；ａ　ａ　４４は任意のアミノ酸、特に塩基性アミノ酸以外であり、そして酸性、中性又は芳香族であることができ、芳香族以外の場合には炭素原子数３〜４個であり、特にアスパラギン酸、アラニン、又はトリプトファンである。

ｐｐ’が次の配列を有する場合、特に興味ある。

ＰＰ”　−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−”ａａ−”Ｌａａ−”−ａａ−”−ａａ−”−ａａ−１Ｓ−ａａ −”−ａａ−１３−ａａ−”−ａａ−ａａ−”−ａａ−’　−ａａ−’−ａａ− ’　−ａａ−’−ａａ−’−ａａ−’　−ａａ−”−ａａ−’　−ａａ−’、この式において、ｐｐ”は上記の式中の引き続（アミノ酸記号との組合わせにおいてｐｐ’、’と同等である。

ａａ−Ｘ（ｘは任意の数である）で象徴される１又は複数のアミノ酸は結合であってＮ−末端鎖中のアミノ酸の数を減少するように機能することができる。従って、示されているアミノ酸配列の全部又は部分が存在する。配列の部分が存在する場合、好ましくはその配列は隣接するアミノ酸、すなわち除去を伴わないそれらの番号順のアミノ酸を含む。通常、少なくとも１個のアミノ酸、さらに普通には少なくとも３個のアミミー’等に連結されるであろう。

ａａ−’は任意のアミノ酸であることができ、炭素原子数３〜６個の好ましくは中性又は塩基性の脂肪族アミノ酸であり、さらに特定すれば炭素原子数５〜６個の中性又は塩基性アミノ酸であり；ａａ−”は脂肪族又は芳香族の任意のアミノ酸であり、特に脂肪族であり、さらに特定すれば炭素原子数約４〜６のものであり；ａａ−”は脂肪族又は芳香族、特に脂肪族、極性又は非極性で、炭素原子数２〜６個、通常２〜５個であり、一般に０〜１個のヒドロキシル置換基を有し；有し、そして極性又は非極性であることができ、特にプロリン及びアスパラギンであり；ａａ”　’は任意の脂肪族アミノ酸であり、特に中性又は塩基性アミノ酸であり、さらに特定すれば約４〜６個の炭素原子を有し、好ましくは脂肪族中性アミノ酸であり；ａａ−’は炭素原子数約３〜６、さらに９ｉｍには約４〜６個の脂肪族アミノ酸、特に酸性又は脂肪族、特に酸性であり；ａ　−？°−８°−１１＋ −１５＋−＋６°−７″−２３及び−ｔ７は、炭素原子数３〜５個の、極性又は非極性の、特に極性の、０〜１個のヒドロキシル置換基を有する脂肪族アミノ酸であり；ａ　−９・−２０・−２３及び弓５は、炭素原子数２〜６個、さらに普通には２〜３個の非極性脂肪族アミノ酸であり；ａ　伺６及び−２′は、炭素原子数４〜５個の、特にカルボキサミド置換基を有する極性脂肪族アミノ酸であり；ａ　ａ−１１・−１４及び−１９は炭素原子数２〜６個、さらに特定すれば４〜６個の脂肪族アミノ酸であり；ａａ−１ｆｆ・−１８及び−２４は、脂肪族酸性アミノ酸であり；そして、ａ　ａ−２６は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニンである。

ａａ−’〜ａ　ａ−２４及びａａ−’〜ａａ−’、さらに特定すればａａ−’〜ａａ−’のＮ−末端断片が特に興味深い。ｐｐ”は便利には、特に、ＶＧＦ及びその類似物、例えばＥＧＦ及びＴＧＦ−αに対する抗体の住産のための免疫原としてＶＧＦをもたらすための融合蛋白質として機能する無関係アミノ酸配列である。

この化合物の第１の観点は、カッコ内の、特に２８位のシスティンと３７位のシスティンとの間の配列、並びに２位と１０位のシスティン及び１５位と２６位のシスティンによって生ずるループである。従って、好ましくはこの化合物は、１５位及び２６位のシスティンにより生ずるループに隣接した、２８位と３７位のシスティンにより生ずるループを有する。

１つの断片として１つの配列のＣ−末端部分を用い、第２断片として他の配列のＮ−末端部分を用いてポリペプチド配列の種々の組合わせを調製することができ、これにより約４０〜６５アミノ酸のポリペプチドが、通常約５０〜６０アミノ酸のポリペプチドがもたらされる。好ましくは、ａａｇｏとａ　ａ　ｔ　？の間、特にａ　ａ　２６〜・ａ　ａ　ｔ　Ｓのある点において連結されるであろう。

好ましくは、配列Ｃ−Ｘ−Ｃ（ここでＸは任意のアミノ酸である）から５個を超えないアミノ酸の部位において連結される。各場合において、システィンのフレームワーク構造は、前に記載したサイズのシスティン橋を伴って維持される。そして、１つの断片は、任意（７）ＥＧＦＳＴＧＦ、ＶＧＦ　（他の成長因子と構造的相同性を有するワクチニアウィルスの部分であり、そして第２図に示される）、又はこの化合物と同じフレームワーク構造を有しそして類似の生理学的活性を有する他の成長因子から採用することができる。これは、哺乳動物源、例えば霊長類、例えばヒト、１歯動物、例えばラット及びマウス、ウシ、鳥類、ブタ等に関係ないであろう。

ａａ！６は化合物の２０番目のアミノ酸を意図せず、特定的に定義された特定の配列のアミノ酸を意図するから、断片は一般に約１０〜５０個、通常１５〜４５個のアミノ酸から成るものであろう。

ＶＧＦが変形されており、ここでＶＧＦがチロシンについて置換されたアラニンを有し、ｍｌ制限部位が導入されている場合が特に興味深い。これは、ＶＧＦ遺伝子からの１つの断片を他の増殖因子からの断片に連結するための便利な部位を提供する。言うまでもな（、なんらのアミノ酸の変化も伴わないで完全な配列を合成することができよう。すなわち、この発明のポリペプチドは市販のペプチド合成機を用いる便利なポリペプチド合成技法に従って合成することができる。

この発明の化合物はグリコジル化されていなくても、又はされていてもよい。特定のアミノ酸配列に依存して、１又は複数のグリコジル化部位が存在することができ、通常６個以下、さらに普通には３個以下のグリコジル化部位が存在することができる。グリコジル化部位はグリコジル化されていても、又はされていなくてもよい。サツカライドは、活性ポリペプチドの合計分子量に、６　ＫＤａｌ　（キロダルトン）以下、普通約５ＫＤａｌ以下を加えるであろう。関与する糖はマンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクチュロン酸、シアル酸等であろう。

この発明の化合物は、成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、及び形質転換成長因子（ＴＣＰ）、特にＴＧＦ・−■の作動薬又は拮抗薬としてインビトロ及びインビボでの広範囲の種類の用途を有する。

細胞の増殖及び他の活性を制御するための、それ自体で、又は他の化合物、特にポリペプチド化合物との組合わせにおいて使用される成長因子の検討は、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆハ１肛力駐ｎｔａｌ　Ｐｈａμすμ佳郊Ｌｊ士徂胚−叶 μｄＬヱ匹上ＩＲａｓｅｒａｇａ　編、Ｖｏｌ、５７、スプリンガー−フェルラーク、ベルリン、　１９８１　、第３章、特に９Ｂ−１０９頁；及びＣａｒｐｅｎｔｅｒ＋Ａｎｍ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９７９）４２し１９３− ２１６中に見出される。

ｈＥＧＦはヒトウロガストロンと同一のようである。ＥＧＦは胎児期及び新生先制の組織の成長に種々の効果を発揮することが見出されている。これらの効果の内、早発性開眼、創傷の治癒、門歯の前出、及び肺の成熟の促進が挙げられる。

ＥＧＦリセプターは広範囲の種類の成人組織に見出される。

ＥＧＦはそれ自体のりセプターのリン酸化を促進することが見出される。ＥＣＦはまた、増加した骨吸収に関連することも見出される。

形質転換成長因子、特にＴＧＦ−１又はＴＧＦ−αはＥＧＦのそれに類似する多くの活性を有する。ＴＧＦはＥＧＦリセブターに結合して該リセプターのリン酸化、そのトリプシン−特異的キナーゼ活性の増強及び細胞増殖の刺激を導く。

Ｃｏｈｅｎ、Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅｓ　ｏｎｓｅ　Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ（八ｕｇｕｓｔ、　Ｊ、Ｔ、　編）　、アカデミツク、ニューヨーク、１９８３　。

７−１２頁；　Ｔａｍ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９　：　３７６−３７８　；　Ｉｂｂｏｔｓｏｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８３）２２１　：　１２９２−１２９４゜この発明の化合物は、ＥＧＦの作動薬としての、及び創傷の治癒、例えば創傷の上皮形成、例えば熱傷、眼創傷、外科切開の上表形成等のための薬剤として特定の用途を有する。

活性成分は、便利なビヒクル、例えばシルバデン（Ｓ　ｉ　１ｖａｄｅｎ）中で、約０．０１〜０．５、通常約０．．０７５〜０．２　ｐ　ｇ　／　ｍ　ｌの量で使用することができる。製剤により創傷が完全にコートされるように、製剤は創傷上に広げられる。創傷の種類、治療に対するその反応、活性成分の濃度等に依存して、治療は１日４回という頻繁さで行われ、又は隔日もしくはそれより低い頻度で行われる。

この発明の化合物は診断アッセイにおける試薬として、又はポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のごとき試薬の調製のために使用され得る。試薬として、これらは類偵の成長因子の検出のため、又は血液のごとき生理学的流体中の成長因子に対する抗体の検出のために使用することができる。

試薬の目的及び特定の処方に依存して、ポリペプチドはラベルされていても、ラベルされていなくてもよい。直接的又は間接的に検出可能なシグナルをもたらす種々のラベルが使用されているにれらのラベルは、放射性核種、酵素、螢光物質、粒子、化学発光物質、酵素基質又はコファクター、酵素阻害剤、磁気粒子等を包含する。例えば米国特許、隘３．６５４，０９０　、隘３．８１７，８３７　、嵐３．９３５，０７４　、隘３．９９６．３４５、ＮＨ３，２７７，４３７、Ｎ［１４，３７４，９２５，１ｌｈ４，３６６．２４１を参照のこと。

ラベルをポリペプチドに連結するための種々の方法が存在し、これらは、他のアミノ基を保護しながらＮ−末端アミノ基を用いてピラゾロンに官能化することを含み、次にこのピラゾロンは種々の試薬、例えばアミノ基と接触して検出可能なシグナルを発生する成分に連結する。第３ループと関連するか又はその近位にあるアルギニンを保護し、他のアルギニンを官能化して既知の方法によりアミノ基又はチオ基への接合のために官能化することができる。別の方法として、ポリペプチドを活性剤、例えば活性化されたカルボン酸と接触せしめ、そしてランダムに置換し、ランダム置換の結果として生物学的に不活性な物質から生物学的に活性な物質を選択することができる。最後に、合成法に依存して、所望の機能を提供するために合成手順の部分としてポリペプチドを修飾することができる。

この発明の化合物はまた、ＥＧＦリセプターをモニターするためにも使用することができる。この発明の化合物は又、ＥＧＦ及び／又はＴＧＦに対する細胞性反応を、これらの天然物質及びこの発明の物質との間の競争を提供することにより、モニターするために使用することができる。こうして、リセフターコンホーメーションの変化をモニターすることができる。

使用されるこの発明の特定の化合物及び添加剤の目的に依存して、インビトロでの使用のため、活性の変化、異る目的及びリセプターの相違に基き、添加剤の濃度は広く変化するであろう。

この発明の化合物は又、成長刺激又は骨形成の調節を含む、種々の療法目的のためにも使用することができる。これらの化合物は、適当な住理学的担体中で、腹腔内に、皮下に、静脈内に、動脈内に、又は注目の部位への適用により投与することができる。さらに、この発明の化合物は、部位指向のための抗体の使用を含むか又は含まないリボゾームへ導入することができる。種々の担体はリン酸緩衝化塩溶液、塩溶液、水等を包含する。添加物の濃度はその最終用途及び活性に依存して広く変化するであろう。

製剤中に他の添加物、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ、他の成長因子、殺菌剤、例えば抗生物質、静菌剤、緩衝剤等を含有せしめることができる。

抗体を調製するためには、ｐｐｌ−４が水素又は短いオリゴペプチド鎖（５アミノ酸より少い）のこの発明のポリペプチドを、哺乳類宿主に注射するために抗原ポリペプチド又は蛋白質に連結することができる。抗原蛋白質は約６０個以上のアミノ酸を有し、そして通常１０キロダルトン（ＫＤ）以下であろう。２官能試薬、例えばｐ−マレイミド安息香酸、グルグルアルデヒド、ｐ、ｐ’−ベンジジン等を用いて、ポリペプチドに特定の部位において、又はランダムに連結するための多数の技法が存在する。一般の抗原性蛋白質にはウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン、破傷風毒素等が含まれる。この発明のポリペプチドは、所望の免疫原反応をもたらすために十分な数で抗原蛋白質に連結される。通常これらは最初の注射後の２回以上の追加免疫注射である。

抗血清のためには、免疫感作された宿主から血液を取り出し、そして免疫グロブリン画分を単離する。モノクローナル抗体のためには、肺臓を単離し、そして常法に従って肺細胞を適当な融合パートナ−と融合せしめる。次に、得られるハイブリドーマを、この発明のポリペプチドのエピトープ部位に結合する抗体についてスクリーニングする。これらの抗体を種々の目的、例えば診断試薬、療法等のために使用することができる。抗体は試験として使用される場合、ポリペプチドについて記載したようにラベルされ又はラベルされない。

この発明の化合物は化合物のサイズに依存して種々の方法で製造することができる。特に約８０以下、さらに特定すれば約６０以下のアミノ酸の場合、この化合物は常法に従って合成により製造することができる。例えば、Ｍｅｒｒｌｆｉｅｌｄ　。

５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、　”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ。

５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　、　５ｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔ−ｈｅｓｉｓ　、　Ｐａｒｔ　Ａ　、　Ｖｏｌ　２　、Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｎｈｏｆｅｒ　４９、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８０．１−２８４頁を参照のこと。さらに、米国特許１１ｈ４．１２７．５２６を参照のこと。

他の方法として、バイブリドＤＮＡ技法を用いることができ、この場合所望のポリペプチド又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列を使用することができる。

ＤＮＡ配列は常用の技法を用いて、例えば−緒に連結されて所望のコード配列を規定するオーバーランプする単鎖を用いて合成することができる。末端を制限部位をもたらすように設計することができ、又は１端もしくは両端を、発現ベクターの相補端への連結のために平滑末端化することができる。

配列の発現のため、最初のメチオニンが与えられる。発現ベクターは一般に入手可能であり、そして文献中に十分に記載されている。

構造遺伝子を合成する代りに、ポックスウィルスを単離し、そして種々の技法により成長因子を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡを単離し、このｍ　ＲＮ　Ａを逆転写し、生ずる単鎖（ｓｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａを鋳型として用いて２本鎖（ｄｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、そしてこのｄ、ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａを単離する。次に、この遺伝子を種々の方法により操作して不所望の非翻訳領域又は不所望のコドンを例えばプライマー修復、インビトロ変異誘発を用いて除去し、１又は複数の部位に制限部位又は異るアミノ酸を導入し、又はベクターに導入し、次に制限処理し、そしてエキソヌクレアーゼ消化して末端塩基を除去する。こうして、遺伝子を所望の数のコドンに減少せしめることができる。

便利な制限部位がコード領域内にある場合、このコード領域を制限処理し、そして、このコード領域を所望のフランキング領域、例えば融合蛋白質をもたらすためにこの発明のポリペプチドに連結すべき外来性ポリペプチドをコードする他のコード領域に連結するためのアダプターを用いることにより、失われたヌクレオチドを置換することができる。

成長因子配列をコードするＤＮＡをＡｌｕｌ及び旦匹■による開裂によりｖｖゲノムから切り出して１９０ｂｐ断片を得る。

発現ベクターは転写及び翻訳制御開始及び停止シグナル領域により特徴付けられ、ここで、オーブンリーディングフレームを存するＤＮＡ配列がこれらの間に挿入され、そして該シグナルの転写及び翻訳制御のちとにおかれるであろう。さらに、発現ベクターは、発現ベクターを有する宿主の選択及び宿主中での発現ベクターの維持を可能にする１又は複数のマーカーを有するであろう。

転写開始は、温度の変化、化学物質等による誘導制御にゆだねられるで、あろう。こうして、所望の生成物の生産の開始に先立ち宿主細胞を高密度に増殖せしめることができる。

さらに、１又は複数の複製系が存在することができる。染色体外維持のため、発現のために使用される宿主中で機能する複製系を有することが必要であろう。宿主が細菌以外のものである場合、プラスミドの利用可能性を増大しそして精製及び特徴付けを一可能にするために、細菌中でのクローニングを可能にする第２の複製系を有することがしばしば望ましいであろう。

広範囲の種類の原核性又は真核性宿主を使用することができ、これには原核性及び真核性の両者を含む単細胞微生物、冷血及び温血の真核生物、例えば昆虫及び哺乳類等が含まれる。遺伝子の発現のために異る造成物を用いることにより、該造成物を異る宿主に導入することができる。同−又は異る糖による種々の程度のグリコジル化をもたらすことにより、又は非グリコジル生成物をもたらすことにより、宿主は異る生成物を提供するであろう。通常、グリコジル化はＶＧＦ配列中に存在する１個以上、通常は２個以上のグリコジル化部位において生じ、この場合、グリコジル化のためには少なくとも１つの糖が付加され、そして通常約６ｋＤａ１以下の糖、通常約４ｋＤａ１以下の糖、しばしば約２ｋＤａ１以下の糖が付加されるであろう。

好ましくは、この発明においては、真核細胞、特に哺乳類細胞における分泌、及び他の成熟過程、例えばグリコジル化を得るために、この発明のポリペプチドと共に天然に存在するリーダー配列を用いることができる。すなわち、天然に存在する分泌リーダー及びプロセシングシグナルに連結されている、この発明のオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列（この発明のＤＮＡ配列それ自体として、又はこの発明のオリゴヌクレオチドに天然に連結されていない外来性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合している）を用いて、適切な真核宿主中の分泌リーダープロセシングシグナルの同時的除去を伴ってこの発明のポリペプチドの分泌を得ることができる。他の方法として、リーダー及びプロセシングシグナルが意図する発現宿主中で機能しない場合、このリーダー及びプロセシングシグナルを、意図する発現宿主により認識されるリーダー及びプロセシングシグナルにより置換することができる。

宿主ゲノムへの組込が好ましい場合、安定な複製系は不要である。通常、注目の配列の周縁に宿主ゲノム中に存在する配列と相同な配列が存在し、組換の可能性を増大せしめるであろう。好ましくは、マーカー、特に増幅を可能にするマーカー、例えばメタロチオネイン、ジヒドロホレートレダクターゼ、又はチミジンキナーゼを発現する遺伝子が含有され、その結果挿入配列が維持されるのみならず増幅される。

この発明のポリペプチドは、免疫原反応の誘導、細胞増殖の増強、創傷の治癒、等のために種々の宿主と共に使用されよう。創傷のためには、上皮形成及び血管新生、並びに創傷の強さの回回復、すなわち分離又は裂けに対する抵抗性が観察される。宿主は哺乳類、例えば１歯動物、家畜、霊長類及びヒトを包含する。

次の例は限定的にではなく、例示的に与えられる。

実−辰２６７６配列のＤａｙｈｏｆｆ蛋白質配列ライブラリを、蛋白質同定資源（ジョージタウン、ワシントンＤＣ）から磁気チーム上に得、そしてラットＴＧＦ　（ｒＴＧＦ）に関連する配列について調べ、この場合、３つの最も密接に関連する配列はマウスＨＧＦ　（ｍＥＧＦ）（Ｓｃｏｔｔ等、　１９８３　、前掲；　Ｇｒａｙ等、　１９８３　、前掲）及びヒトＥＧＰ（ｈＥＧＦ）　（Ｇｒｅｇｏｒｙ等、　Ｔｎｔ、Ｊ、Ｐｅ　ｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、（１９７７）　９　：１０７−１１８）　（これらはヒト、マウス及びラットＴＧＦに類似することが知られているＭａｒｑｕａｒｄｔ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｆ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＋。

匹Ａ　（１９８３）観：　４６８４−４６８８　）　、及びワクチニアウィルスゲノムによりコードされている１４０残基のポリペプチドの残基４５８５　（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ等、１９８２、前掲）であった。ｖＶポリペプチド、ｒＴＧＦ、ｍＥＧＦ、及びｈＥＧＦの整列を第１図に示す。観察される相同性はＦｉｓｈｅｒの精密試験により０．００３０１未満の機会に基く確率を有する。

ｖｖペプチドは、Ｎ−末端近くの残基５及び１５の間、並びにＣ−末端近くの残基ｌＯＯ及び１２４の間に電荷を有しない疎水性残基を有する。これらの残基は内在性膜グリコプロティン（＋ｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）との類イリ性により、翻訳直後又は翻訳中に蛋白質分解的に除去されるＮ−末端疎水性シグナル配列、及び成熟蛋白質を膜内につなぎ止める機能を有するＣ−末端トランスメンプラン配列を有するものと考えられる。ａｒｇ −４３及びａｒｇ−９０におけるウィルスポリペプチドの開裂は可溶性ポリペプチドの放出をもたらすであろう。

１４０残基のｖＶポリペプチドはシグナルペプチドの除去の後にまず約１２０残基の膜結合蛋白質になり、そして次に約４７残基の再審性成長因子ペプチドになると想像される。

次のＤＮＡ配列をＥ、コリ宿主での合成及び発現のために設計した。配列は主として細菌に好まれるコドンを用いるように設計した。配列は幾つかの有用な制限部位を含有し、少数が示されている。このＶＧＦ配列は口ＧＭＹＣＲＣではな（ＤＧＭＡＣＲＣである点において天然配列と異る。引き続くキメラ配列は、１旦Ｈｆｆ及び盈ｄｉ部位並びに５正ｕ及び旦ａｍＨｒ部位により結合される２本の断片を合成し、そしてこれらの断片を変形されたＴＧＦ又はＶＧＦ構造遺伝子を含有するプラスミドベクターに連結することにより調製される。

へ４ヒ　ＴＧＦ′　云− 人　ヒトＴＧＦ　ＶＧＦ’云ＴＧＦ νＧＦ会裁ｙ四ロジＪｋ玉合成ＶＣＦ遺伝子は次の断片から調製される。

鋤Ｉ　Ｂ＜遼ＲＩＶＣＳＨＧＹＴＧＶＧＦｓｌ　５’　ＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＧＶＧＦｓ２　３　’　ＧＴＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＴＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＴＡＡ臆ＲＩ　止ｃＩＩ　現■ＩＩＩＴＲＣＱＨＶＶＬＶＤＹＱＩ？＊ＶＧＦｓ３　５　’　八ＡＴＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＴＴＡＡＧＶＧＦｓ４　３’　ＧＣＡＡＣＧＧＴＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＡＧＶＧＦ遺伝子を常法に従って集成し、そして適当な発現ベクターに挿入するために使用し、Ｎ−及び／又はＣ−末端を延長するために他の断片に結せしめる等を行うことができる。

天然旦旦１夏華蓋ＩＩ立　びウィルス尾長揃目（Ｃｅｒｃｏｐ　ｉ　ｔｈｅｃｕｓ）モンキーの腎臓（ＩＩＳＣ−１）細胞モルレーヤーを１０％のウシ胎児血清を補給したイーグルの基礎培地中に維持した。ＶＶ（ＷＲ株）をｌ１ｅｌａ細胞中に増殖せしめ、そしてシュークロース密度匂配沈降により精製した（Ｍｏｓｓ、Ｂ、　、（１９８１）Ｇｅｎｅ　Ａｍ　１ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌ　ｓｉｓ　。

Ｃｈｉｒｉｃｋｊｉａｎ　、　Ｊ、Ｇ、及びＰａｐｉｓ　、　Ｔ、Ｓ、１Ｊ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−１１ｏ１１ａｎｄ　、ＮＹ）　＋νｏｌ　２　、２５３−２６６頁〕。

１１５Ｃ−１細胞モル−ヤーを細胞当り１５プラーク形成ユニツト（ｐｆｕ）の精製されたウィルスで感染せしめ、そして２×１０’細胞当り１ｍｌのイープル基礎培地（２％ウシ胎児血清を補充）と共にイシキュベートした。Ｍｏｃｋ−感染細胞を同一の方法で処理した。細胞培養上清を低速遠心により透明にし、そして凍結乾燥した。次に、残渣をＩＭ＃酸中に再懸濁し、そして０．２　Ｍ酢酸に対して十分に透析した。不溶物を遠心分離により除去し、そして上清を凍結乾燥し、そしてもとの容量の１００分の１の１Ｍ酢酸に再懸濁し、そして４℃にて貯蔵した。

り０？）グラじ竺仁二１Ｍ酢酸中で平衡化したビオ−ゲルＰ−１０（ビオ−ラド）のカラム上でゲル濾過を行った。）ＩＰＬＣによるサイズ分離は２個のビオーシルＴＳＫ−２５０カラム（ビオ−ラド）を直列に使用した。

一ジ第１セプター・ア・セイＡ４３１細胞のモルレーヤー上のりセプターへの１２５■−ラベルＥＧＦ（”Ｊ −ＥＧＦ）の結合を、Ｃｏｈｅｎ及びＣａｒｐｅｎｔｅｒ　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７５）７２　：　１３１７−１３２１により記載された方法から変更した。測定に先立ち、細胞（ＩＸＩＯ”／ウェル）を２４−ウェルブレー１・（リンプロ、フロラ・ラボラトリーズ）上に、リン酸緩衝化塩溶液中１０％ホルマリンにより固定した。ホルマリン固定された細胞は未固定の細胞に比べてプレートから容易に脱落せず、そしてそのために反復値は一層一貫している。これらのアッセイ条件下で、＋２５７　ＥＧＦ（ＩＸＩＯ’°ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌ）は３ｎＭにおいて結合アッセイを飽和する。アッセイは１０％の飽和値において行った。ＴＧＦ及びＶＧＦの濃度はｍｌ当りＥＧＦのｎｇ当量、すなわち既知量のＥＧＦにより生ずるそれと同等の”’Ｉ−ＥＧＦ結合の阻害を生じさせるために必要な量として表現される。

ラジオイムノアッセイ各５０μβの反応物は次のものを含有した：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、２００ｎ　Ｍ　Ｎａｃｌ　、　４０　ｍＭジチオスレイトール、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＮａＮ　ｚ、Ｔ　Ｇ　Ｆ　−Ｃｒ　（Ｌｉｎ５ｌｅｙ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８５）１：５０００での抗血清、及び特定された他の添加物。反応を抗血清の添加により開始し、そして２３℃にて９０分間継続した。次に、同容量の１０％ホルマリン固定したＳ、アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）　（パンソルビン、カルビオチム）を加え、そして２３℃にてさらに３０分間インキュベーションを続けた。

免疫吸着体を沈降によって取り出し、そして結合した１２５１−ラベル化ペプチドの量を測定した。抗体の非存在下で測定された非特異的結合（合計の５％未満）について補正された結合ペプチドの量を最大結合に対する％として表現した。

己ＤＮＡ人　アッセイ新生児包皮の移植組織から得られた２倍体ヒト線維芽細胞を、ウェル（９６−ウェルプレート、ヌクロン、ロスキルデ、アンマーク）当り３Ｘ１０’細胞の密度で接種し、そしてドルベコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）／　１０％新生児ウシ血清中でコンフルエンシーまで増殖せしめた。次に、培養物を、０．２％新生児ウシ血清を含有する培地に入れ、そして２日後にＥＧＦ　（１０ｎｙｘ／ｍＪ　）又はＶＧＦ　（ｍ／！当りＥＧＦ　１０ｎｇ相当）を加えた。８時間後、培養物を５−　［：ｌ２ｓＩ）ヨード−２′−デオーキシウリジン（アメルシャム、１０μＣｉ／ｍｊ！。

５　Ｃｉ／■；　ＩＣ１＝　３７ＧＢｑ）でラベルし、そしてトリクロロ酢酸不溶性物質中に導入されたアイソトープの量を記載されている（Ｖａｎ　Ｚｏｅｌｅｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、（１９８４）８１　：　４０８５−４０８９　）ようにして決定した。

猪−来ｖｖによる感染の後２４時間のＢ１０−１細胞からの培地を、Ｅ、　Ｇ　Ｆリセプターーリフチヒト類表皮癌細胞（Ａ４３１）への結合について”Ｊ−ＥＧＦと競争することができる物質の存在について試験した。ｖｖ−感染した細胞はＥＧＦと競争する高い活性を放出し、この活性をＶＧＦと命名する。Ｍｏｃｋ−感染したＢ１０−１対照培養物からの対照培地はＥＧＦとの競における最小活性を含んでいた。

試験した最も早い時点、すなわち感染後２時間において、ＶＧＦ生産をモニターした場合、高レベルのＶＧＦが培地中に観察された。、１２時間までに、この活性の最大値が培養上清中に見出され、２４時間ではわずかな増加が見られるに過ぎなかった。

次の第１表により示されるように、ＥＧＦ’生産のレベルはウィルス感染量の増加の関数であった。

男−」−一表ＶＧＦの放出に対する感染量の増加の効果Ｂ５Ｃ−１細胞の培養物に示されているｐｆｕ：細胞比で感染せしめ、そして上清（約１　ｍ！！、／　２　ｘｌＯ６細胞）を感染の２４時間後に収得した。各サンプルを酸性化し、凍結乾燥し、そして記載されている（Ｄｅｌａｒｃｏ及びＴｏｄａｒｏ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９７８）７５　：　４０１−４０５　）ようにしてＥＧＦについて２連のラジオリセブターアッセイにおいて試験した。ｎｇ　ｅｑ、はナノグラム相当。

ヱエ」」鎚七撞逢説ｖｖ−感染Ｂ５Ｃ−１細胞中に見出されるＥＧＦと競争する活性を、上記の感染後２４時間の酸抽出された培養上清から部分精製した。上清からの酸可溶化ポリペプチド（１０，５ｍｇ）を１Ｍ酢酸で平衡化されたビオーゲルＰＩＯカラムに適用し、そして各両分のサンプルをＥＧＦと競争する活性について試験した。主たる活性ピーク（画分４２）はＭｒ２９．０００のカルボニックアンヒドラーゼマーカーのわずかに後に、２５，０００の目かけＭｒをもって溶出した。分子量を、タンデムに連結されたビオ−シルＴＳＫ−２５０１１ＰＬｃサイズ分離カラムを用いることにより確認した。すべての活性は主たるピークとしてＭｒ２５．０００蛋白質マーカーの領域中に溶出した。部分精製されたＶＧＦの１μｇは、ラジオリセプター競争アッセイにおいて９０ｎ、ｇのＥＧＦと同等であった。

ＶＧＦとＴＧＦの　ゞ前記のラジオイムノアッセイにおいて、＋２Ｊ−ラベル化ＴＧＦ−αがＴＧＦ− ｆｆと競争し、ＥＧＦ約０．２〜０．３　ｎｇ相当の抗原濃度において、ラットＴＧＦ−α分子のカルボキシ末端１７アミノ酸に対する抗体からの抗原の５０％の排除（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が観察される。ＶＧＦを相当する濃度で試験した場合、競争は観察されなかった。天然ＥＧＦについての競争的ラジオイムノアッセイにおいて、ＶＧＦＩＩ製物は５０ｎｇ／ｍＪのＥＧＦ相当量で試験された場合でさえ、天然ＥＧＦに対するポリクローナル抗体からの”’Ｉ−ＥＧＦの最少（ＬＩＯ％）の排除（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を示した。

ＶＧＦの生　・′　主細胞当り１５ｐｆｕのｖｖで感染されたＢ１０−１細胞により生産されるＶＧＦのレベルと、レトロウィルスで形質転換された細胞により生産されるＴＧＦ−α のそれとの比較を次の第２表に示す。

】工」し−表ＶＧＦとＴＧＦ−α及びＥＧＦとの生物学的活性の比較無　し　１　、７７９　＜２０ＶＧＦ　２．３　３．７６０　１０８ＴＧＦ−α　０，２　ＮＴ　２９４Ｅ　ＣＦ　８．４８２　３４６ＮＴ：試験せず。

（１）ＶＧＦ（蛋白質ｕｇ当りＥＧＦ９０ｎｇ相当（ｅｑ、））はゲル濾過及びそれに結＜Ｃ＋ａμボンダバック（ウォーターズ・アソシエーツ）カラムからの溶出により精製した。ＴＧＦ−αはＳＭａｒｑｕａｒｄｔ等５Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８３）８０：　４６８４−４６８８に記載されているようにして、５ｎｙｄｅｒ−Ｔｈｅｉｌｅｎネコ癌ウィルスが感染したＦｉｓｈｅｒラット胚細胞から精製し；ＥＧＦはマウス下顎腺から精製した（　Ｃｏｈｅｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（１９８０）益５　：　４１８３４−４１８４２　）。

（２）ＥＧＦ相当量の決定は、記載されているような標準的＋ｚｓＩ−ＥＧＦ結合競争曲線に基いた。

（３）マイトゼネシスアフセイは記載された通りであった；２倍体ヒト線維芽細胞の静置培養物にｌＱｎｇ１ｍｊ！の精製されたＥＣＦ、又は同じＥＧＦ相当量数のＶ　Ｇ　Ｆ　／　ｍβを与えた。組み込まれた〔１ｚｓＩ）ヨードデオキシウリジン（（”Ｊ）　ＩｄＵ）の値は３連の決定の平均を示す。

（４）ソフトアガーコロニーの数は、精製されたＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＪ）又は同じＥＧＦ相当量数のＶＧＦ／ｒｒｌ及び２．０ｎｇのＴＧＦ−β／ｍ２　〔ヒト血小板からへ５ｓｏｉａｎ等、前掲（１９８３）２５８　：　７１５５−７１６０に記載されているようにして精製〕を接種した後１０日口の、６個のランダムな低倍率視野当り、最少２ＯＮＲＫ細胞を含有するコロニーの平均数を示す。上記のＴＧＦ−βのみにより処理されたＮＨＫ細胞のプレートはコゲル濾過カラムからのプールされた両分（２５−３５）を真空遠心により濃縮し、０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中に再懸濁し、清浄にし、そして３．９　龍Ｘ　３０　ｃｍのボンダパックＣｔａカラム（ウォーターズ、ミリホールド、ＭＡ）に注入した。ペプチドを、０．０５％ＴＦＡ中２０〜６０％のアセトンの直線グラジェントにより１．０ｍ！！／分の流速にて２２℃において溶出した。各画分のアリコートをＥＧＦ−競争活性についてラジオリセプターアッセイにおいて測定した。ピーク活性に対応するペプチドを集め、そして０．０５％ＴＦＡにより稀釈し、そしてμボンダパックカラムに再注入し、そして同一条件を用いて溶出した。アセトニトリル濃度は約２２〜２５％であった。

ＶＧＦのアミノ　ｒ配置上記のようにして、ワクチニアウィルスに感染したモンキーの細胞から精製されたＶＧＦ　（１８ｐ　ｍｏｌｅ）をモデル４７０Ａ蛋白質シーケンサ−（アプライド・バイオシステムス）中での自動反復エドマン分解にかけた。フェニルチオヒダントインアミノ酸をｒｐＨＰＬｃにより分析した。

アミノ末端アミノ酸配列は次の通りであった。

Ｄ−３−Ｇ−Ｎ−Ａ−１−Ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−２−１−Ｘ−Ｎ−Ａ（Ｘは未同定残基である。）これらのデーターとワクチニアウィルスのＤＮＡ配列から推定されるそれとの比較により、ＶＧＦが一次翻訳生成物の２０位の残基のアスパラギン酸から始まることが示される（第１図）。

ＴｒＥ虫人　としてのＶＧＦの３ら１ワクチニアウイルスの初期領域の部分を含有するプラスミドであるｐＶＧ３はＢ、Ｍｏｓｇ（ＮＩＨ）から入手可能である。２６０ｂｐ旦旦３Ａ１−且匹■断片を、旦憇旧及び並順ｄｌ［１部位を用いてＴｒｐＥ発現プラスミドｐＪ旧４に挿入した。組換プラスミドをトランスフェクションによりＥ、コリに導入し、そして組換蛋白質の発現をインドール酢酸により誘導した。融合蛋白質を細菌から精製し、そしてＶＧＦ配列を酵素ＬｙｓＣを用いる消化によって切り出した。消化物はラジオリセプターアッセイにおいてＥＧＦと競争することが示された。ワクチニアウィルスに対するラビット抗血清は、これらの細胞の溶解物からの１０ｋＤａｌ及び２５ｋＤａｌのポリペプチドを沈澱せしめる。

ＥＧＦリセプター結合活性は約１１０ｎｇ　ｅｑ、／ｍｇ蛋白質であることが見出された。比較のため、酵母において発現されるＴＧＦ−αは１１５ｎｇ　ｅｑ、／ｍｇ蛋白質である。

バキュロウィルスベタ　−を　いる、　でのＶＧＦのｂ１ＶＧＦ組換蛋白質を発現するために使用される追加の発現系は昆虫系である。Ｍａｅｄａ等及びＣａｒｂｏｎｅｌｌ等、前掲、を参照のこと。このような１つの系において、オートグラファ・カリホルニ力（Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多面体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウィルスはスポロプテラ・フルギペルダ（Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　＋−幻Ａ直）の細胞中で増殖する。エンベロープ遺伝子をウィルスの非必須領域（例えばポリヘトリン遺伝子）にクローン化し、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへトリンプロモーター）の制御のもとに置く。ＶＧＦ遺伝子造成物への好結果の挿入はポリヘトリン遺伝子の不活性化及び非閉塞組換ウィルス（すｆ（わち、ポリヘトリン遺伝子によりコードされた蛋白質性コートを欠くウィルス）の生成をもたらすであろう。次に、これらの組換ウィルスを用いてスボドブテラ・フルギペルダ細胞に感染せしめ、この細胞中で挿入された遺伝子が発現する。

遺−戊ＶＧＦ遺伝子挿入部を昆虫細胞系のための適切なプロモーターの制御のもとにおく。プラスミドρＡｃ６１０及びｐＡｃ６１１は、アンピシリン耐性マーカーを有するプラスミドベクターにクローン化されたポリヘトリン遺伝子を含有する。

ポリリンカーをこの遺伝子に挿入する。これらはポリヘトリン遺伝子の転写開始部位から５０塩基下流及び最初のＡＴＧの７塩基前である。ＶＧＦ遺伝子を便利なポリリンカ一部位にクローン化し、ポリへトリンプロモーターの制御のもとにおく。ＡＴＧ開始メチオニンコドン及び翻訳停止コドンはＡＧＦ遺伝子のそれであり、転写開始部位及びポリアゾニレ−ジョンシグナルはポリヘトリン遺伝子のそれである。

皿！（洟ＡｃＮＰＶのための宿主細胞はスボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ）である。組換ウィルスのストックを形成するため、ＶＧＦ含有プラスミドをＡｃＮＰＶ　ＤＮＡと混合し、そしてリン酸カルシウム技法を用いてＳＦ細胞にトランクフエクトする。組換体ウィルスを培地から単離し、そしてプラークをＳＦ細胞上で精製する。組換体プラークはプローブとして放射性ラベルされたＶＧＦ　ＤＮＡを用いるハイブリダイゼーションにより同定される。

光−里組換ウィルスを同定した後、次にこ胱をＳＦ細胞上で拡張する。次に、組換ウィルスストックを用いてＳＦ細胞に感染せしめ、細胞を溶解し、そして上清をＶＧＦ蛋白質の生産についてスクリーニングし、この蛋白質を、ワクチニアウィルスで感染された哺乳類細胞について前記したようにして精製する。

昆虫細胞中で生産されるＶＧＦの予想配列は次の通りである。

この１２１残基・の配列は、ｖＶで感染されたモンキー細胞から精製されたＶＧＦについて直接決定されたＮ−末端配列°（すなわち、ＶＧＦオープンリーディングフレームの残基２０）から始まり、そしてオーブンリーディングフレームの最後の残基に続く。従って、これはシグナルペプチド（オープンリーディングフレームの残基１〜１９）を欠くが、しかしトランスメンプラン配列（Ｙ　Ｉ　ＰＳＰＧ　ＩＭＬＶＬＶＧ　Ｉ　Ｔ　Ｉ　Ｉ　ＴＣＣＬＬＳＶＹ）を含有する。

１２１残基のペプチドの予想ＭＷは炭水化物を含めないで１３．３０４である。

バキュロウィルスにより生産されるＶＧＦの目かけＭＷは１７，０００であり、ｖｖで感染された細胞から得られるそれよりも実質的に小さく、２つの異る形態はおそらく異るプロセシングのためであることが示される。バキュロウィルスにより生産されたＶＧＦはＮ−末端配列の追加の部分もしくはＣ−末端配列、又は両者を異にし、そして／又はグリコジル化のタイプ及び程度を異にするかもしれない。

然ＶＧＦ戸”　いる軌　の汐７、約１０ボンドの３頭の雌性子ブタをケミタン及びロンパムにより麻酔し、碕してそれらの背部を剃り、そして市販の脱毛クリームにより毛を完全に除去した。黄銅の型板（３×３ｃ＋＋＋、１４７ｇ）を７０℃の水浴中で平衡化し、そして次に正確に１０秒間皮膚に密着せしめた。を椎の各側に、相互に約１インチずつ離して５個の傷をつけた。生ずる水庖の上部を完全に除去し、そ”して１日２回、ビヒクルのみ、又は因子を含有するビヒクルにより処置し、あるいは処理しなかった。ブタには自由に飲食させた。処理の９日又は１０日後、ブタを再び麻酔し、そしてできるだけ多く焼癲を除去した。すべての傷を写真に撮り、そして上皮形成を判定すべき範囲内の各偶においてパンチ生検体を採取した。

次の表は、視覚的に観察した場合に、上皮形成した各偶のおよその％を示す。

上記の結果から、■ＧＦが従来試験されておりそしてマイトジェン活性を有することが証明されている他の成長因子に十分に匹敵する高い能力の上皮形成剤であることが明らかである。

この発明に従えば、種々の分野における広範囲の可能性、例えば、診断、細胞に対するインビトロインビボ効果、マイトジェンとしての作用、栄用培地への添加剤、ＥＧＦ及びＴＧＦに対する作動薬及び拮抗薬としての用途、免疫源としての作用、療法剤としての作用、創傷の治癒の増強等を有する新規な化合物が提供される。さらに、結合活性を有する小オリゴヌクレオチド用意することにより、オリゴヌクレオチドはそれ自体として、又は他のポリペプチドと組合わせて、他のポリペプチドに融合して他のポリペプチドの性質を変え、成長因子リセプターを有する細胞へのポリペプチドの結合をもたらすことができる。すなわち、種々のポリペプチドを成長因子リセプターを有する細胞に結合せしめ、所定の通りに細胞の性質を変えることができる。

理解を明瞭にするため、前記の発明を説明及び例により幾分詳細に記載したが、添付された請求の範囲内において幾つ手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０２１０３２、発明の名称成長因子活性を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸配列３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　オンコゲン４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１６、補正の対象（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」の欄（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文（３）委任状７、補正の内容（１）　（３）別紙の通り（２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録（１）訂正した特許法第１８４条の・　５第１項の規定による書面　１ｉ１ｆｌ（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１ｉｉｎ（３）委任状及びその翻訳文　各１通宝　も　！璽　審　糾　去１′ｗ″″″Ａ−”’　ＰＣＴ／ＵＳ８５１０２１０３−１−−＾−−６−ＩＩ＆ＰＣＴ／ＵＳ８Ｓ１０２１０３Ａ？？ＡＣ！ｉＭＥＮｒＶＸ、　０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　ＷＨＥＲＥ　ＵＮＩＴＹ　ＯＦ　ＸＮＶＥＮＴＸ（Ｍ　工Ｓ　ｆ、ＡＣＫＩＮＧ■発明者　マーカード、ハンス　アメス。

０発　明　者　トダロ、ジョージ　ジエイ　アメスリカ合衆国、ワシントン　９８０４０．マーサー、アイランド、エイ−、フォーティーシックスス　９２２２リ力合衆国、ワシントン　９８１１２．ジアド′ル、フィフティーンアベニュ　イースト　１９４０

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＰＰ３及びＰＰ４は水素であり；Ａ１′は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数２〜６個の中性アミノ酸であり；ａａ２５は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜４個の中性アミノ酸又はチロシンであり；ａａ２７は炭素原子数４〜６個からなり、そして０〜１個のカルボキサミド基を有する中性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａ２９は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜６個の脂肪族アミノ酸、又はヒスチジンであり；ａａ３０は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜６個の脂肪族アミノ酸、又はヒスチジンであり、ここでａａ２９及びａａ３０は異り；ａａ３５は炭素原子数５〜６個の脂肪族アミノ酸又は酸性アミノ酸であり；ａａ３８は炭素原子数４〜５個の脂肪族のカルボキサミド置換アミノ酸、又は酸性アミノ酸であり；ａａ３９は芳香族アミノ酸、又はヒドロキシル置換基を有する炭素原子数３〜４個の脂肪族アミノ酸であり；ａａ４０は炭素原子数３〜５個の非置換脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸ｍ及びｎは０又は１である）で表わされるポリペプチド。
２．その末端において少なくとも１個のアミノ酸に連結されており、ここで生ずる延長されたアミノ酸はワクチニアウイルスのエンベロープ蛋白質以外の配列を有し、そして約１０００個以下のアミノ酸から成る、請求の範囲第１項に記載ののポリペプチド。
３．約６ｋＤａｌ以下の量で糖によりグリコシル化されている、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
４．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ａａ２５からａａ４０までの記号は請求の範囲第１項において定義される通りであり；ａａ１は任意のアミノ酸であり；ａａ３は炭素原子数２〜４個の中性アミノ酸であり：ａａ４は任意のアミノ酸であり；ａａ５は炭素原子数３〜４個の酸性又はヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ６は炭素原子数２〜３個の非置換脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり；ａａ７は酸性アミノ酸又は炭素原子数３〜４個のヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ８は炭素原子数２〜３個の非置換脂肪族アミノ酸又は炭素原子数４〜５個のカルボキサミド置換アミノ酸であり；ａａ１１は炭素原子数５〜６個の非置換中性脂肪族アミノ酸、又はフェニルアラニンであり；ａａ１２はヒスチジン又は炭素原子数４〜５個の中性カルボキサミド置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ１２ａはグリシン又はアスパラギン酸であり；ｐは０又は１であり；ａａ１４は酸性アミノ酸、又は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数４〜５個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ１６は炭素原子数４〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又はアルギニンであり；Ａｒ１は芳香族アミノ酸であり；ＡＩ′は炭素原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ１９は任意のアミノ酸であり；ａａ２０は酸性アミノ酸、又は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜５個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ２１は酸性アミノ酸、又は炭素原子数５〜６個の中性脂肪族アミノ酸であり；Ａｃは酸性アミノ酸であり；ａａ２３は０〜１個のヒドロキシル置換基を有する炭素原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａ２４はメチオニン、プロリン又はチロシンであり；ａａ４１は炭素原子数４〜６個の中性非置換脂肪族又は酸性アミノ酸であり；ａａ４３は炭素原子数４〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａ４４は任意のアミノ酸であり；そしてＰＰ１及びＰＰ２は同一であり又は異っており、そして水素、１個のアミノ酸、又はアミノ酸１０００個以下のポリプペチドであり、ａａ１−４４がワクチニアウィルス成長因子の天然アミノ酸を定義する場合には、Ｐ１及びＰ２はワクチニアウィルス成長因子の天然フランキング領域以外である）で表わされるポリプペチド。
５．いずれかの末端において免疫原性蛋白質に連結されており、この免疫原性ポリプペチド少なくとも６０個のアミノ酸を有する請求の範囲第４項に記載のポリプペチド。
６．ａａ１がロイシンであり、ａａ３がグリシンであり、ａａ４がプロリンであり、ａａ５がグルタミン酸であり、ａａ６がグリシンであり、ａａ７がアスパラギン酸であり、ａａ８がグリシンであり、ａａ１１がロイシンであり、ａａ１２がヒスチジンであり、ｐが０であり、ａａ１４がアスパラギン酸であり、ａａ１６がイソロイシンであり、Ａｒ１がヒスチジンであり、Ａｌ２がアラニンであり、ａａ１９がアルギニンであり、ａａ２０がアスパラギン酸であり、ａａ２１がイソロイシンであり、Ａｃがアスパラギン酸であり、ａａ２３がグリシンであり、ａａ２４がメチオニンであり、カッコ内のアミノ酸が請求の範囲第３項において定義された通りであり、ａａ４１がバリンであり、ａａ４３がバリンであり、そしてａａ４４がアスパラギン酸である請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
７．１つの成長因子の約１５〜５０個のアミノ酸のＮ−末端断片が異る成長因子の１５〜４５アミノ酸のＣ−末端断片に連結されており、これらの断片が請求の範囲第４項に記載の式を有する成長因子ポリペプチドから得られたものであるハイプリド成長因子。
８．請求の範囲第７項に記載のハイプリド成長因子をコードするＤＮＡ配列。
９．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該配列がコード配列の３′末端にメチオニンコドン、及びコード配列の５′末端に終止コドンを含有するＤＮＡ配列。
１０．微生物宿主中で機能する複製系、核宿主中で機能する転写及び翻訳開始及び停止制御シグナル；並びに、前記開始及び停止シグナルの間にありそしてそれらの制御のもとにある、請求の範囲第８項又は第９項のいずれかに記載のＤＮＡ配列；を有する発現ベクター。
１１．請求の範囲第５項に記載の免疫原に対する免疫反応において生成した抗体。
１２．宿主の創傷の上皮形成を包含する方法における使用のための組成物であって、この方法が、前記創傷の部位に上皮形成を惹起するのに十分な量の前記組成物を適用することを含んで成り、前記組成物が次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ａａ２５からａａ４０までの記号は請求の範囲第１項において定義される通りであり；ａａ１は任意のアミノ酸であり；ａａ３は炭素原子数２〜４個の中性アミノ酸であり；ａａ４は任意のアミノ酸であり；ａａ５は炭素原子数３〜４個の酸性又はヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ６は炭素原子数２〜３個の非置換脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり；ａａ７は酸性アミノ酸又は炭素原子数３〜４個のヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ８は炭素原子数２〜３個の非置換脂肪族アミノ酸、又は炭素原子数４〜５個のカルボキサミド置換アミノ酸であり；ａａ１１は炭素原子数５〜６個の非置換中性脂肪族アミノ酸、又はフェニルアラニンであり；ａａ１２はヒスチジン又は炭素原子数４〜５個の中性カルボキサミド置換脂肪族アミノ酸であり；ａａ１２ａはグリシン又はアスパラギン酸であり；ｐは０又は１であり；ａａ１４は酸性アミノ酸、又は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数４〜５個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ１６は炭素原子数４〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又はアルギニンであり；Ａｒ１は芳香族アミノ酸であり；Ａｌ１は炭素原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ１９は任意のアミノ酸であり；ａａ２０は酸性アミノ酸、又は０〜１個のヒドロキシル基を有する炭素原子数３〜５個の中性脂肪族アミノ酸であり；ａａ２１は酸性アミノ酸、又は炭素原子数５〜６個の中性脂肪族アミノ酸であり；Ａｃは酸性アミノ酸であり；ａａ２３は０〜１個のヒドロキシル置換基を有する炭素原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａ２４はメチオニン、プロリン又はチロシンであり；ａａ４１は炭素原子数４〜６個の中性非置換脂肪族又は酸性アミノ酸であり；ａａ４３は炭素原子数４〜６個の中性脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａ４４は任意のアミノ酸である）で表わされるポリペプチドを含んで成る組成物。
１３．蛋白質μｇ当り少なくともＥＧＦ９０ｎｇ相当の純度のＶＧＦ。