JPS62500101A

JPS62500101A - リポソ−ム類における抗腫瘍剤類の被包

Info

Publication number: JPS62500101A
Application number: JP60503627A
Authority: JP
Inventors: バリー，マルセル，ビー; キユリス，ピーター，アール; ホープ，マイケル，ジエイ; マツデン，トーマス，デイ; マイヤー，ローレンス，デイ
Original assignee: ザ　リポソ−ム　カムパニ−，インコ−ポレ−テツド
Priority date: 1984-08-08
Filing date: 1985-08-07
Publication date: 1987-01-16
Anticipated expiration: 2010-12-06
Also published as: EP0191824A4; JP2572553B2; JPH0920652A; CA1305054C; EP0191824B1; JP2847065B2; JPH07165560A; EP0191824A1; CA1270198A; HK1007494A1; JPH07145041A; JPH07145042A; JP2574999B2; DE3587640T2; DE3587640D1; JP2572554B2; JPH07112968B2; WO1986001102A1; CA1270198C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム類における抗腫瘍剤類の被包本発明は、抗腫瘍剤類（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｆＪｅｎｔｓ　）　、特に、リポソーム類における抗腫瘍剤類の被包（ｅｎｃａｐｓｔＪ　ｆａｔｉｏｎ　）に関するものである。

２、先行技術の記載種々の研究者により確立されているように、抗腫瘍剤類の使用による癌の治療は、多くの場合、抗腫瘍剤類を人体に直接投与するよりもリポソーム類に該抗腫瘍剤類を被包することにより大いに改善され得る［例えばフォルセンら（「ｏｒｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ）（１９８３）　、キャンサー　レス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）１９８２）　、ユーロピアン　ジャーナル　オブ　キャンサークリニカル　オンコル（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、　０ｎｃｏ！、）　。

１８：　１６７参照、しかし、アブラら（Ａｂｒａ　ｅｔ　ａｌ）（１９８３）、キャンサー　ケミチル　ファーマコル（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、）、　１１　：　９Ｂ参照のこと］。このような抗腫瘍剤類をリポソーム類へ配合すると、その抗腫瘍活性、クリアランス率、組織分布および毒性が、直接投与に比して変化する［例えばラーマンら（Ｒａｈｍａｎ　ｅｔ　ａｔ）（１９８２）、キャンサーレス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　、　６２　：　１８１７　：　ローザら（Ｒｏｓａ　ｅｔ　ａｌ）（１９８２）　トランスポート　イン　バーイオメンブレンズ（丁ｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）における「モデル　システムズアンド　リコンスディテユーション（閂ｏｄｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　Ｒｅｅｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、アール　アントリー二ら（Ａ、Ａｎｔｏｌｉｎｉ　ｅｔａｌ）ｉｌ、ラベン　プレス（ＲａＶｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、ニューヨーク、２４３−２５６　；　ｏ−ザら（Ｒｏｓａ　ｅｔ　ａｔ）（１９８３）、フ１−マコロジ−（ＰＩ−１ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、　２６：　２２１；上記フォルセンら（Ｆｏｒｓｓｅｎｅｔａｌ）：上記ギャビゾンら（Ｇａｂｉｚｏｎ　ｅｔ　ａｔ）　；および上記オルソンら（Ｏｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ）参照のこと］。例えば、アントラサイクリン抗生物質ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂ　ｉ　Ｃｉ　ｎ　）およびドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　）　（アドリアマイシン）　（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＞およびその医薬的に受容し得る誘導体およびその塩の心臓毒性が著しく減少することは公知である［例えば上記フォルセンら；上記オルソンら（Ｏｌｓｏｎ　ｅｔａｌ）　：および上記ラーマンら（Ｒａｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）参照のことコ。

また、リポソーム類に極めて毒性の高い抗腫瘍剤類を配合すると、その投与される人にこのような抗腫瘍剤類をさらす危険は減少できる。

リポソーム類を使用して抗腫瘍剤類を投与すると、医薬被包および治療中の医某放出の両方に関して問題が生じる。

被包に関しては、治療中に患者に与える脂質負荷を最小にするように、トラップ効果を増加する必要性が引続いてあった。ざらに、高いトラップ効果は、癌の治療において現在使用されている高価な医薬を処理する際の重要な利点である少量の医薬だけしか損失しないということを意味する。

医薬の放出に関しては、アドリアマイシンのごとき多くの抗腫瘍剤類が被包後にリポソーム類から急速に放出されることが見出された。このような急速な放出は、リポソーム被包の有用な効果を減少させ、このため一般に望ましくない。したがって、リポソーム類から抗腫瘍剤類およびその他の医薬放出速度を減少させる方法を見出す努力が当業者により引続いて行なわれてきた。

これらの被包および放出の問題の他に、臨床医に抗腫瘍剤類含有リポソーム類を提供するための商業的に許容し得る方法を見出すという無視すべからざる問題がある。「必要な」ベースにリポソーム類の生産および負荷が実験至的には許容し得る方法であるとはいえ、一般に、臨床的には不満足である。したがって、被包された医薬を有するあるいは有さないリポソーム類が出荷され、貯蔵されかつ従来の商業的な販売ルートを通じて一般に移動される方法に対して重要でかつ継続的な需要がある。

発明の開示上記のごとき技術の状態から、本発明の目的は、リポソーム類に抗腫瘍剤類（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｒＪｅｎｔＳ＞を被包する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、リポソーム類からの抗腫瘍剤類またはその他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法を提供することにある・本発明のざらに他の目的は、リポソーム類が実質的な損耗なしい貯蔵され、出荷されかつ商業的に頒布され１ｑるように抗腫瘍剤類の負荷前または負荷後にリポソーム類を脱水する方法を提供することにある。

これらおよびその他の諸口的を達成するために、その見解の一つによれば、本発明は、透過膜ポテンシャル（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）がリポソームの壁部を越えて形成されかつ抗腫瘍剤類が該透過膜によりリポソーム項内に負荷されるイオン化可能な抗腫瘍剤でリポソーム類を・負荷する方法を提供するものである。

この方法は、水性媒体（例えばプロトン化しく７るアミノ基を有する有機化合物）中に溶解したときに帯電状態（ｃｈａｒ！１ｌｅｄ　５ｔａｔｅ）で存在し得る本質的にいかなる抗腫瘍剤も使用できる。好ま（）くは、該薬剤は、リポソーム類を仕切るように比較的親油性でなければならない。投数の抗腫瘍剤類は、この方法を用いて同時にあるいは順次負荷させることができる。また、イオン化可能な抗腫瘍剤が負荷されるリポソーム類は、従来の被包技術（例えば、リポソーム類が作られる接衝液中に医薬を配合すること）により池の抗腫瘍剤類または伯の医薬で予め付加することができる。

本発明の他の面によれば、リポソーム類に薬剤を保持するために配向した透過膜ポテンシャルがリポソーム膜を越えて発生するリポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍剤類または他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法が提供される。下記に詳述するように、リポソーム類からのアドリアマイシンのようなイオン化可能な薬剤の放出速度を、このような透過膜ポテンシャルが１０倍も減少させ得ることは驚くべきことである。この透過膜ポテンシャルは、被包後Ｅこ発生させ臂るか、あるいは上記被包技術によりリポソーム類（ζ負荷されでいた透過膜ボアンシャルと同一であり得る。

さらに他の面（こよれば、本発明は、リポソ−ム膜か臨床面で抗腫瘍剤類の投与に便利な種々の脱水プＩＪｌ”ｊ−ルを提供する。これらのプロ１〜ロールによれば、抗腫瘍剤類（、裏すボンーム類中に負荷され、かつぞの結果１ｑられる製剤（、上、都合よく、貯蔵され、出荷されるかめるいはリポソーム類から実質的に抗腫瘍剤類の漏出なしに処理される、。

ごのプロトコールのある実施態様（、二よれば、脱水は１種またはそれ以上の保護糖類の存在下に行なわれる。この場合、脱水はさきに冷凍することなく行なわねばならず、抗腫瘍剤類の被包に使用されるりｉ１ζソーム類は、多分子脂質層を有するタイプのものでなければならず、またリボソ・−ム製剤は完全には脱水できないが、むしノろ袈剤内に約２〜約５％の元からの水分を脱水工程の最後まで残しておかなければならない。１モルの脂質当りの１モルの水の点から、これは１モルの脂質当り約１２〜約３５モルの水が脱水製剤中に存在しなければならない。

本発明の他の脱水プロトコールによれば、抗腫瘍剤類は、出荷、貯蔵等用に予め脱水されているリポソーム類に負荷され、ついで再脱水される。脱水は、上記方法により行なわれ、抗腫瘍剤類の負荷は上記透過膜ポテンシャル法を用いて達成される。透過膜ポテンシャルは、必要により脱水工程前または後に発生する。

上記方法の他に、本発明は、つぎの方法により製造される生成物をも提供するものである。すなわち、（１）透過膜ポテンシャルによりリポソーム類中に負荷される抗腫瘍剤類を含む医薬製剤、（２）リポソーム類からの薬剤の放出速度を減少させるようにその膜を越える透過膜ポテンシャルを有するリポソーム類に被包されたイオン化可能な生物学的に活性な薬剤を含む安定化された医薬製剤、および（４）透過膜ポテンシャルにより予め脱水されたワボソーム頬内に負荷された抗腫瘍剤類よりなる医薬製剤である。

本発明の前記および他の目的および利点の達成は、本発明の好ましい実施態様の記載に関連して記載されている。

本明細ｍで使用されているように、「医薬製剤」、「イオン化可能な抗腫瘍剤（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｑｅｎｔ）　Ｊおよび「イオン化可能な生物学的に活性な薬剤（ｉｏｎｉｚａｂｌｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）　Ｊの用語は、次の意味を有している。

すなわち、ヒトまたは動物への投与に好適でかつ生物学的に活性な物質および適当な緩衝剤、希釈剤、担体等よりなる組成物を意味し、イオン化可能な抗腫瘍剤は水性媒体に溶解したときに帯電した状態で存在し得る抗腫瘍剤を意味し、またイオン化可能な生物学的に活性な薬剤は水性媒体に溶解したときに帯電した状態で存在し得る生物学的に活性な薬剤を意味する。

図面の簡単な説明第１図はＮａ　／Ｋ　拡散ポテンシャルの存在下または不存在下に大きなユニラメラベシクル類（ＬＵＶ類）へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の吸収を示す。卵 −ＰＣＬＵｖ類（１μｍｏ＋　リン脂質５／ｍｌ）が０．２ｍ１（のアドリアマイシンの存在下に２０℃で培養された。薬剤の吸収は、下記の「材料および方法」で評価された。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち、白抜三角印は、内部および外部媒体中の２０ｍＭのへベス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７，５）、１６９ｍ）ｌのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類。白抜丸印は、内部および外部媒体中の２０ｍ）ｌのへペス（ｐｎｙ、５）およびワリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）　、１６９ｍ）ｌのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類。白扱四角印は、内部および外部媒体中の２０ｍＭのへペス（ｐＨ７，５）、ｔ＞よび１５０ｍ）ｌのＮａＣＬ外部媒体中の２０ｍ）ｌのヘベス（ｐＨ７，５）、１６９ｍＨのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類。黒丸印は、内部媒体中ノ２０１Ｉｌｌ（ノヘペス（［）Ｈ７，５）＃よび１５０ｍＨの２０ｍ１ −１のヘペス（ｐＨ７，５）、外部媒体中の２０ｍＭのへベス（１）Ｈ７゜５）およびワリノマイシン、１６９ｍＨのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類を表わす。

第２図は、Ｎａ、／Ｋ　拡散ポテンシャルの存在下または不存在下に大きなユニラメラベシクル類へのビンプラスセン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）　（Ｖ　Ｉ　Ｎ　Ｂ　）の吸収を示す。卵−ＰＣ＋ＵＶ類（１μｍｏｌ　リン脂質、／ｄ）がＱ、２ｍ）（のビンブラスチンの存在下に２０’Ｃでつぎの条件下で培養された。自失三角印は、内部および外部緩衝液としての２０ｍＭのへヘス（ｐＨ７，５）、１６９ｍＭのグルタミン酸カリウム、白多友丸印は内部ｄ３よび外部緩衝液としての２０ｍＭのヘベスおよびワリノマイシン、１６９ｍＭのグルタミン酸カリウム、白抜四角印は、ベシクル内部の１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムおよびワリノマイシンΔ３よび外部媒体どしての２ＱｍＨのへヘス（ｐＨ７，５）、１５０ｍ）ｌのＮａＣｆ１を示す。

第３図は最初の遊離のアドリアマイシン濃度（黒丸）の機能どしての膜を越えてのＮａ／Ｋ　勾配を有する卵−ＰＣＬＵＶ類へのアドリアマイシン（ＡＤＭ＞の吸収を示す。白Ｉ友丸印は蓄積する使用可能な全薬剤のパーセン１−を示ず。ベシクル類（１ｍｌ（リン脂質）は、ワリノマイシンの存在トに２時間にわたって示された濃度のアドリアマイシンで２０’Ｃで培養した。

第４図は、（Ａ＞２０’０７′３よび（Ｂ）３７°ＣでＮａ　／Ｋ　透過膜化学勾配およびワリノマイシンの存在下に卵−ＰＣコレステロール　１ｔＪＶ系へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の吸収を示す。ベシクル類（１μｍｏｌの全脂質／ｍｌ）は、Ｑ、２ｍＭのアドリアマイシンの存在下に２０’Ｃまたは３７°Ｃで２時間培養された。使用したコレステロールに対する卵−ＰＣのモル比は、つぎのとおりである。すなわち、黒丸は１：Ｏ１白丸は９：１、半黒丸は３：１であり、また白鳥は１：１である。

第５図は、種々の温度におけるＱ、２ｍＭのアドリアマイシンの存在下に培養したのらのＮａ”、／に＋透過膜化学勾配の存在でのＤＰＰＣ−コレステロール（１：１）ＬＵＶ類（１ｍｌ（脂質）へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の吸収をリンマイシンの不存在下で３７℃、自失四角印はワリノマイシンの存在下で６０℃ 、下向黒三角印（ｓｏｌｉｄ　ｄｏｗｎｗａｒｄｆａｃｉｎｏ　ｔｒｉａｎｑｌｅ）はワリノマイシンの存在下で６０℃、上向黒三角印（ｓｏｌｉｄ　ｕｐｗａｒｄ　ｆａｃｉｎａ　ｔｒｉａｎｒ＋ｌｅ）はワリノマイシンの不存在下での３７℃における卵−ＰＣＬＵＶ類（１ｍＭ＞、下向１扱三角印（ｏｐｅｎ　ｄｏｗｎｗａｒｄ　ｆａｃｉｎｇ　ｔｒｉａｎｇｌｅ）はワリノマイシンの不存在下での６０℃における卵−ＰＣＬＵＶ類を示す。

第６図は０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下での２０°Ｃにおける培養後のＮａ　／Ｋ　化学勾配の存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ　ＬＵＶ類へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の吸収を示す。自失三角印はワリノマイシンの存在下に卵− ＰＣ／卵−ＰＳ（４：１）、黒三角印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（４：１）、白抜四角印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（２０：１）、白扱丸印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵 −ＰＳ（５０：１）、黒丸印はＮａ＋／に１勾配（内側および外側のＫ　緩衝液）の不存在下での卵−Ｐ　Ｃ、／卵−ＰＳ（４：１）への吸収を示す。

第７図は（Ａ）２０’Ｃおよび（Ｂ）３７°Ｃにおける透過膜のｌ）Ｈ勾配を示すＬ［Ｖ類へのアドリアマイシンの吸収を示す。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち、プロトンイオン透過担体ＣＣＣＰ（１０μＭ）の不存在下（熱印）および存在下（白恢印）での０．２ｍ）ｌのアドリアマイシン、２＋ｎＨの脂質。内部緩衝液の組成は１５０ｍ）ｌのＫＯＨ１１７５＋ｎＨのグルタミン酸（１）１１４．６）でおり、一方外部緩衝液の組成は１５０ｍＭのＫＯＨ１１２５ｍｔｌのグルタミン酸および３０ｍＭのＮａＣΩ（ｐＨ７，５）よりなっていた。脂質の組成はＥＰＣ（丸印）および１：１のモル比のＥＰＣ／コレステロール（１：１＞であった。

第８図は３７°ＣにおけるＥＰＣ（黒丸印、自失丸印）およびＥＰＣ／コレステロール（１：１モル比）（黒四角印、白仇四角印＞ＬＵＶ類からのアドリアマイシンの放出を示す。アドリアマイシンは、それぞれ５．０および０．５ｍＭの脂質ならびに薬剤濃度でｐｔ＋勾配に応じてベシクル類へ閉込められる。遊離のアドリアマイシンは、１５０ｍＭのに＋（黒色）または１８０ｍｔ（のＮａ”　（自失印）を含有しｐＨを４．６（パネルＡ）またはｐＨを７．５（パネルＢ）に調整された緩衝液で平衡にしたゲルフィルトレージョンクロマトグラフィカラムによりベシクルに会合した薬剤から分離される。

第９図は比較のためのベシクル類（四角形）および脱水／再水和ベシクル類（円形）のためのｐＨ勾配から発生する透過膜ポテンシャルを示ず。予め存在するプロトン勾配を有するベシクル類は、４℃で２４時間保持される（比較例）か、おるいは同一時間高真空下に２５０１Ｔｌ］４のトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるベシクル類にみられるポテンシャルは、ｃｃｃｐの不存在下（自失丸および四角印）または２０μＭのＣＣＣＰの存在下（黒丸および四角印）に３Ｈ−テトラフェニルホスホニウムブロマイドをプローブとして使用して測定された。ＣＧＣＰの存在下または不存在下にｐＨ勾配なしにベシクル類にみられる透過膜ポテンシャルは、それぞれ黒三角印および自失三角印で示されている。

第１０図は比較のためのベシクル類（四角印）および脱水／再水和ベシクル類（丸印）のためのＮａ　／Ｋ　化学勾配により発生する透過膜ポテンシャルを示す。予め存在するＮａ”／に＋勾配を有するベシクル類は、４°Ｃで２４時間保持される（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に２５０ｎ＋Ｈのトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるベシクル類にみられるポテンシャルは、ｃｃｃｐの不存在下（白抜光および四角印）または２０μＭのＣＣＣＰの存在下（黒丸および四角印）に３］」−テトラフェニルホスホニウムブロマイドをプローブとして使用して測定された。ワリンマイシンの存在下または不存在下に膜の両側にグルタミン酸カリウムを有するベシクル類にみられる透過膜ポテンシャルは、それぞれ自復三角印および黒三角印で示されている。

第１１図は予め乾燥したベシクル類にアドリアマイシンを負荷するための透過膜ポテンシャルの使用を示す。予め存在するＮａ＋／に＋勾配を有するベシクル類は、２５０ｍＨのトレハロースの存在下に２４時間脱水される。再水和化に続いてワリンマイシン（０，５μｇ／μｍｏｔｅのリン脂質）の存在下（自失丸印）または不存在下（黒丸印）にアドリアマイシンを蓄積させるベシクル類の能力が測定された。同一時間４°Ｃに保持された比較のためのベシクル類も、ワリンマイシンの存在下（自失四角印）または不存在下（黒四角印）に試験された。

好ましい実施態様の説明上記のように、本発明はリポソーム類への抗腫瘍剤の被包に関するものである。

抗腫瘍剤類が被包されるリポソーム類は、種々の組成および内部含有物を有しており、かつ現在知られているかおるいは将来開発されるマルチラメラ、ユニラメラまたは他のタイプのリポソーム類おるいは一般に脂質含有粒子の形態をとることができる。例えば、脂質含有粒子は、１９８３年３月２４日、１９８３年８月　８日、１９８４年３月２０日および１９８４年４月１２日にそれぞれ出願され現在出願中の米国特許出＠第４７６、４９６号、同第５２１．１７６号、第５９１，５７６号および第５９９．６９１号に開示されているタイプのステロイドリポソーム類、安定なプルリラメラリポソーム類（Ｓ　Ｐ　Ｌ−Ｖ類）、単相ベシクル類（Ｍ　Ｐ　Ｖ類）または脂質７１ヘリックス担体（１ＭＣ類）の形であり１ｑ、その該当個所は参考としてここに入れられる。

リポソーム類は、リポソーム類の製造法とし２て現在知られているかおるいは将来開発されるいかなる方法によっても製造できる。例えば、マルチラメラリポソーム類＜ＭＬＶ類）製造用の従来の技術により該リポソーム類は形成できる。すなわち、クロロホルム中に脂質類を溶解することにより適当な容器の内壁に１種またはそれ以上の選ばれた脂質類を堆積させ、ついでクロロホルムを蒸発させ、被包させるべき水溶液を容器に加え、該水溶液で脂質類を水和し、かつ得られる懸濁液を旋回または渦動させることにより所望のリポソーム類が製造される。

別方としては、逆相蒸発法、注入法および洗浄剤希釈法のごとき大型ユニラメラリポソーム類（Ｌ　Ｕ　Ｖ類）の製）Δに用いられる技術がリポソーム類の製造に使用できる。リポソーム類製造のためのこれらおよびその他の方法の総説は、マーク　ジエイ　オストロ（Ｎａ＋”Ｃ、Ｊ、　０３ｔｒＯ）　編１リポソーム類（ＬｉＤＯ３ｏｍｅＳ　）　Ｊマーセル　テラカー　インコーホレーテッド（）ｌａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　）　ニューヨーク１９８３年発行の第１章に見出すことができ、その該当個所は参考のために本明細書の一部を構成している。スゾカ　ジュニアら（Ｓｚｏｋａ、　Ｊｒ、、　ｅｔ　ａｔ　）　（ｔ９８０）アン　レブ　バイオフイズ　バイオエンジニャ（Ａｎｎ、　ＲｅＶ、　Ｂ１１１）ｈａｓ、　ａｉｏｅｎｇｒ、）、９：　４６７も参照のこと。この該当個所も参考のために本明細書の一部を構成する。ＬＵＶ類製造の特に好ましい方法は、１９８４年６月２０日に出願された米国特許出願第６２２、６９０号「ユニラメラベシクル類製造用押出技術」に記載され、その該当個所も参考のために水門ｍ書の一部を構成する。

他の別法としては、上記米国特許出願第４７６、４９６号、同第５２１．１７６号および同第５９９．６９１号に記載の方法により製造できる。また、リポソーム類自体を使用するよりも、上記米国特許第５９１，５７６＠に記載されているような方法のごとき他の脂質含有粒子が、本発明の実施に使用できる。ざらに、また必要により、抗腫瘍剤類の担持に使用されるリポソーム類または脂質含有粒子が「決められた粒径分布を有するリポソーム類」という名称の１９８４年６月２０日に出願された米国特許第６２２．５０２号に記載されている方法によりざらに均一な粒径分布を与えることができ、その該当個所も参考のために本明細書の一部を構成する。

上記のように、その面の一つによれば、本発明は、透過膜ポテンシャルがリポソーム類の壁を越えて生じかつ抗腫瘍剤類か該透過膜ポテンシャルによりリポソーム頬内に負荷されるイオン化可能な抗腫瘍剤類でリポソーム類を負荷する方法を提供する。透過膜ポテンシャルは、リポソーム膜を越えて１種またはそれ以上の帯電した種（Ｃｈａｒｌｌｌｅｄ　５Ｏｅｃｉｅｓ　）　（例えばＮａ＋、に＋および／またはＨ＋）に対する濃度勾配をつくることにより発生する。この濃度勾配は、異なる内部および外部媒体、すなわち１種またはそれ以上の帯電された種を有する内部および外部媒体を有するリポソーム類を製造することによりつくり出される。

特に、１種またはそれ以上の帯電された種の最初の濃度を有する最初の媒体を被包するリポソーム類が製造される。

代表的なリポソーム製造技術には（上記議論参照〉、この最初の媒体はリポソーム類が生成するにつれてリポソーム類をつつみ、しかしてリポソーム類の元の外部媒体は最初の媒体と同一組成を有することになる。濃度勾配をつくりだすには、元の外部媒体は異なる濃度の１種またはそれ以上の帯電された種を有する新たな外部媒体で置換される。

この外部媒体の置換は、新たな媒体で平衡化されたゲルフィルトレージョンカラム、例えばセファデックス（５ｅｒ）ｈａｄｅｘ）カラムにリポソーム製剤を通すことにより、または遠心分離、透析または関連する技術等、種々の技術により達成できる。

リポソーム膜の透過性に応じて濃度勾配に相当する全透過膜ポテンシャルを同時に形成するかめるいは透過性増強剤、例えばワリンマイシンのようなイオン透過担体が浴媒体に添加されるはずである。（必要ににす、透過性増強剤は、クロマ１〜グラフイまたは他の技術を用いて負荷を完了したのち、該製剤から除去できることに注目されたし。）いずれかの場合、ネルンスト式により決定されるマグニチュードを有する透過膜ポテンシャルはリポソーム類の膜を越えて発現する。

本発明によれば、この透過膜ポテンシャルは、イオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類に負荷するために使用で２　、Ｈ）。特に、濃度勾配を有しかつこのために適当な配向の透過膜ポテンシャルを持つリポソーム類がいったん作られると、該リポソーム類への抗腫瘍剤類の負荷方法は、該薬剤を外部媒体へ添加ツる極めて簡単な段階へと減少さゼる。

いったん添加すると、透過膜ポテンシャルは自助的にリポソーム類へ該薬剤を負荷する。さらに、下記実施例１に記載したように、この負荷は簡単であるだけでなく極めて効果的である。この実施例に記載したように、９５％以上の抗腫瘍剤類捕捉効果は、透過膜ポアンシＸ・ル負荷技術により達成できることが見出された。

透過膜ポテンシャル負荷方法は、適当な水性媒体（例えばプロトン化し得るアミノ基を有する有機化合物）に溶解したとぎに帯電状態で存在するものであればいかなる抗腫瘍剤でも実質的に使用できる。好ましくは、薬剤は比較的に親油性でなければならないので、これはリポソームの膜を分画する。この方法でリポソーム頬内へ負荷できる抗腫瘍剤類の若干の例としては、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃ　ｉｎ）、？イトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ　）　、プレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ　）　、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）　、スト１ノブｌヘゾシン（ＳｔｒｅｐｔＯＺＯＣｉｎ）　、ビンブラスチン（ｂｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ　）　、ビンクリスチン（ＶｉｎＣｒｉＳｔｉｎｅ　）　、メクロレタミンハイドロクロライド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｎ＋ｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルフアラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ　）　、シクロホスファミド、［・リエチレンチオホスフオルアミド、カルムスチン（ｃａｒｍＵＳｔｉｎｅ）　、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ　）　、セムスヂン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ　）　、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、チオグツ二ｌ／、チタラピン（ｅｙｔａｒａｂｉｎｅ）　、フロクスリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ　）　、デカルレバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ　）　、シスプラチン（Ｃ１ｓｐｌａｓｔ　ｉｎ）およびプロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）がある。

１種の抗腫瘍剤の負荷の他に、この方法は複数の抗腫瘍剤を同時あるいは引続いて負荷するのに使用される。また、イオン化可能な抗腫瘍剤類が負荷されるリポソーム類は、従来の被包技術（例えばリポソーム類が作られる緩衝液中に医薬を配合することにより）を用いて他の抗腫瘍剤または他の医薬を予め負荷しておくこともできる。従来の負荷物質はイオン化可能である必要はないので、このような近づき方は、癌治療におけるリポソーム被包の「医薬カクテル」の製造に大きな幅を与える。事実、実質的に全てのタイプの抗癌医薬は、リポソーム類の脂質または水性部分のいずれかで少なくともある程度予め負荷できる。もちろん、必要により上場のイオン化可能な医薬の１種またはそれ以上は予め負荷でき、かつ透過膜ポテンシャル法を用いてリポソーム類に同一または異種の医薬が添加される。

リポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍剤または他のイオン化可能な生物学的に活性な薬剤の放出速度の低減に関する本発明の面からは、放出速度がリポソーム頬内に該薬剤を保持するために配向しているリポソーム類を越えて透過膜ポテンシャルを著しく形成し得ることが驚くべきことに見出された。すなわち、イオン化したときに正に帯電する薬剤用には、外部ポテンシャルに比較して負でおる内部ポテンシャルを有するリポソーム膜を越えて透過膜ポテンシャルがつくり出されるが、負に帯電している薬剤用には、反対の配向が使用される。

本発明の透過膜負荷の面に関しては、薬剤放出の速度を低減するために使用される透過膜ポテンシャルは、Ｎａ　。

Ｋ＋および、／またはＨ＋のような帯電した種のリポソーム類の内部および外部の濃度を調整することによりつくり出される。事実、このような濃度勾配により生成する透過膜ポテンシャルによりリポソーム類が負荷されると、元の濃度勾配を保つ外部媒体内にリポソーム類を保つことにより放出速度の所望の低減を行なえる。別方としては、透過膜ポテンシャルがリポソーム膜を越えてつくり出されていない場合、例えば１ノボンーム類が従来の技術を用いて負荷されている場合には、所望の透過膜ポテンシャルは、上記交換技術を用いて外部媒体の組成を変えることにより直ちにつくり出されることができる。

本発明の低減された放出速度の而は、リポソーム頬内に被包された実質的にイオン化可能な生物学的に活性な薬剤のいずれも使用できる。特に、この技術は、上記のイオン化可能な抗腫瘍剤類および局部麻酔剤、例えばジブカインおよびクロルプロナジン、β−アドレナリンしゃ新薬、例えばプロパツール、チモロールおよびラベトロール、抗高血圧薬、例えばクロニジンおよびヒドララジン、抗うつ剤、例えばイミプラミン、アミプリブチリンおよびドキセピム、鎮痙薬、例えばフェニトイン、制吐薬、例えばプロ力インアミドおよびプロクロルペラジン、抗ヒスタミン剤、例えばジフェニルヒドラミン、クロルフェニラミンおよびプロメタシン、抗不整脈剤、例えばキシジンおよびシソビラミド、抗マラリア剤、例えばクロロキニーネ、および鎮痛剤、例えばコカインを含む他の種々のイオン化可能な医薬とともに使用できる。一般に放出速度の最大の低減は、その正常な放出速度が通常非親油性物質のそれよりも高いので、親油性物質にみられる。

脱水プロコ・トールに関する本発明の面からは、二つの基本的なアプローチが提供される。すなわち、（１）リポソーム類は、（例えば従来技術または上記の透過膜ポテンシャルを用いて）抗腫瘍剤により負荷され、貯蔵、出荷等のために脱水され、ついで使用時に再水和されるか、あるいは（２）予備成形されたリポソーム類は、貯蔵等のために脱水され、ついで使用時またはその付近に再水和しかつ上記透過膜負荷技術を用いてイオン化可能な抗腫瘍剤で負荷する。

いずれかの場合、リポソーム類は、好ましくは標準の凍結乾燥装置または同様な装置を用いて脱水される。Ｊなわち、好ましくは減圧下に脱水される。必要により、リポソーム類ｄ−３よびその周囲の媒体は、脱水前に液体窒素中−γ゛凍結れる。別りとしでは、リポソーム類は凍結前に単に減圧下置くこと（こより脱水できる。予め凍結しない脱水（よ、凍結を予め行なう場合より長い時間を要するが、方法全体としては凍結なしの場合の方がマイルドで、このため−ａにリポソーム類に対覆る＠傷が小きく、かつリポソーム類の内部成分の損失も小さい。予め凍結することなく室温で′かつ１ｍｍ１ＩＱのオーダーの減圧状態にできる真空ポンプを使用（］て減圧下に脱水リ−ると、約２４〜３６時間を要覆−るが、予め凍結り、て同一条件で脱水すると約１２〜２４時間でｄうる。

」ノポンーム類は、その内部成分の実質的部分を失うことなく脱水方法を残存させるので、リポソーム膜ど相互作用するために、かつ系内の水が除去されるにうに完全に保つために１種またはそれ以上の糖類を使用することが重要でおる。使用される種々の種類としては、トレハロース、シュクロース、ゲルコール、ラクトースおよびデキス１ヘランかある。一般に三糖類は、単糖類よりも優れており、またｊヘレハロースおよびシュクロースのごとき三糖類が最も有効であることか見出された。例えばス１へ１ノブ１〜マイシンおにびジヒドロスｉ〜レプｌ〜マイシンを含むアミノグリコシド類か脱水中にリポソーム類を保護することが見出された。

リポソーム類の内部および外部媒体のいずれかの部分として１種またはそれ以上の糖類か含まれる。最も好ましくは、糖類は内部および外部媒体の両方に含まれるので、これらはリポソーム類の膜の内部および外部表面の両方ど相互作用する。内部媒体への含有は、リポソーム形成工程中（こリポソーム類に被包されることになる緩衝液に糖類を添加することにより行なわれるＯ　１：いていの場合、この緩衝液は最終のリポソーム類用の浴媒体も形成覆るので、緩衝液への糖類の含りも外部媒体の部分にする１、もちろん、元の緩衝液以外の外部媒体が、例えば透過膜ポテンシャル（上記参照）をつくり出すのに使用される場合、新たな外部媒体は１種、またはそれ以上の保護糖類も含まな（プればならない、。

使用されるべき糖の吊は、使用されろ糖の種類および保護されるべきリボソー・へ類の性質に左右される。上記のように、「脱水リポソーム類」の名称で１９８４年８月８日に出願された米国特許第６３８．８０９号の法当個所は参考のために本発明の一部を構成するが、同特許出願から当業者であれば特別なりボソーム製剤用に最適の組合わせを決定する濃度Ｊ″３よび種々の糖の種類を直ちに試験できる。一般に、１ＱＱｍＨ以上のオーダーの糖濃度は、最高のレベルの保護を達成するのに必要なことが見出された。膜リン脂質のモル数の点から、１００ｍＨのオーダーに対するミリモルのレベルは１モルのリン脂質当り約５モルの糖に相当する。

予め凍結せずに脱水を行なう場合、脱水されるリポソーム類が多脂質層（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　１ｉｐｉｄ　１ａｙｅｒｓ　）を有するタイプである場合、また脱水が製剤中の元の水に対して約２〜５％が製剤中に残る終点まで行なわれる場合、１種またはそれ以上の保護糖類の使用か省略できる。

いったんリポソーム類が脱水されると、これらが使用されるまでの期間延長して貯蔵できる。貯蔵に適当な温度はリポソーム類の構成に左右され、また温度感度のいかなる物質でもリポソーム類への被包に使用される。例えば、当業界で知られているように、種々の抗腫瘍剤は熱に不安定であり、このためこのような製剤を含有する脱水リポソーム類は、該薬剤の能力が失なわれないように冷凍状態で貯蔵しなければならない。また、このような薬剤には、脱水方法はｙ温よりもむしろ低温で行なうことが望ましい。

脱水リポソーム類を使用する場合には、再水和は、水溶液、例えば蒸溜水または適当な緩衝液をリポソーム類に単に添加し、これらに再水和させることにより行なわれる。

リポソーム類は溶液を静かに渦巻かせることにより水溶液中に再懸濁できる。再懸濁は室温または他の温度でリポソーム類およびその内部組成の組成に適当に行なわれる。

投与されるべき抗腫瘍剤が脱水前にリポソーム類へ配合され、かつざらに組成変化が望まれない場合には、再水和されたリポソーム類はリポソームで被包された薬剤の投与に公知の方法で癌治療に直接使用できる。

別方としては、上記透過膜ポテンシャル法を用いて、イオン化可能な抗腫瘍剤類は投与直前に再水和化リポソーム類へ配合できる。このアプローチに関連して、透過膜ポテンシャルを発生する濃度勾配は、上記外部媒体交換技術を用いて脱水前または再水和後のいずれかにつくり出される。

例えば、同一の内部および外部媒体を有する、すなわち透過膜ポテンシャルのないリポソーム類は製造され、脱水され、貯蔵され、再水和化され、ついで外部媒体が透過膜ポテンシャルを発生する組成を有する新たな媒体で置換され、かつ該透過膜ポテンシャルはリポソーム類を負荷するのに使用される。別方としては、透過膜ポテンシャルを生じる内部および外部媒体を有するリポソーム類が調製され、脱水され、貯蔵され、再水和化され、ついで透過膜ポテンシャルを用いて負荷される。

いかなる方法においても限定する企図なく、本発明は以下の実施例によりさらに詳細に記載されている。種々の実施例において共通な材料および方法は、つぎのとおりである。

材料および方法托料卵ホスファチジルコリン（卵−ＰＣまたはＥＰＣ）を、標準方法［例えば、シングルトンら（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ）（１９６５）、ジャーナル　オブ　ジ　アメリカン　オイル　ケミカル　ソサエティ（ＪＯｊｌｒｌｌａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏｉｌ　ｃｈｅｍｌｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）、　４２　：　５３］により分離され、かつＴＬＣで測定して９９％以上の純度であった。卵−ＰＳを、ホープら（Ｈｏｐｅ　ｅｔ　ａｍ１９８５）、ビオヒム　ビオフィズ　アクタ（Ｂｉｒｃｈｉｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　８ｔ２　：　５５］に記載の方法により卵−ＰＣから調製した。

」レステＵ−ル、ワリンマイシン、ビンブラスチン、ヘベス、ジパルミトイルボス７７′−＋ジルコリン（ＤＰＰＣ）、１−レバロース、ＣＣＣＰおよび塩類は、シグマ　ケミカルカンパニー（Ｓｉｏｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　（ミズリー州セン１ヘルイス）から得られた。

アドリアマイシンはアトリファ　ラボラ１へり−（八ｄｒｉａ　Ｌａｌ＞０ｒａｊＯｒ＼ｌ）　（オンタリオ州ミツシソらが）またはキャンサーリリーーヂ　センター（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）　（ブリティッシュ］ロンバア州バンク−バー）のいずれかから得られた。メトＩ−レキセイ１〜（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびチトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）もキャンサー　リサーチ　センターから得られた。

１〜リデイエイテツドメトトレキセート（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　ｍｅｔｈ。

ｔｒｅｘａｔｅ）、ＤＰＰＣおよびメチルトリフＴニルホスフォニ２２＋３ラム、また同様に　Ｎａ、Ｈ−イヌ１ノン、１４ｃｍイヌリン、３ト１−テトラフェニルホスフォニウムブロマイドおよび３Ｈ−Ｈ２Ｏはニューイングランド　ニューフレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｏｃｌｅａｒ）　（ケベック州うシーヌ）カら得られた。トリテイエイテッドチトシンアラビノシド（ｔｒｉｔｉａｔｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）はアメルシセム（八ｍｅｒｓｈａｍ）　（オンタリオ州オークビル）から得られた。

試薬グルタミン酸カリウム、、ＫＣＵおよびＮａＣＱはＮａＯＨでｌ）Ｈを７．５に調整した２ＱｍＭのへペス緩衝液中で調製した。この溶液は、それぞれ１５０．１５０および１６９ｍＨのＫＣＱ、ＮａＣＱおよびグルタミン酸カリウムの濃度に相当する通常の３１０ｍ０５ｍ／ｋｇの浸透性（Ｏ３ｍＯｔａｌ’ｉｔｌ／）に調整された。

ベシクル製剤ベシクル類は、上記米国特許出願第６２２　、６９０号および同第６２２　、５０２号に記載の押出技術を用いて調製した。使用されるこの技術の完全な記載は、これらの出願にみられ、かつ参考のために本明細書の一部を構成する。この技術はまた、ホープら（ｔｌｏｐｅ　ｅｔ　ａｌ）（１９８５）、ビオヒム　ビオフィズアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　ＢｉｏＤｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　８１２：　５５−６５］にも記載されている。これらの技術で製造されたベシクル類は、本明細書中においてＥＴＶ類、すなわち押出技術ベシクル類（旦ｘｔｒｕｓｉｏｎ　工ｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ　）またはＬＵＶ類、すなわち大きなユニラメラリポンーム類（Ｌ　ａｒ！Ｊｅ　Ｕｎｌｌａｍｅｌｌａｒ　Ｌ　！［）Ｏ３ＯｍｅＳ）として参照される。

簡単にいえば、乾燥脂質フィルムは２５〜１００μｍＯ１のリン脂質／厩の濃度範囲で大きなマルチラメラベシクル類を製造するために適当な緩衝液で水和される。使用時に２２＋は水和前に　Ｎａ　（５μＣｉ）または３１」−イヌリン（５μＣ＋＞か乾燥脂質に添加される。

混合物を渦動により分散させ、ついで例えば２５０ｐｓｕの圧力を用いて１１００ｎの孔径の２枚の積重ねたポリカーボネートフィルタ「ヌクレボア、インコーボレーテツド（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、　Ｉｎｃ、）　、カルフォルニア州プレザントンコを１０回通過させた。実施例１Ｂおよび２Ｂの実験には、分散液は液体窒素中で凍結され、かつ押出前にボリカーポネー１〜フィルタを５回解凍した。

得られるベシクル類は１１０３ｎの平均粒径を有し、かつ約１，５μ、Ｑ／μｍｏｌ　リン脂質の捕捉容積を有していた。実施例１および２の残りの実験用には、液体窒素中で２回の凍結−解凍のサイクルにより最初の押出を行ない、その後、５回以上フィルタを通過させた。この場合、ベシクル類は９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ再び約１．５μｐ、／μｍｏｌ　リン脂質の捕捉容積を有していた。

２２＋３被包されなｈじた　Ｎａ、Ｈ−イヌリンを、２２Ｎａ１の除去用にはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　−５０、また３Ｈ−イヌリン除去用にはウルトラゲル（υｌｔｒａｇｅｌ）Ａ　ＣＡ３４のカラム（１，４Ｘ１０ｃｍ）にベシクル類を通過させて除去した。この方法は、一般に試料のリン脂質含量を約５０％まで希釈する。

脱水試料（１ｍｌ）をバーチスフリーズドライヤー（Ｖｉｒｔｉｓ　ＦｒｅｅＺｅ　Ｄｒｉｅｒ）　にューヨーク州ガーディナー）を用い高真空下に室温で１０ｄのキメックス管（Ｋｉｍｅｘ　ｔｕｂｅ）内で乾燥した。いくつかの場合、試料を脱水前に液体窒素中で凍結させた。それぞれの場合、減圧脱水法を約２４時間行な１〜７日間脱水および貯蔵をおこなったのち、試料を蒸留水（９００μΩ）で再水和化し、ベシクル類をゆるく渦動させて分散させた。

権定リン脂質はチェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ）　、（１９５６）アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌ、　ｃｈｅｍ、）　２８：　１７５６の記載により無機リンの測定により定量した。同様にボッチャーら（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ）　、（１９６１）アナル　シマ　アクタ（Ａｎａｔ、　Ｃｈｉｎａ、　Ａｃｔａ　）　２４：　２０３を参照。別方としては、おル場合には液シンチレーションカウンティングを行なって定量した［　３Ｈ］　ＤＰＰＣ（０，０５μｃｉ／μｍｏｌ脂質。

アドリアマイシンは、ベシクル懸濁液の分別量を０．５％のトライ１゛ン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００（これはベシクル類を分断しかつ捕捉されている薬剤を放出する）と混合し・、パイ　ユニカム（Ｐｙｅ　Ｕｎｉｃａｍ）　Ｓ　Ｐ　８−２００分光光度計を用いて４８０ｎｍにおける吸収を検定した。ビンブラスチンは、９４％エタノール中に溶解した懸濁液の２６５１ｍに、１１３ける吸収を測定することにより検定１ノだ。

種’？　１７）　ｉ〜１，１７−１’　エイテッド化合物（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）Ｊｊにヒ１４Ｃ−イヌリ／ハＴ）イ’）　ツ７：１．　（ＰｈｉｌｌｉｒｌＳ）　ＰＷ４７００液シンデレージョンカウンターににリカラン１へし、２２Ｎａ＋はベックマンガン？　８００　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｇａｍｍａ　８００　）でガンマカウンティングで定量した。

本実施例は、透過膜ボテンシトルを利用（）たイ５７１′ン化可ｒＪＩな抗腫瘍剤の活性負荷を説明するものである。

実施例のＡ部は、透過膜ポテンシャルを発生ずるためにｘ　ａ＋　、、′Ｋ　＋勾配を利用したリポソーム類中に抗癌剤て゛あるアドリアマイシンおよびビンブラスチンの負荷を説明（）、３部は１）ｌ−（勾配を利用したアドリアマイシンの負荷を説明し、また０部はメ１ヘトレキセイトまたはチトシンアラビノシドのいずれかにより予め受動的に負荷されたリポソーム類ヘアドリアマイシンを負荷させるための透過膜ポテンシャルの利用を説明する。

Δ都Ｎａ＋、／に＋勾配を利用した活性負荷膜ポテンシャルは、グルタミン酸カリウム緩衝液（上記）中で卵−ＰＣＬＵＶ類を形成することにより発生させ、ついでセファデックスＧ−５ＯｆｌＲ塩カラムを用いてＮａＣΩ緩衝液（上記）用に未捕捉緩衝液と交換した。使用した場合、カリウムイオン透過担体、ワリンマイシン（１ｍＭｄ王タノール）を添加して０．５μ９．／′μｍｏｌ　リン脂質の濃度にし、た。膜ポテンシャルは、膜ポテンシャルのプローブであるメチル１ヘリフエニルホスフオニ１クム［バリーら（Ｂａｌｌｙ　ｅｔ　ａｔ　）　、（１９８５）　、　Ｉｆオノイム　ビオフイズアクタ（Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　、８１２．：６６を参照。Ｊ、た下記実施例４を参照。ここでは１０−プはメチル１−リフＪニルボ、スフオ一ウムよりもむ（）ろア］− ・ラフエニルホスホニウムが使用されている。」アドリアマイシン（０，２ｍＭの最終濃度）およびビンブラスチン（０，２ｍＭの最終濃度）を、Ｎａ、／Ｋ　イオン勾配のあるＪ二たはないｌ−Ｕ　Ｖ分散液にワリンマイシンとともにおよびなしに添加した。種々の時間で、隔離されていない医薬が、該溶液の一部を１ｄのゼノｊ−ｆツクスＧ５０カラムに通すことにより除去した。′）いで脂質および医薬濃度は上記方法を用いて検定された。その結果は１．第１図および第２図に示されている。

第１図に示すように、Ｎａ、／′Ｋ　勾配およびワリンマイシンの両方かない場合、低いＬＵＶ会合アドリアマイシンのレベル（５部ｍＯ＋アドリアマイシン、／μｌｌ１ｏｔ　リン脂質以下）か２時間の培養で観察された。しかしながら、ワリンマイシンおよびＮａ、／Ｋ　勾配が存在すると、ベシクル会合アドリアマイシンの債の著しい増加が観察される。この吸収は２０分以内で７５％以上完成し、１９０ｎｍｏｌアドリアマイシン、／μｍｏｌ　リン脂質の平衡レベルに達する。これは、溶液中に最初含有されていた９５％の薬剤がベシクル類によって吸収され、９５％の捕捉率に相当する。濃度の点から、この吸収は約１２７ｍ）ｔの内部アドリアマイシン濃度に相当する。

第２図に示すように、ビンブラスチンも膜ポテンシャルに応じてＬＵＶ系内に蓄積できる。ワリンマイシンおよびＮａ　／Ｋ　勾配が存在する場合には４Ｑｎｍｏｌビンブラスチン、／μｍｏｌ　リン脂質は、Ｎａ、／Ｋ　勾配がない場合のほとんどゼロに近い吸収と比較して２時間以内に蓄積される。ざらに、望ましい吸収はワニリンマイシンがなくてもＮａ、／Ｋ　勾配の存在によりｊｑられる。

要約すれば、第１図および第２図の結果は、透過膜ポテンシャルに応じてアドリアマイシンおよびビンブラスチンを隔離するＬＵＶ系の著しい能力を明らかにしている。使用する条件下では、吸収レベルは、それぞれビンブラスチンおよびアドリアマイシンの２Ｘ１０２および２Ｘ１０４の最終透過膜医薬濃度勾配に応じて達成される。ざらに、これらの勾配は２０’Ｃで４０時間以上安定で必ることか見出された。

操作について特別な理論に結びつけることを望むものではないが、Ｎａ　／Ｋ　勾配に応じてアドリアマイシン、ビンブラスチンおよび他のイオン化可能な抗腫瘍剤にみられる吸収に含まれる機構は、Ｈイオンに対するリポソーム膜の透過性に基づ＜Ｎａ＋／に＋勾配に応じて自動的に発生するｐＨ勾配を含むものと思われる。この機構によれば、イオン化可能な抗腫瘍剤は、内部および外部ｌ」　イオン濃度であるその内部および外部濃度および内部Ｈ濃度が高い場合に高い該薬剤の内部濃度により非帯電状態で膜を通過する。

透過膜ポテンシャルの負荷方法は、ざらに使用される医薬の量が変えられることに特徴がある。第３図に示すように、所定のベシクル濃度を保ちながらく１ｍＭリン脂質）を保ちながら、Ｏ〜１Ｑｍ）ｌの初期アドリアマイシン濃度を増加することは、透過膜ポテンシャルで作動されるアドリアマイシンの吸収法が約４ＱＱｎｍｏｌアドリアマイシン／μｎ。

１リン脂質で満すことが明らかである。Ｏ〜Ｑ、２ｍｔ４のアドリアマイシンで、その吸収は最初の遊離濃度に釣合いかつほぼ定借的（９５％以上の捕捉効率）である。０．２ｍＭ以上のアドリアマイシンで、捕捉効率は吸収法の飽和により減少する。Ｌ２かしながら、これらの高い医薬濃度での高い捕捉効果は、ベシクル濃度増加の簡単な方策により直ちに達成できる。例えば、５ＱｍＨのリン脂質濃度に相当するＬＵＶ類の存在下に１ＱｍＭのアドリアマイシンを培養づると、９８％の捕捉率に相当する１９６　ｎｍｏｌアドリアマイシン、／　ｇ　ｍｏ　ｌ　リン脂質のレベルの吸収か生じる。

ビ〉′シラスｙ；／を使用した同様な研究により、４０ｎｎ＋ｏｌ［二′ンブラスヂン、／、７μｍｏｌ　リン脂質で吸収レベルか満足りることか明らかとな− ）た。１０　（−）　％　ｉこ近い捕捉率は、５吐のリン脂質に相当するり、　ｔＪ　Ｖ類の）９度で０．２ｍＭのビ′ンブラスヂンの培Ｎを・行なうことにより達成される。。

リポソーム系医薬システムは、平衡Ｉ、ノベルのコレステロールお上び面ぎｊ成分により誘発される捕肯：物質の漏出を減少させさら（２−飽和されたリン脂質を通常含むのて°［例え（Ｊ転子ｐＹシンら（Ｇａｂｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ　）　（１９８２）キＡ７ンサー　レノス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ？ｅＳ、）　、　４２　：　４７３４メイＬ：　ニーら（ＭａｙｈｅＷ　ｅｔａｔ　）　（１９７９）　”ｆ　ｔ　：”）−１−リーｂ　ｌ／ｉｊ′−ｌ”　（１）ａｎＣｅｒ丁ｒｃａｔ、　１ｌｅｐ、　）　、　６３　：　１９２３、Ａ３よびババハジニ：１：／”−ロス１−５（Ｐａｌ）ａｈａｄＪＯＩ）ＯｔｌｌＯ３ｃｌ、’　ａｌ　）　（１９８０）　、リポソームス　アント　イムノ［］ジー（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　（丁０１１１ａｎｄ　Ｓｉｘ、　ｅｒｌｓ）　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅ）＊　Ｙｏｒｋ）　９照のことコ、研究は卵ＰＣＬＵＶ系へのアドリアマイシンの活性捕捉に関するコレステロールの影響を測定して行なった。第４Ａ図に示すように、２０’Ｃで平衡量の卵−ＰＣ／コレステロール１ノベルを達成するためのコレステロール含量の段階的増加は、アドリアマイシン蓄積速度の相当する減少をもたらす。しかしながら、急速な吸収は高温でベシクル−医薬系を単に培養することによってもなお達成できる。第４Ｂ図に示すように、平衡吸収レベルは、も３７°Ｃで３０分以内に達成できる。この効果は、３０分間培養したの＃３４２ｎｍｏ　ｌ　、、ｌ　ｇ　ｍｏ　ｌ脂質から１５３　ｎｍｏｌ／μｍＯ１脂質へのベシクル−会合アドリアマイシンの増加が２０’Ｃから３７°Ｃへの温度−Ｌｉによって生ずる卵−ＰＣ／コＬ／ステ日−ル（１：１）系用で最も明らかにされた。これらの結果、ベシクル内部に医薬の効果的な輸送にむし・ろＦ液体−１を右°することか重要であることを示り、でいる３、アドリアマイシンの透過膜ポテンシャル負荷に関するリン脂質アシル鎖の増大した飽和度の効果は、ＤＰＰＣ−コロスプロール（１：１）Ｌｉ−ハフ類への吸収を検出することにより試験された。（−）かしながら、６０　’Ｃでの培養は、２時間て゛１５Ｑｎｍｏｌ医薬／′μ＋＋ｉｏｌ脂質の隔離されたアドリアマイシン蓄積速度を生じる１、さらに、重大な吸収（約６ＱｎｍＯＩ、／μｍｏｌ脂質まで）がワリンマイシンの不存在下に培養したこれらの系で観察された。同様に、卵−ＰＣＬＵＶ類には、それぞれ３７℃および６０℃で６０および１００ｎｌｌｌｏ　ｌ　／μｍｏｌ脂質のアドリアマイシン吸収レベルが達成された（第５図）。

アシル鎖組成およびコレステロール含量の変動の他に、生体内分布および吸収工程に影響する帯電した脂質種もリポソーム系分配系に配合された［フレーリーら（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｔ）　（１９８１）パイオゲミストリー・（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、　２０＋６９Ｔ８、ヨナら（、Ｊｏｎａｈ　ｅｔ　ａｌ　）　＜ｔ９７５）ビオヒム　ごオフィス　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　、４０１：　３３６およびモーフらＵａｕｋ　ｅｔ　ａｌ）　（１９７９）　、ブロク　ナトツルかこのような系を利用できることを示ずために、アドリアマイシンの卵−ＰＣＬＵＶ類への透過膜ポテンシャル負荷に関して酸性（負に帯電）リン脂質、卵−ＰＳの効果を測定した。第６図に示すように、２０モル％の卵−ＰＳを含有する系は、卵−ＰＳの不存在下（第１図）に観察されたのと実質的に同一であるワリンマイシンの存在下に医薬吸収の挙動を示した。しかしながら、純粋な卵−ＰＣ系とは対照的に、ワリンマイシンの不存在下にＬＵＶ類含有卵−ＰＳにおいては著しい吸収が観察された。卵−ＰＳ含最の２モル％から２０モル％への増加は、このような吸収（２時間の培養）＠３０から７ＱｎｍＯＩ７ドワ７マイシン／μｍｏｌ　リン脂質に増加させた。

旦那ｐＨ勾配を利用した活性負荷透過膜ｐＨ勾配、１５０ｍＭのＫＯＨおよび１７５ｍＭのグルタミン酸（ｐＨ４，６）中でＬ（ＪＶ類を形成させついでセファデックスＧ−５０脱塩カラムを用いて１５０ｍＭのＫＯＨ１１２５ｍＭのグルタミン酸および３０ｍＭのＮａＣ！１１の未捕捉緩衝液で交換することにより発生させた。［ホープら（）ｔｏｐｅｅｔａｌ）、（１９８５）、　ドア１−Ｌｌ　ｅ−；ｌｒフィＸ　７クタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　、８１２：５５コ。使用する場合には、プロトンイオン透過担体（エタノール中の１０ｍＭ＞を添加して１０μ Ｍの濃度を達成した。

アドリアマイシン（０，２ｍ）Ｉの最終濃度）をＬＵＶ分散液に添加した。種々のときに、隔離していない医薬を１ｄのセファデックスＧ−５０カラムに該溶液の一部を通過ざ第７図は、透過膜１）Ｈ勾配を示すＥＰＣおよびＥＰＣ／コレステロールより構成されるＬｔＪＶが、プロトンイオン透過担体の不存在下にアドリアマイシンを蓄積することを示す。２０℃で、５０％の最大吸収が、それぞれ５０分間およびＥＰＣ／コレステロールおよびＥＰＣＬＵＶ類用に５分以下観察された（第７Ａ図）。これらの結果は、二つの膜系の相対的プロトン透過性と一致する。ＥＰＣおよびＥＰＣ／コレステロールベシクル類に観察される捕捉率パーセントは、上記報告された値と比較してＮａ　／Ｋ”勾配に対してそれぞれ９Ｂおよび７２％でおる。コレステロール含有ＬｔＪＶ類の場合に得れる僅かに低い債の吸収は、これらのベシクル類がＥＰＣベシクルよりも僅かに低い捕捉容積を有するという事実に基づく。

培養混合物にｃｃｃｐを包含させると一時的にアト１ノアマイシンの高いレベルでの蓄積かあり、つづいてベシクル内部から徐々に放出された。ＬＵｖ系は明らかにプロトンを充分透過してＣＣＣＰの不存在下にアドリアマイシンを蓄積するので、イオン透過担体の添加は、ｌ）Ｈ勾配を損ない、その結果、非常に大きな透過膜医薬濃度勾配を保つ玉ネルギー力が減少するようである。

培養温度を３７°Ｃに増加させると、ＥＰＣ，／コレステロールＬ　ｔＪ　Ｖ類の吸収速度（第７Ｂ図）か２０’Ｃで平衡にした系（第７Ａ図）と比較しで増大した。ＣＣＣＰの不存在下で昇温１ノだＥＰＣベシクル類では２０分後にアドリアマイシンのゆるい放出かあったが、イオン透過担体か存在すうる場合には急速な放出が起った。これらの結果は、種々のＬ　Ｕ　Ｖ系に対する相対プロトン透過性に相当する。

９部叫逓的、／受快飽負荷−「ｌカクテル↓親油性またはカチオン性を示さない水溶性抗癌剤であるメト・トレキセートおよびチ１ヘシンアラビノシドを、最初のベシクル形成工程中にＬ　Ｕ　Ｖ類に受動的に被包させた。

簡単には、卵−ＰＣＬＵＶ類（１８７μｍｏｌ　リン脂質／ｄ）か、２０ｍｏ／ｍｅのチトシンアラビノシド（２μＣｉ／ｄ［３ＨＥチｌ〜シンアラビノシド）または１０ｍｇ／＊メトトレキセート（２μＣｉ、／ｍ！！、［３Ｈ］メトトレキセート）が添加された上記グルタミン酸カリウム緩衝液中で発生した。ベシクル類は、ついで上記ＮａＣｊ緩衝液で予め平衡にしたゲルフィルトレージョンカラムに通し、未捕捉の医薬を除去し、Ｎａ＋／に＋化学勾配を確立し・ｌこ。この方法で調製されたＩＵ’ｖ’類の分析の結果、３３％の有効なチ１〜シンアラビノシドまたはメ１へ１〜レギセー１−か被包されていることが判明した（第１表参照）。

メトトレキセー　トおよびヂトシンアビ、ノシドの受動的捕捉につづいで、Ｎａ４／に＋勾配およびワリンマイシンを用いてアドリアマイシンをベシクル類に能動的に負荷さけた。特に第１表に示すように、０．２１ＴＩＭのアドリアマ・イシンの存在下にベシクル類（１，０ｍ）ｌのリン脂質）を培養すると、９８％の有効なアドリアマイシンの吸収か生じた。

アドリアマイシンにみられる捕捉効率と吸収レベルは、受動的に捕捉さ”れた医薬の不存在下にみられたそれらとほとんど同一であった（第′１表と第１図および第２図を比較のからのチャージされた医薬の放出速度の低減この実施例は、イオン化可能な医薬がリポソーム類が放出される速度を低減する透過膜ポテンシャルの能力を説明するものである。本実施例のＡ部および８部は、それぞれ必要の透過膜ポテンシャルを発生させるためのＮａ＋、／に＋勾配およびｐＨ勾配を利用を説明するもので医薬放出速度低減のためのＮａ　／Ｋ　勾配の使用実施例１Ａに続いて行なわれた活性捕捉に引続いてＬＵＶ類からのアドリアマイシンの放出は、つぎのようにして検定された。アドリアマイシンを含有するベシクル類（１０ｍＭリン脂質）は、最初遊離の医薬を除去するために上記のＮａＣＣまたはＫＣｐ緩衝液で平衡にした１５ｍ１２のゲルフィルトレージョンカラムを通した。ついで、３７°Ｃで平衡にした流通平衡装置に溶質をおいた。流通速度は、試料区分容ｆｉ（５（Ｍりの全交換が２０間以下で起るように調整した。一部分（１００μｐ）は種々の時間で除去され、かつ未捕捉の物質は１威のゲルフィルトレージョンカラムを用いて分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンおよびリン脂質を検定した。

これらの実験の結果は、第２表に示されている。この表から明らかなように、Ｎａ　／Ｋ　透過膜か存在すると、卵−ＰＯ２卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（８：２＞および卵ＰＣ／コレステロール（１：１）ベシクル類の医薬保持時間か非常に長くなる。同様な試験をＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／コレステロール（１：１）ベシクル類についても行なった。この場合、複雑な医薬放出の動力学か観察され、Ｔ２Ｏを決定することは困難である。しかしながら、一般に、Ｎａ　／Ｋ　勾配は、この組成のベシクル類には保持時間が著しく増加しないことが判った。測定されたデータは、２４時間で約４４％の医薬か放出され、透過膜Ｎａ＋／に＋勾配が使用されるか否かには関係ないことを示している。

８部医薬放出速度を低減させるためのｌ）Ｈ勾配の使用実施例１Ｂの方法を用いて活性負荷をおこなったのち、しＵＶ類からのアドリアマイシンの放出を、つぎのようにして検定した。すなわちアドリアマイシンを含有するベシクル類（５ｍＨのリン脂質）を最初適当な緩衝液で平衡にした１５ｍＩ！のゲルフィルトレージョンカラムを通して遊離の医薬を除去した。ベシクルを含有する区画を３７℃で平衡にした流通透析装置にあいた。流通速度を試料の区画容量（５０ｍ）の全交換が１０分でできるように調整した。一部分（０，’１５７りを数回にわたって削除しハかつ未捕捉の物質を１ｍｌのゲルフィル１−レーション力ラムを用いて分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンおよびリン脂質を検定した。ｐＨ勾配の存在下（パネルＢ）および不存在下（パネルＡ）でのＥＰＣＬＵＶ類（丸印）およびＥＰＣ／コレステロールＬＵＶ類（四角印）についての放出性を第８図に示す。熱印はＮａ　／Ｋ　勾配の不存在下での放出性を示し、自失印はこのような勾配の存在下での放出性を示す。特に、第８Ａ図では、アドリアマイシン含有ベシクル類を内部１）Ｈと同じにりＨ４，６に調整された緩衝液で平衡にした脱塩カラムを通し、第８Ｂ図では、ベシクル会合１の分離中に外部Ｄ　１１を７．５に保持した。

第８図に示すように、全ての場合、透過膜ｐＨ勾配を除去すると、アドリアマイシンの流出速度か箸しく増大する。

Ｎａ＋、／に＋勾配の不存在下（熱印）に［）Ｈを７．５から４．６に減少；５　ｔ　ｌ＞　ト、ＦＰＣ／”］、］ｚステｏ−ル１−ｔＪＶ類四角中）て【９上捕捉襲剤の５０％放出「４間か２４時間からｔ１時間（Ｊ″、またＦビｃｔ−ｕｖ類（丸印）では３時間から１時間未満に減少し７だ。放出の動力学に対する影響は、「）１」勾配あ」、びＮａ、、／Ｋ　勾配の両名がｐＨ勾配のみの代りトー使用される場合（ζはＥＰＣ，／”−ルスデ［１−ルベラクル類（、：　Ｇ；夫みられなかっ）た（熱印と白抜印とを比較されたＬ））。

Ｌ／　カＬ　’；Ｋ　７３’ら、卵−ＰＯ系で１ヨ７、ｌ）　Ｈ勾配とＮａ＋／Ｋ”勾配どの組合４月！は、［）［１勾配のみで達成する場合より保持［ｌ、１間が長り４Ｊ：る［黒丸印（Ｄ　Ｉ−（のみ）と白↑友丸印（！’ｌ　ｔ　１ニー　Ｎ　；１　”　、％　Ｋ　”　）とを比較されたし７）。この効果は、Ｎ（ λ４・’に＋勾配が０１−１勾配虹加わっＩ、：場合（、ニアドリフ″ン〜Ｃシ ′ンの５０％放出時間か３時間から１６時間に増大する透過膜Ｄ　）−１勾配（パ堂ル［１３）の存在下では、ＥＰＣＬＵＶｍには最も若しい。１６時間Ｔ　５０値もＮａ＋／に＋勾配のみを使用してＥ　Ｐ　Ｃベシクル類で得られることに注目されたい（第３表参照）。

実施例３抗腫瘍剤を含有するリポソーム類の脱水この実施例は、抗腫瘍剤であるアドリアマイシンを含有するリポソーム類の脱水およびその後の再水和を説明するものである。

卵ホスフ１デジルコリンＥＴＶ類を２５０ｍＭの１へレバロースを含有りる溶質溶液Ｃ１６９１１ＩＨのグルタミン酸カリウ／＼、２０Ｉ７１Ｍのヘペス（ｏｆ −１７，４＞、４０μｍｏｌ脂質／ｍ］脂質用して−に記のようにして調製した。ついで、外部カリウム緩衝液をすｌ・リウム緩妊ｉ液［１５０ｍＭのＮ　ａ　Ｃｐ、２ＱｍＭのへベス（ｐＨ７，４＞、２５０ｍＭトレハ１トレハロ−ス］Ｊ　ＩＣ。アドリアマイシン（２００ｍｎｏｌ／　μｍｏｌ脂質）を、ワリンマイシン（０，５ｆｚｑ／μｒｏｏｔ脂質とともに加えて膜ポテンシャル＠発生させた。２時間培養したのち、上記の１・１ツバロース含有ナトリウム緩衝液で平衡にしたセフ−，７デツクスＧ−５０のカラムにベシクル類を通して末被包アドリアマイシンを除去した。ＦＴＶ類は、予め凍結することなく２４時間で脱水し、ついでよ記のようにして再水引化（〕た、　ＪＩ５２水２７′再水和７′再水和の両方においてベシクル頬内の捕捉されたアドリアマイシンの吊ならびにベシクル類からの医薬漏出の速度は、セファデックスＧ−５０のカラム（１ｍｌ）にベシクル懸濁液の１００μｐの部分を通して未捕捉物質を除去したのら、上記検定方法〈「検定」の項参照）を用いて測定した（さらに詳細には米国特許第６２２．６９０号参照のこと）。このカラムは使用されるリポソーム類の少量パーセントが捕捉されるので、脱水、／再水和工程後に保持される被包物質のｆｆ１Ｊについて測定された値は、本メを明の方法で実際に達成されるレベルよりも幾分低い。

これらの実験の結果は、第３表に示されている。ここに示すように、３０％を越える医薬が脱水および再水和後に保持される。さらに、アドリアマイシンの再水和ベシクル類からの漏出速度は、脱水されなかったベシクル類でみられる速度に匹敵する（データは示さず）。

実施例４透過膜ポテンシャルを利用した再水和リポソーム類へのイオン化可能な抗腫瘍剤の負荷この実施例は、（１）膜を越えての濃度勾配を有するリポソーム類が、保護糖の存在下に脱水され、かつ濃度勾配の損失なしに再水和されること、および（２）再水和後に、濃度勾配かイオン化可能な抗腫瘍剤（アドリアマイシン）をリポソーム類へ負荷するのに使用し得ることを説明するものでおる。

膜を越えてのＮａ”／に＋化学勾配を有するベシクル類を、グルタミン酸カリウム緩＠液（１６９ｍＭのグルタミン駿カリウム、２５Ｏｎ＋Ｈのトレハロース、２０ｍ）ｌのへペスｐＨ７，４＞中でＥＴＶ類（４Ｃ１ｍｏｌ脂質／ｍｌ）ヲ形成し、ついでＮａＣｐ溶液で予め平衡にしたセファデックスＧ−５０カラム（１，４Ｘ１０ＣＩＩｌ）にベシクル類を通してＮａＣｆ１緩衝液（１５０ｍ）！のＮａＣ１）、２５０ｍ１４のトレハロース、２０ｍＭのへペス、Ｉ）Ｈ７，４＞で外部緩衝液を置換することにより調製した。使用時にワリンマイシン（ミズリー州セントルイスのシグマ社製）を０．５μＱｉμｍｏｌ　リン脂質の濃度になるように添加した。

同様に、透過膜ｐＨ勾配（内部酸）を、低いｐＨ（１３５ｍＭのグルタミン酸、２５０ｍ）ｌのトレハロース、水酸カリウムを添加１ノてｐＨを５．５にした〉を有する緩衝液中でリポソーム類を調製し、ついで高いｐＨ（１２５ｍＭのグルタミン酸、３０ｍＭのＮａＣＵ、２５０ｍＭの！”−１／　ハ０−ス、水酸化力ｆノウムを添加してｐＨを７．５にした）を有する緩衝液を用いてセファデックスＧ−２０で交換した。使用する場合、プロトンイオン透過担体ＣＣＣＰを最終濃度２０μＭに添加した。

透過膜ポテンシャルは、親油性カチオン３Ｈ−テ１−ラフ工二ルホスフオニウムブロマイド＜　３Ｈ−ＴＰＰＢ、カナダ国ＮＥＮ）の分布を決定することにより測定した。特に、１μ９のエタノール中の１μＱｉの３Ｈ−ＴＰＰＢをＥＴＶ分散液の１〜２ｍ１ｔの試料に添加し、かつその混合物を２０℃で２０分間培養した。一部分（１００μＱ）除去し、未捕捉の３Ｈ−ＴＰＰ＋を１／Ｍ！の使い捨て可能なシリンジに充填したセファデックスにその一部分を負荷することにより除去し、ついでこのカラムを５００ｇで３分間遠心してベシクル類を溶出させた。捕捉された３Ｈ−ＴＰＰ”は液体シンデレージョンカウンティングにより測定し、かつリン脂質はホスフェートアッセイにより測定した。

ＦＴＶ法によりＥＴＶ類内に捕捉された　Ｎａ、３Ｈ−イヌリンまた【ま１４Ｃ −イヌリンの但を測定することにより決定されたＥＴＶ類用の捕捉容量値（μρ 、／被のリン脂質）を使用して、ベシクル類の３Ｈ−ＴＰＰ＋　（内側［３ト」 −Ｔ”ＰＰ＋１　・４３よび外側［３Ｈ−ＴＰＰ＋］。の濃度を計暉し、これから、透過膜ポテンシャル（１，）はネルンスト式を用いて計算した。

■　・−５９１０！］［３１−１−Ｔ　Ｐ　Ｐ　コ　・　／［３Ｈ−ＴＰＰ　］ｍ　０１　′ Ｎａ／Ｋ　およびＤ　Ｈ勾配ベシクル類の両者ば、高真空下に２４時間脱水し、ついで再水和した。比較のためのベシクル類は４°Ｃで２４時間保持した。乾燥しかつ再水和したのら、イオン透過担体の存在下または不存在下にこれらのベシクル類により示される透過膜ポテンシャルは、同様にイオン透過担体の存在下または不存在下に比較例のものにより発生した透過膜ポテンシャルに匹敵した。その結果は、第９図（ｐＨ）および第１０図（Ｎａ　／Ｋ　）に示すとおりでおる。

これらの図面に示されるように、脱水されかつ再水和されたベシクル類ににり示される透過膜ポテンシャルは、比較例のものにより示されるものと実質的に同一でおる。唯一の明白な差違は、ｐＨ勾配ベシクルの場合、脱水／再水和ベシクル類の透過膜ポテンシャルか、比較例のベシクル類の透過膜担体より幾分低いということである。

脱水および再水和後にアドリアマイシンを蓄積するＮａ１、／Ｋ　ベシクル類の能力を、イオン透過担体の存在下または不存在下に試験し、比較例のベシクル類、すなわち２４時税水するよりもむしろ４℃で２４時間保存されたベシクル類により示される蓄積と比較した。充分なアドリアマイシンをベシクル類の外部媒体に添加して０．２七ルーアドリアマイシン、／１モルーリン脂質の最終濃度にした。

これらの試験結果を第１１図に示す。ごこにみられるように、脱水／再水和ベシクル類は、比較例のベシクル類と実質的に同一の速度および同一程度で７ドリアマイシンを蓄積する。したがって、この例は、ベシクル類の遅延した負荷が濃度勾配と脱水２／再水和工程との結合により達成されＩＨることを示すものである。

第１表メ１〜ｌヘレキセ−１へ　３３　３５．３＋アドリアマイシン　９９　９９チトシンアラビノシド　３３　４４．５＋アドリアマイシン　９８　９８ビンブラスヂン　９０　３６アドリアマイシン　９５　９５メ１〜トレキセートを、ベシクル類の製造中（１８７μｍ。

１の脂質／―）に、２０ｍＭの濃度で受動的に捕捉した。アドリアマイシンは、ワリンマイシンの存在下に、１！Ｉ！）ｌのリン脂質に相当しかつ１００μＭで始まるアドリアマイシン濃度のベシクルとともに透過膜Ｎａ＋／に＋勾配を用いて捕捉された。チトシンアラビノシドは、ベシクル類（１８７μｍｏｌの脂質／７りの製造中に２５＋ｎＨの濃度で受動的に捕捉された。またビンブラスチンは、ワリンマイシンの存在下に５ｍＨのリン脂質に相当しかつ２００μＭで始まるビンブラスチン濃度のベシクルとともに透過膜Ｎａ＋　、／に＋勾配を用いて捕捉した。

第２表卵−ＰＣアドリアマイシン　ＫＣρ　１，５ＮａＣρ　１６卵−ＰＣ／卵−ＰＳ　アドリアマイシン　ＫＣＵ　１．５（８：２）　ＮａＣＣ６卵−ＰＣ，／Ｃｈｏｌ　アドリアマイシン　ＫＣ！Ｑ　４（１：１）　ＮａＣ１１ｌ　３０医薬を被包したのち、外部緩衝液および未捕捉の薬剤を、特定したようにＫＣΩ またはＮａＣΩ緩衝剤で置換された。

Ｔ２Ｏは、捕捉された薬剤の５０％をベシクル類から放出する必要な時間を示す。

第３表アドリアマイシンを保持するｌセレ又証久胚虱勉皿力アドリアマイシン（含量）ｎｍｏ　ｌ　、／　ｎｍｏ　ｌ脂質 −−一一−島−−−−靜一−−鯉−２−−一一峙一説水前　１９７１悦水ａ３よび再水和直前　１８５脱水１および再水和後１時間　１５Ｂ脱水および再水和後２時間　１４５ｎ　ｍｏｌｅ　ＶＩＮＢ／　ｐ　ｍｏｌｅ　ＰＬＰ促されＥｚＡシ門　ヅ。

ｎ　ｍｏｌｅ　ＡＤ、Ｍ／Ｐｍｏｌｅ　Ｒ躇ｎ　ｍｏｌｅ　ＡＤＭ／ｐｍｏｌｅ　ｇ謹ミｎ　ｍｏｌｅ　ＡＤＭ／、ｕ　ｍｏｌｅ　ＰＬミミｎｍｏｌ　八〇Ｍ／Ｈｍｏｌ　鮨τ（ミｎｍｏｌ八〇Ｍへ）ＪＩＴＩＯＩ　ｐＪ′ｉｉ買０　４　日　１２　１６　２０　２４市（４閣）１６８Ｂ直配（β１問）ＦＩＧ、　１０岬嘴動）テシリｒ打シ・シセ吃之’ＩＩＸ手続ネ由正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１５０１フ４レスタルセンター　ワン　リザーチ　ウェイ（番地なし）名　称　ザ　リポソーム　カンパニー、インコーホレーテッド代表者　ブルーム、アレン国　籍　アメリカ合衆国および「特許出願人」の欄７、補正の内容く１）別紙添付の特許法第１８４条の５第１項の規定による書面のとおり。

（２）別紙添付の明細書および請求の範囲の翻訳文の浄書のとおり国際調査報告１ＭｍｍａＬ１６ＭＩ　ＡＤゝ“””’　”’　ＰＣＴ／１Ｊｓ８ｓ１０１５０１１４−″６１１１＋　Ａｌｌ”“”　”’　ＰＣＴ１０５８５１０１５０１° ”−′″ｌＡｃ″″パ１ゝｏｒ↑１０９８５１０１５１１１

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）膜を越えて帯電した１種またはそれ以上の種の負荷されるべきイオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類に生じさせる配向を有する透過膜を発生し得る濃度勾配を有するリポソーム類を調製する工程と、（ｂ）該イオン化可能な抗腫瘍剤類を該リポソーム類と混合する工程とよりなるイオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類に負荷する方法。
２．濃度勾配が（ａ）１種またはそれ以上の帯電した種の第１の濃度を有する第１の媒体をリポソーム類内に被包し、かつ（ｂ）該リポソーム類を１種またはそれ以上の帯電した種の第２の濃度を有する第２の媒体中に懸濁させることにより形成されてなる請求の範囲第１項に記載の方法。
３．濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求の範囲第１項に記載の方法。
４．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲第１項に記載の方法。
５．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第１項に記載の方法。
６．請求の範囲第１項の方法によりリポソーム類中に負荷されたイオン化可能な抗腫瘍剤類よりなる医薬製剤。
７．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第６項に記載の医薬製剤。
８．抗腫瘍剤類を内部に被包してなる脱水リポソーム類よりなる医薬製剤。
９．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第８項に記載の医薬製剤。
１０．（ａ）膜を越えて帯電した１種またはそれ以上の種のイオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類内に負荷する配向を有する透過膜ポテンシャルを発生し得る濃度勾配を有するリポソーム類を調製する工程と、（ｂ）該リポソーム類を脱水する工程と、（ｃ）該脱水リポソーム類を貯蔵する工程と、（ｄ）該脱水リポソーム類を再水和する工程と、（ｅ）イオン化可能な抗腫瘍剤類を再水和リポソーム類と混合する工程と、よりなるイオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類に負荷する方法。
１１．濃度勾配が（ａ）１種またはそれ以上の帯電した種の第１の濃度を有する第１の媒体をリポソーム類内に被包し、かつ（ｂ）該リポソーム類を１種またはそれ以上の帯電した種の第２の濃度を有する第２の媒体中に懸濁させることにより形成されてなる請求の範囲第１０項に記載の方法。
１２．濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲第１１項に記載の方法。
１４．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。
１５．請求の範囲第１０項の方法によりリポソーム類中に負荷古れたイオン化可能な抗腫瘍剤類よりなる医薬製剤。
１６．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第１５項に記載の医薬製剤。
１７．（ａ）リポソーム製剤を調製する工程と、（ｂ）該リポソーム製剤を脱水する工程と、（ｃ）該脱水製剤を貯蔵する工程と、（ｄ）該脱水製剤を再水和する工程と、（ｅ）リポソーム類の膜を越えて帯電した１種またはそれ以上の種のイオン化可能な抗腫瘍剤類を該リポソーム類内に負荷する配向を有する透過膜ポテンシャルを発生し得る濃度勾配生成する媒体により再水和製剤内のリポソーム類の周囲の外部媒体を置換する工程とよりなるイオン化可能な抗腫傷剤類をリポソーム類に負荷する方法。
１８．濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求の範囲第１７項に記載の方法。
１９．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲第１７項に記載の方法。
２０．抗腫傷剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第１７項に記載の方法。
２１．請求の範囲第１７項の方法によりリポソーム類中に負荷されたイオン化可能な抗腫傷剤類よりなる医薬製剤。
２２．抗腫傷剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第２１項に記載の医薬製剤。
２３．製剤が正に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して負であり、また製剤が負に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して正であるような配向を有するリポソーム膜を越えて透過膜ポテンシャルを発生させることによりなるイオン化可能で生物学的に活性な薬剤をリポソーム類から放出させる速度を低減させる方法。
２４．透過膜ポテンシャルは、リポソーム膜を越えて１種またはそれ以上の帯電した種の濃度勾配をつくることにより発生すみものである請求の範囲第２３項に記載の方法。
２５．濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求の範囲第２４項に記載の方法。
２６．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲第２４項に記載の方法。
２７．薬剤が抗腫瘍剤である請求の範囲第２３項に記載の方法。
２８．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第２７項に記載の方法。
２９．リポソーム類がその膜を越えて透過膜ポテンシャルを有し、該透過膜ポテンシャルの配向が、製剤が正に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して負であり、また薬剤が負に帯電している場合にはリポソーム瓶の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して正であるイオン化可能で生物学的に活性な薬剤を被包してなるリポソーム類よりなる医薬製剤。
３０．透過膜ポテンシャルは、リポソーム膜を越えて１種またはそれ以上の帯電した種の濃度勾配をつくることにより発生するものである請求の範囲第２９項に記載の医薬製剤。
３１．濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求の範囲第３０項に記載の医薬製剤。
３２．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲第３０項に記載の医薬製剤。
３３．薬剤が抗腫瘍剤である請求の範囲第２９項に記載の医薬製剤。
３４．抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第３３項に記載の医薬製剤。
３５．２種またはそれ以上の抗腫瘍剤類を被包してなるリポソーム類よりなる医薬製剤。
３６．抗腫瘍剤類がイオン化可能な抗腫瘍剤類である請求の範囲第３５項に記載の医薬製剤。
３７．イオン化可能な抗腫瘍剤類が透過膜ポテンシャルによりリポソーム類内へ負荷されてなる請求の範囲第３６項に記載の医薬製剤。
３８．イオン化可能な抗腫瘍剤類がドキソルビシンである請求の範囲第３７項に記載の医薬製剤。
３９．２種またはそれ以上の抗腫瘍剤類がドキソルビシンおよびメトトレキセートを含有してなる請求の範囲第３５項に記載の医薬製剤。
４０．２種またはそれ以上の抗腫瘍剤類ドキソルビシンおよびチトシンアラビノシドを含有してなる請求の範囲第３５項に記載の医薬製剤。
４１．抗腫瘍的に有効な量の請求の範囲第６項の医薬製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。
４２．請求の範囲第８項の医薬製剤を再水和し、かつ抗腫瘍的に有効な量の再水和製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。
４３．抗腫瘍的に有効な量の請求の範囲第１５項の医薬製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。
４４．抗腫瘍的に有効な量の請求の範囲第２１項の医薬製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。
４５．抗腫瘍的に有効な量の請求の範囲第３３項の医薬製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。
４６．抗腫瘍的に有効な量の請求の範囲第３５項の医薬製剤を投与することよりなる腫瘍の治療方法。