JPS6244180A - 汎用型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な汎用型エンド−β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼ（以下、本発明酵素と略することもある
。）およびその製造法に関するものである。さらに詳し
くは、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖の高マン
ノース型や混合型だけでなく、複合型糖鎖のＮ、Ｎ’−
ジアセチルキトビオース構造に対して作用する基質特異
性をも有し、そのＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオース構
造内の　β１→４結合の部分を加水分解する作用を有す
る、エンド−グリコシダーゼである汎用型エンド−β−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびこれをなたまめ
より採取する方法に関するものである。

一般に、糖タンパク質は、酵素、ホルモン、免疫グロブ
リンや細胞表面など生物界に広く分布し、その糖鎖部分
の役割りの重要性が最近特に注目されてきており、多く
の研究者が糖鎖部分の機能解明に従事しているが未だ全
容解明には至っていない、その理由として、機能解明の
基礎となる糖鎖の構造について、糖タンパク質がアミノ
酸と糖という性質の異なる構成ユニットを持つことが研
究の障害になっていると考えられる。この意味において
、糖鎖構造を研究する場合、又、糖タンパク質のＮ鎖が
生理活性に与える影響を研究する場合、糖タンパク質か
ら糖部分をオリゴ糖として切りはなすエンド−グリコシ
ダーゼは非常に重要な酵素になるものと考えられる。

そこで、本発明者らは１種々の給源中におけるエンド−
グリコシダーゼについて鋭意研究したところ、なたまめ
より抽出した溶液中に新規な汎用型エンド−β−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼを見出すに至った。

従来、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは
バクテリア等から得られたものが知られているが、いず
れも特定の糖鎖に対してのみ作用するものであった。

即ち、アスパラギン結合型糖鎖の構成としては、高マン
ノース型、混合型、複合型に分けられる。

次に各型の式と作用部位を示す。

上記各型において、従来のエンド−β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼは高マンノース型と混合型の糖鎖には
作用するが、シアル酸の結合したままの複合型には作用
しない。また、別の給源のものは高マンノース型糖鎖に
は強く作用するが、複合型糖鎖には高濃度の２−メルカ
プトエタノールとノニデッド（ｎｏｎｉｄｅｔ）−Ｐ２
Ｏなどのタンパク質の変成剤の存在下でなければ作用し
ないというものであった。

しかし、なたまめより得られた本発明酵素は、高マンノ
ース型や混合型の糖鎖だけでなく、シアル酸の結合した
ままの複合型Ｍ鎖にも強く作用し、しかも活性発現のた
めにタンパク質を変成させてしまうような２−メルカプ
トエタノールやノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）−Ｐ２Ｏ
などを必要としないという、いわば汎用型といえる新規
なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと認め
られるものである。

本発明酵素は、糖タンパク質の糖鎖がその糖タンパク質
の生理活性ではたす役割りを解明していく研究には重要
なものとなることは明らかである。

即ち、糖タンパク質のタンパク部分を化学的に変成させ
てしまう物質を何ら必要とすることなく活性発現する本
発明酵素は、公知の酵素よりもより広い基質特異性を有
することによってより有用なものである。

本発明酵素は、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖
の高マンノース型や混合型だけでなく、シアル酸の結合
したままの複合型糖鎖にも作用するという広い基質特異
性を有するので、糖タンパク質の糖鎖の機能的、生理的
役割を研究する上において、本発明酵素をその糖タンパ
ク質に作用させることにより複合型を含めたほとんどの
アスパラギン結合型糖鎖の取り除かれたタンパク質の活
性を調べることが可能となるため、この方面における本
発明酵素の利用が期待される。又、一部の。

糖タンパク質の糖鎖構造が腫瘍により通常の糖鎖構造と
異なる構造に変化するという報告が多く発表されている
。この様なことがら糖鎖の構造も医学、生化学、生理学
的に注目されており、糖鎖をタンパク質部分から遊離さ
せる作用を持つ本発明酵素は、糖鎖の構造決定の際にも
有用な酵素として利用されることが期待される。

本発明酵素は、水性媒質等により、なたまめより抽出分
離される。抽出液には酵素活性を有するのでそのまま粗
精製酵素として使用することができる。

抽出液は通常の酵素精製法に従って使用目的に応じた精
製段階に精製することができる。上記のなたまめとは、
なたまめの根、茎、葉、花、種子。

さや、生体液など特に限定するものではなく、特定の部
位、あるいはいくつかの部位を混合したものが使用でき
る。又、抽出法は特に限定されず、常法により行われる
。例えば、なたまめからの抽出は通常、水または緩衝液
により行うことができる。

一般的には、なたまめの種子を取り出し、これを粉砕機
で粉砕し、０．１Ｍリン酸緩衝液で４℃程度で１２時間
抽出し、抽出液に硫安を加えて、３ｏ−ｈ％硫安とし、
沈澱区分を分離し、これを水に溶解し、透析し、脱塩す
る。透析内液をＤＥＡＥ−トヨパールに吸着させて、リ
ニアグラジェント法により溶出し、得られた活性区分を
リン酸緩衝液に対して透析し、透析内液をハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させ、リニアグラジェント法に
より溶出し、得られた溶出区分をリン酸緩衝液に対して
透析し、透析内液を濃縮し、濃縮液をセファクリルＳ−
２００でゲル濾過し、得られた活性区分を水に対して透
析し、透析内液を凍結乾燥することによって本発明酵素
標品を得ることができる。

次に、実施例５で得られた汎用型エンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼの理化学的性質を示す。

１、基質特異性 糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖のＮ、Ｎ’−ジ
アセチルキトビオース構造の部分に作用し、下図の矢印
（″＞）で示されるＮ−アセチルグルコサミンの　β１
→４結合を加水分解し、糖タンパク質よりオリゴ糖を遊
離する活性を持ち、アスパラギン結合型糖鎖の高マンノ
ース型や混合型だけでなく、複合型にも作用する。

２、作　用 Ｈｕａｎｇ、Ｃ，−Ｃらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、
Ｒｅｓ、１３．１２７−１３７、１９７０）に準じて調
製した一般的な高マンノース型糖鎖を基質とした場合、
下記の反応式のととく基質の矢印（つ）で示す部分を加
水分解する作用を有する。

本酵素の活性はこの糖鎖に限らず、あらゆる高マンノー
ス型に作用する。基質が混合型や複合型でシアル酸が結
合したものであっても、やはリアスパラギンに結合して
いるＮ−アセチルグルコサミンと、そのグルコサミンの
４位の炭素に結合しているＮ−アセチルグルコサミンと
の間の結合を加水分解する。

３、分子量 ６２．０００　（セファクリルＳ−２００によるゲル濾
過の溶出位置より） ４、至適ｐＨ ５，０ ５、安定ｐＨ 中性付近で安定 ６、Ｋｍ値 Ｍａｎ　ＧＧｌｃ　ＮＡｃ＠ＡＳＮ−ＤＮＳに対するＫ
ｍ値は０．１８ｍＭである。

７、力価の測定方法 本発明酵素の力価の測定は、イワセ（Ｉｗａｓｅ、Ｉ）
らの方法（アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）１１３．９３−９５．１９８１
）に準じて行う。

すなわち、グレイ（Ｇｒａｙ、す、Ｒ）の方法（メソド
・イン・エンチモロジイ側ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｎｏｌｏｇｙ）。

Ｖｏｌ、旦、　ｐＰ、１３９−１５１）により調製した
基質１μｇを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５，２０μＱ
に酵素溶液を５μＱ添加し、反応後の溶液中に含まれる
物質を高速液体クロマトグラフィーで分離し加水分解分
の定量を行うことにより力価を測定する。３７℃で１分
間に１μｍｏｌの基質を分解する酵素量を１単位（Ｕｎ
ｉｔ　Ｃ本明細書においてｒＵＪと略称する）とする。

以下、本発明の実施例として示す。ただし、本発明はこ
の実施例に限定されるものではない。一実施例１゜ なたまめ１０ｇを粉砕機で粉砕し、得られた粉砕物を１
００ｍ　Ｑのビーカーに入れ、さらに０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）　４０ｍ　Ｑを加えて冷室（４℃）
で攪拌し抽出した。１２時間後、この溶液を遠心分離し
、上清液を粗抽出液とした。粗抽出液中の本酵素活性は
３００ｍＵ存在した。

実施例２゜ 実施例１で得られた粗抽出液３６ｍ　Ｈに硫安２０．２
ｇを攪拌しながら加え、硫安が溶解後室温で放置した。

１時間後この硫安溶液を遠心分離し、得られた沈澱区分
を１０ｍ　Ｑの水に溶解後、５ｏ＋Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
７，０に対して透析した。得られた透析内液中の本酵素
活性は２９０ｍ　Ｕ存在した。

実施例３゜ 実施例２で得られた透析内液を、５ｍＭリン酸緩衝液ｐ
８７．０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒｌ　（
東洋曹達社製）の充てんされた１５　Ｘ　２００ｃｍの
カラムに通した。

吸着した酵素を食塩Ｏ〜０．１Ｍのリニアグラジェント
法で溶出し活性区分を集めた。得られた活性区分中には
２７０ｍＵの活性が存在した。

実施例４゜ 実施例３で得られた活性区分を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
ｉ（７，０）で透析し、この透析内液を同一緩衝液で平
衡化したハイドロキシアパタイトカラム（１０Ｘ　１５
０ｍｍ）に通した。吸着した酵素をｐＨ７，０リン酸緩
衝液濃度５〜１００ｎ＋Ｍのリニアグラジェント法で溶
出し、溶出された活性区分を集めて得られた活性区分中
の本酵素活性は２４０ｍＵ存在した。

実施例５゜ 実施例４で得られた活性区分を透析・濃縮後、５鱈リン
酸緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２０
０（ファルマシアファインケミカルズ社製）カラム（１
，５Ｘ　１５０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行った。溶出
された活性区分を集めて濃縮後、水で透析し、この透析
内液を凍結乾燥して、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼの精製標品を得た。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖のＮ，Ｎ
   ′−ジアセチルキトビオース構造の部分に作用し、下図
   の矢印（⇒）で示されるＮ−アセチルグルコサミンのβ
   １→４結合を加水分解し、糖タンパク質よりオリゴ糖を
   遊離する活性を持ち、アスパラギン結合型糖鎖の高マン
   ノース型や混合型だけでなく、複合型にも作用する基質
   特異性を有するエンド−グリコシダーゼである汎用型エ
   ンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。 ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）糖タンパク質が、糖ペプチドやアミノ酸の結合し
   たオリゴ糖をも含むことを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の汎用型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミ
   ニダーゼ。
3. （３）なたまめより汎用型エンド−β−Ｎ−アセチルグ
   ルコサミニダーゼを採取することを特徴とする汎用型エ
   ンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造法。