JPS6224745B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は概ね、肝臓炎に関連したアンチゲンの
存在を検出する方法に係る。特定するに、本発明
は、肝臓炎の存在を検出すべく酵素で標識された
抗体を用いてアンチゲンと反応させることを包含
する肝臓炎に関連したアンチゲンの免疫測定に係
る。 「肝臓の炎症」を意味する肝臓炎は、胆管が感
染し又は閉塞することによる。ビールス性肝臓炎
には２種類在つて、一方が他のものより潜伏期が
長いと考えられる。従前、患者が肝臓炎にかかり
既知の非経口的暴露を有したとき、その肝臓炎は
「血清性肝炎」といわれた。もし患者が既知の非
経口的暴露を有さず経口的に肝臓炎にかかつてい
れば、それは「伝染性肝炎」と呼ばれた。しかし
ながら、文献等で情報提供されているように、両
者は潜伏期が重なり合い、その上「伝染性肝炎」
であつても非経口的にかかることがあり、所謂
「血清性」肝炎であつても経口的にかかることが
ある。かくして、肝臓炎には少くとも２種の違つ
た媒介によつて引き起される二つのタイプがある
ように思われるが、これらを識別するのに用語
「血清性肝炎」および「伝染性肝炎」を用いるべ
きでない。従つて、「伝染性肝炎」に最も近似し
たタイプの肝炎には「肝（臓）炎Ａ」を用いるべ
きであり、また「血清性肝炎」に最も近似してい
るものには（肝（臓）炎Ｂ」を用いるべきことが
示唆されている。 本明細書に記載の「例」は肝臓炎Ｂに関連した
アンチゲンの検出に指向する。而して、血清性肝
炎に最も近似した肝臓炎にかかつている患者は、
それがどんな症状であれ、しばしば血液中に上記
アンチゲンを有している。この時点で注意すべき
ことは、肝臓炎Ａ又は仮定される肝臓炎Ｃに関連
したアンチゲンの存在を測定するための信頼しう
る方法がないということである。かくして、本明
細書中の例は肝臓炎Ｂに関連したアンチゲンの存
在を検出することに指向する。しかしながら、別
タイプの肝臓炎に関連したアンチゲンであつても
それが一度同定されたならそのアンチゲンの存在
を検出するのに本発明の方法が使用され得ない理
由はない。 「血清性肝炎」ないし肝臓炎Ｂにかかると、無
視することのできない苛酷な臨床問題が創出す
る。而して、問題が苛酷なるが故に、肝臓炎を検
出するための試験方法が種々開発された。かかる
試験方法に、ミクロ・アウチタラニー（Micro―
Ouchterlony）、免疫拡散、補体結合、免疫電気
滲透法（Immunoelectro―osmophoresis）、ヘム
凝集およびヘム凝集抑制、電子顕微鏡、ならびに
固相放射免疫測定が包含される。これらの試験方
法は各々、ブリテイツシユ・メジカル・ブリテン
（British Medical Bulletin）、1972、Vol.28、No.
２（ウイルス性肝炎）、P138〜141に詳述されて
いるので必要に応じこれを参照されたい。 免疫電気滲透法又は逆電気泳動法（CEP）
は、肝臓炎に関連したアンチゲン（以下時折肝炎
関連アンチゲン又は単に肝炎アンチゲンと呼称す
る）とその抗体（以下単に肝炎抗体と呼ぶ）を検
出する迅速且つ簡単な方法を供与する。しかしな
がら、この技術は、例えば補体結合に比べ若干感
度において劣る。而して、その主な利点は、２時
間内で試験を完了しうるということであるが、し
かしながら、感度レベルが低いために、CEPは
食品医薬管理局（the Food and Drug
Administration）によつてもはや認可されていな
い。 放射免疫測定法（RIA）は、試験を行うのに必
要な装置が比較的複雑、特殊な高価装置であるば
かりでなく、放射性同位元素（ラジオアイソトー
プ）を取扱う際厳重な予防策が要求されるので、
この技術を日常診断目的に適用することは若干制
限されるものと信ずる。その上、ラジオアイソト
ープ標識は重大な潜在的健康危険を呈し、監視お
よび原子エネルギー委員会（Atomic Energy
Commission）の（使用および製造に対する）免
許を必要とし、且つ廃棄物処理問題を呈する。に
もかかわらず、この技術は今日、免疫測定するの
にかなりよく定着している。 無論、免疫学的方法は、全ての抗体およびアン
チゲンの主要特性すなわち特定の補体アンチゲン
又は抗体との反応性に依拠する。かくして、もし
抗体がそのアンチゲンを含有する血清に添加され
るなら、抗体とアンチゲンは錯形成し而して溶液
から析出することができる。ほとんどの前記試験
方法において、この簡単な事実を利用することに
より、人血清中のアンチゲンの存在が検出され
る。 これまで、標識抗体が種々のアンチゲンを同定
するために用いられてきた。もし、特定のアンチ
ゲンに対し特異性であることがわかつている抗体
を、該抗体産性のため刺激された寄主動物の血清
又は血しようのグロブリン部分から分離するな
ら、この抗体は既知方法によつて標識することが
できる。この抗体を、標識剤例えば上述の如きラ
ジオアイソトープ又は螢光薬品のような物理的に
検出できる物質と結合させることにより、抗体の
存在を検出することができる。かくして、標識抗
体を診断に用いるとき、対応するアンチゲンが或
る調製試験試料中に存在すれば、該標識抗体はそ
のアンチゲンと結合し、而して試験試料中の該標
識抗体を検出することによりアンチゲンの存在が
確認されうる。 この診断用標識抗体は、それが検出を所望され
るアンチゲンとだけ反応し該アンチゲンとは全く
異なるかさほど重要でない他の近縁アンチゲンと
相互反応しないように十分特異性であるべきであ
る。かくして、いかなる免疫測定においても、抗
体の給源および抗体の産生方法がいずれも全く臨
界的であるということは明らかである。 前述の如く、肝臓炎に関連したアンチゲンを検
出する方法の一つに固相放射免疫測定法が包含さ
れる。この手順は米国特許第3867517号に開示さ
れている。該特許に開示される如く、放射免疫測
定を行う際、該測定に用いられる成形ポリスチレ
ンのチユーブウエルないしインサートが先ず抗体
で被覆される。これは、被覆すべき該部材を抗体
溶液と一緒に温置することによつて達成される。
その後、未知試料を、この抗体被覆せるチユーブ
ウエルないしインサートと共に温置して抗体と該
試料中に存在するアンチゲンとを反応させる。チ
ユーブウエルは次いで洗浄され、更に放射性同位
体Ｉ―125で標識された抗体と共に温置される。
再度の洗浄によつて、未結合の標識抗体が全て取
り除かれる。かくして、試験試料中にアンチゲン
が存在する場合、ポリスチレンのチユーブウエル
（ないしインサート）、抗体、アンチゲンおよびＩ
―125標識抗体からなるサンドイツチが形成され
る。次いで、このＩ―125標識抗体から出る放射
線が計数器によつて測定され対照と比較される。 また、放射免疫測定を行う際、置換ポリスチレ
ン例えばイソチオシアノスチレンをグラフトさせ
たポリテトロフルオルエチレンの円板が有用であ
りうることも開示されている。このポリスチレン
は、たん白質と共有結合して生物試験に有用な試
薬をもたらしうるたん白質反応性基の特殊設計表
面をもつ不溶性物質である。最近、抗体をラジオ
アイソトープ又は螢光薬品で標識することに取つ
て代る重要な方法が開発された。これは、抗体を
酵素で標識する方法である。この手順について
は、米国特許第3654090号および同第3791932号に
記載されている。また、クリニカ・ケミカル・ア
クタ（Clinika chemical Acta）、48（1973）、15
〜18には、サンドイツチ法又は競合いずれかによ
るアルフアフエトプロテインの酵素結合式免疫測
定が開示されている。 酵素標識は、放射免疫測定に比較していくつか
の重要な利点を有している。例えば、最終混合物
中の酵素標識分子は全て、読み取りに参与するが
他方、最終混合物中のアイソトープ原子は、読み
取りの間ごく小割合しか崩壊せず而して該割合の
みが放射免疫測定に参与するにすぎない。また、
酵素標識では、検出可能な最終生成物を形成すべ
く多くの基質分子を攻撃することにより、全ての
標識が読み取りに、例えば100000回／minまで反
復参与し、それがため感度が大巾に高められる
が；アイソトープ標識原子は読み取りの間１度だ
け崩壊し、その後は参与しなくなる。酵素標識試
薬は保存寿命が長いが；アイソトープ標識試薬は
絶えず崩壊しつつあり、その保存寿命問題は苛酷
である。また、酵素標識試薬の使用に関連した健
康危険は最小のものであるが、アイソトープ標識
の場合それは重大である。更にまた、酵素標識に
よる免疫測定は、簡単で且つ比較的安価な読み取
り装置を用いることができるが；アイソトープに
よる免疫測定の首尾は、これと著しく相違して崩
壊の検出効率に依拠し而してまた、きわめて高価
につく検出装置の性能に依拠する。 人の血液中に肝炎アンチゲンを見出すことは、
肝臓炎の臨床歴を取得することと均等ではないか
もしれないが、種々の研究によつて、肝炎アンチ
ゲンに関し陽性と出た血液を患者が受容したとき
肝炎感染の発病が高いとわかつた。しばしば、血
液センターから入手される特定の血液ユニツトを
使用するか否かを、比較的短時間で決定せねばな
らないので、肝臓炎のスクリーニングテスト（選
別試験）を高価な装置を必要とすることなく高感
度、迅速且つ容易に行うことはきわめて重要であ
る。肝臓炎に関連したアンチゲンの検出に従来用
いられた種々の試験は或る程度満足されてきたけ
れども、しかしこれは全て一つ又は二つ以上の欠
点を有した。 毎年肝臓炎によつて何千人もの人が死に且つ入
院している。長い間、この病気を抑制する鍵は、
世界的に有効でありまた容易且つ日常的に行いう
る血液選別技術であると考えられてきた。既述の
ように、いくつかの技術が今日受容されているけ
れども、それらは比較的低感度であり、繁雑且つ
時間のかかる手順を必要とし、ほとんどのヘモト
ロジーラブ（hemotology lab）において容易に
は利用し得ない複雑な装置を使用せねばならず、
或は、非常に不安定で手近かには保全し得ない試
薬を用いねばならない。それ故、これらの技術は
理想的な試験の要求を満たすものではなかつた。 概括するに、本発明は、「サンドイツチ」原理
を用いた肝炎アンチゲンの直接的免疫測定を包含
する。この測定を行うに際し、検出せんとするア
ンチゲンを、これと反応する抗体層の間にはさ
む。一方の抗体層は酵素で標識されており、他の
層は不溶性部材に共有結合している。酵素は、化
学基質にさらされるが、該基質は酵素触媒の存在
で化学変化を起こして反応生成物を形成する。肝
臓炎の有無は、この反応生成物を定量することに
よつて決定される。 本発明の別の様相に従えば、肝臓炎の検出キツ
トないしセツトが供与される。この検出セツトの
三大試薬は、肝臓炎に関連したアンチゲンと反応
する抗体を結合させた不溶性重合体固体、酵素で
標識された肝炎抗体試薬および、酵素の触媒的影
響下化学的に変化して検出可能な最終生成物を形
成することのできる酵素基質である。選ばれた具
体化では、結合体の酵素がアルカリ性ホスフアタ
ーゼ（りん酸酵素）であり、酵素基質がｐ―ニト
ロフエニルホスフエートである。上記検出セツト
にはまた、肝炎アンチゲンに対し陰性、弱陽性お
よび強陽性の血清を包含する対照血清、試験試料
―不溶性重合体固体間の非特異性反応の頻度を最
小限にする試験試料用馬グロブリン添加剤の溶
液、酵素基質溶液のPHを反応に最適な範囲に保持
すべく企図された緩衝液、ならびに温置で用いら
れる少量の試薬―不溶性重合体固体間の接触を高
めるように計算された寸法の複数個のバイアル
（小びん）が含まれる。酵素―酵素基質系として
アルカリ性ホスフアターゼおよびｐ―ニトロフエ
ニルホスフエートを用いるとき、緩衝液は
Na₂CO₃0.028MおよびMg〓0.001Mの水溶液であ
る。 本発明の別の態様において、アルカリ性ホスフ
アターゼの如き官能酵素と化学的に結合した、免
疫学上活性な精製肝炎抗体が免疫測定法に用いら
れるべく供与される。 本発明の更に別の態様において、円板様不溶性
部材ないしマトリツクスが免疫測定法に用いられ
るべく供与される。このマトリツクスはその表面
層に、たん白質と反応する複数個の基を、一様に
グラフトさせている。精製された肝炎抗体はこの
反応基に共有結合して肝炎抗体の外面層をもたら
す。 免疫測定法において、上記の不溶性部材は平底
のバイアルに入れられ、且つ液体試験試料で程よ
く覆われる。試験が再現性であるためには、試験
試料中のアンチゲンが抗体で被覆された円板の表
面全体に暴露されていることが重要である。平ら
な表面をもつ円板の使用は感度損失に帰すことが
発見された。従つて、本発明の円板の両面は、円
板面―バイアル底の接触を少くするように或る不
整形状に変形されている。選ばれた一つの具体化
では、抗体を結合させるに先立つて円板をプレス
に通すことにより、その両面を焼き網様ないし格
子形にされる。 それ故、本発明の主要目的は、体液中の肝臓炎
に関連したアンチゲンの有無を迅速、簡単、正確
且つ日常的に決定しうるような肝臓炎の検出キツ
トおよびその使用方法を提示することである。 本発明の別の目的は、比較的未熟な人が肝臓炎
に関連したアンチゲンの高感度再現性免疫測定法
を日常基準で実施するのに適合せる単位化試験セ
ツトを提供することである。 本発明の別の目的は、免疫測定法を実施するに
際し手順上の誤りを最小限にすべく企図された如
上の試験セツトにして、必要な試薬、反応容器等
を全て、試験の精度および感度を最適にすべく企
図された形で入れた該試験セツトを提供すること
である。 本発明の別の目的は、試験の際実施される種々
の工程を標準化するように企図された試験セツト
入り実験室装置を提供することである。 本発明の更に別の目的は、試験試料の比較基準
として、肝炎関連アンチゲンに対し陰性、弱陽性
および強陽性の対照試料を含む試験セツトを提供
することである。 本発明の別の目的は、免疫測定法で用いられる
肝炎抗体―酵素結合体にして、抗体と酵素とが各
各の所望される化学特性を保有するが如き該結合
体を提供することである。 本発明の他の目的は、免疫学的特性ないし触媒
特性を損失することなく長期間保存することので
きる如上の結合体にして、肝臓炎に関連したアン
チゲンと高度に反応しうるものを提供することで
ある。 本発明の更に別の目的は、反応に触媒作用を及
ぼして最終生成物を高い反応速度でもたらすこと
のできる酵素と結合した肝炎抗体を提供すること
である。而して、上記最終生成物の濃度は、測光
型検出器を用いて正確に検出されうる。 本発明の別の目的は、上述の如き結合体にし
て、高度に精製され而して、肝臓炎に関連したア
ンチゲンの高感度、高精度免疫測定を促進するの
に大いに貢献するところの該結合体を提供するこ
とである。 本発明の別の目的は、既述の試験で記した如き
有用な不溶性マトリツクスにして、その表面全体
に高濃度の精製肝炎抗体を一様に分布させたもの
を提供することである。 本発明の他の目的は、肝炎抗体を固体に結合さ
せることによつて、それが使用中受けるかもしれ
ない機械力ないしは化学的力によつて除去されな
いようにすることである。この点に関して絶対に
必要なことは、上記結合を行う際抗体が官能性の
まゝであるようにすることすなわち抗体がその免
疫反応に参与でき而して該結合によつて免疫化学
的に変性されないようにすることである。 本発明の他の目的は、免疫測定の際抗体で被覆
された不溶性固体が取扱いやすいように且つま
た、温置の際使用溶液にその被覆表面のより多い
部分が定量暴露されるように該不溶性固体の形状
を改善することである。 如上の目的および他の目的ならびに本発明の特
徴は、一つの選定された而して好ましい具体化を
以下説示することによつて当業者には明らかとな
ろう。 その前に、添付図面を簡単に説明するなら、 第１図は、本発明の方法の工程を要約した流れ
図であり、第２図は、本発明の方法および試験セ
ツトに用いられる選定された不溶性部材の透視図
であり、 第３図，第４図および第５図は、本発明の免疫
測定法の三つの温置段階を図示し、 第６図は、本発明に従つて試験される試験試料
の陽性免疫測定の際現出する「サンドイツチ」構
造の概略的表示である。 好ましい具体化の説明 先ず、本発明をその最も広い全様相において詳
述する。本発明に従つた肝臓炎の検出方法は、第
１図に例示する如き四つの異なる段階で実施され
る。 第１の段階は、不溶性部材１０（第２図参照）
上に固定させた抗体を第３図に図示せる如き試験
血清中に存在するアンチゲンと反応させることを
包含する。この反応はアンチゲンを固定し、而し
て該アンチゲンは、第４図に示す如き第２の工程
で酵素標識された抗体と反応して、該酵素標識さ
れた抗体をも固定するようになる。第５図に示す
如く、酵素は適当な基質にさらされ、該基質は酵
素の作用を受けて色の変化をきたす（第３の段
階）。この色変化は、肝臓炎に関連したアンチゲ
ンの存在を示す指標となる。最後の第４段階は、
色の度合いを読み且つこれを対照基準で得られた
値と比較することを包含する。 上に概記した試験に必要とされるもの全てを含
む本発明の肝炎検出セツトは100回の試験に向く
よう企図される。明らかな如く、以下に開示せる
試薬の量等を比例的に加減することにより、これ
よりも大きな又は小さな規模のセツトを製造する
ことができる。試薬および対照を含むキツトは例
えば箱の中に配列されて、使用時まで２〜８℃で
保存される。更に、100回の試験を行うのに十分
な個数のバイアルが備え付けられる。 また、第２図に示す如き格子形に似た表面を有
し、その外側には肝炎アンチゲンと反応する抗体
層を結合、凍結乾燥させた重合体円板が100〜105
個備え付けられる。かかる不溶性固体円板の正確
な性質とその製造法については後で開示する。 試験セツトの第２の試薬は、肝炎関連抗体―ア
ルカリ性ホスフアターゼ結合体の試料よりなる。
この試薬の正確な性質、その製造法および有用な
代替試薬については後で開示する。この試薬は、
そのまゝ使用に供される溶液として支給される。 試験セツトの第３の試薬は、400mgのｐ―ニト
ロフエニルホスフエート酵素基質である。この化
合物は、粉末形で安定であるが、しかし緩衝液に
溶解させて１mg／mlの溶液にするときは比較的不
安定となる。従つて、かかる溶液は使用直前に調
製しなければならない。 試験の際に用いられる他の物質に、或る量の馬
グロブリン、試料希釈剤ならびに種々の緩衝液お
よび洗浄液が包含される。これらの試薬および物
質の正確な性質および製造法については後で述べ
る。 Ａ 抗体の産生 本発明を実施するために、肝臓炎に関連したア
ンチゲンと反応する抗体を取得することが必要で
ある。注意すべきは、かかる抗体が存在するとい
うこと而して、本発明を特定の抗体の使用に限定
するつもりはないということである。 反応性抗体は、既知のアンチゲンないし抗原試
料を注入された寄主動物から採血したものを精製
することによつて用意することができる。肝臓炎
に関連したアンチゲンと反応する抗体は概ね、英
国特許第1387625号に開示された方法によつて産
生されうる。 肝炎抗体の産生は先ず、肝炎に間連したアンチ
ゲンについて陽性であることがわかつている血液
の取得に依拠する。従つて、種々の給源から得ら
れた血液ユニツトは先ず、それが本発明の精製さ
れた免疫特異性抗体を産生するのに適しているか
どうかを決定すべく評価されねばならない。 肝炎アンチゲンに関し陽性と思われる血液袋セ
グメントを２〜８℃で垂直位置に保ち血球が下半
分に落ち着くようにする。該血球から血しようが
分離される。而して、この希釈前の血しようとそ
して生理食塩水で１：16に希釈せる試料の、基準
抗体に対する力価を周知の逆電気泳動（CEP）
法によつて試験した。希釈してない血しようと
１：16に希釈した試料がいずれも陽性であるとき
は、その血液ユニツトは、後述の如き本発明の精
製抗体の調製用に受容されると認められる。 血液ユニツトから単離されたアンチゲン部分
は、寄主動物体内での抗体産生を刺激するのに用
いられ、或は該動物によつて産生される抗体を精
製するのに用いられる。アンチゲンがいずれに用
いられるにせよ、その前にこれを前単離プロセス
に付さなければならない。 血しようは無菌の減圧容器に移され、そこで、
CaCl₂の5M溶液を、血しよう200mlにつき
Cacl₂0.75mlの基準で加えることにより凝固され
る。次いで、この溶液を水浴中37℃で１時間温置
し又は、凝塊が形成するまで温置する。堅い凝塊
が形成した後、血しようを−20℃で凍結させ且つ
２〜８℃で融解させて凝塊を収縮せしめる。血清
が凝塊から分離する。これを必要に応じ過する
と、このものはそのまゝ、免疫化用肝炎アンチゲ
ンペレツトの製造に供され、或は免疫吸収塔での
使用に供される。 (1) 免疫化用アンチゲンペレツトの製造 上記プロセスに付した肝炎陽性血清を４℃で30
分間10000rpmの遠心分離にかけた。この遠心分
離の上澄み液を超遠心管に配分して、例えばベツ
クマン（Beckman）L2―65B機で４℃、４〜20時
間40000〜50000rpmの超遠心に付した。各管内の
上澄み液を取り出し、廃棄した。アンチゲンを含
むペレツトは、規定（0.15M）食塩類で前ゆすぎ
した。 次いで、各遠心管に少容量の生理食塩水を加
え、管内の内容物を音響振動（sonication）に付
してペツトを崩壊させた。次いで、各ソニケータ
チユーブ内の懸濁物を一緒にし（プールし、）こ
れを再度、生理食塩水の入つた清浄なチユーブに
等配分した。この溶液を再び、上記の如く、ベツ
クマンL2―65B遠心機で４℃、４〜20時間40000
〜50000rpmで遠心する。 上段に記載の手順は５回ないしそれ以上反復す
ることができる。 各遠心管から上澄み液を取り除いた後、ペレツ
ト物質を最小容量の生理食塩水中にプールした。
試料を基準肝炎抗体に対して分析した。もしペレ
ツトがCEPにより１：25又はそれ以上の力価を
示すなら、それを免疫化に用いることができる。
プールしたアンチゲンペレツトを３mlずつの分取
量に分けて将来の使用に備え−20℃で凍結した。 (2) 肝炎抗体の産生および前精製 上述の如く調整したアンチゲンペレツトの試料
を、免疫化の朝、等容のフロインド（Freund）
完全補助液に添加して、当業者に周知の手順に従
いエマルジヨンを調製した。次いで、該アンチゲ
ンを寄主動物例えば馬に、それ自体既知の技術に
従い注射して肝炎抗体を発生した。免疫性を付与
した馬から採血し、或はこの馬を慣用技術による
血しよう搬出法（plasmapheresis）に付した。
別法として又は追加的に、他の免疫付与ルートで
補助液不在の調剤を用いることができる。 採取した血液は、後の免疫吸収―精製工程を予
期して肝炎抗体を単離すべく処理せねばならな
い。概括するに、この前精製は３段階で遂行され
る。先ず、寄主動物からの血しようを再石灰化す
る。次いで、不溶性アンチゲン―抗体の錯形成を
惹起することにより肝炎関連抗体以外の抗体を沈
降させるのに十分量の正常人血しよう（NHP）
と上で得た血清とを混合する。吸収された抗血清
を、CEPを使つて肝炎抗体に関し分析する。最
後に、肝炎に関連したアンチゲンと反応する抗体
を硫酸アンモニウムで沈殿させる。この物質は使
用時まで凍結することができる。 (3) 免疫吸収剤チヤーコール塔の製造 本発明の試薬を生成するのに用いられる精製抗
体の製造は、上述の如く産生された肝炎抗体を免
疫特異性抽出プロセスに付すことにより達成され
る。この手順の総説が、「アンチゲンと抗体の免
疫得異性分離」（Immunospecific Separation of
Antigens and Autibodies）」と題したブラデイ
ツシユ（Bradish）等の1975年３月19日付け英国
特許第1387625号に記されているので必要に応じ
これを参照されたい。 一般に、この精製プロセスを本発明で利用する
とき、それは、抗体が肝炎アンチゲンと反応して
錯形成し而して、採血から抽出された抗体試料中
に不可避的に存在する他の外来抗体およびたん白
質を除外するという抗体の能力を利用する。 前洗浄した吸収剤カーボンをガラス管ないしプ
ラスチツク管に慣用技術を用いて充てんすること
により、塔を用意した。肝炎アンチゲンの異なる
混成物を得るために、別個の血清試料少くとも６
個からアンチゲンをプールした。次いで、プール
したアンチゲンを、柴外吸収を基にして１〜２
mg／ml（溶媒）のたん白質濃度に調整した。 アンチゲンをカーボンに付着させるべく、この
希溶液を300〜1000ml／hr範囲の流量で吸収塔に
導入した。この際、吸収塔内のチヤーコール１ｇ
当り75mgのたん白質を添加するようにすべきであ
る。吸収塔からの流出物を500mlの分取量で集
め、その各々をたん白質含量について検査した。
流出物が出発物質のたん白質含量にほゞ等しい該
含量を示すとき、吸収塔はアンチゲンで飽和され
たと認められる。チヤーコール層は、流出物が
280nmにおいて目立つ程の検出可能な吸収を示さ
なくなるまで塔に硫酸塩緩衝剤入り食塩水
（PBS）を流すことによつて、チヤーコール層を
洗浄した。 ゆるく結合したたん白質を溶離すべく、チヤー
コール層を新しく調製したチオ硫酸ナトリウム
200mg／入り5Mよう化ナトリウム液でフラツシ
ユ（洗い流し）した。その後、吸収塔に十分量の
PBSを流し入れて、該塔から上記のよう化ナトリ
ウム液を流去する。而して、１mg／mlのナトリウ
ムアジト（防腐剤）を含有するPBCで吸収層を最
終的に洗浄した後、塔を２〜８℃に保存すること
により、後の使用に備えることができる。 (4) 酵素結合体に用いられる抗体および不溶性固
体の製造 上述の如く精製した抗体は硫酸アンモニウムが
ない。これをPBSによつて、抗体１部対緩衝剤２
部の基準で希釈した。塔を整備し、画分が集めら
れるように位置づけた。この塔に、上記の抗体溶
液を約200ml／hrの流量で連続的に添加した。流
出物を集め、これをたん白質および肝炎抗体含量
について試験することにより、塔がいつ抗体で飽
和されるかを決定した。飽和が達せられた後、塔
の層をPBSで洗浄してゆるく吸収されたたん白質
を除去した。 この時点で、チヤーコール層に固定したアンチ
ゲンは、このものと反応する抗体と結合してい
る。また、塔を通つてきた他の外来たん白質およ
び抗体は、この層に固定したアンチゲンに対して
非特異性であり、而して上記抗体から分離してき
た。 この抗体―アンチゲン結合を破断し且つ精製抗
体を溶離すべく、使用直前に調製したNaIの5M溶
液を塔に導入した。このNaI溶液の使用容量は、
層に結合した抗体を全て取り出すのに十分である
べきである。塔流量を少くとも20ml／hrに設定す
るとき、溶出液が適当な容量の画分で集められ
る。集まつた合計量は少くとも、よう化ナトリウ
ム（NAI）溶液の添加容量に等しくあるべきであ
る。 精製抗体の各画分は、集められると二回の過
に付される。すなわち、一回目は0.45μの膜に通
し、二回目は0.22μの膜に通す。次いで、２〜８
℃の蒸留水を用いて、得られた液を１：３に希
釈する。例えば200mlの液を40mlの蒸留水に添
加する。次いで、希釈したこれら抗体画分を、例
えば、XM―50の膜を備えたアミコン
（AMICON）濃縮機に入れて濃縮する。 最終精製工程として、この濃縮された精製抗体
を透析する。透析の後、抗体を取り出して遠心分
離にかける。上澄み液を少くとも20時間0.01Mの
硫酸ナトリウム溶液に対して透析し、これをPBS
に対する初めの透析と比較する。この後の透析が
終了した後、抗体のたん白質濃度を測定する。 次いで、この抗体について、CEP技術に従い
基準アンチゲンに対する活性度を測定して抗体含
量を決定し、またもし受け入れられるとわかつた
ら、これを凍結乾燥して使用時まで保存する。 Ｂ 抗体―酵素結合体の製造 子牛の腸内アルカリ性ホスフアターゼを再構成
せる抗体の溶液に、３：１の酵素／抗体比で混合
することにより、最終濃度がBPS（PH7.4）溶液
１mlにつき全たん白質10mg以上になるようにす
る。この溶液を透析してNH₄ ⁺イオンを完全に除
去する。 透析処理された抗体―酵素混合物を次いで遠心
分離にかけ不溶性物質を全て除く。PBS―Mg〓
溶液の添加により、上澄み液のたん白質含量を10
mg／mlに調整する。この溶液に８％のグルタルア
ルデヒド溶液を、抗体―酵素溶液10mlにつきグル
タルアルデヒド溶液１mlの基準で添加する。3.5
〜20分間緩徐に撹拌し而してこの間、抗体と酵素
がグルタルアルデヒドによつて化学結合した後、
この結合体の溶液を0.001MのMg〓入りPBCに対
して透析してグルタルアルデヒドを除去する。 次いで、透析処理した物質を遠心分離にかけ、
得られた上澄み液にトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（PH８）緩衝剤0.05M、正常人アル
ブミン（結晶質）１％、NaN₃0.02％および
MgCl₂0.001Mの水溶液を添加してこれを希釈し
た。 アルカリ性ホスフアターゼに加えて、他の酵素
も亦本発明の方法に用いることができる。事実、
抗体に共有結合しうる酵素としてほとんど無限の
ものが挙げられる。かかる種々の酵素のうち以下
に列挙したものが特に有利である。 １ アルコール脱水素酵素 ２ グリセロール脱水素酵素 ３ グリオキシレート還元酵素 ４ Ｌ―乳酸脱水素酵素 ５ りんご酸脱水素酵素 ６ グルコース６―りん酸脱水素酵素 ７ マンニツト１―りん酸脱水素酵素 ８ グルコール酸化酵素 ９ ガラクトース酸化酵素 10 Ｌ―アミノ酸酸化酵素 11 Ｄ―アミノ酸酸化酵素 12 ポリフエノール酸化酵素 13 アスコルビン酸酸化酵素 14 カタラーゼ 15 ペルオキシダーゼ 16 コリンエステラーゼ 17 ホスフオリパーゼＣ 18 α―アミラーゼ 19 リゾチーム 20 β―ガラクトシダーゼ 21 アミログルシダーゼ 22 β―グルクロニダーゼ 23 カルボキシペプチダーゼＡ 24 ウレアーゼ 25 無機ピロホスフアターゼ 26 アルドラーゼ 27 炭酸脱水酵素 28 ヒスチダーゼ 抗体を標識するのに用いられる酵素は、いくつ
かの考慮すべき事柄に留意して選定される。かか
る留意すべき事柄には、酵素の安定性酵素の測定
容易性、抗体の共有結合の条件に対する酵素の耐
久性ならびに酵素の入手性および価格が包含され
る。 Ｃ 抗体で被覆された不溶性部材の製造 試薬製造の次の工程は、精製抗体の一部分を不
溶性部材に共有結合させることである。この結合
を行うために、用いられる不溶性部材は、反応基
又は生物試験に用いられる特異性抗体と反応しう
る部位を与えられていなければならない。 「グラフト・コポリマーズ（Graft
Copolymers）」と題したG.W.トレギアー
（Tregear）等の米国特許第3700609号には、或る
重合体主鎖に別の重合体又は共重合体の側鎖をグ
ラフトさせてなる不溶性連続重合体物質が開示さ
れている。このグラフトされた重合体を適宜選定
することによつて、生物物質を不溶性マトリツク
スに化学結合させることができる。上記特許に開
示された生成物は、インペリアル・ケミカル・イ
ンダストリーズ・オブ・オウストレイリア・アン
ド・ニユージーランド（ICIANZ）より商品名プ
ロタポール（PROTAPOL）DI／１の円板形で市
販されている。 プロタポールDI／１は、イソチオシアノポリ
スチレン基を表面全体にグラフトさせたポリテト
ラフルオロエチレン主鎖よりなり、放射免疫測定
法に使用すべく企図されている。現在入手されう
るこの種の円板は、厚さが約0.01インチ、直径が
約0.5インチである。 第２図に示す如き本発明の一つの重要な具体化
に従えば、各円板１０は、一連の稜線１２と別の
一連の稜線１４とで構成される格子形焼き網模様
の両面１１を付与されている。稜線１２および１
４は好ましくは互いに垂直であり而してそれらは
複数個の矩形くぼみ１６を画成する。各稜線１２
および１４の側面は、くぼみ１６の隣接対から上
方向へと次第にテーパー（断面厚が減少）して、
稜線の頂部を画成する線となる。注意すべきこと
は、図面の稜線１２および１４が、本発明の説明
を簡略化するために非常に誇張して描かれている
ということである。 円板の所望形状は、該所望形状を円板に付与す
べく企図された、突起を表面にもつローラーに該
円板を通すことによつて達成される。明らかなよ
うに、このローラーは、円板を事実上破壊するこ
となくその重合体物質の外観を変形するに十分量
の圧力をもたらすように設計されている。これ
は、円板がその表面に反応性層を有しているので
重要である。かくして、円板を射ち抜くことによ
り、抗体が結合することのできない円部が暴露さ
れる。ポリテトラフルオロエチレン層の暴露は事
実上、結合能力の低い円板をもたらすであろう。 考慮すべき主な事柄は、平底のバイアルに入れ
たとき実質上試験試料と完全接触の状態になるよ
うな両面をもつ円板をもたらすことである。すな
わち、マトリツクスとバイアル底との間の面同士
の接触を最小限にすべきである。本発明の別の重
要な具体化では、円板の両面は、高低点分野をも
つように形づくられている。 既述の如く、凍結乾燥形に製造された抗体は、
抗体5.0mg毎に0.1MのNaHCO₃（PH9.6）を100ml
添加することによつて再構成される。一般に、そ
の結合方法は、２〜８℃の該希溶液に撹拌下、格
子形ないし焼き網模様の表面をもつ円板を８〜16
時間接触させることを包含する。次いで、抗体希
溶液を廃棄した後、円板を、二度連続容量の
0.1M NaHCO₃（PH9.6）りん酸塩緩衝剤入り食塩
水および、0.5％のトウイーン（TWEEN）20を
含有するりん酸塩緩衝剤入り食塩水中0.3％の冷
い（２〜８℃）牛血清アルブミンで洗浄する。更
に、結晶質の牛血清アルブミンで洗浄し且つドラ
イアイス上で凍結させた後、凍結乾燥を行い、而
してこの円板を使用に供すまで２〜８℃で保存す
る。 本明細書中の記載は、肝炎抗体を結合させた円
板の製造に係るけれども、本発明の円板がほとん
ど無限の数のたん白質を固定するのに有用である
ことは当業者に明らかであろう。例えば、試験試
料―円板間の接触増加によつて、下記たん白室が
該円板との結合を包含する試験に用いることがで
きる。すなわち、かかるたん白質に、ジコキシ
ン、アヘン剤およびステロイドの如き薬品に対す
る抗体；天然産物例えばインシユリンおよび他の
ホルモンに対する抗体；ならびに、血液その他の
体液中に見出される代謝産物に対する特異性酵素
が包含される。 例 以下の手順を用いて円板8000枚を製造した。各
円板を先ず、既述の如き所望形状にするためにプ
レス処理した。肝炎抗体は円板8000枚のバツチに
40mg必要であつた。すなわち、円板1000枚につき
５mgである。再構成した抗体のたん白質含量を、
0.1MのNaHCO₃（PH9.6）800mlの最終容量におい
て0.05mg／mlに調整した。次いで、この全800ml
の緩衝剤入り抗体を、洩れ止めライナーを備え中
には円板8000枚の入つた1000mlのねじ蓋びんに装
入した。そして、このびんを16時間例えば一夜２
〜８℃で回転させて各回転サイクルを通し円板が
緩徐にタンブリングするようにした。その後、液
をびんから流し出し廃棄した。円板は２の広口
フラスコに移した。 円板を冷い（２〜８℃）0.1MのNAHCO₃緩衝
液（PH9.6）１で二度続けて洗浄し、その後該
緩衝液を除去した。次いで、円板を再度洗浄し
た。このときは、冷い緩衝剤（0.01Mのりん酸ナ
トリウム、0.15MのNACl、PH7.4）１ずつ二度
の連続洗浄であつた。残留せる緩衝剤を除去した
後、円板を三度目の洗浄に付した。これには、冷
たい牛血清アルブミン溶液（0.3％）１量ずつ
二度の連続洗浄を用いた。 最後に、円板を、２mg／ml濃度の冷い結晶質牛
血清アルブミン（PH８）溶液１量ずつ二度の連
続洗浄に付した。この工程は、円板上のたん白質
にたん白質環境を与える目的で実施された。残留
洗液を除去した後、円板を、一枚の紙で内張り
した皿ないしはトレー（９×9in）に移した。該
トレーには夫々、200mlの結晶質牛血清アルブミ
ン溶液が入れてあつた。移し終つた後、一枚の
紙を使つてこれらを覆つた。緩衝剤を完全に除去
し、次いで円板をドライアイス上で30分急速に凍
結させた。 しかる後、トレーの内容物を凍結乾燥させ、乾
燥した円板を取り出し、これを目止めした容器内
で貯蔵した。 (1) 対照血清の調製 免疫測定から意味深い資料を得るために、陰性
と陽性の対照血清を用意して所定の試験試料と適
宜比較する必要がある。かかる対照物の調製を以
下に詳述する。 陰性の対照は、例えば放射免疫測定法により、
肝炎アンチゲンについて試験し陰性とわかつた人
血しようから製造した。而して、肝炎アンチゲン
に関し明らかに陰性である各ユニツトに、5Mの
CaCl₂を血しよう200mlにつきCaCl₂溶液0.75mlの
基準で添加して凝塊を誘引した。次いで、凝塊が
形成するまでこの血しようを水浴中37℃で温置し
た。凝塊した血しようユニツトを次いで−20℃で
凍結して少くとも12時間貯蔵した。次いで、この
血しようユニツトを２〜８℃で融解させ、血清を
集めた。もし血清が過度に濁つていたら、これ
を、例えば２〜８℃で30分間9000rpmの遠心分離
により清澄化することが望ましいかもしれない。 シリカ例えばエアロジル（AEROSIL）―380
を血清１当り20ｇ加え、２時間室温で混合して
リポプロテインを除去し血清を安定化させた。次
いで、この混合物を遠心分離にかけ、沈殿物を廃
棄した。もし所望なら、適当な過手段によつて
過してシリカを除去することができる。 次いで、上澄み液を更に、例えばミリポア
（MILLIPORE）膜ないしホーム（HORM）膜そ
れに多孔率が連続的に低下するパツドで過処理
した。パツドは0.45ミクロンの膜である。この
0.45ミクロンの膜で過する前に、ナトリウムア
ジド（NaN₃）を0.1重量％の濃度で上記上澄み液
に添加した。斯界で周知の如く、ナトリウムアジ
ドは防腐剤として作用する。0.45ミクロンないし
それ以下の多孔率フイルターによる最後の過
は、無菌の装置および技術を用いた層流環境で行
うべきである。 次いで、この無菌溶液は、免疫測定用試薬目止
め溶器に小分けされるまで２〜８℃で貯蔵されう
る。提示した100回の試験セツトには、7.5mlの陰
性対照血清が供与される。 陽性対照血清は、肝炎アンチゲン試験で陽性と
出た血液ユニツトからの血しようを再石灰化する
ことにより製造した。各陽性ユニツトから１％試
料を採取し、これらを一緒にプールして試験プー
ルとした。先ず、この試験プールを60℃で10時間
熱処理して試料中の肝炎誘発物質を全て不活性に
した。該プールが室温に冷却したとき、アンチゲ
ン活性が保留されていたことを検査すべく一部分
を取り出し、CEP技術を使つて基準抗体に対し
滴定した。次いで、試験プールに、血清１当り
20ｇ濃度のシリカを添加した。この血清を次いで
２時間室温で撹拌し、その後これを２〜８℃で30
分間9000rpmの遠心分離にかけた。沈殿物は廃棄
した。 得られた上澄み液を、CEPを使つて対照基準
抗体に対し滴定した。もし力価が申分のないレベ
ルのまゝであれば、全血清ユニツトの総量を一緒
にプールし且つこれを、試験プールで述べたと同
じプロセスに付すことができる。 一緒にした試験プールと主要プールは、本発明
の免疫測定で陽性対照血清に関し最適結果が得ら
れるように十分量の陰性対照血清で希釈した。好
ましくは、本発明試験での陽性対照血清の読みが
吸光度単位×1000で2000より高くあるべきであ
る。この希釈した陽性対照血清を次いで、既述の
如き、連続範囲の低下多孔率を用いる適当な手段
で過した。0.45ミクロン又はそれ以下の膜で最
終的に過する前に、0.1重量％のナトリウムア
ジドを添加した。陰性プールのときのように、こ
の最後の過は、層流環境中無菌条件下で行うべ
きである。 弱陽性対照血清は、強陽性対照を陰性血清で希
釈することにより製造することができる。弱陽性
血清の読みは、本発明の試験で測定するとき600
〜1000であるべきである。本発明の好ましい具体
化の100回試験セツトには強陽性対照2.5mlと弱陽
性対照2.5mlが備え付けられる。 Ｄ その他の試薬および装置 0.5インチよりわずかに大きなすなわち、直径
0.50インチの円板につり合う寸法の直径を有する
200ないしそれ以上のガラス製平底バイアル（使
い捨て）が備えつけられる。これらバイアルのう
ち100個は、試験の初めの温置および洗浄用に使
われ、残る100個は、後の、酵素基質との温置に
用いられる。従つて、この試験セツトにより、
100回の測定を同時に行うことができる。 以下に詳述する如く、不溶性固体円板一枚をこ
れら100個のバイアル各々に入れる前に、馬グロ
ブリン試験試料希釈剤を0.05mlずつ各バイアルに
入れる。この工程は、試験試料と不溶性円板との
初めの温置で非特異性反応を排除する予備手段と
とれる。円板上に被覆される抗体は精製されてお
り、肝炎アンチゲンと高度に反応するけれども、
人血清又は血しよう中には、馬グロブリンそのも
のと反応し得而して円板と酵素標識結合体との間
に橋を形成して擬似陽性反応をもたらしうる物質
が時折存在する。先の工程で添加した馬グロブリ
ンはこの物質と結合し、そのため円板との反応は
自由でない。先に開示した如く、円板上に被覆さ
れた抗体は、人血液から集めた肝炎関連アンチゲ
ンで馬を免疫化することにより産生される。本発
明の100回試験セツトには、りん酸塩緩衝剤入り
食塩水（PBS）に馬グロブリン330mgを溶解して
なる溶液5.5mlが備えつけられる。 Ｆ 基質の製造 試験の酵素反応用に選んだ基質はｐ―ニトロフ
エニルホスフエートである。このものは、炭酸ナ
トリウム緩衝剤に１mg／mlの濃度で溶解させた。
緩衝剤の濃度は0.028モルの炭酸ナトリウムおよ
び0.001モルのマグネシウム（PH9.8）であつた。 この時点で注意すべきことは、下の表に示す
如く他の基質を適当なPH緩衝剤と共に用いること
ができるということである。

【表】 フエート

【表】 リルホスフエート
上表に示した基質は全て有機りん酸エステルで
ある。好ましい酵素アルカリ性ホスフアターゼに
合つた基質として他の有機りん酸エステルが使用
されうることは明らかである。更に、注意すべき
ことは、アルカリ性ホスフアターゼ以外の酵素を
抗体―酵素結合体に用いるときも、適当な基質を
選定することは当業者にとつてほとんど困難でな
いということである。 Ｇ 方 法 試験を本発明に従つて行うべく、バイアル100
個を架で区分けし、種々の試料に対応するように
これらを識別した。各バイアルに馬グロブリン溶
液0.05mlを入れ、次いで95個のバイアルに試験試
料0.5mlを添加した。同時に、他のバイアル３個
に夫々、陰性対照血清の試料0.5mlを添加し、他
の１個に強陽性対照血清の試料0.5mlを入れ、そ
して残る１個には弱陽性対照血清の試料0.5mlを
入れた。かかる馬グロブリンと各試料を入れた
100個のバイアルに、次いで、抗体で被覆した円
板を一枚ずつ装入した。これらのバイアルを、例
えば振とう中の水浴で0.5時間43℃で温置した。
この温置の間、対照又は試験試料中に存在する肝
炎アンチゲンは円板上の抗体と結合する。 不溶性円板部材の入つたバイアルに酵素標識さ
れた抗体試薬を添加する前に、初めの温置で形成
した上層液を取り除かねばならず、また不溶性部
材を洗浄して未結合アンチゲンを除去せねばなら
ない。この洗浄溶液は好ましくは、塩化ナトリウ
ムの0.85％溶液（PH6.5〜7.5）である。該溶液を
2.5mlずつ用いて二回洗浄した後、各バイアルに
抗体―酵素結合体0.3mlを添加し、そして再度、
バイアルを振とうしながら43℃で１時間温置し
た。而して、その間、酵素標識された抗体は、初
めの温置で抗体被覆せる円板に固定された肝炎ア
ンチゲンと反応する。 酵素標識された抗体試薬の添加および第２の温
置の後、形成せる上層液ないし上澄み液をアスピ
レーターで除去し、各バイアル内の円板を洗浄溶
液2.5mlの分取量で３回洗浄した。この洗浄によ
つて、未反応の抗体―酵素結合体が除去された。
次いで、各不溶性部材を清浄なバイアルに移し、
これに2.5mlのｐ―ニトロフエニルホスフエート
（pNPP）酵素基質―緩衝剤溶液を添加した（１
mgpNPP／ml）。ｐ―ニトロフエニルホスフエー
ト―アルカリ性ホスフアターゼ系の最適な作業PH
が9.8であるので、酵素基質は炭酸塩−Mg〓緩衝
液（PH9.8±0.1）に溶解される。この緩衝液を用
いるとき、それはNa₂CO₃0.028MおよびMg〓
0.001Mの水溶液よりなる。試験セツトには、40
mlの濃厚物が備え付けられうる。而して、これを
蒸留水で希釈するときは、400mgのpNPPに直接
添加されうる。この緩衝剤入り基質を入れた後、
バイアルは第３の温置に付される。これは、振と
うしながら43℃で１時間行われる。もし別の抗体
―酵素結合体が用いられるなら、別の基質を使用
せねばならない。 次いで、各バイアルに2MのNaOH溶液２滴
（0.1ml）を添加して反応を停止させる。この目的
のために、各試験セツトには3Mの水酸化ナトリ
ウム15mlが備えつけられる。 円板上に酵素が存在する場合、すなわち、肝臓
炎に関連したアンチゲンについて陽性の試料を入
れたバイアル内で、上に開示した酵素基質溶液は
無色の液体から黄色の液体へと変化する。 陰性対照から得られた上澄み液を適当なバイア
ル内にプールする。蒸留水をブランクとした分光
光度計により、その405nmでの吸収を読む。この
陰性対照の読みが600（吸光度単位×1000）より
も小さいとき、それは、試験試料の結果と比較す
るのに適当な基準と認められる。次いで、このプ
ールした陰性対照試料をブランクとして、試験試
料および陽性対照の値を読み、その結果を吸光度
単位×1000として記録する。或る分光光度計を用
いるとき、該装置に陰性対照を挿入し、読みを零
に調整し且つ試験試料の値を直接読むことが可能
である。上記プールした陰性対照試料をブランク
として用いた、未知試験試料の光学密度（吸光
度）×1000の値が100より大きいとき、該試料は、
肝臓炎に関連したアンチゲンについて陽性と認め
られる。この値は、非反復性の陽性が存在するな
ら概ね実験室技術の誤差から生ずるところの該非
反復性陽性を制限するために選定された。 また、試験試料の読みは、弱陽性対照試料およ
び強陽性対照試料とも比較することができる。か
くして、試料中の肝炎アンチゲンの有無のみなら
ずその濃度も知ることができる。 例 未知試料の各群に関して五つの対照すなわち陰
性対照３、強陽性対照１、および弱陽性対照１が
試験されるべきである。これらの対照は、試験試
料と同じプロセスおよび温置時間に付すべきであ
る。 注意：各移動には清浄なピペツト又は使い捨て末
口を用いて相互汚染（cross―contamination）を
避けること。 １ 水浴を43℃に予め設定する。 ２ 試験試料および対照に対応させるべく２組の
バイアルに番号を付し、これらのバイアルをバ
イアル保持器に入れる。第１組のバイアルは、
試験試料および対照を抗体被覆せる円板および
抗体―酵素標識試薬と共に温置するのに用い、
第２組のバイアルは、工程12で基質反応に用い
る。 ３ 第１組のバイアル底に馬グロブリン試薬0.05
ml（１滴）をピペツトで入れる。有利なこと
に、馬グロブリンを試験試料希釈剤中に用いる
ことによつて、或る人血清中に存在する抗体と
馬グロブリンとが反応し、而して該抗体から生
ずるところ非特異性擬似陽性が本質上排除され
る。 ４ この第１組のバイアルに、各試験試料0.5ml
をピペツトで入れる。この際該試料は、対応試
料表示をもつバイアルの底部に添加される。同
時に、陽性および陰性の試料0.5mlを対応する
各バイアルの底部にピペツトで入れる。 ５ 該第１組の各バイアルに抗体被覆せる円板一
枚を移し入れる。円板の表面は清浄に保つ。而
して、円板の移動は、清浄なピンセツト又はサ
クシヨン・チツプド・カニユーレを用いて行う
べきである。円板を手で取り扱うべきでない。 ６ 上記バイアルを、穏和な撹拌を行うべく振と
う付属装置を備えた水浴で30分間43℃で温置す
る。 ７ 各試料を抗体被覆せる円板と共に温置した
後、各バイアルから上澄み液を全て完全にアス
ピレートする。バイアル全部に等張食塩水2.5
mlを添加して円板を洗浄する。この手順を反復
して各円板を二回洗浄する。全流体の除去を助
成すべく、バイアル保持器を傾けながらアスピ
レートする。各洗浄液を加えた後、バイアル保
持器を振とうする。アスピレータに結合した容
器内に集められた廃液は、投棄前に高圧蒸気滅
菌（121℃で最低１時間）に付すべきである。 ８ 最後の洗浄およびアスピレーシヨンの後、各
バイアルに酵素標識した抗体の溶液0.3mlを添
加する。 ９ これらのバイアルを、穏和に撹拌すべく振と
う付属装置を備えた水浴内で１時間43℃で温置
する。 10 ｐ―ニトロフエニルホスフエート（pNPP）
（100mg）のバイアル１個の内容物を100mlの希
基質緩衝液にゆすぎ入れることにより、pNPP
基質を調製する。（なお、希基質緩衝液は、蒸
留水90mlに濃重炭酸ナトリウム緩衝剤10mlを添
加することによつて調製される）。静かに回転
させて混合する。而して、溶液化は直ちに生起
すべきである。 注意：この基質溶液は、使用するその日に調製す
べきである。而して、不使用時は冷凍しておくべ
きである。24時間経過した溶液は廃棄すべきであ
る。 11 上澄み液を、工程７のようにアスピレートし
且つ三回洗浄する。 12 工程２で用意した番号付きの、第２組の清浄
なバイアルに円板を移し入れる。 13 円板を入れた各バイアルに、工程10で調製し
たｐ―ニトロフエニルホスフエート基質溶液を
2.5ml添加する。 14 これらのバイアルを、穏和な撹拌のため振と
う付属装置を備えた水浴で１時間43℃で温置す
る。 15 該バイアル全部に3Mの水酸化ナトリウム溶
液２滴（約0.1ml）を添加して反応を停止させ
る。バイアルを保持器内で振とうして試薬をよ
く混合する。吸光度の読み取りは、反応停止後
４時間内で行うべきである。 16 三つの陰性対照をプールして、光度計によ
る、蒸留水をブランクとした405nmでの吸光度
を読む。該結果を吸光度単位×1000として記録
する。もし陰性対照が600より高い値を示すな
ら、試験は不十分だつたことになり、而して試
験を繰返えさなければならない。貫流式光度計
を用い且つ強陽性試料に遭遇するときは、次の
試料の吸光度を読む前にキユベツトないし平皿
を蒸留水でゆすぐべきである。使い捨てでない
キユベツトを用いるときは、陽性の読みに続い
て該キユベツトを蒸留水でゆすがねばならな
い。 17 プールした陰性対照の場合、装置を零の吸光
度に調整する。各反応混合物の吸光度を測定
し、その結果を吸光度単位×1000として記録す
る。しかしながら、或る光度計を用いるとき、
その装置を零に調整することができない。この
場合、陰性対照の読みを各試料の読みから差し
引かねばならない。 結果の評価 未知の試験試料の吸光度単位×1000の値が、プ
ールした陰性対照をブランクとして、100より高
いとき、該試験試料は反応性であると認められ
る。反応性と認められる試料については試験を反
復することが望ましいかもしれない。反応性血清
を、肝臓炎に関連したアンチゲンについて陽性と
分類する前に、コーデイス・コンフアーマトリ・
テスト・セツト（Cordis Confirmatory Test
Set）で試験して確認を得る必要がある。この試
験は反応性試料全てについて行わなければならな
い。馬グロブリンとの中和によつて確認された反
応性血清は、肝臓炎Ｂアンチゲンについて陽性で
あると認めなければならない。上述の如く、確認
試験は、結果を評価するために必要であるが、ま
たそれは、食品医薬管理局や多くの州の法律で要
求されてもいる。概括するに、本発明に従つた確
認試験は次のようにして遂行される。 すなわち、陽性試験試料は二度試験する。各バ
イアル内の円板に該試料をさらす第１段階の後、
洗浄に引続いて、一方の円板を肝炎アンチゲンに
対し特異性の抗体に暴露し、また他の円板を正常
馬血清に暴露する。30分間温置する。その後の手
順は、日常選別試験で行つているのと同じであ
る。もし試料が肝臓炎について陽性であるなら、
馬抗体に暴露された試料はきわめて低い値を示す
のに；正常馬血清に暴露された円板は、日常選別
試験で見出されるのと均等の高い値を示す。 低濃度の肝炎アンチゲンを有する試料は最終読
み取り値が低くなりがちである。高濃度の肝炎ア
ンチゲンを有する試料は最大値を示す。濃度差が
狭い範囲であれば、該結果読み取られる光学密度
は、試料中に存在する肝炎アンチゲンの濃度に関
する定量情報を与える傾向がある。 方法の限界 １ 非反復性反応性：もし或る反応性試料に関す
る反復試験が100切り取り値より小さな値を示
すなら、この試験は非反復性反応性であると推
定され且つ肝臓炎に関連したアンチゲンについ
て陰性と認められる。最初の結果は、不十分な
洗浄の如き技術上の誤差のせいかもしれない。 ２ 非特異性陽性：或る人血清中に存在する、馬
グロブリンに対し反応性の抗体から生ずる非特
異性陽性は、試験試料希釈剤中の馬グロブリン
を用いることによつて本質上排除される。 ３ EDTA中に集められた血液からの血しようは
使用すべきでない。 注目すべきことは、各種工程での温置時間およ
び温置温度が広い範囲にわたりうるということで
ある。かくして、本発明は、温置の時間および温
度に関しいかなる態様にも限定されるつもりはな
い。例えば、不溶性部材を試料と共に温置する時
間は10分〜24時間の範囲であり得、またその温度
は２℃〜50℃の範囲でありうる。他方、不溶性部
材を酵素標識された結合相手と共に温置する時間
は30分〜24時間であり、その温度は２℃〜50℃で
ある。 また、注目すべきことは、本発明の方法が肝臓
炎に関連したアンチゲンの存在するどんな体液に
も用いられて該アンチゲンの存在を検出すること
ができるということである。かくして、本方法
は、血清、血しよう、血しようの成分、血清の成
分、尿、唾液および脳背髄液中の肝炎アンチゲン
の有無を決定するのに用いることができる。 結 果 本発明に従つて実施した試験結果を次表に示
す。表Ａに示した結果は、CEP方法により肝炎
について陽性と出た試料に関する本発明に従つた
試験結果である。表Ｂに示した結果は、放射免疫
試験では肝炎について陽性であつたがCEP方法
では陰性と出た試験試料に関する値である。表Ｃ
に示した値は、放射免疫試験、CEP両方法で肝
炎について陰性と出た試験試料の結果である。表
Ａ，ＢおよびＣに示した種々の試料に関する数値
は、本発明の方法で試験して得られた値である。

【表】 本発明は、その精神ないし不可欠な特徴を逸脱
することなく他の特定態様で具体化することがで
きる。それ故、此処に記載した具体化は、上の説
明よりはむしろ「特許請求の範囲」によつて示さ
れる本発明の範囲を、全ての点で、例示するもの
であり限定するものではないと認められるべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法の工程を要約した流れ
図である。第２図は、本発明の方法および試験セ
ツトに用いられる選定された不溶性部材の透視図
である。第３図，第４図および第５図は、本発明
の免疫測定法の三つの温置段階を図示する。第６
図は、本発明に従つて試験される試験試料の陽性
免疫測定の際に現出する「サンドイツチ」構造の
概略的表示である。 図中主要部分を示す記号の説明は以下の通りで
ある。１０：不溶性マトリツクス、１１：格子形
模様の表面、１５：バイアル。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 肝炎アンチゲンを含む液体試料から該アンチ
   ゲンを検出するに当り、 (a) 前記アンチゲンと関連せる第一量の抗体にし
   て、水不溶性水非懸濁性固体キヤリアーに結合
   した抗体を用意し、 (b) 前記液体試料を前記工程(a)の固体キヤリアー
   と接触温置して反応混合物を形成し、 (c) 前記アンチゲンと関連せる第二量の抗体にし
   て、酵素と共有結合した抗体の溶液を用意し、 (d) 前記工程(b)より取得せる反応混合物を前記工
   程(c)の酵素結合抗体と接触温置し、酵素結合抗
   体の溶液から固体キヤリアーを分離し、 (e) 固体相に結合せる物質の酵素活性を、検出す
   べき肝炎アンチゲンの存在に相関させる諸工程
   よりなる方法。