JPS62239990A - 新規リパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は新規なリパーゼおよびその製造法に関する。本
発明のリパーゼはトリグリセライドの分解、特に好まし
くは血清中のトリグリセライドの分解に用いられる。

従来の技術 血清などの生体体液試料中に存在するトリグリセライド
を酵素リパーゼで分解し、遊離した脂肪酸またはグリセ
ロールを定量することによってトリグリセライドを測定
する方法が知られているが実用に供されている方法はほ
とんどがグリセロールを定量する方法である。この目的
のため最初に用いられたリパーゼは動物の膵臓に由来す
るりパ−ゼであった。しかしこの酵素はトリグリセライ
ドを完全には分解できなかった。血清中のトリグリセラ
イドを酵素により完全に分解するため微生物を起源とす
るリパーゼの検索、性質の異なるリパーゼの組み合わせ
による分解、リパーゼと化学的薬剤の組み合わせによる
分解が研究された。例えば、リゾープス・アリザス（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ　）のリパーゼ（特
公昭５９−１５６３８、特開昭５２−２５６９３）、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属のリパー
ゼ（特開昭４９−５０９９０．同４９−６９１８６、同
４９−８９５９６、同４９−１１３６９５　、同５７−
５８８９８）　、リパーゼとプロテアーゼの併用（特公
昭５４−９５１８、特開昭５３−１１４４９３　’）、
リゾープス・アリザスのリパーゼ、ブタ肝臓由来のカル
ボキシルエステラーゼおよびアルカリ金属またはアルカ
リ土類金属のアルキル硫酸塩の組み合わせ（特開昭４９
−６４４９５）　、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属の
リパーゼ、すい臓リパーゼおよび胆汁酸塩の組み合わせ
（特開昭５２−１１９８７）　、クロモバクテリウム（
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属のリパーゼ（特
開昭５１−６８２９７、同５１−７４６９２、同５７−
５８８９８）　、リゾープス・アリザスのリパーゼとカ
ンジダ・シリンドラツセ（Ｃ，ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ
）のリパーゼの組み合わせ（特開昭５２−２５６９４、
特公昭５６−２９　）　、カンジダ・ルゴーサ（Ｃｏｒ
ｕｇｏｓａ　）のリパーゼと界面活性剤の組み合わせ（
特公昭５７−３９１５８）　、リゾープス・アリザスの
リパーゼとシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ、　
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のリパーゼの組み合わせ（特
公昭５７−２８２７６）　、リゾープス属などのリパー
ゼとコレステロールエステラーゼの組み合わせ（特公昭
５６−４６７９９）　、リパーゼと界面活性剤。

フェノール誘導体若しくはアニリン誘導体の組み合わせ
（特公昭５Ｂ−５６７７）が知られている。

また、シュードモナス属のある種のものが、グリセロー
ル生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合が１％以上の
リパーゼを生産する（特開昭５９＝１８７７８０）こと
も知られている。

また、ペニシリウム属がリパーゼを産生ずることは公知
である。Ｉｗａｉらはペニシリウム・サイクロピウム・
ウェストリング（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏ
−ｐｉｕｍ　Ｗｅｓｔｒｉｎｇ　）株が２種のリパーゼ
を産生ずることを報告している（Ａｇｒ、ＢｉｏｌＣｈ
ｅｍ、＋　１０６３−１０７０頁、第３９巻、　１９８
０年）。彼等は又、ペニシリウム・サイクロピウムＭ１
株が２種のリパーゼを産生ずることを報告している（Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　２０５−２１１頁、第８７巻、
　１９８０年）。

発明が解決しようとする問題点 上述した血清中のトリグリセライドの分解に関する先行
技術において、単独で用いられた微生物由来のリパーゼ
は依然としてトリグリセライドを十分に分解することが
できないか、または分解速度が緩やかであった。あるい
は、これらのリパーゼはトリグリセライド測定用試薬組
成物に含まれる界面活性剤により活性が阻害されるとい
う欠点があった。また、起源の異なる複数のリパーゼを
組み合わせて用いる場合はその製造がやっかいである。

本発明はこれらの問題を解決して、単独で用いても十分
にトリグリセライドを分解することができ、且つトリグ
リセライドの測定において脂肪の乳化に用いられる界面
活性剤、例えばポリエチレングリコールアルキルフェニ
ルエーテル系などの界面活性剤による活性の阻害を実質
的に受けることのない新規なリパーゼおよびその製造法
を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段 本発明によれば、トリグリセライドに作用し、グリセロ
ール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合が５％以上
であり界面活性剤により活性化され、その濃度が少なく
とも５％以下の範囲において活性が実質的に阻害されな
いという性質を有する新規リパーゼおよびその製造法が
提供される。

本発明のリパーゼはペニシリウム厘に属する菌株の培養
によって得られる。ペニシリウム属に属し本発明のリパ
ーゼを産生ずる菌株としては、特に好ましくはペニシリ
ウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４６１３（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ　　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　　ＡＴＣＣ３４
６１３）　　が挙げられる。

ペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４６１３ハ少
なくとも３種類の異なる性質のリパーゼを生産すること
を確認した。本発明のリパーゼはそのうちの一つで前述
した公知の２種とは明らかに異なる新規なリパーゼであ
る。本発明のリパーゼは以下に示す理化学的性質を示す
。

（１）作用ニ トリグリセライドに作用し、グリセロール生成活性の脂
肪酸生成活性に対する割合が５％以上である。

（２）基質特異性： 炭素数４〜１８の脂肪酸のトリグリセライドをよく分解
する。

（３）至適ｐＨの範囲：　ｐＨ５〜７（第１図に示す）
（４）安定ｐｉ（の範囲： ｐＨ３〜８において、３７℃、３０分間処理した後残存
活性を測定したところ、約４．５〜６のｐＨの範囲で安
定であった（第２図に示す）。

（５）作用通温の範囲：３５〜４０℃（第３図に示す）
（６）温度安定性： ｐＨ７，０において、０〜５０℃の各温度で３０分間処
理した後、残存活性を測定したところ、約３５℃まで安
定であった（第４図に示す）。

（７）阻害、活性化および安定化： 界面活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５
％以下の範囲において実質的に活性が阻害されない。

（８）分子量：約１１０，０００　　（セファデックス
Ｇ−１００を用いたゲルろ適法による） （９）等電点：　ｐＨ３，８４（アンホラインを用いた
等電点電気泳動法による） （１０）結晶形：菱形、板状 本発明のリパーゼのトリグリセライドに対する反応性を
、公知のシュードモナス属由来のリパーゼ（商標名：リ
ボプロティンリパーゼ・タイプＡ、東洋紡績社製）およ
びクロモバクテリウム属由来のリパーゼ（東洋醸造社製
）と対比して第１表に示す。

（以下余白） 第１表 本発明のリパーゼと前述の公知のリパーゼは界面活性剤
に対する感受性および脂肪酸とグリセロールの生成速度
の点で最も異なる。即ち、本発明のリパーゼは約５％と
いう高濃度の界面活性剤の存在下でも実質的に活性阻害
を受けることがないくまた、速やかにグリセロールを生
成するという性質を有する。この性質はリパーゼを血清
中のトリグリセライドの分解に用いる場合に有用である
。

本発明において、ペニシリウム属菌株の培養は、糸状菌
の一般的な培養方法により行われる。例えば、栄養培地
としては、ペニシリウム属菌株が資化し得る炭素源、窒
素源および無機物などを含む合成培地または天然培地が
用いられる。炭素源としてはグルコース、フラクトース
、マルトース、シュクロース、糖蜜、澱粉、デキストリ
ン、有機酸およびグリセリンなどが使用される。窒素源
としては麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母
、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン、アミノ
酸などの有機窒素源、および硝酸塩、アンモニウム塩な
どの無機窒素源が使用される。

無機物としてはカリウム、ナトリウム、マグネシウム、
カルシウム、亜鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用
される。培養中の発泡を抑えるために、界面活性剤、シ
リコン、植物油などの消泡剤を添加することもできる。

培養は、通常振盪または通気攪拌下好気的条件のもとに
おこなうのがよい。培養温度、培地のｐＨなどの培養条
件は菌が生育しリパーゼが産生される範囲内であればい
ずれの条件でもよい。

以上のようにして得られた培養物から本発明のリパーゼ
を採取するには、その理化学的性質を利用して、公知の
蛋白質の精製法を適宜組み合わせて行うことができる。

例えば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を除い
たのち、硫安、硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタ
ノール、メタノール、アセトンなどを用いた有機溶媒沈
澱、活性炭、シリカゲル、アルミナ、ヒドロキシアパタ
イト、セルロースなどを用いた吸着クロマトグラフィー
、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン交換
セファデックスなどを用いたイオン交換クロマトグラフ
ィー、セファデックス、バイオゲルなどを用いたゲルろ
過および電気泳動、限外ろ過、透析などの公知の方法を
任意の順序で適宜組み合せ、または繰り返すことにより
精製する。

本発明において、リパーゼ活性の表示は、基質オリーブ
オイル乳化液に３７℃においてリパーゼを作用させたと
き、１分間に１マイクロ当量のグリセロールを生成する
量を１単位とした。

酵素活性測定法 １）グリセロール生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成するグリセロールを酵
素法で測定する。

（１）試薬 ａ）基質ニオリーブ油（半井化学製）１０ｇ、トリトン
Ｘ　−１００１０ｇ　、精製水３０ｒ１１！を攪拌子を
用い３０分間攪拌乳化する。次いでこれに１０％牛血清
アルブミン（フラクション■）を含む５０ｍＭ　ＩＪン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）を２０−を添加混合する。

ｂ）グリセロール測定試薬：１００−のＭＥＳ（２−（
Ｎ−モノホリノ）エタン−スルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６
，５）に下記の試薬を溶解する。

トリトンＸ−１０００，１ｇ、　Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−）ルビジン
６４．６■、４−アミノアンチピリン　１０．２■、Ｅ
ＤＴＡ・２ナトリウム　３７．２■、アデノシン酸リン
酸・２ナトリウム２００■、塩化マグネシウム・６水塩
　４０．７■、グリセロールキナーゼ　５０単位、グリ
セロリン酸オキシダーゼ４００単位、ペルオキシダーゼ
２００単位。

（２）操作 基質１．０−を試験管にとり３７℃で予備加温する。こ
れに希釈酵素液０．１ｒＩ１１を加え反応を開始する。

３７℃で１５分間反応後、０．２Ｍ　トリクロル酢酸液
２．０ｍ１を加え反応を停止する。反応停止液を東洋ろ
紙（ｍ　１３１）を用いてろ過する。ろ液０．０２ｍｆ
をグリセロール測定試薬３−中に加え、３７°Ｃで１０
分間加温し５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。

（３）活性表示 １分間に１マイクロモルのグリセロールを生成する酵素
量を１単位とした。

２）脂肪酸生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成する脂肪酸を水酸化ナ
トリウム溶液で滴定し測定する。

（１）操作 上記基質１．０ｍｔ’を試験管にとり、３７℃で予備加
温する。これに希釈酵素液０．１−を加え反応を開始す
る。３７°Ｃで１５分間反応後、２．５ｍｆ’のエタノ
ール−アセトン混液（１：１）を加え反応を停止する。

指示薬としてフェノールフタレインを数滴加え１／２０
Ｍ水酸化ナトリウムで滴定する。

（２）活性表示 １分間に１マイクロモルの脂肪酸を生成する酵素量を１
単位とした。

実施例１ 米糠２％、コーンスチーブリ力−１，５％からなる培地
（ｐＨ６，０）　２０ｊｌ！の入ったジャーファーメン
タ−にペニシリウム・サイクロピウム＾ＴＣＣ３４６１
３を接種し、２５℃において２４時間培養して種培養液
とした。上記と同じ組成の培地が５００１入った発酵槽
に種培養液を接種し、２５℃において４０時間培養した
。培養液をろ過して菌体を除き、得られたろ液を限外ろ
過により濃縮した。濃縮液に硫酸アンモニウムを７５％
飽和に加え、生成した沈澱を集め１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　２０１に溶解した。

この溶液を限外ろ過により脱塩した後、あらかじめ同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース２　ｋ＋ｒを加
えた。同緩衝液３０／を用いてＤＥＡＥ−セルロースを
洗浄した後、０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液
を加え、得られた溶出液を限外ろ過により脱塩、濃縮し
た。この液をあらかじめ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマ
シア社製）を充填したカラムに通した。カラムを０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で洗浄した後、塩化ナ
トリウムの濃度を０．１〜０．２５Ｍに上げる直線濃度
勾配法により溶出を行った。リパーゼ活性は３つのピー
クに分かれた（第５図に示す）。第２の活性ピークの両
分を集めて硫安堰折に付し、５５％飽和から７５％飽和
の範囲で生成した沈澱を集めた。沈澱を１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐ）ｌ　７．０）に熔解し、限外ろ過により脱
塩した後、凍結乾燥を行うことにより精製リパーゼ標品
を得た。この精製標品をハイドロキシアパタイトを用い
たカラムクロマトグラフィーに付した後、硫安溶液より
結晶化を行った。結晶形は菱形、板状であった。

上記で得られた精製標品は、比活性が９．２Ｕ／■蛋白
であり、培養液から約１３０倍に精製され、収率は約１
７％であった。

参考例１ 実施例１において、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロ
マトグラフィーで得られた第１および第３の活性ピーク
の両分をそれぞれさらに精製した。

第１の活性ピークから得られた標品は、トリブチリンに
よく作用し、脂肪酸のメチルエステルに対する作用は弱
いという性質を示し、第３の活性ピークから得られた標
品は、脂肪酸のモノグリセライドにはよく作用するが、
トリグリセライドに対する作用は弱いという性質を示し
た。これらの性質は前掲の先行技術に開示されたリパー
ゼに相当するものである。

参考例２ 本発明のリパーゼを血清脂質に作用せしめ、生成したグ
リセロールを測定することによりリパーゼの脂質への反
応性をみた。

即ち、０．５Ｕ／−グリセロールキナーゼ、４Ｕ／−α
−グリセロホスフェートオキシダーゼ、２Ｕ／−ペルオ
キシダーゼ、３．３ｍＭアデノシン三リン酸、０．５ｍ
Ｍ４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭ　　ＴＯＯ３（
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）　−ｍ−）ルイジン）　、２　ｍＭｉ化マグネシウ
ム・６水塩、０．５Ｕ／−の本発明のリパーゼ、および
０．０５〜５．０％の範囲の濃度のポリエチレングリコ
ールｐ−イソオクチルフェニルエーテル（商標名ニトリ
トンＸ　−１００，Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社製）を含
む０．１Ｍ−Ｐ　Ｉ　ＰＥＩ緩衝液（ｐｌ＋　６．５）
１．０−と標準血清試料（商標：リピツドセーラム■”
栄研”、栄研化学社製）　０．０１−を混合し、３７℃
において１０分間インキエベートした。反応液の５５５
　ｎｍにおける吸光度を測定し、試料中のトリグリセラ
イド（トリオレイン換算）濃度を算出した。

使用したトリトンＸ　−１００の濃度と測定値を第２表
に示す。本発明の酵素は、５％という高濃度の界面活性
剤によっても活性が阻害されないことが分かる。

第２表 参考例３ ０．５　Ｕ／ｒｎ１グリセロールキナーゼ、４Ｕ／＋ｎ
ｅα−グリセロホスフエートオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ、３．３ｍＭアデノシン三リン酸、０
．５ｍＭ４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭ　　ＴＯ
Ｏ３，２ｍＭ塩化マグネシウム・６水塩、および０．１
〜１．０％の濃度のトリトンＸ　−１００を含む０．１
Ｍ−Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ緩衝液（ｐｆｌ　６．５）　１．０
−と２５Ｕ／−の本発明のリパーゼ０．０２−を混合し
、３７℃において５分間インキニベートした。次いで、
血清試料０．０１１ｎ１を添加し、経時的に５５５　ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。

トリトンＸ　−１００の濃度とリパーゼの反応性ノ関係
を第６図に示す。本発明の酵素はトリトンＸ−１００に
よって活性化され、その効果は０．１〜１．０％の範囲
においてほとんど変わらないことが分かる。

比較例１ 各種リパーゼのグリセロール生成活性と脂肪酸生成活性
を測定したところ、本酵素はシュードモナス属（東洋紡
績社、大野製薬社製）、クロモバクテリウム属（東洋醸
造社製）由来の市販リパーゼに比べ、脂肪酸生成活性に
対し、グリセロール生成活性が著しく高い特性を有する
。

（以下余白） 第３表 比較例２ 参考例３において、本発明のリパーゼに代えて市販のシ
ュードモナス属由来のリパーゼ（商標名：　　ＬＰＬ″
Ａｍａｎｏ″■、大野製薬社製）、クロモバクテリウム
属由来のリパーゼ（東洋醸造社製）またはシュードモナ
ス属由来のリパーゼ（商標名：リボプロティンリパーゼ
・タイプＡ、東洋紡績社製）をそれぞれ表示活性で５０
Ｕ／ｍｅ、１００Ｕ／艷および０．２Ｕ／−用いた以外
は同様に操作した。

トリトンＸ　−１００の濃度と各リパーゼの反応性の関
係を第７図Ａ〜第７図Ｃに示す。第７図ＡはＬＰＬ″Ａ
ｍａｎｏ”■、第７図Ｂはクロモバクテリウム属由来の
リパーゼ、第７図Ｃはリボプロティンリパーゼ・タイプ
Ａをそれぞれ用いた場合を表す。

これら公知の酵素は、いずれもトリトンＸ　−１００の
濃度が高くなるにしたがい活性が阻害されることがわか
る。

参考例４ 参考例３において、トリトンＸ　−１００に代えて０．
１〜０．５％のノニルフェノールエトキシレート系界面
活性剤（商標名ニアデカトールＮＰ−７００、旭電化社
製）または０．１〜０．５％の第２級直鎖アルコールエ
トキシレート系界面活性剤（商標名ニアデカトールＳｏ
、１３５、旭電化社製）を用いた以外は同様に操作した
。

界面活性剤の濃度と本発明のリパーゼの反応性の関係を
第８図および第９図に示す。第８図および第９図はそれ
ぞれノニルフェノールエトキシレート系界面活性剤およ
び第２級直鎖アルコールエトキシレート系界面活性剤を
用いた場合を表す。

本発明の酵素はこれらの界面活性剤によって実質的に阻
害されないことが分かる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新規なリパーゼおよびその製造法が提
供される。本発明のリパーゼは血清中のトリグリセライ
ドをほぼ完全に分解し、かつ高濃度の界面活性剤によっ
ても実質的に活性阻害を受けることがないため、トリグ
リセライドの測定に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリパーゼの至適ｐＨの範囲を表す図で
あり、同じく第２．３．４図はそれぞれ安定ｐＨの範囲
、作用適温の範囲および温度安定性を表す図である。 第５図は、ペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４
６１３の産生する３種のリパーゼのＤＥＡＥ−セファロ
ースによるカラムクロマトグラフィーのパターンを表す
図である。 第６図は、トリトンＸ　−１００の濃度と本発明のリパ
ーゼの反応性の関係を表す図である。同じく第７図Ａは
シュードモナス属由来のリパーゼ（ＬＰＬ”　Ａｍａｎ
ｏ”■）、第７図Ｂはクロモバクテリウム属由来のリパ
ーゼ、第７図Ｃはシュードモナス属由来のリパーゼ（リ
ポプロティンリパーゼ・タイプＡ）の反応性を表す図で
ある。 第８図は、ノニルフェノールエトキシレート系界面活性
剤の濃度と本発明のリパーゼの反応性の関係を表す図で
あり、同じ（第９図は、第２級直鎖アルコールエトキシ
レート系界面活性剤の濃度と反応性の関係を表す図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　トリグリセライドによく作用しグリセロール生成活
   性の脂肪酸生成活性に対する割合が５％以上であり、界
   面活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５％
   以下の範囲において実質的に活性が阻害されない性質を
   有するリパーゼ。 ２　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である特許請求
   の範囲第１項記載のリパーゼ。 ３　非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールア
   ルキルエーテル系の界面活性剤である特許請求の範囲第
   ２項記載のリパーゼ。 ４　ペニシリウム属に属し、トリグリセライドによく作
   用しグリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割
   合が５％以上であり界面活性剤により活性化され、その
   濃度が少なくとも５％以下の範囲において実質的に活性
   が阻害されない性質を有するリパーゼを産生する菌株を
   培養し得られた培養物から当該リパーゼを採取すること
   を特徴とするリパーゼの製造法。 ５　ペニシリウム属に属する菌株がペニシリウム・サイ
   クロピウムである特許請求の範囲第４項記載のリパーゼ
   の製造法。