JPS62232392A - Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents
Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のスレオニン生合成に関与するホ
モセリンデヒドロゲナーゼ（以下ＨＤと略す）とホモセ
リンキナーゼ（以下ＨＫと略す）の両酵素をコードする
遺伝子を含む組換え一体ＤＮＡをコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有させ
、該微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ
−スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを採取すること
を特徴とするＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストリ
ーの産業分野に係り、特に、医薬１食品および飼料工業
において有用なＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン
の製造分野に関する。
ウム属に属する微生物のスレオニン生合成に関与するホ
モセリンデヒドロゲナーゼ（以下ＨＤと略す）とホモセ
リンキナーゼ（以下ＨＫと略す）の両酵素をコードする
遺伝子を含む組換え一体ＤＮＡをコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有させ
、該微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ
−スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを採取すること
を特徴とするＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストリ
ーの産業分野に係り、特に、医薬１食品および飼料工業
において有用なＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン
の製造分野に関する。
従来の技術
］リネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などの微
生物を用いる発酵法によるＬ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンを生産する方法については、該菌種の野生株
から誘導された突然変異株を用いる方法がよく知られて
いる。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産性
変異株としては、アミノ酸の栄養要求性変異やアミノ酸
のアナログに対する耐性変異あるいはそれらの変異を共
有する菌株が知られており、例えば、特開昭４７−１９
０８７や特公昭５４−３２０７０などに記載されている
。一方、このような突然変異の付与により育種された菌
株とは別に、組換えＤＮＡ技術により育種された菌株を
用いるＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製造法
も知られている。
生物を用いる発酵法によるＬ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンを生産する方法については、該菌種の野生株
から誘導された突然変異株を用いる方法がよく知られて
いる。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産性
変異株としては、アミノ酸の栄養要求性変異やアミノ酸
のアナログに対する耐性変異あるいはそれらの変異を共
有する菌株が知られており、例えば、特開昭４７−１９
０８７や特公昭５４−３２０７０などに記載されている
。一方、このような突然変異の付与により育種された菌
株とは別に、組換えＤＮＡ技術により育種された菌株を
用いるＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製造法
も知られている。
例えば、大腸菌のスレオニン生合成に係わる酵素の遺伝
情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＤＮＡ
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に保有させ、該菌株を用いてＬ−スレオニンあるいは
Ｌ−イソロイシンを発酵生産する方法が開示されている
（特開昭５８−１２６７８９および特開昭６Ｏ−３０６
９３）。
情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＤＮＡ
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に保有させ、該菌株を用いてＬ−スレオニンあるいは
Ｌ−イソロイシンを発酵生産する方法が開示されている
（特開昭５８−１２６７８９および特開昭６Ｏ−３０６
９３）。
また、ブレビバクテリウム属菌株のＨＤをコードする遺
伝子（以下ＨＤ遺伝子ともいう）を含む組換え体プラス
ミドＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属およびブレ
ビバクテリウム属菌種によるＬ−スレオニンおよびＬ−
イソロイシンの製造法も開示されている（特開昭６Ｏ−
１２９９５）。
伝子（以下ＨＤ遺伝子ともいう）を含む組換え体プラス
ミドＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属およびブレ
ビバクテリウム属菌種によるＬ−スレオニンおよびＬ−
イソロイシンの製造法も開示されている（特開昭６Ｏ−
１２９９５）。
発明が解決しようとする問題点
近年、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンに対する
需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の製造法の改
良がますます望まれている。本発胡者らは、この課題に
対処するために、組換えＤＮＡ技術によりコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−スレオ
ニンおよびＬ−イソロイシンの生産能力を向上させるべ
く研究を行った。
需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の製造法の改
良がますます望まれている。本発胡者らは、この課題に
対処するために、組換えＤＮＡ技術によりコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−スレオ
ニンおよびＬ−イソロイシンの生産能力を向上させるべ
く研究を行った。
問題点を解決するための手段
］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物のＬ−スレオニン生合成に係わる酵素のうち
、ＨＤとＨＫの遺伝情報を同時に含む組換え体プラスミ
ドＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム嘱菌種に導入することにより、Ｌ−スレオニンおよ
びＬ−スレオニンを前駆体として生合成されるし一イン
ロインンの生産能が著しく向上することを見出し、本発
明を完成するに至った。コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種由来の遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いるＬ−スレオニンあるいはＬ−イ
ソロイシン生産菌としては、前記のごと＜ＨＤ遺伝子を
適用した例が知られているが、ＨＤ遺伝子とＨＫをコー
ドする遺伝子（以下ＨＫ遺伝子ともいう）の両遺伝子を
使用した例は知られておらず、両遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡがＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産
性に顕著に寄与することは、本発明により初めて見出さ
れたものである。
する微生物のＬ−スレオニン生合成に係わる酵素のうち
、ＨＤとＨＫの遺伝情報を同時に含む組換え体プラスミ
ドＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム嘱菌種に導入することにより、Ｌ−スレオニンおよ
びＬ−スレオニンを前駆体として生合成されるし一イン
ロインンの生産能が著しく向上することを見出し、本発
明を完成するに至った。コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種由来の遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いるＬ−スレオニンあるいはＬ−イ
ソロイシン生産菌としては、前記のごと＜ＨＤ遺伝子を
適用した例が知られているが、ＨＤ遺伝子とＨＫをコー
ドする遺伝子（以下ＨＫ遺伝子ともいう）の両遺伝子を
使用した例は知られておらず、両遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡがＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産
性に顕著に寄与することは、本発明により初めて見出さ
れたものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子
を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮ八との組換え体ＤＮＡ
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、
該培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを
採取することにより、高収率でＬ−スレオニンまたはＬ
−イソロイシンを製造することができる。
クテリウム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子
を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮ八との組換え体ＤＮＡ
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、
該培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを
採取することにより、高収率でＬ−スレオニンまたはＬ
−イソロイシンを製造することができる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種としては、コリネ型グルタミン
酸生産菌として知られる微生物は全て用いることができ
るが、好適には下記の菌株が使用される。
レビバクテリウム属菌種としては、コリネ型グルタミン
酸生産菌として知られる微生物は全て用いることができ
るが、好適には下記の菌株が使用される。
コリネバクテリウム・グルタミクム
ＡＴＣＣ３１８３３
コリネバクテリウム・グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１′５９９０ ブレビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ 宿主微生物としては、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン非生産性の菌株を用いることもできるが、好まし
くはＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−ＩＪ
リジン産性を有する菌株を用いる。Ｌ−スレオニン、Ｌ
−イソロイシンまたはＬ−’Ｊリジン産性を有する菌株
は、アミノ酸要求性変異、アナログ耐性変異またはこれ
らの変異を組み合わせる公知の変異誘導法によって造成
できる〔プレスコツト・アンド・ダンズ・インダストリ
アル・ミクロバイオロジイ（ＰＲＥＳＣＯＴＴ ａｎｄ
ＯＵＮＮ’Ｓ ＩＮＤＩＪｓＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢ
ＩＯＬＯＧＹ）第４版、ジー・リード（Ｇ、 Ｒｅｅｄ
） ＮＪＡ 、ザ・ニー・ケイ・アイ・パブリッシン
グ・カンパ＝ −（Ｔｈｅ ＡＶＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇＣｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ、 Ｃｏｎｎ、＞ １
９８２． ＰＰ、７４８−８０１． ケイ・ナカヤ
？ （Ｋ、Ｎａｋａｙａｍａ） Ｅ。
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１′５９９０ ブレビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ 宿主微生物としては、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン非生産性の菌株を用いることもできるが、好まし
くはＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−ＩＪ
リジン産性を有する菌株を用いる。Ｌ−スレオニン、Ｌ
−イソロイシンまたはＬ−’Ｊリジン産性を有する菌株
は、アミノ酸要求性変異、アナログ耐性変異またはこれ
らの変異を組み合わせる公知の変異誘導法によって造成
できる〔プレスコツト・アンド・ダンズ・インダストリ
アル・ミクロバイオロジイ（ＰＲＥＳＣＯＴＴ ａｎｄ
ＯＵＮＮ’Ｓ ＩＮＤＩＪｓＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢ
ＩＯＬＯＧＹ）第４版、ジー・リード（Ｇ、 Ｒｅｅｄ
） ＮＪＡ 、ザ・ニー・ケイ・アイ・パブリッシン
グ・カンパ＝ −（Ｔｈｅ ＡＶＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇＣｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ、 Ｃｏｎｎ、＞ １
９８２． ＰＰ、７４８−８０１． ケイ・ナカヤ
？ （Ｋ、Ｎａｋａｙａｍａ） Ｅ。
本発明において、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子の供給源とな
る微生物としては、コリネ型グルタミン酸生産菌でＨＤ
およびＨＫ活性を存するものであればいかなる微生物で
もよく、例えばコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物の野生株あるいはそれから誘
導したＬ−’ＪリジンＬ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン生産性変異株を用いることができる。これらの菌
株の染色体ＤＮＡは、本発明者らが特開昭５８−１２６
７８９に示したように、培養中にペニシリン処理した菌
体をリゾチームおよび界面活性剤で処理して溶菌した後
、常法で除蛋白し、次いでエタノールで沈殿させること
により単離できる。
る微生物としては、コリネ型グルタミン酸生産菌でＨＤ
およびＨＫ活性を存するものであればいかなる微生物で
もよく、例えばコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物の野生株あるいはそれから誘
導したＬ−’ＪリジンＬ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン生産性変異株を用いることができる。これらの菌
株の染色体ＤＮＡは、本発明者らが特開昭５８−１２６
７８９に示したように、培養中にペニシリン処理した菌
体をリゾチームおよび界面活性剤で処理して溶菌した後
、常法で除蛋白し、次いでエタノールで沈殿させること
により単離できる。
染色体ＤＮＡからＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製
できるものであれば特に限定されないが、例えば本発明
者らが開発したｐＣＧｌ（特開昭５７−１３４５００）
、ｐＣＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４．
ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９＞、ｐ
ＣＥ５４、ｐＣＢ１０１ （いずれも特開昭５８−１０
５９９９）、ｐｃＥ５１ （特開昭６０＝３４１９７）
およびｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３ Ｃいずれもモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジ工ネｆ イクス（！Ｊｏｌ
、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） １９６．１７５ （
１９８４） 〕などのプラスミドを使用することができ
る。プラスミドベクターは、本発明者らが特開昭５７−
１３４５００あるいは特開昭５７−１８６４８９に開示
したように、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌
後、クリヤード・ライゼートを調製し、ポリエチレング
リコールでＤＮＡを沈殿させ、しかる後にセシウムクロ
ライド−エチジウムブロマイド密度匂配遠心にかけ、Ｃ
ＣＣ−ＤＮＡとして単離精製することができる。
断片を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製
できるものであれば特に限定されないが、例えば本発明
者らが開発したｐＣＧｌ（特開昭５７−１３４５００）
、ｐＣＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４．
ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９＞、ｐ
ＣＥ５４、ｐＣＢ１０１ （いずれも特開昭５８−１０
５９９９）、ｐｃＥ５１ （特開昭６０＝３４１９７）
およびｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３ Ｃいずれもモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジ工ネｆ イクス（！Ｊｏｌ
、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） １９６．１７５ （
１９８４） 〕などのプラスミドを使用することができ
る。プラスミドベクターは、本発明者らが特開昭５７−
１３４５００あるいは特開昭５７−１８６４８９に開示
したように、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌
後、クリヤード・ライゼートを調製し、ポリエチレング
リコールでＤＮＡを沈殿させ、しかる後にセシウムクロ
ライド−エチジウムブロマイド密度匂配遠心にかけ、Ｃ
ＣＣ−ＤＮＡとして単離精製することができる。
ＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタープ
ラスミドとの組換え体は、染色体ＤＮＡとベクタープラ
スミドを制限酵素で切断した後、ＤＮＡ’Ｊガーゼで処
理するか、あるいはその切断末端をターミナルトランス
フェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させて結合するなどの常法〔メソッ
ヅ・イン拳エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） 、 ５８（１９７９） ）によ
り、種々の組換え体混成物とともに生成せしめることが
できる。
ラスミドとの組換え体は、染色体ＤＮＡとベクタープラ
スミドを制限酵素で切断した後、ＤＮＡ’Ｊガーゼで処
理するか、あるいはその切断末端をターミナルトランス
フェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させて結合するなどの常法〔メソッ
ヅ・イン拳エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） 、 ５８（１９７９） ）によ
り、種々の組換え体混成物とともに生成せしめることが
できる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の菌
株から通常の変異操作によって誘導したホモセリン（あ
るいはメチオニンとスレオニン）要求性のＨＤ欠損変異
株またはスレオニン要求性でホモセリンを分泌生産する
ＨＫ欠損変異株を上記組換え体混成物を用いて形質転換
し、ホモセリンまたはスレオニンに対して非要求性とな
った形質転換株を選択することによって、ＨＤおよびＨ
Ｋ両遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを取得する
ことができる。コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌株の形質転換法としては、本発明者らが開
発したプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−１８
６４９２および特開昭５７−１８６４８９．具体的には
実施例に示す）により実施することができる。かくして
得られた組換え体プラスミドＤＮＡの中から、ＨＤ欠損
変異株とＨＫ欠損変異株を再度形質転換したとき両株の
欠損形質を復帰させるものを選ぶことにより、ＨＤおよ
びＨＫ両遺伝子を含む組換え体プラスミドを人手するこ
とができる。
株から通常の変異操作によって誘導したホモセリン（あ
るいはメチオニンとスレオニン）要求性のＨＤ欠損変異
株またはスレオニン要求性でホモセリンを分泌生産する
ＨＫ欠損変異株を上記組換え体混成物を用いて形質転換
し、ホモセリンまたはスレオニンに対して非要求性とな
った形質転換株を選択することによって、ＨＤおよびＨ
Ｋ両遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを取得する
ことができる。コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌株の形質転換法としては、本発明者らが開
発したプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−１８
６４９２および特開昭５７−１８６４８９．具体的には
実施例に示す）により実施することができる。かくして
得られた組換え体プラスミドＤＮＡの中から、ＨＤ欠損
変異株とＨＫ欠損変異株を再度形質転換したとき両株の
欠損形質を復帰させるものを選ぶことにより、ＨＤおよ
びＨＫ両遺伝子を含む組換え体プラスミドを人手するこ
とができる。
以上のようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源とし
た場合には、野生型のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体が得られ、これをコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌株に保有させ、Ｌ−スレオニンま
たはＬ−イソロイシンの生産性を向上させることができ
る。しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種において、スレオニン生合成に係わ
るＨＤはスレオニンでフィードバック阻害を受け、スレ
オニン合成を制御することが知られている〔アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ３８ （５）、 ９
９３（１９７４） ）ので、この阻害から解除された変
異型のＨＤをコードする遺伝子を有する組換え体プラス
ミドを用いる方がＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシ
ンの生産性は高まる。
クテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源とし
た場合には、野生型のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体が得られ、これをコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌株に保有させ、Ｌ−スレオニンま
たはＬ−イソロイシンの生産性を向上させることができ
る。しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種において、スレオニン生合成に係わ
るＨＤはスレオニンでフィードバック阻害を受け、スレ
オニン合成を制御することが知られている〔アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ３８ （５）、 ９
９３（１９７４） ）ので、この阻害から解除された変
異型のＨＤをコードする遺伝子を有する組換え体プラス
ミドを用いる方がＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシ
ンの生産性は高まる。
このような変異型のＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドは、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト
リイ（＾ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ３
３（５）、９９３ （１９７４）に記載されているよう
に、スレオニンのアナログ例えばα−アミノ−β−ヒド
ロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略す）に耐性となった変異
株、すなわちＨＤ活性のスレオニンによる阻害が解除さ
れた菌株を分離し、その染色体ＤＮＡを供与源として、
野生型の遺伝子から出発したと同様な方法で取得できる
。あるいは野生型の遺伝子を含む組換え体プラスミドを
保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を常法通り変異処理し、スレオニンアナログ耐
性を付与することによっても、スレオニンによる阻害を
受けなくなったＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミドを
調製できる。
ドは、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト
リイ（＾ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ３
３（５）、９９３ （１９７４）に記載されているよう
に、スレオニンのアナログ例えばα−アミノ−β−ヒド
ロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略す）に耐性となった変異
株、すなわちＨＤ活性のスレオニンによる阻害が解除さ
れた菌株を分離し、その染色体ＤＮＡを供与源として、
野生型の遺伝子から出発したと同様な方法で取得できる
。あるいは野生型の遺伝子を含む組換え体プラスミドを
保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を常法通り変異処理し、スレオニンアナログ耐
性を付与することによっても、スレオニンによる阻害を
受けなくなったＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミドを
調製できる。
野生型あるいは変異型のＨＤおよびＨＫ遺伝子を含む組
換え体プラスミドは、前記のごときプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物に導入できる。これらの組換え
体プラスミド保育株によるＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシンの生産は、従来の発酵法によるＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシン製造に用いられる培養方法に
より行うことができる。すなわち、該形質転換株を炭素
源、窒素源１ｗＡ機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有
する通常の培地で、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調
節しつつ培養を行えば、培養物中にＬ−スレオニンまた
はＬ−イソロイシンが生成蓄積するのでこれを採取する
。
換え体プラスミドは、前記のごときプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物に導入できる。これらの組換え
体プラスミド保育株によるＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシンの生産は、従来の発酵法によるＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシン製造に用いられる培養方法に
より行うことができる。すなわち、該形質転換株を炭素
源、窒素源１ｗＡ機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有
する通常の培地で、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調
節しつつ培養を行えば、培養物中にＬ−スレオニンまた
はＬ−イソロイシンが生成蓄積するのでこれを採取する
。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シニークロース、マルトース、マンノース、Ｊｌｌ
！粉、澱粉加水分解物、Ｕ蜜などの炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸。
ス、シニークロース、マルトース、マンノース、Ｊｌｌ
！粉、澱粉加水分解物、Ｕ蜜などの炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸。
乳酸、酢酸などの各ｌ有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いることができる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いることができる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物ならびにペプ
トン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチーブ・リカー、カゼイン加水分解物、フィック−１
ミールあるいはその消化物、鴫加水分解物などの窒素含
を物など種々のものが使用可能である。
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物ならびにペプ
トン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチーブ・リカー、カゼイン加水分解物、フィック−１
ミールあるいはその消化物、鴫加水分解物などの窒素含
を物など種々のものが使用可能である。
さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
１硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。
１硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地にＬ−スレオニンおよび
／またはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−スレオニンおよび／またはＬ
−イソロイシンを回収する。
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地にＬ−スレオニンおよび
／またはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−スレオニンおよび／またはＬ
−イソロイシンを回収する。
かくしてコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体プラスミドを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属の微生物を用いることにより
、高収率でＬ−スレオニンおよび／またはＬ−イソロイ
シンを生産することができる。
ム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体プラスミドを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属の微生物を用いることにより
、高収率でＬ−スレオニンおよび／またはＬ−イソロイ
シンを生産することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例
（１） コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３１８３３の染色体ＤＮＡとベクターｐＣＥ５４の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを純水
１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地）で増殖したコ
リネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の
種培養を４００１１１１の半合成培地ＳＳＭ （グルコ
ース２０ ｇ、 （ＮＨ４）ｉｓｏ、１０ｇ、尿素３ｇ
、酵母エキスＩｇ。
３１８３３の染色体ＤＮＡとベクターｐＣＥ５４の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを純水
１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地）で増殖したコ
リネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の
種培養を４００１１１１の半合成培地ＳＳＭ （グルコ
ース２０ ｇ、 （ＮＨ４）ｉｓｏ、１０ｇ、尿素３ｇ
、酵母エキスＩｇ。
Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４１ｇ 、 Ｍ ｇ Ｃｌ ２・６Ｈｚ
○ ０．４ ｇ 。
○ ０．４ ｇ 。
Ｆｅ５０＜・７Ｈ２０１０ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ１・４〜６Ｈ
ｔＯＯ，２ｍｇ、ＺｎＳＯｓ’７ＨｉＯＯ，９ｍｇ、
Ｃｕ Ｓ ０４ ・５ Ｈ＊０ ０．４ｍｇ、 Ｎ ａ
ｔＢａｏｔ・１０Ｈ２００，０９■、（ＮＨ４）６ＭＯ
ｙＯ＊＜・４８２０ ０、０４ ｍｇ、ビオチン ３０
ｇｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１βに含み、ｐ
Ｈ７： ２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪
培養した。東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度
（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養液
中０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧを
添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるま
で生育させた。
ｔＯＯ，２ｍｇ、ＺｎＳＯｓ’７ＨｉＯＯ，９ｍｇ、
Ｃｕ Ｓ ０４ ・５ Ｈ＊０ ０．４ｍｇ、 Ｎ ａ
ｔＢａｏｔ・１０Ｈ２００，０９■、（ＮＨ４）６ＭＯ
ｙＯ＊＜・４８２０ ０、０４ ｍｇ、ビオチン ３０
ｇｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１βに含み、ｐ
Ｈ７： ２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪
培養した。東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度
（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養液
中０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧを
添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるま
で生育させた。
培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）、０．００５Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム）。
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）、０．００５Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム）。
０．０５Ｍ ＮａＣ１，ｐＨ８，０） で洗浄後、リ
ゾチーム溶液（２５％シヨ糖、０．ＩＭ ＮａＣＡ。
ゾチーム溶液（２５％シヨ糖、０．ＩＭ ＮａＣＡ。
０、０５ Ｍ ）リス、 ０．８ ｍｇ／ｍｌリゾチー
ム、ｐＨ８，０，以下同じ）１０ｍｌに懸濁し、３７℃
で４時間反応を行った。集菌した菌体から斉藤らの方法
［５ａｉｔｏ、 Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ：バイオキミ
カ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
ム、ｐＨ８，０，以下同じ）１０ｍｌに懸濁し、３７℃
で４時間反応を行った。集菌した菌体から斉藤らの方法
［５ａｉｔｏ、 Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ：バイオキミ
カ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔ′ａ）、 ７２．６１９ （１９６３））に従っ
て高分子染色体ＤＮＡを単離した。
て高分子染色体ＤＮＡを単離した。
ベクターとして用いたｐＣＥ５４（特開昭５８−１０５
９９９）は、本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ２（特開昭
５８−３５１９７）とニジエリシア・コリのプラスミド
ｐＧＡ２２〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ
。
９９９）は、本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ２（特開昭
５８−３５１９７）とニジエリシア・コリのプラスミド
ｐＧＡ２２〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ
。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、’） １４０．４００ （１９７
９） ）を連結せしめたプラスミドである。詳しくはｐ
ＣＧ２とｐＧＡ２２の各々１ケ所しかないＰｓｔＩ切断
部位で両者を和合連結したプラスミドである（第１図参
照）。このｐＣＥ５４はその保有株コリネバクテリウム
・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣＣ３１８３
３から誘導したりゾチーム感受性変異を有する菌株）の
培養菌体から次の方法で単離した。
９） ）を連結せしめたプラスミドである。詳しくはｐ
ＣＧ２とｐＧＡ２２の各々１ケ所しかないＰｓｔＩ切断
部位で両者を和合連結したプラスミドである（第１図参
照）。このｐＣＥ５４はその保有株コリネバクテリウム
・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣＣ３１８３
３から誘導したりゾチーム感受性変異を有する菌株）の
培養菌体から次の方法で単離した。
４ＱＱｍｌＮＢ培地で３０℃で振盪培養し、○Ｄ約０．
７になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ緩衝液で
洗浄後、リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で２
時間反応させた。反応液に５Ｍ ＮａＣｊ！ ２．４
ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、
４％５ ウＩＪ ／Ｉ／硫酸−１−）ＩＪウムと０．７
Ｍ ＮａＣｊ！からなる溶液４．４ｍｌを順次添加し
、緩やかに混和してから氷水上に１５時間装いた。溶菌
物を遠心管に移し、４℃で６０分間６９．４００Ｘｇの
遠心分離にかけ上澄液を回収した。これに重量百分率１
０％相当のポリエチレングリコール（ｐＥＧ） ６．０
００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解
後、氷水上に置いた。１０時間後、１．５００ｘｇで１
０分間遠心分離してペレットを回収した。ＴＢＳ緩衝緩
衝液５奢ｌえてベレットを静かに再溶解してから１．５
ａ＋ｇ／ｉｆエチジウムブロマイド２．Ｑ＋ｎｌを添加
し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密度を
１．５８０に合わせた。
７になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ緩衝液で
洗浄後、リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で２
時間反応させた。反応液に５Ｍ ＮａＣｊ！ ２．４
ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、
４％５ ウＩＪ ／Ｉ／硫酸−１−）ＩＪウムと０．７
Ｍ ＮａＣｊ！からなる溶液４．４ｍｌを順次添加し
、緩やかに混和してから氷水上に１５時間装いた。溶菌
物を遠心管に移し、４℃で６０分間６９．４００Ｘｇの
遠心分離にかけ上澄液を回収した。これに重量百分率１
０％相当のポリエチレングリコール（ｐＥＧ） ６．０
００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解
後、氷水上に置いた。１０時間後、１．５００ｘｇで１
０分間遠心分離してペレットを回収した。ＴＢＳ緩衝緩
衝液５奢ｌえてベレットを静かに再溶解してから１．５
ａ＋ｇ／ｉｆエチジウムブロマイド２．Ｑ＋ｎｌを添加
し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密度を
１．５８０に合わせた。
この溶液を１０５．ｏｏｏｘｇ、１８℃で４８時間超遠
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チニーブの側面か
ら注射器で抜きとることによってｐＣＥ５４プラスミド
ＤＮＡを分離した。この分画液を等容量のイソプロピル
アルコール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコー
ル、１０％ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解度の塩
化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマ
イドを抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透
析した。
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チニーブの側面か
ら注射器で抜きとることによってｐＣＥ５４プラスミド
ＤＮＡを分離した。この分画液を等容量のイソプロピル
アルコール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコー
ル、１０％ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解度の塩
化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマ
イドを抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透
析した。
（２）ＨＤ遺伝子とＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロ
ーニング 上記で調製したｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡ３μｇを含
む制限酵素５ａｊｔ Ｉ用反応液（トリス１０ｍＭ、Ｍ
ｇＣｊ！２６ｍＭ、ＮａＣ，ｆ！２００ｍＭ、ｐＨ７，
５）６０ｔ、ｔｌに６単位の５ａｆｌ（宝酒造社製）を
添加し、３７℃で６σ分間反応後、６５℃で１０分間加
温して反応を停止させた。一方、コリネバクテリウム・
グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡ８μｇ
を含む５ａｆｌ用反応液１４０μβに４単位のＳａｊ
Ｉを添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分
間加温して反応を停止させた。
ーニング 上記で調製したｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡ３μｇを含
む制限酵素５ａｊｔ Ｉ用反応液（トリス１０ｍＭ、Ｍ
ｇＣｊ！２６ｍＭ、ＮａＣ，ｆ！２００ｍＭ、ｐＨ７，
５）６０ｔ、ｔｌに６単位の５ａｆｌ（宝酒造社製）を
添加し、３７℃で６σ分間反応後、６５℃で１０分間加
温して反応を停止させた。一方、コリネバクテリウム・
グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡ８μｇ
を含む５ａｆｌ用反応液１４０μβに４単位のＳａｊ
Ｉを添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分
間加温して反応を停止させた。
両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用媛衡液
（トリス６６０ｍＭ、ＭｇＣＬ６６ｍＭ、ジチオスレイ
トール１００ ｍＭ。
（トリス６６０ｍＭ、ＭｇＣＬ６６ｍＭ、ジチオスレイ
トール１００ ｍＭ。
ｐＨ７，６＞４０μｆ、５ｍＭ ＡＴＰ４０μ／。
Ｔ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製、１単位／μｍ）０．３μ
βおよび純水１２０μｌを加え、１２℃で１６時間反応
させた。
βおよび純水１２０μｌを加え、１２℃で１６時間反応
させた。
このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ３１８３３由来のリソチーム感受性変異
株から誘導されたに５３株〔本菌株はホモセリン要求性
（ＨＤ欠慣）とロイシン要求性の変異を有している〕の
形質転換に供した。Ｋ５３株は昭和６０年５月２３日付
で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−８２５７として寄託しである。
ミクムＡＴＣＣ３１８３３由来のリソチーム感受性変異
株から誘導されたに５３株〔本菌株はホモセリン要求性
（ＨＤ欠慣）とロイシン要求性の変異を有している〕の
形質転換に供した。Ｋ５３株は昭和６０年５月２３日付
で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−８２５７として寄託しである。
形質転換には次のように調製されるプロトプラストを用
いた。Ｋ５３株の種培養をＮＢ培地に植菌して３０℃で
振盪培養し、ＯＤが０．６になった時点で集菌した。菌
体をＲＣＧＰ＠地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、
酵母エキス２．５ｇ、に２ＨＰ０４３．５ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４１，５ｇ。
いた。Ｋ５３株の種培養をＮＢ培地に植菌して３０℃で
振盪培養し、ＯＤが０．６になった時点で集菌した。菌
体をＲＣＧＰ＠地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、
酵母エキス２．５ｇ、に２ＨＰ０４３．５ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４１，５ｇ。
ＭｇＣＬ・６Ｈ２００，４１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０
１０ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４〜６Ｈｚ０２ｍｇ、 Ｚ ｎ
３０４ ・７ ）（２００，９ｍｇ 。
１０ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４〜６Ｈｚ０２ｍｇ、 Ｚ ｎ
３０４ ・７ ）（２００，９ｍｇ 。
（ＮＨ４）ＢＭＣｈＯ２＊ ’ ４ＨｘＯＯ，０４１１
１ｇ。
１ｇ。
ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸
二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量
１０．０００）３０ｇを水１４７１．：含む培地〕にｌ
ＩＩＩｇ／ｍｌのりゾチームを含む溶液（ｐＨ７，６）
に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管
に移して３０ｔで５時間緩やかに振盪反応してプロトプ
ラスト化した。
二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量
１０．０００）３０ｇを水１４７１．：含む培地〕にｌ
ＩＩＩｇ／ｍｌのりゾチームを含む溶液（ｐＨ７，６）
に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管
に移して３０ｔで５時間緩やかに振盪反応してプロトプ
ラスト化した。
このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２．５０’ ＯＸ ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣｉ
ｌ衡液（Ｍ ｇ Ｃ１２１０ｍ Ｍ 、 Ｃａ Ｃ１２
３０ｍＭ、）リス５０ｍＭ、 ショ糖４００ｍＭ。
２．５０’ ＯＸ ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣｉ
ｌ衡液（Ｍ ｇ Ｃ１２１０ｍ Ｍ 、 Ｃａ Ｃ１２
３０ｍＭ、）リス５０ｍＭ、 ショ糖４００ｍＭ。
ｐＨ７，５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度
のＴＳＭＣ榎衡液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液
１００μｌを加えて混和し、次いで７３ＭＣ緩衝液中に
２０％ＰＥＧ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して
混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ａ＋
ｌを添加し、２．５００ｘｇで５分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲ
ＣＧＰ培地に懸濁してから、Ｑ、２ｍｌをカナマイシン
３００μｇ／ｍｌを含むＲＣＣ，Ｐ寒天培地（ＲＣＧＰ
培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し
、３０℃で７日間培養した。
緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度
のＴＳＭＣ榎衡液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液
１００μｌを加えて混和し、次いで７３ＭＣ緩衝液中に
２０％ＰＥＧ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して
混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ａ＋
ｌを添加し、２．５００ｘｇで５分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲ
ＣＧＰ培地に懸濁してから、Ｑ、２ｍｌをカナマイシン
３００μｇ／ｍｌを含むＲＣＣ，Ｐ寒天培地（ＲＣＧＰ
培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し
、３０℃で７日間培養した。
寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水ｌｌＴｌ１に懸濁した。
で２回遠心洗浄後、生理食塩水ｌｌＴｌ１に懸濁した。
この菌液をロイシン５０μｇ ／ｍｌおよびカナマイシ
ン２０μｇ ／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１ 〔グ
ルコース１０ｇ。
ン２０μｇ ／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１ 〔グ
ルコース１０ｇ。
ＮＨ４８２Ｐ０４ １ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｍｇ５Ｏ
ｎ・７Ｈ２００，２ｇ、Ｆｅ５Ｏ１・７Ｈ２０１０ｍｇ
。
ｎ・７Ｈ２００，２ｇ、Ｆｅ５Ｏ１・７Ｈ２０１０ｍｇ
。
ＭｎＳＯ４・４〜６８２０ ０．２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＊’
７Ｈ２０Ｑ、９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ
。
７Ｈ２０Ｑ、９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ
。
Ｎ ３２Ｂ４０ｔ ・１０ Ｈ２Ｏ０，０９ｍｇ、 （
ＮＨａ）ａＭ○７０２．・４Ｈ２００，０４■、ビオチ
ン５０μｇ、ｐ−アミ７安息呑酸２．５■、サイアミン
塩酸塩１ ｔｎｇおよび寒天１６ｇを１ｐ中に含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃で３
日培養し、ホモセリン非要求性でカナマイシンに耐性と
なった形質転換株を選択した。
ＮＨａ）ａＭ○７０２．・４Ｈ２００，０４■、ビオチ
ン５０μｇ、ｐ−アミ７安息呑酸２．５■、サイアミン
塩酸塩１ ｔｎｇおよび寒天１６ｇを１ｐ中に含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃で３
日培養し、ホモセリン非要求性でカナマイシンに耐性と
なった形質転換株を選択した。
これらの形質転換株をＮＢ培地で培養し、その菌体から
上記（１）でｐＣＥ５４を単離したのと同様な方法でプ
ラスミドＤＮＡを単離した。
上記（１）でｐＣＥ５４を単離したのと同様な方法でプ
ラスミドＤＮＡを単離した。
形質転換株の一株から得られ、ｐｃｈｏｍｌと命名した
プラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５４の唯一の５ａｊＮ
切断部位に３．６キロベースの５ａｆＩＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドであることがわかった。この５ａＩ
ｌｒ切断片は第１図に示すような位置に２ケ所のＰｓｔ
ｌ切断部位と１ケ所のＥＣ０ＲＩ切断部位を有していた
。
プラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５４の唯一の５ａｊＮ
切断部位に３．６キロベースの５ａｆＩＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドであることがわかった。この５ａＩ
ｌｒ切断片は第１図に示すような位置に２ケ所のＰｓｔ
ｌ切断部位と１ケ所のＥＣ０ＲＩ切断部位を有していた
。
ｐｃｈｏｍｌＤＮＡを用い、上記と同様な方法でに５３
株のプロトプラストを形質転換し、カナマイシン耐性で
選択された形質転換株は、同時にホモセリン非要求性を
示し、それから単離されたプラスミドはｐｃｈｏｍｌと
同一の構造を有していた。このことからコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の）（Ｄ遺伝子
がｐｃｈｏｍｌ上にクローン化されていることが明らか
となった。
株のプロトプラストを形質転換し、カナマイシン耐性で
選択された形質転換株は、同時にホモセリン非要求性を
示し、それから単離されたプラスミドはｐｃｈｏｍｌと
同一の構造を有していた。このことからコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の）（Ｄ遺伝子
がｐｃｈｏｍｌ上にクローン化されていることが明らか
となった。
ＨＫ遺伝子がｐｃｈｏｍｌ上に存在することは次のよう
に確認した。ｐｃｈｏｍｌＤＮＡを用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３から誘導した
スレオニン要求性でホモセリン生産性のＨＫ欠損変異株
に５４（本菌株は昭和６０年５月２３日付で微工研にＦ
ＥＲＭＰ−８２５８として寄託しである）のプロトプラ
ストを形質転換した。本枕のプロトプラストは以下のよ
うにペニシリン処理菌体から調製した。ＮＢ培地での種
培養０．１１Ｔｌｌをスレオニン１００μｇ＃＋Ｉを含
む１０ｍ１の３３Ｍ培地に接種し３０℃で振盪培養した
。ＯＤが０．１５になった時点で０．４５単位／ｍｌと
なるようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け
ＯＤが０．６になったところで集菌し、以後前記でに５
３株のプロトプラストを調製したのと同様な方法でリゾ
チーム処理してプロトプラスト化した。形質転換も前記
と同様に行い、カナマイシン３００μｇ ／ｍｌを含む
ＲＣＧＰ寒天培地で形質転換株を選択した。カナマイシ
ン耐性形質転換株は同時にスレオニン非要求性であった
。
に確認した。ｐｃｈｏｍｌＤＮＡを用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３から誘導した
スレオニン要求性でホモセリン生産性のＨＫ欠損変異株
に５４（本菌株は昭和６０年５月２３日付で微工研にＦ
ＥＲＭＰ−８２５８として寄託しである）のプロトプラ
ストを形質転換した。本枕のプロトプラストは以下のよ
うにペニシリン処理菌体から調製した。ＮＢ培地での種
培養０．１１Ｔｌｌをスレオニン１００μｇ＃＋Ｉを含
む１０ｍ１の３３Ｍ培地に接種し３０℃で振盪培養した
。ＯＤが０．１５になった時点で０．４５単位／ｍｌと
なるようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け
ＯＤが０．６になったところで集菌し、以後前記でに５
３株のプロトプラストを調製したのと同様な方法でリゾ
チーム処理してプロトプラスト化した。形質転換も前記
と同様に行い、カナマイシン３００μｇ ／ｍｌを含む
ＲＣＧＰ寒天培地で形質転換株を選択した。カナマイシ
ン耐性形質転換株は同時にスレオニン非要求性であった
。
この形質転換株を４００ｍｌＳＳＭ培地で振盪培養し、
ＯＤが０．２になったところで０．５ｊｌ１位／ｍｌと
なるようにペニシリンＧを添加し、さらにＯＤ約０．６
まで培養し、集菌した菌体から上記〔１）で記載したの
と同じ方法で溶菌し、塩化セシウム−エチジウムブロマ
イド密度匂配遠心でプラスミドを単離した。このプラス
ミドを各種制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動で
解析した結果、ｐｃｈｏｍｌと同一のプラスミドである
ことが確認された。
ＯＤが０．２になったところで０．５ｊｌ１位／ｍｌと
なるようにペニシリンＧを添加し、さらにＯＤ約０．６
まで培養し、集菌した菌体から上記〔１）で記載したの
と同じ方法で溶菌し、塩化セシウム−エチジウムブロマ
イド密度匂配遠心でプラスミドを単離した。このプラス
ミドを各種制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動で
解析した結果、ｐｃｈｏｍｌと同一のプラスミドである
ことが確認された。
以上の結果からｐＣｈ ｏｍｌとしてクローニングされ
た３、６キロベースの５ａｌｌＤＮＡ切断片にはＨＤお
よびＨＫ両遺伝子が存在していることが判明した。
た３、６キロベースの５ａｌｌＤＮＡ切断片にはＨＤお
よびＨＫ両遺伝子が存在していることが判明した。
ｐｃｈｏｍｌ上にクローニングされた３、６キロベース
のＳａｊ！ ｌ切断片の代表的な制限酵素に対する切断
地図を第２図に示した。
のＳａｊ！ ｌ切断片の代表的な制限酵素に対する切断
地図を第２図に示した。
（３）宿主菌に高度のα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草
酸耐性を与える変異型プラスミドの作製ｐｃｈｏｍｌを
保有するに５３株をカナマイシン２５μｇ ／ｍｌを含
むＮＢ培地で対数増殖の後期まで増殖させた。菌体を５
０ｍＭ）ＩＪス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２
回遠心後、Ｎ−メチル−Ｎ’−二トローＮ−二トロソグ
アニジン４００μｇ／Ｔｎｌを含む５０ｍＭ）リス・マ
レイン酸緩衝液（ｐ、８６．０＞に懸濁し室温で３０分
間処理した。処理菌体を同じ緩衝液で２回遠心洗浄後、
ＮＢ培地に懸濁し３０ｔで２時Ｍ振盪培養した。培養菌
体を生理食塩水で２回遠心洗浄し生理食塩水に懸濁した
。菌懸濁液をカナマイシン２０μｇ ／ｍｌとα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略す）６ｍｇ
／ｍ１を含む最少寒天培地Ｍ１に塗抹して３０℃で３日
間培養した。出現した１つのコロニーを純化後、前記と
同様にして培養菌体からプラスミドを単離し、このプラ
スミドをｐｃｈｏｍｌＯと命名した。
酸耐性を与える変異型プラスミドの作製ｐｃｈｏｍｌを
保有するに５３株をカナマイシン２５μｇ ／ｍｌを含
むＮＢ培地で対数増殖の後期まで増殖させた。菌体を５
０ｍＭ）ＩＪス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２
回遠心後、Ｎ−メチル−Ｎ’−二トローＮ−二トロソグ
アニジン４００μｇ／Ｔｎｌを含む５０ｍＭ）リス・マ
レイン酸緩衝液（ｐ、８６．０＞に懸濁し室温で３０分
間処理した。処理菌体を同じ緩衝液で２回遠心洗浄後、
ＮＢ培地に懸濁し３０ｔで２時Ｍ振盪培養した。培養菌
体を生理食塩水で２回遠心洗浄し生理食塩水に懸濁した
。菌懸濁液をカナマイシン２０μｇ ／ｍｌとα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略す）６ｍｇ
／ｍ１を含む最少寒天培地Ｍ１に塗抹して３０℃で３日
間培養した。出現した１つのコロニーを純化後、前記と
同様にして培養菌体からプラスミドを単離し、このプラ
スミドをｐｃｈｏｍｌＯと命名した。
ｐＣｈｏｍ １あるいはｐｃｈｏｍｌＯを保有するに５
３株の培養菌体を生理食塩水で遠心洗浄後、約１０４細
胞相当の菌をＡＨＶ２ｍｇ／ｍｌ。
３株の培養菌体を生理食塩水で遠心洗浄後、約１０４細
胞相当の菌をＡＨＶ２ｍｇ／ｍｌ。
４ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍ
１に塗抹し、菌株のＡ、ＨＶ耐性度を比較した。
１に塗抹し、菌株のＡ、ＨＶ耐性度を比較した。
３０℃で３日間培養した結果、ｐｃｈｏｍｌ保有株はＡ
ＨＶ ２ ｍｇ／ｍｌを含有するＭ１寒天培地で生育
したが、４ｍｇ／ｍｌを含む寒天培地では生育できなか
った。一方、ｐｃｈｏｍｌＯ保有株はＡ ＨＶ ６ ｍ
ｇ／ｍｌを含有するＭ１寒天培地でも生育した。
ＨＶ ２ ｍｇ／ｍｌを含有するＭ１寒天培地で生育
したが、４ｍｇ／ｍｌを含む寒天培地では生育できなか
った。一方、ｐｃｈｏｍｌＯ保有株はＡ ＨＶ ６ ｍ
ｇ／ｍｌを含有するＭ１寒天培地でも生育した。
ｐｃｈｏｍｌＯは、各種制限酵素での切断解析の結果、
ｐｃｈｏｍｌと同一の構造を有しており、スレオニン要
求性のＨＫ欠損変異株に５４の相補能も保持していた。
ｐｃｈｏｍｌと同一の構造を有しており、スレオニン要
求性のＨＫ欠損変異株に５４の相補能も保持していた。
（４） ｐｃｈｏｍｌあるいはｐｃｈｏｍｌＯを導入し
た菌株によるスレオニンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９およびリジン生産性菌株ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ２１４７５（チアリジン耐性）を
ｐＣｈｏｍｌおよびｐＣｈｏｍｌ Ｏで形質転換した。
た菌株によるスレオニンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９およびリジン生産性菌株ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ２１４７５（チアリジン耐性）を
ｐＣｈｏｍｌおよびｐＣｈｏｍｌ Ｏで形質転換した。
プロトプラストは上記（２）でに５４株のプロトプラス
トを調製したのと同様の方法で調製した。即ち、３３Ｍ
培地での培養中途でペニシリンＧ（０，４５１位／ｍ１
）を添加しテ処理シタ培養菌体をリゾチーム処理して調
製した。プロトプラストをプラスミドＤＮＡ １μｇを
用いて前記と同様の方法で形質転換し、ＲＣＧＰ寒天培
地でカナマイシン耐性の形質転換株を選択した。形質転
換株から、上記（２）でに５４株のｐＣｈｏｍ ｌ形質
転換株からプラスミドを単離したのと同様の方法で、プ
ラスミドを単離し、各種制限酵素での切断解析により、
形質転換株がｐｃｈｏｍｌあるいはｐｃｈｏｍｌｏを保
有することを確認した。
トを調製したのと同様の方法で調製した。即ち、３３Ｍ
培地での培養中途でペニシリンＧ（０，４５１位／ｍ１
）を添加しテ処理シタ培養菌体をリゾチーム処理して調
製した。プロトプラストをプラスミドＤＮＡ １μｇを
用いて前記と同様の方法で形質転換し、ＲＣＧＰ寒天培
地でカナマイシン耐性の形質転換株を選択した。形質転
換株から、上記（２）でに５４株のｐＣｈｏｍ ｌ形質
転換株からプラスミドを単離したのと同様の方法で、プ
ラスミドを単離し、各種制限酵素での切断解析により、
形質転換株がｐｃｈｏｍｌあるいはｐｃｈｏｍｌｏを保
有することを確認した。
形質転換株と各々の親株のスレオニン生産試験を次のよ
うに行った。ＮＢ培地で３０℃。
うに行った。ＮＢ培地で３０℃。
１６時間振盪培養した１培養Ｑ、５ｍｌを生産培地〔グ
ルコース１００’ｇ、（ＮＨｔｈＳＯ＊ ２０ｇ。
ルコース１００’ｇ、（ＮＨｔｈＳＯ＊ ２０ｇ。
Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４ｏ、 ５ ｇ 、 Ｋ ２ ＨＰ Ｏ
４０，５ｇ 。
４０，５ｇ 。
Ｍｇ５Ｏｓ’ ７Ｈ２０１ｇ、Ｆｅ５Ｏ１’ ７８２０
１ ０ｍｇ、 Ｍｎ ３０４ ・ ４ 〜６ ８
２０ １ ０ｍｇ、 ヒ゛オチン１００μｇおよび
炭酸カルシウム２０ｇを水１１に含み、ｐ Ｈ７，２に
調整した培地〕５ｍｌの入った試験管に接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。培養後、培養ν液をペーノ〈
−りロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色による
比色定量法によりＬ−スレオニン生成量を測定した。結
果を第１表に示す。
１ ０ｍｇ、 Ｍｎ ３０４ ・ ４ 〜６ ８
２０ １ ０ｍｇ、 ヒ゛オチン１００μｇおよび
炭酸カルシウム２０ｇを水１１に含み、ｐ Ｈ７，２に
調整した培地〕５ｍｌの入った試験管に接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。培養後、培養ν液をペーノ〈
−りロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色による
比色定量法によりＬ−スレオニン生成量を測定した。結
果を第１表に示す。
第 １ 表
コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ３１８３
３０同 ＡＴＣＣ３１８３３／ｐｃｉｏｍ１
０．４同 ＡＴＣＣ３１８３３
／Ｉ）ＣｈｏｌＴｌｌｏ １．９コリネバ
クテリウム・へ−キ１リス ＡＴＣＣ１３８６８０同
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＣｈｏｍｌ
Ｏ，６同 ＡＴＣＣ１３８６８＃ｌＣ
ｈｏｍ１０ ２．２ブしビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９０同
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐｃｈｏｍｌ ０
．３同 ＡＴＣＣ１３８６９／Ｉ）Ｃ
ｈｏｍｌＯ１，７プレビバクテリウム・フラブム
ＡＴＣＣ２１４７５０同 ＡＴＣＣ２１４７
５／ｐＣｈｏｍ１ ０．４同 Ａ
ＴＣＣ２１ｔ７５／ｐｃｈｏｍｌｏ ５．
２（５） ｐＣｈ ｏ ｍ １あるいはｐｃｈｏｍｌ
ｏを導入した菌株によるイソロイシンの生産 上記（（１）と同様の方法でコリネバクテリウム・グル
タミクムＦＥＲＭ Ｐ−７１６０，ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７およびリジン生産性菌
株コリネバクテリウム・グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ
−１５８を形質転換し、ｐｃｈｏｍｌとｐｃｈｏｍｌＯ
の形質転換株を得た。形質転換株がプラスミドを保をす
ることは前記と同様にして確認した。親株と形質転換株
のイソロイシン生産試験を上記（４）と同一条件で行っ
た。
３０同 ＡＴＣＣ３１８３３／ｐｃｉｏｍ１
０．４同 ＡＴＣＣ３１８３３
／Ｉ）ＣｈｏｌＴｌｌｏ １．９コリネバ
クテリウム・へ−キ１リス ＡＴＣＣ１３８６８０同
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＣｈｏｍｌ
Ｏ，６同 ＡＴＣＣ１３８６８＃ｌＣ
ｈｏｍ１０ ２．２ブしビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９０同
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐｃｈｏｍｌ ０
．３同 ＡＴＣＣ１３８６９／Ｉ）Ｃ
ｈｏｍｌＯ１，７プレビバクテリウム・フラブム
ＡＴＣＣ２１４７５０同 ＡＴＣＣ２１４７
５／ｐＣｈｏｍ１ ０．４同 Ａ
ＴＣＣ２１ｔ７５／ｐｃｈｏｍｌｏ ５．
２（５） ｐＣｈ ｏ ｍ １あるいはｐｃｈｏｍｌ
ｏを導入した菌株によるイソロイシンの生産 上記（（１）と同様の方法でコリネバクテリウム・グル
タミクムＦＥＲＭ Ｐ−７１６０，ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７およびリジン生産性菌
株コリネバクテリウム・グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ
−１５８を形質転換し、ｐｃｈｏｍｌとｐｃｈｏｍｌＯ
の形質転換株を得た。形質転換株がプラスミドを保をす
ることは前記と同様にして確認した。親株と形質転換株
のイソロイシン生産試験を上記（４）と同一条件で行っ
た。
その結果を第２表に示す。
第 ２ 表
コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ Ｐ−
７１６０１，２同 ＦＥＲＭ Ｐ−７１６０
／ｐＣｈｏｍｌ ２．６同 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７１６０／ｐＣｈｏｍ１０ ５．３ブレビ
バクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７０同
ＡＴＣＣ１４０６７／ｐｃｈｏｍｌ
０．６同 ＡＴＣＣ１４０６７／ｐｃ
ｈｏｍ１０ ３．７コリネバクテリウム・グルタ
ミクム ＦＥＲＭ ＢＦ−１５８０同
Ｆ［ｉＲＭ ０Ｐ−１５８／Ｉ）Ｃｈｏｍｌ
０．９同 ＦＥＲＭ ０Ｐ−１５８
／ｆｌｃｈｏｍ１０ ４．８（６）ＨＤおよび）（
Ｋ両遺伝子のサブクローニング第２図のＳｍａ Ｉ切断
部位から３カ所あるｐｖｕｎ切断部位のうちの右端の切
断部位にいたる切断片（太い黒線部分）を含む組換え体
プラスミドを次のようにして取得した。
７１６０１，２同 ＦＥＲＭ Ｐ−７１６０
／ｐＣｈｏｍｌ ２．６同 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７１６０／ｐＣｈｏｍ１０ ５．３ブレビ
バクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７０同
ＡＴＣＣ１４０６７／ｐｃｈｏｍｌ
０．６同 ＡＴＣＣ１４０６７／ｐｃ
ｈｏｍ１０ ３．７コリネバクテリウム・グルタ
ミクム ＦＥＲＭ ＢＦ−１５８０同
Ｆ［ｉＲＭ ０Ｐ−１５８／Ｉ）Ｃｈｏｍｌ
０．９同 ＦＥＲＭ ０Ｐ−１５８
／ｆｌｃｈｏｍ１０ ４．８（６）ＨＤおよび）（
Ｋ両遺伝子のサブクローニング第２図のＳｍａ Ｉ切断
部位から３カ所あるｐｖｕｎ切断部位のうちの右端の切
断部位にいたる切断片（太い黒線部分）を含む組換え体
プラスミドを次のようにして取得した。
ｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡＩμｇを含むＥＣＯＲＩ用
反応液（トリスｉｏｏｍ■。
反応液（トリスｉｏｏｍ■。
ＭｇＣ１，５ｍＭ、ＮａＣ１５０ｍＭ、ｐＨ７，５＞２
０μｌにＥＣ０ＲＩ （全酒造社製）を３単位添加し、
３７℃で６０分間反応後、７０℃で１５分間加温して反
応を停止させた。これにデオキシＡＴＰとデオキシＴＴ
Ｐを各０．０５ｍＭ添加し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉラージフラグメント（全酒造社製）を３単位加え、３
７℃で３０分間反応させ、７０℃で１５分間加温して反
応を停止させた。
０μｌにＥＣ０ＲＩ （全酒造社製）を３単位添加し、
３７℃で６０分間反応後、７０℃で１５分間加温して反
応を停止させた。これにデオキシＡＴＰとデオキシＴＴ
Ｐを各０．０５ｍＭ添加し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉラージフラグメント（全酒造社製）を３単位加え、３
７℃で３０分間反応させ、７０℃で１５分間加温して反
応を停止させた。
一方、ｐｃｈｏｍｌプラスミドＤＮＡ３μｇを含むＳｍ
ａ Ｉ用反応液（トリスｌＤｍＭ。
ａ Ｉ用反応液（トリスｌＤｍＭ。
ＫＣｌ ２０ｍＭ、ＭｇＣＲ２６ｍＭ、ｐＨ７，５）２
０μ！に３ｍａＩ（全酒造社製）を３単位およびＰｖｕ
Ｉｌ （全酒造社製）を１単位添加し、３７℃で６０分
間反応させた。反応物中から、モレキュラー・クローニ
ング（コールドスフリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
１９Ｂ２） １６４頁に証載されている方法を用いて、
２．６キロベースのＤＮＡ切断片を分画、精製した。す
なわち、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、２．
６キロベースのバンドを切り出し、透析膜中で電気泳動
することによりゲルからＤＮＡ切断片を抽出した。抽出
液に３倍量のエタノールを添加し、−８０℃、１０分間
冷却したのち、遠心により沈殿を集めた。真空中でエタ
ノールを蒸発させ、２０μｌのＥｃｏＲＩ用反応液に溶
解した。
０μ！に３ｍａＩ（全酒造社製）を３単位およびＰｖｕ
Ｉｌ （全酒造社製）を１単位添加し、３７℃で６０分
間反応させた。反応物中から、モレキュラー・クローニ
ング（コールドスフリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
１９Ｂ２） １６４頁に証載されている方法を用いて、
２．６キロベースのＤＮＡ切断片を分画、精製した。す
なわち、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、２．
６キロベースのバンドを切り出し、透析膜中で電気泳動
することによりゲルからＤＮＡ切断片を抽出した。抽出
液に３倍量のエタノールを添加し、−８０℃、１０分間
冷却したのち、遠心により沈殿を集めた。真空中でエタ
ノールを蒸発させ、２０μｌのＥｃｏＲＩ用反応液に溶
解した。
両反応物を混合し、５ｍＭ ＡＴＰを５μｌとＴ４リ
ガーゼ（宝酒造社製）を１単位添加し、１２℃、１６時
間反応させた。前記の方法によりに５３株のプロトプラ
ストを作成し、このリガーゼ反応物を用いて形質転換を
行った。カナマイシン耐性かつホモセリン非要求性を示
した形質転換株の１株からプラスミドＤＮＡを前記の方
法により調製した。
ガーゼ（宝酒造社製）を１単位添加し、１２℃、１６時
間反応させた。前記の方法によりに５３株のプロトプラ
ストを作成し、このリガーゼ反応物を用いて形質転換を
行った。カナマイシン耐性かつホモセリン非要求性を示
した形質転換株の１株からプラスミドＤＮＡを前記の方
法により調製した。
制限酵素ＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で
解析した結果、ｐｃｈｏｍ２０はｐｃｈｏｍｌのＳａｊ
！Ｉ３．６キロベ一ス挿入断片のうち第１図に示すＰｓ
ｔｌｌ、Ｏキロベース断片を含む目的の２．６キロベー
スの領域をサブクローニングしていることがわかった。
解析した結果、ｐｃｈｏｍ２０はｐｃｈｏｍｌのＳａｊ
！Ｉ３．６キロベ一ス挿入断片のうち第１図に示すＰｓ
ｔｌｌ、Ｏキロベース断片を含む目的の２．６キロベー
スの領域をサブクローニングしていることがわかった。
ｐｃｈｏｍ２０と命名したこのプラスミドＤＮＡを用い
て、Ｋ２Ｓ株およびに５４株を再度形質転換して調べた
ところ、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子の相補能を有すること
が確認された。
て、Ｋ２Ｓ株およびに５４株を再度形質転換して調べた
ところ、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子の相補能を有すること
が確認された。
ＨＤふよびＨＫ活性を、ジャーナル・オブ・ハイオケミ
ストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ６８．３１１
（１９７０）、 同書 ７１．２１９ （１９７２）
に記載されている方法で測定した結果、Ｋ５４株のｐ（
ｈａｍ２０形質転換株はｐｃｈｏｍｌ形質転換株と同様
に、Ｋ５４株の１６倍のＨＤ活性を示し、Ｋ２Ｓ株のｐ
ｃｈｏｍ２０形質転換株はｐｃｈｏｍ１形質転換株と同
様に、Ｋ２Ｓ株の１７倍のＨＫ活性を示した。この結果
から、Ｓｍａ ＩからＰｖｕＵにいたる２．６キロベー
スの切断片上にＨＤおよびＨＫ遺伝子が存在することが
わかった。
ストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ６８．３１１
（１９７０）、 同書 ７１．２１９ （１９７２）
に記載されている方法で測定した結果、Ｋ５４株のｐ（
ｈａｍ２０形質転換株はｐｃｈｏｍｌ形質転換株と同様
に、Ｋ５４株の１６倍のＨＤ活性を示し、Ｋ２Ｓ株のｐ
ｃｈｏｍ２０形質転換株はｐｃｈｏｍ１形質転換株と同
様に、Ｋ２Ｓ株の１７倍のＨＫ活性を示した。この結果
から、Ｓｍａ ＩからＰｖｕＵにいたる２．６キロベー
スの切断片上にＨＤおよびＨＫ遺伝子が存在することが
わかった。
（７）ＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ切断片の塩
基配列 ｐｃｈｏｍｌおよび＝ｐＣｈｏｍ２０にサブクローニン
グされたＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ切断片の
全塩基配列をメソッズ・イン・エンディモロジ−１０１
巻、２０頁、１９８３年に記載されている方法を用いて
決定した。すなわち、常法により制限酵素切断地図を作
成したのち、Ｍ１３ファージ・ベクターにサブクローニ
ングして一本＃ＪＩ Ｄ Ｎ Ａを調製し、ジデオキシ
ヌクレオチドによるチェーンターミネーション法により
塩基配列を決定した。
基配列 ｐｃｈｏｍｌおよび＝ｐＣｈｏｍ２０にサブクローニン
グされたＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ切断片の
全塩基配列をメソッズ・イン・エンディモロジ−１０１
巻、２０頁、１９８３年に記載されている方法を用いて
決定した。すなわち、常法により制限酵素切断地図を作
成したのち、Ｍ１３ファージ・ベクターにサブクローニ
ングして一本＃ＪＩ Ｄ Ｎ Ａを調製し、ジデオキシ
ヌクレオチドによるチェーンターミネーション法により
塩基配列を決定した。
その結果を第３表に示す。第３表は２６１５塩基対より
成るＳｍａ Ｉ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片の塩基配列とそ
の中に存在する２つのオープンリーディングフレーム（
塩基３２２から塩基１５５７までおよび塩基１５７１か
ら塩基２４９７まで）に対応するアミノ酸配列を示して
いる。これらのオーブンリーディングフレームがそれぞ
れＨｌよびＨＫ構造遺伝子に相当する。
成るＳｍａ Ｉ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片の塩基配列とそ
の中に存在する２つのオープンリーディングフレーム（
塩基３２２から塩基１５５７までおよび塩基１５７１か
ら塩基２４９７まで）に対応するアミノ酸配列を示して
いる。これらのオーブンリーディングフレームがそれぞ
れＨｌよびＨＫ構造遺伝子に相当する。
笛 ３ 表
Ｐｒ０１１？８１ａＡ１１１５ＶａｌＬ１１ＬＩＬ１１
１／ＨＩＭ１１１１８１ｍＡＩａｂ＊ｒＬｙ１１８１ａ
＾１ａｌｌ＊Ｌｅｕ＾Ｉａ５■窒撃戟■ ａ＋ｙａｌｕＶａ＋ｔ’ｒｏｗ＊ｕＡｓｐｕｌｙ）＠ｒ
ＭｌｌＩＬ１１ｔＪｖａｌｖａＩＬｙｓＭｌａｌｌ＠ｓ
ｒｇＭＩａｕ−ＹＬ＠ｈｙｍＧＯ丁ＧＣＣＣＧＧＣＧＣ
ＧＴＴＧＡＧＴＧＧ丁ＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＯｐｃ
ｈｏｍｌＤＮＡ ＩＡｇを含むＨｉ ｎｄＩＩｌ用反
応’ＩＮ （ト！ｊ スｌ Ｏｍ Ｍ、 Ｍ ｇ Ｃβ
２５ｍＭ。
１／ＨＩＭ１１１１８１ｍＡＩａｂ＊ｒＬｙ１１８１ａ
＾１ａｌｌ＊Ｌｅｕ＾Ｉａ５■窒撃戟■ ａ＋ｙａｌｕＶａ＋ｔ’ｒｏｗ＊ｕＡｓｐｕｌｙ）＠ｒ
ＭｌｌＩＬ１１ｔＪｖａｌｖａＩＬｙｓＭｌａｌｌ＠ｓ
ｒｇＭＩａｕ−ＹＬ＠ｈｙｍＧＯ丁ＧＣＣＣＧＧＣＧＣ
ＧＴＴＧＡＧＴＧＧ丁ＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＯｐｃ
ｈｏｍｌＤＮＡ ＩＡｇを含むＨｉ ｎｄＩＩｌ用反
応’ＩＮ （ト！ｊ スｌ Ｏｍ Ｍ、 Ｍ ｇ Ｃβ
２５ｍＭ。
ＮａＣ１６０ｍＭ、ｐＨ７，５）２０ＡＩにＨｉｎｄｍ
（全酒造社製）を３単位添加し、３７℃で６０分間反応
後、７０℃で１５分間加温し反応を停止させた。これに
デオキシＡＴＰ、デオキシＧＴＰ。
（全酒造社製）を３単位添加し、３７℃で６０分間反応
後、７０℃で１５分間加温し反応を停止させた。これに
デオキシＡＴＰ、デオキシＧＴＰ。
デオキンｃＴＰ、デオキンＴＴＰを各０．０５ｍＭ添加
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（
全酒造社製）を３単位加え、３７℃で３０分間反応後、
７０℃で１５分間加温し反応を停止させた。これに１μ
ｇの２Ｍ ＮａＣｊ！を加え、さらにＳａｊ！Ｉ（全
酒造社製）を３単位加え、３７℃、１時間反応させた後
、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、（６）に記
した方法で２．５キロベースの断片を精製し、２０４の
Ｈｉ ｎｄｌｉ用反応液に溶解した。
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（
全酒造社製）を３単位加え、３７℃で３０分間反応後、
７０℃で１５分間加温し反応を停止させた。これに１μ
ｇの２Ｍ ＮａＣｊ！を加え、さらにＳａｊ！Ｉ（全
酒造社製）を３単位加え、３７℃、１時間反応させた後
、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、（６）に記
した方法で２．５キロベースの断片を精製し、２０４の
Ｈｉ ｎｄｌｉ用反応液に溶解した。
一方、ｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡ ＩＪｌｇを含むＥ
ｃｏＲＩ用反応液２０ＪＬＩＩにＥＣ０ＲＩを３単位添
加し、３７℃で６０分間反応後、７０℃で１５分間加温
して反応を停止させた。これにデオキシＡＴＰとデオキ
シＴＴＰを各０．０５ｍＭｍ加し、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩラージフラグメントを３単位加え、３７℃で３
０分間反応させ、７０℃で１５分間加温して反応を停止
させた。これに１威の２ＭＮａＣｊ７を加え、さらに５
ａｊ７ Ｉ３３単を加え、３７℃で１時間反応させた後
、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、（６）に記
した方法で１２．５キロベースの断片を精製し、２０庫
の）（ｉｎｄＩＩＩ用反応液に溶解した。
ｃｏＲＩ用反応液２０ＪＬＩＩにＥＣ０ＲＩを３単位添
加し、３７℃で６０分間反応後、７０℃で１５分間加温
して反応を停止させた。これにデオキシＡＴＰとデオキ
シＴＴＰを各０．０５ｍＭｍ加し、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩラージフラグメントを３単位加え、３７℃で３
０分間反応させ、７０℃で１５分間加温して反応を停止
させた。これに１威の２ＭＮａＣｊ７を加え、さらに５
ａｊ７ Ｉ３３単を加え、３７℃で１時間反応させた後
、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、（６）に記
した方法で１２．５キロベースの断片を精製し、２０庫
の）（ｉｎｄＩＩＩ用反応液に溶解した。
両ＤＮＡ切断片の溶液を混合し、５ｍＭ ＡＴＰを１４
とＴ４１Ｊガーゼを１単位添加し１２℃で１６時間反応
させた。前記と同様にに５４株のプロトプラストを調製
し、このリガーゼ反応物を用いて形質転換を行った。カ
ナマイシン耐性・スレオニン非要求性を示した形質転換
株の一株から、プラスミドＤＮＡを前記の方法で調製し
た。
とＴ４１Ｊガーゼを１単位添加し１２℃で１６時間反応
させた。前記と同様にに５４株のプロトプラストを調製
し、このリガーゼ反応物を用いて形質転換を行った。カ
ナマイシン耐性・スレオニン非要求性を示した形質転換
株の一株から、プラスミドＤＮＡを前記の方法で調製し
た。
ｐｃｈｏｍ２１と命名したこのプラスミドＤｉ’ＪＡは
Ｓａβ１３．６キロベ一ス断片のうちのＨｉｎｄｍ−３
ａｐｒ ２．５キロベ一ス断片をサブクローン化してい
ることを制限酵素による解析で１認した。
Ｓａβ１３．６キロベ一ス断片のうちのＨｉｎｄｍ−３
ａｐｒ ２．５キロベ一ス断片をサブクローン化してい
ることを制限酵素による解析で１認した。
Ｋ５４株のｐｃｈｏｍ２０あるいはｐＣｈｏｍ２１保有
株のＨＤおよび１−（Ｋ活性をジャーナル・オブ・バイ
オケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ５３゜
３１１ （１９７０）および同書 ７１．２１９ （１
９７２）に記載されている方法で測定した結果、ｐｃｈ
ｏｍ２１保有株のＨＤ活性はｐｃｈｏｍ２０の１５分の
１以下であったが、ＨＫ活性は６分の５以上保有されて
いた。このことから、ＨＤの完全発現にはＨＤの開始コ
ドン上流７５ベースに存在するＨｉｎｄ■切断部位より
も上流の領域が必要であることが判明した。
株のＨＤおよび１−（Ｋ活性をジャーナル・オブ・バイ
オケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ５３゜
３１１ （１９７０）および同書 ７１．２１９ （１
９７２）に記載されている方法で測定した結果、ｐｃｈ
ｏｍ２１保有株のＨＤ活性はｐｃｈｏｍ２０の１５分の
１以下であったが、ＨＫ活性は６分の５以上保有されて
いた。このことから、ＨＤの完全発現にはＨＤの開始コ
ドン上流７５ベースに存在するＨｉｎｄ■切断部位より
も上流の領域が必要であることが判明した。
第４表に示すように、ＨＤ遺伝子のオーブン・リーディ
ング・フレームの開始コドンの上流とＨＫ遺伝子のオー
ブン・リーディング・フレームの開始コドンの上流（Ｈ
Ｄ遺伝子のオーブン・リーディング・フレームのＣ末端
領域）の１２０ベ一ス以内に類似配列が存在し、これら
の配列が両遺伝子の発現に必要である。さらにＨＫ遺伝
子のオーブン・リーディング・フレームの終止コドンの
下流の６０塩基以内には第５表の下線部で示したステム
・ループ構造をとる配列があり、コリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属に属する細菌の転写終止シ
グナルと考えられる。
ング・フレームの開始コドンの上流とＨＫ遺伝子のオー
ブン・リーディング・フレームの開始コドンの上流（Ｈ
Ｄ遺伝子のオーブン・リーディング・フレームのＣ末端
領域）の１２０ベ一ス以内に類似配列が存在し、これら
の配列が両遺伝子の発現に必要である。さらにＨＫ遺伝
子のオーブン・リーディング・フレームの終止コドンの
下流の６０塩基以内には第５表の下線部で示したステム
・ループ構造をとる配列があり、コリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属に属する細菌の転写終止シ
グナルと考えられる。
第４表には上段にＨＤ、下段にＨＫの配列を示しである
。下線部が共通配列である。ＤＮＡ配列の下に開始コド
ンから５残基目までのアミノ酸配列を示した。ＨＫ開始
コドン上流のＳｔｐはＨＤの停止コドンを示している。
。下線部が共通配列である。ＤＮＡ配列の下に開始コド
ンから５残基目までのアミノ酸配列を示した。ＨＫ開始
コドン上流のＳｔｐはＨＤの停止コドンを示している。
第５表には、ＨＫのＣ末端ＤＮＡ配列と４残基のアミノ
酸配列を示しである。
酸配列を示しである。
第 ４ 表
１１ｉｎｄＤ１
ＩＩＩ ： ＣＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧ八ＵΔＨ
□Ａ１ｆｉＡＣＣへ八〇Ｃ八Ｔ［でｆｆ１ｃｃｃＡΔｆ
ｉｃＴＴ１人人ＣＩ：ＬＣ丘ＧＣＡ＾ＧＧＴＣＣＣＧＧ
ＣＩＩＫ ： ＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＧＣＴ
Ｇ（ＩＡＡコ］〕］コ１６．Ｔ口ＩＴＴＣＣＣＧＣＡＣ
［：ＧＴＴＧＡＡ（、ＬＧｆＴＧビＣ温Ｇ匡Ｔ庁ＴＴＧ Ｉｌ二Δ［ＣＧ１１ＡＡＴＴ６エＪ：ＣＴＴＴＴＡｉＡ
ＴＴＣＧＧＡＡ［：ＡＧＴＣＧＧＣＡｆｌｌ■ｒＮＧ第
５ 表 へＴＴＡＧＴＧへＧＣＡＡ 発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属に属する微生物のスレオニン生合成に関与
するＨＤおよびＨＫの遺伝情報を担うＤＮＡとベクター
プラスミドとの組換え体ＤＮＡを保有させることにより
、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌
種におけるし−スレオニンあるいはそれを前駆体として
生合成されるし一インロインンの生産性を付与あるいは
向上させることができる。
□Ａ１ｆｉＡＣＣへ八〇Ｃ八Ｔ［でｆｆ１ｃｃｃＡΔｆ
ｉｃＴＴ１人人ＣＩ：ＬＣ丘ＧＣＡ＾ＧＧＴＣＣＣＧＧ
ＣＩＩＫ ： ＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＧＣＴ
Ｇ（ＩＡＡコ］〕］コ１６．Ｔ口ＩＴＴＣＣＣＧＣＡＣ
［：ＧＴＴＧＡＡ（、ＬＧｆＴＧビＣ温Ｇ匡Ｔ庁ＴＴＧ Ｉｌ二Δ［ＣＧ１１ＡＡＴＴ６エＪ：ＣＴＴＴＴＡｉＡ
ＴＴＣＧＧＡＡ［：ＡＧＴＣＧＧＣＡｆｌｌ■ｒＮＧ第
５ 表 へＴＴＡＧＴＧへＧＣＡＡ 発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属に属する微生物のスレオニン生合成に関与
するＨＤおよびＨＫの遺伝情報を担うＤＮＡとベクター
プラスミドとの組換え体ＤＮＡを保有させることにより
、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌
種におけるし−スレオニンあるいはそれを前駆体として
生合成されるし一インロインンの生産性を付与あるいは
向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はｐｃｈｏｍｌの制限酵素Ｓａｊ！ Ｉ。
Ｐｓ ｔ Ｉ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの切断地図
とその作製工程を示す。プラスミドの分子壷はキロベー
ス（Ｋｂ）で表示されている。ｐｃｈｏｍｌの太い実線
部分の染色体ＤＮＡ断片上にＨＤおよびＨＫ両遺伝子が
含まれている。 第２図は、ｐｃｈｏｍｌ上にクローニングされた３、６
キロベースのＳａｊ！Ｔ切断片の代表的な制限酵素に対
する切断地図を示す。 第１図 ＋１４．５１０） （旧、ＶＯ）
とその作製工程を示す。プラスミドの分子壷はキロベー
ス（Ｋｂ）で表示されている。ｐｃｈｏｍｌの太い実線
部分の染色体ＤＮＡ断片上にＨＤおよびＨＫ両遺伝子が
含まれている。 第２図は、ｐｃｈｏｍｌ上にクローニングされた３、６
キロベースのＳａｊ！Ｔ切断片の代表的な制限酵素に対
する切断地図を示す。 第１図 ＋１４．５１０） （旧、ＶＯ）
Claims (8)
- （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼおよび
ホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有す
るコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該培養物か
らＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン
の製造法。 - （２）ベクターが、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属に属する微生物内で複製可能なｐＣＧ１
、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＣＥ５１、ｐＣ
Ｅ５２、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１および
それらから誘導されるプラスミドから選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼお
よびホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する宿主微生物にスレオニンまたはイ
ソロイシンのアナログに対する耐性を付与することがで
きるＤＮＡ断片であることを特徴とする組換え体ＤＮＡ
。 - （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼお
よびホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物。 - （５）第３表で示されるホモセリンデヒドロゲナーゼの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。 - （６）第３表で示されるホモセリンキナーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ。 - （７）リジンを生産する能力を有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼおよびホモセリ
ンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
を含む組換え体ＤＮＡを導入し、得られる形質転換株を
培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシンを採取することを特徴とする
Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製造法。 - （８）第３表のＤＮＡ配列において、ホモセリンデヒド
ロゲナーゼあるいはホモセリンキナーゼをコードするオ
ープン・リーディング・フレームの開始コドンの上流に
ある１２０塩基配列およびホモセリンキナーゼをコード
するオープン・リーディング・フレームの開始コドンの
下流にある６０塩基配列またはそれらの一部を含む、コ
リネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属に属す
る微生物で外来遺伝子を発現させるのに必要なＤＮＡ配
列。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076298A JPS62232392A (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
| DE1986107595 DE204326T1 (de) | 1985-06-05 | 1986-06-04 | Verfahren zur herstellung von l-threonin und l-isoleucin. |
| DE8686107595T DE3684511D1 (de) | 1985-06-05 | 1986-06-04 | Verfahren zur herstellung von l-threonin und l-isoleucin. |
| EP19860107595 EP0204326B1 (en) | 1985-06-05 | 1986-06-04 | Process for producing l-threonine and l-isoleucine |
| CA000510914A CA1306963C (en) | 1985-06-05 | 1986-06-05 | Process for producing l-threonine and l-isoleucine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076298A JPS62232392A (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62232392A true JPS62232392A (ja) | 1987-10-12 |
Family
ID=13601456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61076298A Pending JPS62232392A (ja) | 1985-06-05 | 1986-04-02 | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62232392A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6649379B1 (en) | 1987-06-12 | 2003-11-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and deregulated enzyme for threonine production |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
Citations (4)
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| JPS6012995A (ja) * | 1983-06-15 | 1985-01-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 |
| JPS6062982A (ja) * | 1983-09-14 | 1985-04-11 | Ajinomoto Co Inc | 組換えｄνａ，該組換えｄνａを有する細菌及び該細菌を用いるｌ−スレオニン又はｌ−イソロイシンの製造法 |
| JPS6291193A (ja) * | 1985-06-05 | 1987-04-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
-
1986
- 1986-04-02 JP JP61076298A patent/JPS62232392A/ja active Pending
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| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
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