JPS6222800A

JPS6222800A - 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド

Info

Publication number: JPS6222800A
Application number: JP60161429A
Authority: JP
Inventors: Akiko Saito; 斎藤　暁子; Susumu Sekine; 進関根; Moriyuki Sato; 盛幸佐藤; Seiga Itou; 伊藤　菁莪
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1985-07-22
Filing date: 1985-07-22
Publication date: 1987-01-30
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: JPH062065B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを含む微生物および該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。

従来の技術哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、　　　□ニー・ピエイ・
レビイス（Ｕ、　Ｊ、　Ｌｅｗｉｓ）らによってジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイｘｆイ（Ｊ
、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、　　８０　、４４２９
（１９５８）に、エイ・ニス・バートリー（Ａ、　Ｓ、
Ｈａｒｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）。

１００．７５４（１９６６）に、シー・エイチ・リー（
Ｃ，ＨｌＬｉ）らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストシイ・アンド・バイオフィジクス・　（サブルメ
ント）［：Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ１０ｐｔｉｙ
Ｓ、　（Ｓｕｐｐｌ’、）］　＋’　１−＋　３２７（
１９６２）に報告されている。

魚類の成長ホルモンについては、単離された報告は下記
の例がある。

ティラピアよりの単離例：ニス・ダブリ、・ファ７−　
（Ｓ、Ｌ　Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジエネラ；し・アンド・
コンパラティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ。

Ｃｏｍｐ、Ｂｎｄｏｃｒｉｎ、）、３０．９１（１９７
６）、　　　　　　　゛チョウザメよりの単離例：ニス
・ダブリュ！ファ　−？　−（Ｓ、　Ｗ、　　Ｆａｒｍ
ｅ−ｒ）ら、エントクＩＪ’／Ｃｌシイ（Ｂｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ）、　　１０８．　３７７（１９８１）
。

コイよりの単離例：エイ・エフ・タック（八、Ｆ。

［ｏｏｋ　）ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ
・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、１Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎ、）。

５０、３３５（１９８３）。

シロサケよりの単離例：特願昭５９−６８６７０一方哺
乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成長ホル
モン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ，Ｓｅ
ｅｂｕｒｇ）ら：ネイチャー１−　（Ｎａｔｕｒ’ｅ）
２７０４８６（１９７７））　、ウシおよびブタの成長
ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ，
、’　Ｓｅｅ−ｂｕｒｇ）ら：ディー・エフ・エイ（Ｄ
、Ｎ　Ａ）、　、’２　、３７（１９８３）〕、ヒト成
長ホルモン遺伝子〔ジエイ・エイ、７−シ＋ル（Ｊ、　
ＡｌＭａｒｔｉａｌ）ら；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）、　　２０５．　６０２（１９７９）　　〕などが゛
すでに知られており、魚類の成長ホルモン遺伝子につい
てもシロサケ成長ホルモンの遺伝子が本発明者らにより
既に単離されている〔特願昭５９−１３４５３６１゜発
明が解決しようとする問題点魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量力乏限られている。従って魚類
の成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望
まれている。

問題点を解決するための手段本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちウナギ脳下垂体からメツセンジャーＲ、
Ｎ　Ａ　（ｍＲＮ八）を抽出し、これと相補的なり　Ｎ
　Ａ　（ＣＤＮＡ）を合成し、次いでウナギの成長ホル
モンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロ
ーブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮ
Ａを選択することにより、ウナギ成長ホルモン遺伝子を
クローン化し、そのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。

本発明者らはさらに研究を進め、ウナギの成長ホルモン
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物を培養することにより、培養物中にウナギ成長ホ
ルモンポリペプチドが著量、蓄積することを見い出し、
本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。

即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮΔを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃ　ＤＮＡ）を調製
し、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製
する。さらに、該組換え体プラスミドを宿主微生物に挿
入する。該ＤＮＡおよび組換え体プラスミドは、とくに
エッシエリヒア・コリのような細菌中でウナギ成長ホル
モン遺伝子の増幅に使用することができる。該組換え体
プラスミドを有する微生物、はウナギ成長ホルモンを安
価に大量に製造するために有用である。

従って、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤ’ＮΔ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡならびに該組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する
。

本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。

ウナギ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴｄ
Ｔセルロース（ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
）カラムを通すことによりポリアデニル酸を有するＲＮ
Ａ〔ポリ（Ａ）ＲＮＡ）を分離する。このポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡを鋳型とし、逆転写酵素により二重鎖ＤＮＡを合成
する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換え技法を用い、大
腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベクターＤＮＡに談合
成りＮＡを挿入して得られる。

次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。

捕獲されたウナギより脳下垂体を摘出し、即座に液体窒
素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にチオシアン酸グ
アニジンを加え破砕し、可溶化する。次いでＬｉＣ１！
を加えて、遠心後、沈殿物として全細胞質ＲＮＡを得る
。また、チオシアン酸グアニジン可溶化物をＣｓＣβ溶
液層に重層し、超遠心後、沈殿物とＱてＲＮＡを得るこ
ともできる。

抽出したＲＮＡをＮａ（１！またはＫＣＲの高塩濃度（
たとえば０．５　Ｍ　）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ＞を有するｍＲ
ＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）！ＪスーＨ
（ｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポＩ
Ｊ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。

以下、オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
　＆　Ｂｅｒｇ）；モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジ４　（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、　）　
２．．１６Ｈ１９８２）ｌ）に従い、ｃ　ＤＮＡの合成
および、そのベクターへの組み込みを行う。

まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしでは
たとえばｐＣＤＶｉを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）１Ｍ　ｇ
　ＣＲａ（たとえば６ｍＭ）、Ｎａ（１’（たとえば１
．　Ｏｍ　Ｍ）を含む溶液中でＫｐｎ　Ｉで処理し、ｐ
ＣＤＶｉのＫＴ）ＴＩ　Ｉ部位を切断する。

このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ６，
８，３０ｍＭ）、　　カコジル酸ナトリウム（たとえば
１４０　ｍＭ）　、　ＣｏＣｊ！２（たとえば１ｍＭ）
、ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）およびｄ
ＴＴＰ（たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼとともに一定温度
（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イ
ンキュベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個
前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをト
リス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）
　、ＭｇＣ１２（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣβ（たとえ
ば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断後、低融
点アガロースゲル電気泳動法〔ラルス・ウイスランダー
（Ｌａｒｓ　Ｗ、１ｅｓｌａｎｄｅｒ）、アナリティカ
ル・バイオケミストリイ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉ’５ｔｒｙ）９８．　３０５（１９７９）
　、以下ＬＯＴ法という〕にて分画し、約３．１キロベ
ースの断片を回収する。次いで該Ｉ）ＮＡをＮａ（ｌま
たはＫＣ，ｉｌ’の高塩濃度（たとえば０，５Ｍ）溶液
に溶解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに通塔してポ
リ（Ｔ）を有するベクタープライマー分子のみをカラム
に吸着させる。水、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液のよ
うな低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポＩＪ（Ｔ）の付加
したベクタープライマー分子のみを単離する。

次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩ　ＤＮ
Ａを適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｊ？緩衝液（た
とえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＣ（たとえば６
ｍＭ）’、ＮａＣ＃　（たとえば５０ｍＭ）を含む溶液
中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌの　　゛ＰｓｔＩ部位を
切断する。このＤＮＡを、ｄ　ＴＴＰＯ代わりにｄＧＴ
Ｐを加える以外はベクタープライマー合成の場合と同様
に処理し、１５個前後のオリゴ（ｄＧ）鎖を付加す５る
。該ｐＮΔを適当な溶液たとえばトリス−Ｈ，Ｃβ緩衝
液（たとえばｐＨ７、、，５，１，０ｍＭ−）、ＭｇＣ
β２（たとえば６ｍＭ）。

ＮａＣβ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中）１　ｉ　
ｎｄｌ［にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約
０．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥベニ
パーにて回収する。・このようにしてリンカ−ＤＮＡを
得る。

以上のようにして得たボ’Ｊ　（Ａ）　Ｒ，Ｎ　Ａ　、
ベクタープライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮハ
合成を行う。ポリ（Ａ）ＲＮＡ、ベクタープライマーＤ
ＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５
０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２　：（たとえば８　ｍ　Ｍ）。

ＫＣβ（たとえば３０ｍＭ＞、ジチオスレイトール（た
とえば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、。

ｄＣＴＰ；　ｄＧＴＰ（たとえば各々２ｍＭ）を含む溶
液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７℃）、一定
時間（たとえば４０分間）反応させる。

こうして得たＲＮＡ＝ＤＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴ
ＴＰがｄ　ＣＴ、Ｐに変わる以外はベクタープライマー
に（ｄＴ）鎮を付加した条件と同様の操作でオリゴ（ｄ
Ｃ）鎖を１５個前後付加する。このＤＮＡをトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，，１０ｍＭ）、Ｍｇ
Ｃｊｌ！２（たとえば６　ｄ）、’、　　Ｎ　ａ　Ｃβ
（たとえば６０ｍＭ、）を含む溶液中ＨｉｎｄＩＩＩで
切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−ＤＮＡ
を混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐｈ７．．
５’、−２０ｍＭ）、ＭｇＣＬ　　（たとえば４ｍＭ）
、　　（ＮＨ＜）２ＳＯ４＜たとえばｌ　Ｏｍ　Ｍ、−
）　。

Ｋ（１（たとえば０．、ＩＭ、）、β−ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）　（たとえば０
．１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡ　！Ｊガーゼと
ともに一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（たと
えば１２℃）でインキスペードする。こうしてｃＤＮＡ
とリンカ−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液に
（ＩＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう加え、大腸
菌ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸
菌リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変
換することにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換え
プラスミドを得る。

こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコツ）　（Ｓｃ
ｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細飽工学　２．６１６（
１９８３）　３により形質転換する。

上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Ａｐ’）菌株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補
性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを
保有する菌株を選択するのに一般的に用いられる。すな
わち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロースフ
ィルター上に固定し、既知のウナギ成長ホルモンのアミ
ノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡ
プローブと会合させ、強く会合するものを選択する〔グ
ルンステインーホグネス（Ｇｒｕｎｓ−ｔｅｉｎ　−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ７ス（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、　ＩＩＳ＾、、　
？２．３９６］（１９７５）　］。プローブＤＮＡは通
常のトリエステル法〔ジャーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイエテイ＜Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ
ｃ、　）、　９７．７３２７（１９７５）　〕で会合さ
れる。合成りＮＡプローブによる選択はサザーン（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ　）らの方法〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏｌ。

Ｒｉａｌ、）、　９８．５０３　（１９７５）］によっ
てさらに確実に　　　　゛でき、この方法でウナギ成長
ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え
体プラスミドＤＮＡを同定できる。

このようにして得られる組換え体プラスミドの一例がｐ
ＥＧＨ１５である。このプラスミドをウナギ成長ホルモ
ンをコードするＤＮＡの供給源として用いることができ
る。

ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドから該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤＮＡに組
み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得
られる形質転換体を培養することによってウナギ成長ホ
ルモンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、これを
採取することによってウナギ成長ホルモンポリペプチド
を製造することができる。

ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドとしては、上記ｐＥＧＨ１５が好適な例としてあげら
れる。

ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（Ｉ
ａｃ）系、ＰＬ系などのプロモーターを持ち、その下流
にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダルガー
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（
ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に
調節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適な
ベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＬＭｌをあげ
ることができる。ｐＧＬＭｌは第３図に示したプラスミ
ドで、それを含む大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａｃ
ｏｌｉ　ＥＧＬＭＩ　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８２３）と
して昭和６０年７月２日付で工業技術院微生物工業技術
研究所（微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵
素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｑ
ガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用い
て行うことができる。

具体例として示したｐＥＧＨ１５とｐ　Ｇ　Ｉ−Ｍ　１
の場合は次のごとく造成を行う。すなわちｐＥＧＨ１５
よりウナギ成長ホルモン成熟ペプチドをコードするｃＤ
ＮＡ部分およびベクタ一部分を含むＢａｎ■−ＢａｍＨ
Ｔ消化断片を得、ｐＧＬＭｌからはＰＬプロモーターと
ｃ１８５７遺伝子を含むＢａｍＨｌ−Ｂａｎ１Ｔ消化断
片を得る。一方、以下のような合成りＮＡリンカ−を作
製する。

上記両ＤＮＡ断片と合成りＮＡ！ＪンカーとをＴ　４　
ＤＮＡ　！Ｊガーゼで結合し、第３図に示した祖換え体
プラスミドｐＵＰＡ　ｌを得る。本プラスミドはＰＬプ
ロモーター下流に、成熟ウナギ成長ホルモンをコードす
る領域が連結した形を有する。

上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
μｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリｘ−Ｈ（１（ｐＨ６，０〜９．５好ましく
はｐ　Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭのＮａＣＲ
，２〜３０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ　ｇ
　Ｃｊ！　２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１０
０単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位
）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素に
より異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応
の停［トは、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱す
ることによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボ
ネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用
いることができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、ＬＧ
Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣＡ（ｐＨ６，１〜９．
５、好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０）、２〜２０ｍＭ
（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ２．０．１〜１
０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．０　ｍ　Ｍ　）のΔＴ
Ｐ、１〜５０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ＞のジチ
オスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３〜
２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０時
間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎ　らの形質転換法〔ニス・エフ・
コーエン（Ｓ、Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ’、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
　。

ＵＳＡ、６９．２１１０（１９７２））ｌ　ニヨッ−ｃ
、大１１ｆ％　菌１ｍ　’４　人する。

組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・プロミド
密度勾配超遠心法〔ディー・ピーフレウェル（口、Ｂ、
Ｃｌｅｗｅ　１１）ら：プロシ−ディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ　ンス（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ｔＪ　
Ｓ　Ａ　。

６２、１１５９（１９６９）］あるいはバーンボイム（
Ｂｉｒｎ−ｂｏｉｍ）らの方法〔エイチ・シー・バーン
ボイムＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　）ら：ヌクレイック
・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）ユ、　１５１３＜１９７９）３などを用いて行
う。

プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。

さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム・ギルバード法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ７ス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）、　　７４．　
５６０（１９７７＞　］またはＭ１３ファージを用いた
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）法〔サンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ　）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミイ・オブ・サイｘ　ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　。

ＵＳＡ、コ４．５４６３（１９７７）；アマ−ジャム（
Ａ＋ｒ＋ｅｒｓｈａｍ　）社Ｍ１３クローニング・アン
ド・シークエンシング＋ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ
　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄ−ｂｏｏｋ
）　）によって決定する。

本発明のウナギ成長ホルモンポリペプチドは以下のとお
りに製造できる。

すなわち、プラスミド（例えばｐＵＬＡｌ　）を用いて
大腸菌に−１２ｃ６００を形質転換させ、アンピシリン
耐性のコロニーの中からｐ［ＪＬＡ　１を有する大腸菌
を選びだす。ｐＵＬＡｌを有する大腸菌を培地に培養す
ることにより培養物中にウナギ成長ホルモンポリペプチ
ドを生成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにウナギ
成長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合
成培地、天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース。

ラクトース、クリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ，ＣＩ。

（ＮＨ，）２ＳＯ４，カザミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バタトトリプトン、コーン・ステイ
ープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ２Ｈ
ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣＲ。

Ｍｇ５Ｏ，、ビタミンＢ＋　　、ＭｇＣＬなどが使用で
きる。

培養はｐ　Ｈ５，５〜８．５．温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。

培養５〜９０時間で培養菌体中にウナギ成長ホルモンポ
リペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し、
菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して菌体
を破砕し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチ
ドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。

また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌ　ｉ）のサンプルバッファー〔レムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌ　ｉ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、　　
’２２７　、６８０（１９７０）　）に加熱、溶解後、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レムリ’　（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ）の方法：同上文献〕□にかけ、ウェスタン・
プロッティング（トーピン（Ｔｏｗｂｉｎ）　ら：プロ
シイーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ’、　Ａｒ、’
ａｄ、　Ｓｃｉ、　）　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７６、４
３５’０（１９７９）　）をした後、ワサビペルオキシ
ダーゼで標識した二次抗体〔ダコー（ＤＡＫＯ）社製〕
を用いた酵素抗体染色法〔田部−史：細胞工学、２゜１
０６１（１９８３）　）により行った。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　ウナギ脳下垂体よりのポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ
の調製ウナギ脳下垂体よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチ
ウム法〔カサラ　（Ｃａｔｈａｌａ）ら、ディーエフエ
イ（Ｄ　Ｎ　Ａ　）　、　　２　、３２！Ｊ（１９８３
）　］に従いポリ（Δ）を有するＲＮＡを下記のごとく
調製した。

ウナギの凍結脳下垂体０．５ｇ（約１０００個体分）を
５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

５０ｍＭ）　ＵスーＨ（１（’ｐＨ７）および８％（Ｖ
／Ｖ）β−メルカプトエタノールからなる溶液１０ｍ１
中でテフロンホモゲナイザ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可
溶化した。この可溶化物を遠心管に移し、４ＭＬｉ（Ｊ
！溶液７０ｍ１を加えて攪拌した後、４℃２０時間静置
した。旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲ１０ローターにて９．００
Ｏｒ　ｐ　ｍ、’　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿とし
て回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２ｉ塩化リ
チウムからなる溶液１０　Ｑｍｌに懸−し、旧ｔａｃｈ
ｉ　ＲＰＲＩ　Ｑｏ−ターにて９．００Ｏｒｐｍ、６０
分間遠心後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡ
の沈殿を０．１％ラウリル硫酸−）−）リウム、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ）リス・Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ７，
５）からなる溶液１０ｍ１に溶解し、フェノール−クロ
ロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得
られたＲＮＡ約１ｎ＋ｇを１０ｍＭ、）リス、Ｉ（ＣＡ
　（ｐｔｌ　８．０）および１ｍＭ　　、ＥＤＴＡから
なる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間インキユヘ
ートし、０，１ｍｌの５Ｍ　　ＮａＣ＃を加えた。混合
物をオリゴ（ｄＴ、）セルロース・カラム〔ピー・エル
・バイオケミカル（Ｐ−ＬＢｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ）
社製〕クロマトグラフィー（カラム体積０．．５ｍ１）
にかけた。吸着したポ’Ｊ（Ａ、）を有する１ｎＲＮＡ
を１０ｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐＨ’７．５）および１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポＩＪ（Ａ、）
を有するｍＲＮｊＡ約７μｇを得た。

実施例２．　　ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの
挿入ニオカヤ？−バーグ（Ｏｋａ、ｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　）の
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　）、　２．１６
Ｈ１９８２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の
概略を第１図に示す。

ｐｃＤ、Ｖｌ［オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ
−ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ　）、　：　モレキュ２−・アン
ド・セルラー・バイオロジイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、）、　　３．２８０（１９８３）〕４００μ、ｇ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　
　ＭｇＣ１１２およびｌｏｍＭＮａＣｌからなる溶液３
００μβに加え、さらに５０Ｏ単位のＫｐｎｌ（全酒造
社製、以下特記しない限り制限酵素はすべて宝酒造社製
）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中の
Ｋｐｎ１部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿によりＩ）ＮΔを回収した。

Ｋ　ｐ　ｎ、　Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０
ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０．ｍＭｈリス−ＨＣ，
β（ｐ、Ｈ６，８＞、　１　ｍＭ　　ＣａＣｌ！２およ
びＱ、１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記す
る）からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）に
ｄＴＴＰを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μ
βに加え、さらに８１単位のターミ九ルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）
（Ｐ−Ｌｌｏｊｏｃｈｅｍｉｃ、ａｌｓ社製）、を加え
て、３７℃、１１分間反応させた。ここで、ｐＣＩ）Ｖ
ｌのＫｐｎ　Ｉ切断部位の３′末端にポリ（ｄＴ）鎖が
約６７個付加された。。該溶液からフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ（ｄＴ）鎖の
付加したｐＣＤ■ＩＤＮΔ約、１００μｇを回収した。

該ＤＮＡをｌＱｍＭ）リス−ＨＣＩＩ　（ｐＨ７，５Ｌ
、６．ｍＭ　　、ＭｇＣ１１２，１００ｍＭ　　ＮａＣ
Ｊ！からなる緩衝液１５０μｌに加え、さらに３．６０
単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。該
反応物をＬＧＴ法で処理後、約３．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮ
Ａ断片を回収し、約６０μｇのポＩＪ　（ｄＴ）　１Ｍ
付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡをｌＱｍＭ）リス−Ｈ
Ｃｊｌ！、（ｐＨ８，０）および１ｍ、Ｍ　　ＥＤＴＡ
からなる溶液５００μｐに溶解し、６５℃５分間インキ
ュベート後、氷冷して５０μｇの５Ｍ　　Ｎａ・Ｃβを
加えた。混合物をオリゴ（ｄＡ）セルロースカラム（コ
ラボラティブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけ
た。ボ！Ｊ　（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着
し、これをｌＱｍＭ）リス−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，０
）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ！Ｉ
　（ｄＴ）　Ｉの付加したｐ（：：ＤＶＩ　（以下ベク
タープライマーと略記する）２７μｇを得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐＬｌ（オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ＆
　Ｂｅｒｇ）　：モレーｔ−−ラー・アンド・セルラー
・バイオ・ロジイ　（Ｍｏｌ、　　Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ
、）、　　３．　２８０（１９８３）　　］約１４／Ｊ
ｇをｌＱｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐＨ７，５）。

６ｍＭ　　ＭｇＣＬおよび５０ｍＭ　　Ｎａ（、ｊ！か
らなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰＳ
−ｔＩを加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中
のＰ　Ｓ　ｔ　Ｉ部位で切断させた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Ｐ
ｓｔＩで切断したｐＬＩＤＮΔ約１３μｇを回収した。

該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度０．２５ｍ
ＭのｄＧＴＰを含む溶液５０μβに加え、さらにＴ　ｄ
　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）５４
単位を加えて３７℃１３分間インキユベートシ、ｐＬｌ
のＰｓｔＩ切断部位３′末端に（’ｄＧ）鎖を約１４個
付加した。フェノール−クロロホルム抽出機エタノール
沈殿にてＤＮＡを回収した。

該ＤＮＡをｌＱｍＭ）リス−ＨＣｌ’　（ｐＨ７，５＞
、６　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２および６０ｍＭ　　
ＮａＣｊ２からなる緩衝液１００μβに加え、さらに８
０単位のＨｉｎｄｌｌｌを加えて３７℃３時間インキュ
ベートし、ｐＬＩＤＮＡの）ｌｉｎｄｌ’ｉ部位で切断
した。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約０，５ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法「ドレ
ツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）ら、アナリテイカル・バイオ
ケミストリイ（八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、＞、　　１
１２．　２９５（１９８１）　　）にて回収し、オリゴ
（ｄＧ）６Ｎ付きのリンカ−ＤＮＡ（以下単にリンカ−
ＤＮＡと略記する）を得た。

上記で調製したポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクター
プライマー約１．４μｇを５ＱｍＭｌ・リス−ＨＣＡＭ
ｐＨ８，３）、８’ｍＭ　　ＭｇＣｊ’ｚ　、　３０ｍ
Ｍ　　Ｋ（１！、０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、’２ｍ’Ｍｄ
ＮＴＰ　（ｄΔＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴ
Ｐ）および１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（
Ｐ　−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる
溶液２２．３μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生
化学工業社製）を加え、３７℃４０分間インキュベート
し、ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、ＲＮ’Ａ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライ
マーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰお
よび０．２μｇポＩＪ（Ａ）を含む’１’ｄＴ緩衝液２
０μｌに溶かし、１４単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ、　−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７℃８
分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に１２個の（
ｄＣ）鎮を付加した。

該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤ’Ｎ’Ａ−ベク
タープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをｌＱｍＭ
）リス−）１（１！　（ｐ’Ｈ７’、５）、６ｍＭＭ　
ｇ　ＣＩ　２および６０ｍＭ　　’ＮａＣｊｌ’からな
る液４００μＡに溶かし、２０単位のＨ１ｎｄ■を加え
、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＴ１１部位
で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
、エタノール沈殿して０．５　ｐｍｏ’ｌｅの（ｄＣ）
鎖付加ｃ　Ｄ’Ｎ　Ａ−ベクタープライマーＤＮ’Ａを
得た。該Ｄ　Ｎ　Ａ　０．０８’ｐｍｏｌｅおよび前記
のリンカ−ＤＮＡ０．１６　ｐｍｏｌｅを１０ｍＭトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５＞、０．ＩＭ　　ＮａＣＡおよ
び１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに溶かし、６５
℃。

４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分、３０分間イン
キニベートした。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ）１７．
５）、４ｍＭ　Ｍｇ　ｃ　Ｌ＋　　１０ｍＭ　（ＮＨ４
）’２ＳＯ４，０，１Ｍ　　ＫＣＩおよびＱ、ｌ　ｍ　
Ｍｇ−ＮＡＤの組成で、全量４００μｌとなるよう反応
液を調製した。該反応液に１０単位の大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ
　ＩＪガーゼ（Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製）を加え、１ｌｌ−夜インキユベートした。該反
応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ
となるよう成分を追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼ、７単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ’（Ｐ−
Ｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）およ−び２単位
の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）を加え、１２ｔ、２５ｔで順次１時間
ずつインキユベートした。

上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され
、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した。

実施例３．　ウナギ成長ホモルンｃ［）ＮＡを含む組換
えＤＮＡの選択：実施例２で得た組換えプラスミドを用い、大腸菌Ｃ６０
０ＳＰ８株〔カメロン（（：ａｍｅｒｏｎ）　：　プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイｘ　ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　）　ｌｌ５Ａ。

７２、３４１６（１９７５））　ヲ５ｃｏｔｔう（７）
方法Ｃ重宝Ｐｌｉａ　：細胞工学、　２．６１６　（１
９ｇ３））に従い形質転換した。

？４％　ラレタ約２．４００個のコロニーをニトロセル
ロース上に固定した。ウナギ成長ホルモンのＮ末端から
２７番目−３２番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮ
’Ａ、すなわち３′５′ ＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＡΔＡＣＴ　　　１７ｍｅｒ
（Ｔ）　　（Ｇ）　　（Ｃ）（Ｃ）　　（Ｇ）（Ｇ＞（３番目の塩基はＡ、Ｔ、Ｇのいずれか６番目の塩基は
ＡまたはＧ１９番目の塩基はＴまたはＣ１１２番目の塩基はＴまたはＣ１１５番目の塩基はＡまたはＧであり、組み合わせて４８通りの合成りＮＡの混合物となる。）を３Ｆｐで標識したプローブに３８℃で強く会合した３
菌株を選んだ〔グルンステイン・ホグネス（Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシイーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ
ンス（Ｐｒｃｏ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　５ｃｉ
）　ｌｌ５Ａ、　　７２゜３９６Ｈ１９７５）　）。得
られた３菌殊についてサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の
方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）　　９８．５０３゜（
１９７５）　）により、上記プローブおよびＣ末端付近
のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡプローブ、すなわ
ち５′３′ （Ｃ）　　（Ｇ）　　（Ｔ）　　（Ｇ）（Ｇ）（Ｃ）（３番目の塩基はＴまたはＣ１６番目の塩基はＡまたはＧ、９番目の塩基はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目の
塩基はＡまたはＧであり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物となる。）とも会合が確認された。これらのプラスミドはｐＥＣ；
Ｈ８，９，１５と命名したが、いずれもウナギ成長ホル
モンのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有する
ことから、ウナギ成長ホルモンｃＤＮＡを含んでいるも
のと考えられた。

実施例４．　プラスミドｐＥＧＨ１５の塩基配列：」１
記で得られたプラスミド３種につき、種々の制限酵素で
消化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。プラスミ
ドｐＥＧＨ１５中のｃＤＮＡ制限酵素地図を第２図に示
す。

次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと強い会合を
示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられるｐ
ＥＧＨｌ　５についてその翻訳領域の全ヌクレオチド配
列をＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）
法［Ｓａｎｇｅｒら：プロシイーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ
。

７４、　５４６３（１９７７）　：Ａｍｅｒｓｈａｍ社
Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　ｈａｎｄｂｏｏｋ　）に従って決定した。ヌクレオチ
ド配列を第−表に示す。第一表中、塩基数１−５７がシ
グナルペプチドを、５Ｌ−６２７がウナギ成長ホルモン
の成熟ペプチドをコードする。

ｐＥＧＨｌ　５に含まれるｃＤＮＡ配列から予想される
アミノ酸配列は、天然のウナギ成長ホルモンから決定さ
れているアミノ酸配列の一部と完全に一致し、該ｃＤＮ
、Ａはウナギ成長ホルモンをコードしていることが確δ
忍された。

ｐＥＧＨ１５を含む大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉＥＥＧＨ１５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８２４）
として微工研に昭和６０年７月２日付で寄託しである。

実施例５、　ウナギ成長ホルモンをコードするｍ換え体
プラスミドｐＵＰＡ　ｌの造成：ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＥＧ８１５　３μｇを１０ｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ！　
（ｐＨ７，５＞、７ｍＭ　　ＭｇＣ（１２および１００
ｍＭ　　Ｎａ（Ｊ！を含む溶液（以下Ｙ−１００緩衝液
と略す）３０μＱに溶かし、制限酵素Ｂａｎ■（東洋紡
績社製）８単位ふよび制限酵素ＢａｍＨ１（東洋紡績社
製）８単位を加え、３７℃、２時間消化反応を行った。

該反応液からＬＧＴ法により、ｐＥＧＨ１５でコードさ
れる成熟ウナギ成長ホルモン翻訳領域、３′−非翻訳領
域およびベクタ一部分を含む約８５０ｂｐのＤＮＡ断片
約０．１μｇを得た。

別にｐＧＬＭｌ　　２μｇを３０μＱのＹ−１００緩衝
液に溶かし、制限酵素ＢａｎＴＩＴ　（東洋紡績社製）
８単位および制限酵素ＢａｍＨＴ８単位を加え、３７℃
、２時間消化反応を行った。該反応液からＬ　Ｇ　Ｔ法
によりＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７遺伝子を含む
約４．ＯＫｂのＤＮＡ断片約１ｉｇを得た。

一方成熟ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発現
に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベクタ
ーＤＮＡと上記ＤＮＡを連結する目的で下記のＤＮＡＩ
Ｊンカーを合成した。

まず−重鎮ＤＮＡ２１ｍａｒと１５ｍａｒを通常のトリ
エステル法〔アール・フレア（Ｒ９Ｃｒｅａ）ら：プロ
シイーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ’
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）。

ＵＳＡ、　７５　、５７６５（１９７８）〕により合成
した。２１ｍｅｒおよび１５ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ各々
３０ｐ　ｍｏｌｅを５０ｍＭトリス−ＨＣＩＩ　　（ｐ
Ｈ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ！２゜１０ｍＭ　　
ＤＴＴおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む溶液３０ρに溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３単
位を加え、３７℃、４０分間リン酸化反応を行った。

上記で得たｐＥＧＨ１５のＢａｎｌＩ−ＢａｍＨＩ断片
（約８５０ｂＰ）　０．０３ｐｍｏｌｅ、　ｐＧＬＭｌ
のＢａｍＨｌ−Ｂａｎ１ｌＩ断片（約４、ＯＫｂ　）　
０．００６ｐ　ｍｏｌｅを５０ｍＭ）リス−ＨＣ＃　　
（Ｔ）８７．５）、１０ｍＭ　　Ｍｇ（Ｊ！ｓ、　１０
＋＋＋Ｍ　ＤＴＴおよび１ｍＭＡＴＰを含む溶液３０μ
ρに溶かし、これに上記の合成りＮＡＩＪン酸化反応液
１μＱを加えた。この混合液にＴ４ＤＮΔリガーゼ（宝
酒造社製）３単位を加え、４℃、１８時間結合反応を行
った。該反応液を用いて大腸菌に２９４株を形質転換し
、Ａｐｌのコロニーを得、このコロニーよりプラスミド
ＤＮＡを回収し、第３図に示したｐＵＰＡ　ｉを得た。

ｐＵＰＡ１の構造は、ＥｃｏＲＩ、ＢａｎＴＨ。

Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｎＩＩ、Ｈｐａ　Ｉ、ＢａｍＨＩ
。

ＢｇｌＵ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩで切断して、アガロース
ゲル電気泳動にて確認した。

実施例６．　ｐＵＰＡｌを含む大腸菌によるウナギ成長
ホルモンペプチドの生産実施例５で得た組換え体プラスミドｐＵＰＡ　１を用い
常法により大腸菌０６００株を形質転換した。得られた
Ａｐｌコロニーを１０ｍ１のＭＣＧ培地〔０，６％Ｎａ
、ＨＰＯ，、０，３％Ｋｏ２ｐｔ＋、、　　０．５％Ｎ
ａＣ１。

０．１％ＮＨ４ＣＡ、　０．５％グルコース、０．５％
カザミノ酸。

１ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、’ｈｇ／ｍｌビタミンＢ＋　　、
　ｐＨ７，２）に接種し、３０℃で７時間培養した。得
られた培養液を５０ｍ１のＭＣＧ培地に接種し、３０℃
で１８時間培養した。得られた培養液を１１のＭＣＧ培
地に接種し、３０℃で５時間培養後、４２℃で２時間培
養し、さらに３７℃で４１時間培養した。得られた培養
液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を回収した
。この菌体をレムリ（ｌａｅｍｌｉ）のサンプルバッフ
ァーに懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、ウェスタンブロッティング〔トービン（Ｔｏ
ｔＩｌｂｉｎ）ら：プロシイーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｃｉ）、　　［ＩＳＡ。

ハ、　４３５０（１９７９）］後、ペルオキシダーゼ染
色法〔円部−裏：細胞工学、　２．１０６１（１９８３
））により、分子量約２６．０００の部位にポリペプチ
ドバンドを検出した。このバンドは該プラスミドを含ま
ない大腸菌を用いた場合には存在しなかった。この結果
、ｐＵＰＡ’ｌを保有する大腸菌はウナギ成長ホルモン
ポリペプチドを大量に生産していることがわかった。

ｐＵＰＡ１を含む大腸菌は、８ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉＥｕｐＡｌ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８２５）とし
て、微工研に昭和６０年７月２日付で寄託しである。

実施例７゜実施例６に従ってウナギ成長ホルモン生産菌を培養後、
８．００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ
　　ＮａＣｊ！および３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣβを
含む緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した。洗浄菌体を上記
緩衝液５ｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕、［ブランソ
ン・ソニック・パワー・カンパニイ（Ｂｒａｎｓｏｎ　
５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ）社、ソニフ
ァイアー壷セル・ディスラブター（Ｓｏ旧ｆｉｅｒ　ｃ
ｅｌｌｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）　２００．　　アウトプッ
トコントロール（Ｏｕｔ−ｐｕｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ）　
２．１０分間処理〕した。これを１５．００Ｏｒ　ｐ　
ｍ、　３０分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残渣
からマーストンらの方法〔エフ・ニー・オー・マースト
ン（Ｆ、Ａ、０．　Ｍａｒｓｔｏｎ）　　ら：バイオテ
クノロジイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　２．８０
０（１９８４）　：１によりウナギ成長ホルモンポリペ
プチドを抽出、精製、可溶化、再生を行い、以下の方法
でウナギ成長ホルモンポリペプチドの成長促進活性を測
定した。

魚類成長ホルモン活性の測定ニジマスの稚魚（平均体重１３ｇ）を一群１５尾ずつに
分け、水温１５℃の循環式タンクで飼育した。餌は配合
原料くます４Ｃ，日本配合飼料社製）をはじめの９日間
は１日に体重の４％、その後は３％を２回に分けて与え
た。ウナギ成長ホルモンポリペプチドを少量の０．（１
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で溶解後、０．９％塩化す
）　ＩＪウム水溶液を加えて１μｇ１５μｇとなるよう
にした。これを体重１ｇあたり１μｇ腹腔内に注射した
。対照群には０．９％塩化す）　ＩＪウム水溶液のみを
投与した。

注射は５日ごとに５回行い同時に体重を測定した。

この結果、本発明の成長ホルモンがニジマスの成長を促
進することが明らかになった。

発明の効果本発明によれば、ウナギの成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらはウナギの成
長ホルモンポリペブチトノ大量生産に利用することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図（１）および（２）はオカヤマ・バーブ法にょる
ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造
成過程の概略を示す。第２図はｐＢＧＨ１５に含まれるウナギ成長ホルモンを
コードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。第３図は組換え体プラスミドｐ［ＪＰＡＩの造成過程を
示す。手続ネ１■ｉヨ書く自発）昭和６０年　２月２７日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類の成長
ホルモンポリペプチド。
（２）魚類の成長ホルモンが条鰭類無足目に属する魚類
の成長ホルモンである特許請求の範囲第１項のポリペプ
チド。
（３）条鰭類無足目に属する魚類の成長ホルモンポリペ
プチドをコードするＤＮＡ。
（４）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第３項のＤＮＡ
。
（５）条鰭類無足目に属する魚類の成長ホルモンポリペ
プチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ
。
（６）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第５項の組換え
体ＤＮＡ。
（７）プラスミドｐＥＧＨ１５と名づけた特許請求の範
囲第５項の組換え体ＤＮＡ。
（８）条鰭類無足目に属する魚類の成長ホルモンポリペ
プチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ
を含む微生物。
（９）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第８項の微生物
。
（１０）該微生物がエッシェリヒア・コリに属する特許
請求の範囲第８項の微生物。
（１１）条鰭類無足目に属する魚類の成長ホルモンポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物を栄養培地に培養し、該培養物中に魚類
の成長ホルモンポリペプチドを蓄積せしめ、該培養物か
ら該ポリペプチドを採取することを特徴とする魚類の成
長ホルモンポリペプチドの製造法。