JPS62218862A - 試料成分の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、試料中の細胞、ウィルスおよび他の成分の存
在を検出する方法並びに該方法に使用する試薬用の担体
および府記担体を含んで成る診断用組成物に関する。

［従来技術］ 免疫反応、免疫様反応（例えばレクチン−炭水化物相互
作用）または複合体形成反応に基づく化学的測定法は、
生物学的材料中のタンパク質、炭水化物、抗原および抗
体の定性および定量分析における有用な手段として長年
用いられてきた（文献ｌ、２）。近年まで、最も広範に
用いられてきたイムノアッセイ法は、放射性同位体標識
リガンド（例えば抗体）を使用し、生成した複合体から
発せられる放射能を測定する方法であった。しかし、放
射性同位体を使用すると、実験室内において危険が生じ
得、また処理の問題もある。そこで、非放射性物質を用
い、それ故ラジオイムノアッセイのような危険が無く、
感度および特異性はラジオイムノアッセイと同程度であ
るような代わる方法が開発されてきた。これらの方法は
、主に、信頼性があり、手頃な感度（ｎｇレベルまで）
の酵素、蛍光または発光の使用に基づく。これらの方法
の内、酵素イムノアッセイは、基質から有色の最終生成
物を生成し、比較的簡単に、それ故経済的に裸眼で検出
し得るか、または分光学的に測定し得るという利点を有
するので、おそらく最も広範に使用されているであろう
。

酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、抗原抗体反応
に基づいており、抗原を、支持体に固定した第１抗体と
反応させ、さらに酵素に結合した第２抗体と反応させ、
酵素を適当な基質と反応させて有色最終生成物を生成す
る。しかし、このアッセイの感度は、必ずしも十分に満
足できるものではなく、酵素イムノアッセイの種々の改
良がなされてきた。二重抗体（「サンドウィッチ」）系
にアビジンと共にビオチン化酵素を使用すると、アッセ
イの感度が高まることが近年報告されており、この増幅
系は、酵素抗体コンジュゲートを含んで成る系よりも良
好に酵素活性を保つとも記載されている（文献３〜７）
。他の方法は、抗体架橋法であり、この方法は、標準的
な方法と比較してアッセイの感度を５０倍以上も高める
と報告されている（文献８）。

循環プロセスを用いて抗原抗体反応を増幅する更に他の
増幅系が開発されている（文献８）。この系においては
、イムノアッセイに通例用いられる酵素であるアルカリ
性ホスファターゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（ＮＡＤＰ）の脱リン酸化を触媒してニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成し
、ＮＡＤは、過剰のエタノール基質の存在下にアルコー
ルデヒドロゲナーゼの補酵素として作用してＮ　Ａ　Ｄ
　Ｈを生成し、還元および酸化されたヌクレオチドは、
ジアホラーゼによって触媒的に元の状態に戻り、それに
よって第２の基質であるバラ−ヨードニトロテトラゾリ
ウムバイオレットが、増幅最のホルマザン色素を生成す
る。すなわち、この系においては、系の感度を２５０倍
高めることができ、ＩＱ−１１１モルのオーダーの低濃
度のアルカリ性ホスファターゼが検出された。しかし、
本発明者らは、タンパク質の分析にはこの増幅方法によ
って良好な感度および再現性を得ることができるが、例
えば病態試料中の病原性微生物（例えばバクテリア、ウ
ィルスもしくは菌類）またはその成分の分析には感度ゐ
（十分でないことを見出した。

［発明の構成］ 従って、検出可能な最終生成物を直接または間接に生成
し得る酵素のような物質を、該物質が検出系中で多価状
態で存在するように、試料中の検出しようとする成分用
の試薬と組み合わせる新規方法が開発された。

従って、本発明は、試料中の細胞、ウィルスらしくは循
環体成分またはそれらに対する抗体の存在を検出する方
法であって、 ａ）試料を、固体支持体に結合している試薬と接触させ
、該試薬は、細胞、ウィルスもしくは循環体またはそれ
らに対する抗体に結合し得、ｂ）工程ａ）において試料
と接触させた、固体支持体に結合している試薬を、工程
ａ）で使用したものと同じまたは異なる試薬と接触させ
、該試薬は、検出可能な生成物を生成する反応を開始し
得る物質が多価結合している水不溶性高分子担体に結合
しており、または水不溶性高分子担体に多価結合した、
検出可能な生成物を生成する反応を開始し得る物質に結
合しており、および Ｃ）工程ａ）において試料と接触さＵ−１工程ｂ）にお
いて水不溶性高分子担体または物質と結合した試薬と接
触させた前記固体支持体結合試薬を、検出可能な反応生
成物の萌駆体であるか、または検出可能な最終生成物を
生成するような反応を開始し得る化合物と反応させて検
出可能な反応生成物を得る ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
した細胞、ウィルスもしくは循環体またはそれらに対す
る抗体の存在を検出する方法に関する。

本発明において、「細胞成分」とは、特定の成分、すな
わち定義し得る物質だけでなく、該成分が一部分を構成
している細胞全体並びに前記のような多くの定義し得る
物質で構成される細胞膜、核、染色体および小器官（例
えばミトコンドリア）をもさす。同様に、「ウィルス成
分」とは、ウィルス上またはウィルス内に存在する特定
の定義し得る物質以外に、前記のような成分を含んで成
るウィルス全体、ウィルスエンベロープおよびウィルス
内部を構成する核酸粒子をさす。微生物およびウィルス
の全体に関連して、特に興味深い成分は、しばしば表面
成分である。「循環体成分」とは、細胞またはウィルス
の内部または表面を形成しない成分、すなわち体液中に
存在し得る細胞外成分、例えば血漿タンパク質、ホルモ
ンおよび抗体をさす。

以下、これらの全成分を、試料成分と称することがある
。試料成分は、必ずしも天然物でなくてもよく、天然物
の類似体、誘導体もしくは相似物として合成的または半
合成的に生成し得ることを指摘しておく。

「抗体」とは、抗原に対する暴露への応答として生成し
た物質、例えば人体または動物体内で病原体に対して生
成した抗体をさす。抗体は、ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体であってよい。

「試料」とは、生物学的起源の材料（または合成らしく
は半合成の類似体もしくは誘導体）を含有する液体、例
えば単一成分もしくは単一成分の混合物の溶液もしくは
懸濁液、または細胞もしくはウィルス（もしくは前記の
ようなその構成成分）の！ｆ６：Ｊ液をさす。試料は、
好ましくは体液、例えば血液、尿、リンパ液、糞便また
は精液を含んで成る。

工程ａ）において使用する試薬は、試料成分と結合し得
る試薬（すなわち成分カメ親和性を示す試薬）のいずれ
であってもよい。試料中の全成分を、それを含有する液
体から単に分離したい場合には、結合は非特異的（例え
ば非特異的疎水結合）であってよい。しかし、前桟未聞
のアッセイ特異性および感度を得ることができるという
本発明の検出方法独特の性質を利用するには、試薬は特
異性である（すなわち特定の細胞、ウィルスまたは循環
体性質に結合して、試料の分析に高い選択性が得られる
）ことが好ましい。この試薬は、分析する試料成分また
は試料中に存在すると思われる試料成分に対して相補的
であることが好ましい。

工程ｂ）において使用する試薬も、原則として、分析す
る試料成分と結合し得るいずれの試薬であってもよく、
工程ａ）およびｂ）において用いる試薬は、それらが同
じ成分または同じ細胞もしくはウイルス（またはその構
成成分）上の異なる成分に結合し得るならば異なってい
てよい。しかし、好ましくは、工程ａ）およびｂ）にお
いて使用する試薬は同じであり、とりわけ本発明の検出
方法の精度を高めるには、特定の成分に特異的で、試料
中の他の成分が結合しない試薬でもある。

高分子担体に多価結合する物質はラベルとして作用し、
それによって試料成分が結合したかどうかを検出するこ
とが可能となる。試薬と物質（例えば酵素）の間の結合
が一価であるので必然的に酵素によって生成される検出
可能な生成物分子の数が限られている故に十分なアッセ
イ感度を得られないという、既知のサンドウィッチＥＬ
　Ｉ　ＳＡ法における困難は、物質を多価の状態で供給
することによって克服され、大量のラベル分子を用いた
多価結合による結合増幅によって、放射性同位体を用い
ない既知のイムノアッセイ系において得られる感度より
も遥かに高い感度を得ることができる。従って、本発明
の検出方法は、例えば体液試料中の、既知のいずれのア
ッセイ法によっても検出できなかった限界濃度の病原体
の検出を可能にするものであり、以下（実施例を含む）
に詳細に説明する。

試薬およびラベル物質用の水不溶性高分子担体は、複数
の結合部位を有する適当な担体のいずれであってもよい
。

前記のように、本発明の方法は、アッセイにおいて試薬
ａ）およびｂ）に結合した試料成分の検出に用いられる
。すなわち、この方法は、試料成分の定性（すなわち試
料中に、ある試料成分が存在するか否かの分析）および
試料成分の定量に用いられる（以下に説明する）。本発
明の方法は主に、診断の分野において、従来のＥＬ　Ｉ
ＳＡ法の改良法　　　゛として特定の病原体によって起
こる病気を診断するために、および特定の成分を、試料
中に存在する池の成分から分離および／または精製する
ために用いられることが意図されている。

本発明の方法の実施に用いる要素の代表的な好ましい態
様を以下に詳細に記載する。

本発明の方法の工程ａ）およびｂ）において使用する試
薬は、検出しようとする成分に応じて、その成分と結合
し得るものを選択する。適当な試薬は、炭水化物もしく
は炭水化物誘導体、ポリペプチド、タンパク質または他
の細胞もしくはウィルス表面成分または循環体成分、そ
れらに対する抗体、金属コンジュゲートまたは一本鎖オ
リゴヌクレオチドから選択し得る。試薬が炭水化物また
は炭水化物誘導体である場合、これはしばしば細胞、ウ
ィルスまたは循環体成分のレセプター、例えば細菌膜タ
ンパク質のレセプターであり、そのようなレセプターを
有する表面（例えば上皮組織）への細菌の付着を仲介す
るものである。化学的には、炭水化物または炭水化物誘
導体は、ポリサツカライド、糖脂質、新糖脂質、糖タン
パク質または新穂タンパク質であってよい。「新」とは
、その化合物が、天然物に相当するように、炭水化物部
分と脂質／タンパク質部分とのカップリングによって合
成的に調製されたことを示す。有用な炭水化物レセプタ
ーの例は以下の通りである： ハ　　　　　　　ヘ　　　　　　　ヘ　　　　　　　　
ハ、−−Ｆ’ｌ　　　　　　　　　　　メ　　　　　　
　　　　　　−ａ）エヌ・フィロン、アイ・オフエフお
よびダブリュ・シャロン（Ｎ、　Ｆｉｒｏｎ、　１．０
ｆｅｋ　ａｎｄ　Ｌ　５ｈａｒｏｎ）、インフェクショ
ン・アンド・イムニテイ（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）、４３．１９８４．１０８８頁；イー・
エッチ・ビーチ−（Ｅ、Ｈ，Ｂｅａｃｈｅｙ）（編）バ
クト・アドヘレンス、レセプターズ・アンド・レコグニ
ション（Ｂａｃ　ｔ　。

Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ、　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、第８巻、チャプマン・アン
ド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ）、ニ
ューヨーク、１９８０゜ ｂ）エッチ・レフシーおよびシー・スパンボーダーエデ
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・レターズ（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ
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アール・モルバイ、ニス・ビー・スベンソン、ジェイ・
ウィンバーブ、エイ・ランドブラッド、ニス・スベンソ
ン、およびビー・セダーグレン（Ｇ、　Ｋａｌｌｅｎｉ
ｕｓ、　Ｒ，Ｍｏ１ｌｂｙ、　Ｓ、Ｂ、５ｖｅｎｓｓｏ
ｎ。

Ｊ、　Ｗｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｌｕｎｄｂｌａｄ、　
Ｓ、　５ｖｅｎｓｓｏｎ、　ａｎｄ　Ｂ、Ｃｅｄｅｒｇ
ｒｅｎ）、フェムス・ミクロバイオロジー・Ｃ）アイ・
パークキネン、ジエイ・ファイン、エム・アクトマン、
ブイ・バイサネン、およびティー・ケイ・コーホネン（
Ｉ，Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ、　Ｊ、　Ｆｉｎｎｅ、　Ｍ。

Ａｃｈｔｍａｎ、　Ｖ、　Ｖａｉｓａｎｅｎ、　ａｎｄ
　Ｔ、に、　Ｋｏｒｈｏｎｅｎ）、バイオケミカル・ア
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頁。

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ＢＤ　Ｌｅｔｔ、）１５９．１９８３．２３３頁。

ｅ）エム・ジエイ・アンダーマン、ジエイ・ニス・ホワ
イトヘッド、およびワイ・ニス・キム（Ｍ、Ｊ。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、Ｓ、　Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、
　ａｎｄ　Ｙ、Ｓ、　Ｋｉｍ）、インフェクション・ア
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ｒ）エム・バートリニおよびダブリュ・ピグマン（Ｍ。

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ーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒ
ｅｓ、）、１４．１９７８．５３頁。

ｇ）ジェイ・イー・ブラウン、ケイ・−エイ・カールソ
ン、エイ・リンドバーグ、エヌ・ストロンバーグ、およ
びジェイ・スリン、エム・エイ・チェスター、ディー・
ハイネガード、エイ・ランドブラッド、およびニス・ス
ベンソン（編ＸＪ、Ｅ、　Ｂｒｏｗｎ、Ｋ。

−Ａ、　Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ａ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ
、　Ｎ、　Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、　ａｎｄＪ、　Ｔｈｕ
ｒｉｎ　ｉｎ　Ｍ、Ａ、　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｄ、　ｆ
ｌｅｉｎｅｇａｒｄ、　Ａ。

Ｌｕｎｄｂｌａｄ、　ａｎｄ　Ｓ、　５ｖｅｎｓｓｏｎ
　（ｅｄｓ））、ブロク・セブンス・インド・シムプ・
グリココンジュゲーツ（Ｐｒｏｃ、　７ｔｈ　Ｉｎｔ、
　Ｓｙｍｐ、　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ラ
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ｈ）エイ・ガナーソン、ピー・−エイ・マード、エイ・
ランドブラッド、ニス・スベンソン（Ａ。

Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ、　Ｐ、−Ａ、、　Ｍａｒｄｈ、
　Ａ、　Ｌｕｎｄｂｌａｄ、　Ｓ。

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ｉ）ノー・スパンボーグーエデン、ビー・アンダーソン
、エル・ハブバーブ、エッチ・レフノー、ジー・マグン
ソン、ジー・モーリ、ジエイ壷ターメンおよびティー・
ソダーストーム（Ｃ，Ｓｖａｎｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ、　
Ｂ、　Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｈａｇｂｅｒｇ、
　Ｉｔ、　Ｌｅｆｆｌｅｒ。

Ｇ、　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｇ、　Ｍｏｏｒｉ、　Ｊ
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ヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ａｎｎ、　Ｎ
、Ｙ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、４０９．１９８３．５６０頁
。

ｊ）ティー・ファイグおよびアール・エイ・チャイルズ
（Ｔ、　Ｆｅ１ｚｉ　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、　Ｃｈｉｌｄｓ
）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシーズ
（Ｔｒｅｎｄｓ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、）、１０．１９８５．２４
頁。

ｋ）ジー・エフ・スブリンガーおよびアール・アール・
プサイ（Ｇ、Ｆ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｒ，Ｒ
，Ｄｅｓａｉ）、アン・タリノ・ラブ・サイ（Ａｎｎ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、）、１９８５．２９
４頁。

ｌ）ジェイ・ホームグレン（Ｊ、　Ｈｏ１ｇ＋ｇｒｅｎ
）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２．１９８１
．４３１頁。

より明確にするために、種々の試料成分に対する適当な
試薬を次に挙げる。

＋　　　　１　　　１　　　　　　　ＩＩΔ　　Δ　　
ム　　　　　　Δ　Δ Δ　　卆　　　　　　　　　Δ す→ ｌ　　　　　く　　　Ｉ　　　　　　　　ｌ　　　　：
Ｘ表す刊 １　　　　　く　　　　　　　　　　１　　　Ａｇ　　
　　　　−一二 セ　　　　悩 表　　　　’ｔ−ト”５上 の　　！　　膿　　　　　　　　Ｃト 工程ａ）において使用する試薬が結合する固体支持体は
、ポリマーを含んで成るべきである。このことは、支持
体自体が、試薬が結合し得る材料から成るか、または材
料を前記ポリマーで被覆し得ろことを意味する。後者の
場合、固体支持体は、前記ポリマーで被覆された安定な
固体材料のマトリックス、例えばガラス、紙、厚紙また
はプラスチックを含んで成る。試薬が結合するポリマー
は、プラスチック、ポリサッカライド、ンリコーンポリ
マー、イオン交換樹脂、ポリペプチド、ンリカらしくは
シリケート（例えばボロシリケート）またはセルロース
から選択し得る。適当なプラスチックの例には、ポリス
チレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン
、ラテックス、ナイロン、テフロン、ダクロン、ポリ酢
酸ビニル、ボリヒニルアルコールまたはその適当なコポ
リマーがある。ポリサッカライドの例には、アガロース
またはデキストラン：イオン交換樹脂の例には、スチレ
ンおよびｐ−ジビニルベンゼンのスルホン化架橋ポリマ
ーのような陽イオン交換樹脂並びにトリメチルアミン基
を有するスチレン／ｐ−ジビニルベンゼンコポリマーの
ような陰イオン交換樹脂；ポリペプチドの例には、ポリ
ブレン；シリコンポリマーの例にはシロキサン：シリケ
ートの例にはガラスがある。ポリマーを直接に使用でき
ない場合には、要すれば修飾した官能基を導入して、特
定の試薬に結合するように調整してもよい。

固体支持体の物理的形状は、本発明の方法における所定
の用途に依存する。すなわち、支持体は、プレート、フ
ィルム、マクロ粒子、ディツプスティック、フィルター
または紙の形状であってよい。

固体支持体の代表的な態様には、ガラスまたはプラスチ
ック製の要すれば被覆した薄層もしくはマイクロタイタ
ープレートおよびディツプスティック、クロマトグラフ
用カラムに適宜充填した高分子マクロ粒子、高分子担体
の通過に十分な大きさの孔を有するガラスまたはプラス
チック製フィルター並びに濾紙がある。ある種の紙およ
びある種の適用に際しては、非特異的結合を行うために
試薬を支持体に供給する必要が無い場合があることに注
意すべきである。

最も実際的な適用には、試料は、病原体、非病原体、炭
水化物もしくは炭水化物誘導体、ポリペプチド、タンパ
ク質または他の細胞もしくはウィルス成分、これらの成
分に対する抗体、または試薬として使用するものと相補
的な一本鎖オリゴヌクレオチドを含有しているか、また
は含有していると思われる。本発明の方法は、現在のと
ころ、病態試料中の濃度に相当する低濃度の病原体を検
出することが可能であるとわかっているので、試料中の
病原体の検出に特に適しており、これにより、病態の原
因の信頼性のある診断が可能になったと考えられる。

本発明の方法によって検出可能な病原体には、バクテリ
ア、ウィルス、菌類（酵母菌を含む）、マイコプラズマ
、プリオンおよび細菌毒素かある。

各病原体群の代表例を以下に挙げる。

１、病原体： ａ、バクテリア：肺炎球菌、腸内細菌（大腸菌、すＩ＋
／千立引［シゲラＩＴ＋）、バチルス種、クロストリジ
ウム種、ナイセリア種、ストレプトコッカス種、スタフ
ィロコッカス種、アクヂノミセス種、ミコバクテリウム
種、ヘモフィルス種、ボルデテラ種、ノカルジア種、ト
レボネマ種、リケッチア種、クラミジア種、 ｂ、ウィルス：例えば、ヘルペトウイルス、ピコルナウ
ィルス、ミクソ−およびパラミクソウィルス、アルボウ
ィルス、レオウィルス、レトロウィルス、ラブドウィル
ス、アデノウィルス、 Ｃ１菌類：　例えば、アルテルナリア、カンジダ、セフ
ァロスポリウム種、コクシジウム、コクシジオイデス、
クリプロコツカス、エピデルモフィトン、フザリウム、
ゲオトリクム、ヒストプラズマ、ミクロスボルム、スコ
プラリオブシス、スボロトリクム、トルロプシス、トリ
コフィトンなど、 ｄ、マイコプラズマ：例えばマイコプラズマ種、ｅ、プ
リオン 「、細菌毒素：例えば、シアノ毒素およびコレラ毒素。

診断的利用以外にも、本発明の方法は、分析（例えば組
み替え体が挿入遺伝子を発現するかを調べるため）また
は精製の目的で、試料中の特定の成分を他の成分から分
離するためにも使用し得る。

このような成分には、前記のような非病原性生物、単独
でまたは細胞もしくはウィルス表面上に存在する炭水化
物もしくはその誘導体、同様に単独でまたは細胞もしく
はウィルス表面上に存在するポリペプチドまたはタンパ
ク質、または例えばハイ　。

ブリッド化においてＤＮＡプローブとして作用するとも
言える試薬として使用するものと相補的な一本鎖オリゴ
ヌクレオチドが含まれていてよい。

試薬およびラベル物質が結合しているか、または試薬を
伴ったラベル物質が結合している水不溶性高分子担体は
、試薬および／または物質が結合し得る活性部位を複数
有するポリマーであってよい。このようなポリマーとし
ては、水不溶性長鎖ポリマー、例えばポリスチレンまた
はポリ−ｐ−ジビニルベンゼンが適当である。活性部位
は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミド、シアノ、イ
ミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ、エステルおよ
びアシル基またはハライド含有基を含んで成る群から選
択することが好ましい。ポリマー上に適当な活性部位が
存在しない場合は、官能基の置換のような適当な修飾を
施してよい。本発明の方法において、活性化ポリマーを
試料と接触させた後、特定の試料成分のためのアッセイ
結果を損なう恐れのある交差反応を避けるために、残っ
た活性部位を不活性化する。この担体は、水溶性成分か
らの担体の分離を容易にするために、水不溶性であるべ
きである。

本発明の目的のためには、高分子担体は、立体的に結合
を妨害し得る長鎖ポリマーであるよりも、ある形状の粒
子は試料成分と試薬とを確実により良好に結合させるの
で、ミクロビーズの形状である方が好ましい。更に、ミ
クロビーズは、本発明の方法の工程ｂ）において固体支
持体と接触する間懸濁状態を保てるように十分に軽いも
のにすべきであり、そうするとミクロビーズの分散性は
確実に改良される。

この目的のために、ミクロビーズの大きさは、通例０．
０５〜２０μｍである。とりわけ本発明の方法において
使用する固体支持体の種類に応じて、ミクロビーズの大
きさを前記範囲内で変化させてよい。

ミクロビーズは、通例、ポリマーを含んで成る。

このことは、ビーズが、前記の説明に従って水不溶性で
あるべき適当なポリマーのみから成っていても、適当な
ポリマーで被覆された担体材料を含んで成っていてもよ
いということを意味する。ポリマーは、プラスチック、
ポリサッカライド、コポリマー、シリコンポリマー、ガ
ラス、リボソーム、架橋ポリマーまたはシリカもしくは
シリケート（例えばボロシリケート）から選択し得る。

適当なポリマーの代表例は、前記固体支持体のものと同
様であってよい。ミクロビーズは、要すれば複数の活性
部位を有１−てぃて上１’１−７小ト八ｆｌ−痒Ｈド部
位の例は、実質的に前記と同意義である。適当な活性部
位が存在しない場合には、適当な官能基を導入すること
によってポリマーを修飾してもよい。有利な修飾の代表
例を第１図に示す。

前記と同様に、高分子担体に多価結合している物質（ラ
ベル物質）は、検出可能な生成物を生成する反応を開始
し得る物質、とりわけ酵素、抗体および血液凝固因子の
いずれから選択してもよい。

とりわけ、酵素は、以下のいずれの群から選択してもよ
い。

第１群ニオキシドレダクターゼ（供与体のＣＨ−０１４
基に作用する） 第２群：　トランスフェラーゼ（リン含有基を転位する
） 第３群：ヒドロラーゼ（エステル結合に作用する）第４
群：リアーゼ（例えばアルドラーゼおよび炭酸脱水素酵
素）、または 第５群：　イソメラーゼ（分子内トランスフェラーゼ）
。

欠咋２−蒲藪１に舎へふ１九円丁？−二斗酵素は、直接
には検出できないが、以下のいずれかの式に従って検出
可能な最終生成物を生成する反応を触媒する基質を必要
とする物質である：ｌ）基質Ｘモルから検出可能な生成
物Ｘモルが生成、または ２）基質Ｘモルから検出可能な生成物ｎＸＸモルが生成
（増幅反応）。

ラベル物質は、十分な抗原の凝集を起こして検出可能な
生成物を生成し得る抗体であってもよい。

工程ａ）およびｂ）において抗体を試薬として使用する
場合、この抗体は、多価結合ラベル物質として使用する
抗体とは異なるものにすべきであることに注意しなけれ
ばならない。換言すると、凝集に使用する抗原は、試料
中に存在すると思われる試料成分とは異なるものである
べきである。

血液凝固因子をラベル物質として使用する場合、これは
、例えばウシまたはブタの精製した因子であってよく、
本発明の方法において有用なものとするためには、この
因子は、一連の血液凝固反応の少なくとも一段階を更に
開始するものであることが好ましい。このような因子は
、活性化された状態であっても、プロテアーゼのような
活性化剤と共に供給されてもよい。血液凝固因子は、フ
ィブリノーゲン（■）、プロトロンビン（ＩＩ）、トロ
ンビン（Ｉ［ａ）、組織性トロンボプラスチン（ＩＩＩ
）、プロアクセレリン（Ｖ）、促進性グロブリン（Ｖｌ
）、プロコンバーチン（■）、抗血友病性グロブリン（
ＶＩＩＩ）、血漿トロンボプラスチン成分（ＩＭ）、オ
ートプロトロンビンＩ［（Ｘ）、血漿トロンボプラスチ
ン前駆因子（Ｘｌ）、ハーゲマン因子（Ｘ［）およびフ
ィブリン安定化因子（ＸＩＩＩ）から選択し得る。

工程Ｃ）においてラベル物質と反応し、次いで検出可能
な反応生成物を形成する化合物は、血液凝固因子（ラベ
ル物質として使用したものを除く）、検出可能な凝集を
起こす抗体ラベルに対する抗原、または酵素によって触
媒されて有色、蛍光もしくは発光生成物を生成するか、
変色を起こす酵素基質（例えばＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ（前記の
ように循環的に生成する）は、チアゾリルブルーを触媒
して、黄色から青色に変色させる）から適当に選択し得
る。酵素−基質反応は、検出可能な生成物の色、蛍光ま
たは発光を、アッセイを行う試料成分の濃度に応じて弱
め、または強めもし得る。このような場合、本発明の方
法は、半定量分析に使用し得る。酵素基質は、オルトリ
ン酸フェノールフタレーン、リン酸デモフタレイン、オ
ルトニトロフヱニルグリコシド、ナフトール、アニリン
、クマリン、テトラゾリウム色素、ダンシルおよびそれ
らの誘導体、ＮＡＤＰ並びにイソチオシアネートから選
択することが好ましい。

本発明の方法の好ましい態様においては、ａ）固体支持
体は、試薬が結合しているマクロ粒子を含んで成り、カ
ラムに充填されているか、または固体支持体は、試薬が
結合している多孔性フィルター資金んで成り、試料を、
該カラムまたはフィルターに通し、 ｂ）高分子担体は、前記と同じまたは異なる試薬を組み
合わせられ、酵素が多価結合している１〜２０μｍの大
きさのミクロビーズを含んで成り、該ミクロビーズの懸
濁液を前記カラムに通し、お上Ｃ）酵素基質の溶液また
は懸濁液を前記カラムに通して、色、蛍光または発光を
起こす ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
した細胞、ウィルスまたは循環体の試料中における存在
を検出する。

この上うなカラムを使用することによって、比較的大量
の試料を分析することが可能である。

本発明の方法の他の好ましい態様においては、ａ）固体
支持体は、試薬が結合しているディツプスティックまた
はフィルムを含んで成り、該ディツプスティックまたは
フィルムを試料に浸漬し、ｂ）該ディツプスティックま
たはフィルムを、前記と同じまたは異なる試薬を組み合
わせられ、酵素が多価結合している０、０５〜１０μｍ
の大きさのミクロビーズを含んで成る高分子状担体と接
触させるために、該ミクロビーズの懸濁液に浸漬し、お
よび Ｃ）ディツプスティックまたはフィルムが、細胞、ウィ
ルスまたは循環体成分高濃度下で不透明になり、または
ディツプスティックを酵素基質の溶液または懸濁液に浸
漬すると、色、蛍光または発光が起きる ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
した細胞、ウィルスまたは循環体成分の試料中における
存在を検出する。

このようなディツプスティックまたはフィルムは、例え
ば細菌濃度が約１０１０であれば不透明になることがわ
かった。しかし、病理学的限界細菌濃度は、しばしば１
０＠−１０’細菌／ｊ１７２であるので、固体支持体を
酵素基質溶液に浸漬して分光学的に検出可能な生成物を
生成する反応を行うことか必要な場合がある。

本発明の方法の他の好ましい態様においては、ａ）固体
支持体は、要すればウェルのある、試薬が結合している
フィルムまたはプレートを含んで成り、試料を、該フィ
ルムまたはプレートに適用し、試料中の細胞、ウィルス
または循環体成分が結合するのに要する時間後に除去し ｂ）高分子状担体は、前記と同じまたは異なる試薬を組
み合わせられ、酵素が多価結合している１〜２０μｍの
大きさのミクロビーズを含んで成り、該ミクロビーズの
懸濁液を、前記フィルムまたはプレートに適用し、試料
中の細胞、ウィルスまたは循環体成分が結合するのに要
する時間後に除去し、および Ｃ）酵素基質の溶液または懸濁液を前記フィルムまたは
プレートに適用することによって、色、蛍光または発光
を起こす ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
した細胞、ウィルスまたは循環体成分の試料中における
存在を検出する。

フィルムまたはプレート（例えばマイクロタイタープレ
ート）への試料の適用は、通例、例えばピペットによっ
て試料の滴をフィルムまたはプレート上に置くことによ
って行う。

試薬に結合した試料成分の量を測定する代わりに、結合
しなかった試料成分の量を測定することも有利であり得
る。すなわち、本発明は更に、予め測定した量のミクロ
ビー女の、細胞、ウイルスまたは循環体成分に結合しな
かった割合を測定することによって、工程ａ）において
試薬に結合した該細胞、ウィルスまたは循環体成分の量
を定量する前記方法にも関する。

本発明の方法の好ましい態様を第２図に示す。

尿路感染症の診断を例として、本発明の方法の代表的な
態様を以下に記載する。

尿路感染症の多くは、特定の病原性大腸菌、特にＰ−フ
ィムブリエ大腸菌が、尿路の上皮細胞壁に付着し得るた
めに起こる。付着は、レセプター特異性相互作用（すな
わち、線状ポリペプヂド構造（フィムブリエと呼ばれる
）と上皮細胞表面の炭水化物構造（Ｇａｌａ　ｌ−＞４
　Ｇａｌβ−０−）との相互作用）を介して起こる。

臨床的分離物の同定は、従来バイオアッセイ、例えば上
皮細胞への付着または赤血球凝集に基づいていた。この
評価は、いくつかのレセプターに特異的な付着物（ａｄ
ｈｅｓ　ｉｎ）は重複して現れ得、標的細胞のレセプタ
ー組成は個々の組織および種によって変化するという事
実によって複雑である（文献１３参照）。このようなア
ッセイの感度は低く、それ故分析の前に試料を培養しな
ければならない。

近年提案されたアッセイ法は、ラテックスビーズ凝集に
基づく。このようなアッセイにおいて、レセプター化合
物は、スペーサーアームを介してプラスチックビーズに
結合する。付着物（ａｄｈｅｓｉｎ）担持バクテリアと
の相互作用の結果、凝集が起こる。この方法も、特異性
は高いが感度は不十分である。

本発明は、バクテリア（または他の病原体）を、支持体
と組み合わせた試薬に結合させることによって固体支持
体（フィルム、ディツプスティックまたはカラム中の担
体材料）上に濃縮した診断系を用いることによって、試
料中の病原体の存在を測定する従来の診断方法の感度が
非常に低いという問題を克服している。次いで、バクテ
リアを、試薬および複数の酵素を担持した球形粒子（ミ
クロビーズ）と接触させる。結合しなかったビーズを洗
浄によって除去した後、酵素基質を加えて、有色、蛍光
または発光生成物を生成するか、または固体支持体に結
合したバクテリアの初期効果を更に増幅する第２の酵素
系を活性化する。

他の態様においては、本発明は、 ａ）細胞、ウィルスもしくは循環体成分またはそれらに
対する抗体に結合し得る試薬に組み合わせられ、検出可
能な生成物を生成する反応を開始し得る物質が多価結合
しているか、または ｂ）検出可能な生成物を生成する反応を開始し得る物質
であって、前記試薬を組み合わせられた物質が多価結合
している高分子担体に関する。

この担体、試薬および物質は、担体を使用し得る本発明
の方法において、前記のような性質のものである。

更に他の態様においては、本発明は、 ａ）細胞、ウィルスもしくは循環体成分またはその抗体
と結合し得る、固体支持体に結合している試薬、および ｂ）検出可能な生成物を生成する反応を開始し得、高分
子担体に多価結合している物質と組み合わせ反応を開始
し得る物質が多価結合している高分子担体に組み合わせ
られた前記と同じまたは異なる試薬 を含んで成る診断用組成物に関する。

この組成物の特徴は、この種の組成物を使用し得る本発
明の方法の記載によって示す。

本発明によると、この組成物は、試薬が結合している複
数のディツプスティックであって、各ディツプスティッ
クまたはディツプスティックのサブグループには異なる
試薬が供給されており、各試薬は異なる細胞、ウィルス
もしくは循環体成分またはその抗体に結合し得るような
ディツプスティックから成っていてよいとも考えられる
。また、この組成物は、試薬が結合するウェルを複数個
有するマイクロタイタープレートであって、各ウェルま
たはウェルのサブグループには異なる試薬が入っており
、各試薬は異なる細胞、ウィルスもしくは循環体成分ま
たはその抗体に結合し得るようなマイクロタイタープレ
ートを含んで成っていてもよＬ）−７のご）−は−いず
れかの娼仝においてｔｌ−面じ診断組成物によって広範
な病気の診断することが可能になり、それ故診断が非常
に簡単になることを意味する。

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、実施例
は本発明を制限するものではない。

［実施例］ 材料および方法 オリゴサツカライドＧａｌαｌ→４Ｇａｌβ−０−２−
（カルボメトキシエチルチオ）エチルグリコシドを、ダ
ーメン（Ｄ　ａｈｍｅｎ）らの方法（文献１０．１１）
に従って合成した。このグリココンジュゲートを、ＫＬ
Ｈ（キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈ
ｏｌｅ　　Ｌｉｍｐｅｔ　　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ））
（文献１１．１２）と組み合わせて抗原として使用し、
マウスにおいてモノクローナル抗体を生成した。

この抗体（細胞系統８７１５　Ｃ，υは、バイオカーブ
・ケミカル社（Ｂ　１ｏｃａｒｂ　　Ｃｈｅｏ＋１ｃａ
ｌｓ　　Ａ　Ｂ　。

スウェーデン）によって製造されている。

ラテックスビーズ（０，８１μｍ）を、セラゲン・ダイ
アゴノスティクス社（Ｓｅｒａｇｅｎ　　Ｄｉａｇｏｎ
ｏｓｔｉｃｓ、米国）から；ラテックスビーズおよびア
ミノ−ラテックスビーズ（０，２３μｍ）を、ゼルファ
・ファインビオヘミカ社（Ｓ　ｅｒｖａ　　Ｆ　ｅｉｎ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、西独）から；ディノスフェレ（
Ｄ　ｙｎｏｓｐｈｅｒｅ）ビーズ（３μｍ’−１’シル
活性化）を、ディノ社（Ｄｙｎ。

Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉ註、ノルウェー）から；　トリサイ
ト（Ｔ　ｒｙｓｉｔｅ、ポリスチレン）フィルム（厚さ
０　、２　ｍｍ）を、ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ　　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ、米国）から；セファロース（商標）
マクロビーズ６ＭＢ。

ＣＮｌ３ｒ−活性化を、ファルマシア・ファイン・ケミ
カル社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆ　ｉｎｅ　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ１スウェーデン）から入手した。

子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）をベーリン
ガーー７ンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ。

西独）から；４−ニトロフェニルニナトリウムオルトホ
スフェートを、ビー・ディー・エッチ・ケミカル社（Ｂ
　Ｄ　ＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ　　Ｌ　ｔｄ、、英国）か
ら；５−アミノサリチル酸および０−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを、シグマ社（Ｓ　ｉｇｍ
ａ、米国）から入手した。子牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ
　Ａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤ■■）、ジ
アホラーゼおよびｐ−ａ−ドニトロテトラゾリウムバイ
オレット（Ｉ　ＮＴ）をシグマ社から；Ｎ−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸
塩を、メルクーシュヒャルト社（Ｍｅｒｃｋ　−Ｓ　ｃ
ｈｕｃｈａｒｄｔ、西独）から；マウス免疫グロブリン
に対するペルオキシダーゼ複合兎免。

疫グロブリンを、ダコーイムノグロプリン社（ＤＡ　Ｋ
　Ｏ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　　Ａ／　Ｓ　
、デンマーク）から：グロボシドを、バイオカーブ・ケ
ミカル社から；　ＧａＬａ　ｌ　−＋４　Ｇａｌβ−０
−ＣＥＴＥ−ＢＳＡ（（Ｇａｌ−Ｇａｌ）ｎ−ＢＳＡ）
および（Ｇ　ａｌβ１→４Ｇ　ｌｃＮ　Ａｃ）ｎ　−Ｂ
　Ｓ　Ａを、ニス・ニス・エイ、ファイン・ケミカルズ
・ディビジョン（ＳＳＡ、ＰｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ
　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、スウェーデン）から；β−ガラ
クトシダーゼ（大腸菌由来のグレード■）および西洋わ
さびペルオキシダーゼ（タイプ■）を、シグマ社から入
手した。

本発明の微生物検出のための診断方法の原理を８８　Ｔ
ｌ１１−）−２＋−−ｙｒ−：＠七コシ　）−４−Ｒ１
１ｉチに！ｈ　ＩＪ　　　ｂｎ　嬰Ａ−１且曲株または
腎孟腎炎と診断された患者の尿から採った株であった（
引用文献、エッチ・レフエラー（Ｈ。

ＬｅｆＴｌｅｒ）およびシー・スパンボーグーエデン（
Ｃ。

Ｓ　ｖａｎｂｏｒｇ　−Ｅ　ｄｅｎ）、「イー・コリ・
レクチンズ／アドヘシンズ・パインディング・トウ・グ
リコリピッズ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　　１ｅｃｔｉｎｓ／ａ
ｄｈｅｓｉｎｓ　　ｂｉｎｄｉｎｇｔｏ　　ｇｌｙｃｏ
ｌｉｐｉｄｓ）Ｊ、バクチリアルψレクチンズ（Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　　Ｌｅｃｔｉｒ＋ｓ＋）、ディー・ミレ
ルマン（Ｄ　、　Ｍ　ｉｒｅｌｍａｎ）編、ウィリー（
Ｗｉｌｅｙ）、１９８５年（文献１３）参照）。最も高
頻度に使用される株は、同定されており、０４：に１２
：Ｈｌ（ＧＫｌ）およびＫ１２：Ｈ４８（Ｃ６００）で
あることがわかっている。培養は、コロニゼーション・
ファクター・アンティゲン（Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
　　ＦａｃｔｏｒＡｎｔｉｇｅｎ）（ＣＦ　Ａ）寒天プ
レート上で、３７℃で一晩行った。コロニーを採り、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７，４）に懸濁させた。Ｐ−フィムブリエの
存在を、細胞結合アッセイおよび新しく開発されたキッ
ト（文献１５．１６．１７）を用いて試験した。スタフ
ィロコーｌカス番廿プロ７ノーｆ−カスｈｔｉｅｔ＋−
マＪＩ、茶、）−ｆネラル・ホスピタル（Ｍａｌｍｏ　
Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

スウェーデン）で尿から単離・同定されたものであった
。

出発材料の調製 １、（Ｇａｌ−Ｇａｌ）ｎ−ＡＬＰの調製エタノール中
の６６．７ｍＭＧａ１α１→４Ｇａｌβ−０−２−（カ
ルボメトキシエチルチオ）エチルグリコシド溶液１　、
５　ｍＱを、水中の７５　（ｗ／ｖ）％ヒドラジン０　
、２　ｙＱで処理した。この溶液を、室温で一晩撹拌し
た。次いで、この溶液を蒸発乾固した。合成したヒドラ
ジド（ＤＭＳｏ　　２００μσ中７．３５ｍｇ）を、ダ
ーメンらの方法（文献１２）に従って対応するアシルア
ジドに変換し、次いで０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，０）中のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）溶液（Ｉ０ｍｇ／ｒｚＱ）に滴加した。反応の間、
Ｉ）Ｈを９．１〜９．３に保った。生成したグリコジル
化ＡＬＰを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０，
０，０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３　）に対して透析し、使用時
以外は冷蔵庫に貯蔵した。

１１ａ）およびｂ）、ＮＨｔ−ラテックスおよびＢＳＡ
−ラテックスの調製 ラテックスビーズ（０，８１μｍまたは０．２μｍ）を
、発煙赤硝酸／氷酢酸（Ｉ：　４　ｖ／ｖ）でニトロ化
し、ジヂオン酸ナトリウムで還元した。生成したＮ　Ｈ
、−ラテックスビーズを、ナサ・チク・ブリーフ（ＮＡ
ＳＡ　　ＴＥＣＨＢＲＩＥＦＸＭＳＣ１３９０６）（文
献１４）に記載の方法に従ってＢＳＡに共有結合させた
。ＢＳＡ−ラテックスビーズを、ＮａＮ３０．１％を含
有する緩衝液に懸濁させ、使用時以外は冷蔵庫に貯蔵し
た。

ミクロビーズの調製、一般的方法 ＩＩ［、ＢＳＡ−ラテックスに結合した（Ｇ　ａｌ−Ｇ
　ａｌ）ｎ−ＡＬＰの調製 ２種の異なる方法を用いて、グリコジル化ＡＬＰをラテ
ックスビーズに共有結合により固定化した。すなわち、
グルタルアルデヒド法およびカルボジイミドカップリン
グ法である。

■：１．グルタルアルデヒドカップリング■で得られた
グリコジル化ＡＬＰ溶液（Ｉ０ｍｇ／ｘＲ）２５μｇを
、Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）２０
０μｇ中のグルタルジアルデヒド（２，５ｗ／ｖ％）ｔ
ＯμＣと混合した。１時間後、ｌ３ＳＡ−ラテックス懸
濁液（ｌＯ１″粒／村、０．２１または０．８１μｍ）
５０μｅを加えた。反応混合物を一晩放置し、濾過し、
水洗した。ビーズの活性を、後のｒ（Ｇａｌ　−Ｇａ１
）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐ修飾ラテックスビーズの特徴」の項
に記載する方法に従って試験した。

■：２．カルボジイミドカップリング ■で得られたグリコジル化ＡＬＰ溶液（ＩＯＨ／ａ１２
）２５μｇを、水１２５μσ中のカルボジイミド（Ｎ、
Ｎ−ジメチルアミノプロピル−Ｎｏ−エチルカルボジイ
ミド）　２　、５１１Ｉｇと混合した。ｐＨを４゜７に
調節し、ＢＳＡ−ラテックス懸濁液（ｔｏ１３粒／酎、
０耐２１または０．８１　ｔｔ＋ｎ）４０　ｕＱを加え
た。１２時間後に反応を停止した。修飾したラテックス
ビーズを濾過し、水洗し、分析した、（ｒ（Ｇａｌ−Ｇ
ａｌ）ｎ−ＡＬＰ修飾ラテックスビーズの特徴」の項参
照）。

−Ｇａｌ）ｎ−ＡＬＰの調製 ＮＨ３−ラテックス懸濁液（Ｉ０１３粒／１ｔＱ、０゜
２１−０．８１μｍ）６０μＱを水洗し、遠心した。

ビーズを水０．１ＲＱに懸濁させた。２ｍｇの（Ｇ　ａ
ｔ　−Ｇａｌ）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐ　（水１７５μＣ中）
およびカルボジイミド（５０ｍｇ／ｘ１２）２７５　ｕ
（ｌを加えた。混合物を振ｔＩｌ器で一晩インキエベー
トした。水洗前に、ビーズをＢＳＡ（Ｉ０ｍｇ／酎）溶
液と共にインキュベートすることによって、ビーズ上に
残ったＮ　Ｈｔ−またはカーポジイミド基をブロックし
た。

（Ｇａｌ−Ｇａｌ）ｎ−ＡＬ　Ｐを結合したＮＨ，−ラ
テックスは、■に記載の方法によっても調製された。

ＡＬＰをＮＨ，−ラテックスと組み合わせた後、グロボ
シドで被覆した場合もあった。

Ｖ、（Ｇａｌ−Ｇａｌ）ｎ−ＢＳＡおよびＡＬＰの混合
物を結合したラテックスビーズの調製水５００μＣ中の
（Ｇａｌ　−Ｇａ１）ｎ　−Ｂ　Ｓ　Ａ（０、５ｍｇ）
およびＡＬＰ（５ｍｇ）のモル混合物（Ｉ：Ｉ　ｏ）を
、予めカルボジイミドで活性化したＮＨｌ−ラテックス
ビーズ縣Ｂ妨（Ｉ０’　３ｔｖ　／　ｙθ）３００ｕ０
に加えた。この反応は、４℃で一晩行った。残ったＮＨ
，−およびカルボジイミド基を、トリス緩衝液（０，１
Ｍ５ｐｌ（８，０）で、次いでＢＳＡ（Ｉ０ｍｇ／ｍｇ
）でブロックした。ビーズを洗浄後、０．１％Ｎ　ａ　
Ｎ　ｓ含有緩衝液に懸濁させた。

β−ガラクトシダーゼおよび（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｌ）
ｎ　−Ｌ３ＳＡで修飾したラテックスビーズの調製Ｎ　
Ｈ２−ラテックス懸濁液（ｔＱＩ３粒／ｍＱ、０゜８１
μｍ）３００μＱを水洗し、遠心した。このペレットを
ｔＭ−Ｈｃ＆（Ｉｍ１２）ｔ：懸濁させ、＋４℃に冷却
した。０．０５Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液１００μＱを加
えた。１５分後にビーズを遠心し、水洗し、５０ｍＭリ
ン酸カリウム（叶Ｉ　７　、２　）　Ｉ　ｚ（Ｉに！＠
局させた。（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｌ）ｎ　−Ｂ　Ｓ　Ａ
およびβ−ガラクトシダーゼの混合物（Ｉ／　１００ｗ
／ｗ）を、ジアゾ化ビーズと反応させた。１０分後、β
−ナフトール（Ｉｍｇ／１ｘ（２）溶液０　、５　ｍＱ
で反応を停止し、ビーズを遠心し、洗浄し、トリス緩衝
液（ｐＨ８。

０）に懸濁した。

Ｖ［、ＡＬＰ（またはβ−ガラクトシダーゼもしくは西
洋わさびペルオキシダーゼ）および（Ｇ　ａｌ　−Ｇａ
ｌ）ｎ−ＢＳＡの、ＮＨ，−ラテックスへのジアゾカッ
プリング ＡＬＰカップリング ＮＨ２−ラテックスの懸濁液（ＩＱ＋３粒／７！１２．
０゜８１μｍ）３００μｅを水洗し、遠心した。このペ
レットをＩＭ−ＨＣρ（Ｉ１１Ｑ）に懸濁させ、４℃に
冷却した。０．０５Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液１００μｅ
を加えた。１５分後にビーズを遠心し、水洗し、５０ｍ
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，２）ｌｘ（！に懸濁させた
。（Ｇ　ａｔ　−Ｇ　ａｌ）ｎ　−Ｂ　Ｓ　ＡおよびＡ
ＬＰの混合物（Ｉ０：１ｗ／ｗ）を、ジアゾ化ビーズと
反応させた。１０分後、β−ナフトール（Ｉｍｇ／村）
溶液１　、５　ｍ（ｌで反応を停止し、ビーズを遠心し
、洗浄し、トリス緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。

β−ガラクトシダーゼまたは西洋わさびパーオキシダー
ゼのカップリング これらの酵素を結合したビーズを、（Ｇ　ａｌ−Ｇ　ａ
ｔ）ｎ−ＢＳＡおよびβ−ガラクトシダーゼの間の比を
ｌＯ：Ｉｗ／ｗでなく　Ｉ　：１００ｗ／ｗとしたこと
を除いては同様の方法で製造した。

■、ラテックス（またはＮＨ，−ラテックス）のコーテ
ィング アミノ−ラテックス（Ｂ　Ｓ　Ａ−ラテックスの調製を
参照）または非修飾ラテックスビーズを（Ｇａｌ−Ｇａ
１）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐで被覆する第３の方法をも使用し
た。修飾した酵素の過剰量を、ビーズと共に１２時間イ
ンキュベートした。ビーズを濾過し、緩衝液で洗浄し、
使用時以外は４℃で貯蔵した。

■、　（Ｇａｌ−Ｇａｌ）ｎ−ＡＬＰを結合したディノ
スフェレビーズの調製 トシル−活性化ディノスフエレビーズの１０％溶液（３
μｍ、１０”粒／耐）を、（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｔ）ｎ
　−ＡＬＰ（Ｉ００％モル過剰）と、ｐＨ９，６，４℃
で一晩反応させた。共有結合によって修飾したビーズを
緩衝液で数回洗浄し、０．１％ＮａＮ３含有緩衝液中で
貯蔵した。ディノスフェレを粗酵素ＡＬＰと反応させた
後にグロボシドで被覆するというように、この方法の改
良法も行った。

ＩＹ　　Ａ　ｒ、　ｒ）ｋ）ｙｒ１″！ａ＋　　ｒ−＋
＋ｔムーｒｒｓ罰人ａｍ、ｈｂし合したラテックスビー
ズの調製 Ｇａｌαｌ→４Ｇａ１β−に対するモノクローナル抗体
を、ビオカーブ社から求めた。この抗体は、ＩｇＧ抗体
である。飽和硫酸アンモニウムを用い沈澱し、次いでＤ
Ｅ−５２イオン交換カラムを用いて精製することによっ
てこの抗体を濃縮した。

この抗体を、０〜０．４Ｍ塩化ナトリウム／トリス緩衝
液勾配で溶出した。集めたフラクションの、（Ｇａｌ　
−Ｇａ１）ｎ　−Ｂ　Ｓ　Ａに対する結合能を試験した
。

■に記載の方法と実質的に同様に、ＮＨ，−ラテックス
（０，２μｍ）ビーズを、ＡＬ、Ｐ／抗体（ｌ：１０ｗ
／ｗ）で修飾した。修飾したビーズを洗浄し、水に対し
て透析し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（０、！％Ｎ　ａ　
Ｎ　ａ、ＰＩ（７，２）の溶液として貯蔵した。

マクロビーズの調製 ＢＳＡのアガロースビーズ（セファロース（商標）６Ｍ
Ｂ）へのカップリング ＢＳＡ６０ｍｇを０．１Ｍ　　ＮａＨＣＯａ（ＰＨ９）
３雇中に溶解し、前記冷緩衝液で素早く洗浄しておいた
臭化シアノジエン活性化セファロース（商標）６ＭＢ（
６７１１２）に加えた。カップリングは、エンド−オー
バー−エンド・ロッキングテーブル上で４°Ｃで一晩行
った。ビーズをカップリング緩衝液および蒸留水で洗浄
した。

ＧａＩａ　１−＋４　Ｇａ１−β−０−ＢＳＡ−アガロ
ースビーズ（セファロース（商標）６ＭＢ）の調製ＢＳ
Ａ−アガロース（Ｉ，５ｇ）を、０．４Ｍ−ＮａＨＣＯ
３（ｐＨ９，３）で洗浄した。グリコシドＧａｌαｌ−
＋４Ｇａｌβ−０−ＣＥＴＥを、前記のように対応する
アシルアジドに変換した。アシルアジド溶液０　、３　
ｍＱｃ該誘導体約８ｍｇ含有）を１３ＳＡ−アガロース
１．５ｇおよび０　、４　Ｍ　　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９
，３）０．５ｘＩ２の懸濁液に加えた。２０℃で４時間
、次いで４℃で一晩反応を行った。生成物を蒸留水で洗
浄した。

修飾した酵素および修飾したビーズの特徴（Ｇａｌ−Ｇ
ａｌ）ｎ−ＡＬＰの特徴 修飾した酵素の２８０ｍｍにおける吸光度は、所定の濃
度の親酵素の吸光度に相関していた。酵素活性は、自動
プリズマ（ＰＲＩ　ＳＭＡ）分析機（クリニコン社（Ｃ
１ｉｎｉｃｏｎ　　ＡＢ、スウェーデン）製）で測定し
た。この活性は、親酵素の活性に相関していた。糖含量
は、フェノール−硫酸法（エム・ドウボイス（Ｍ、　Ｄ
ｕｂｏｉｓ）、ケイ・エイ・ギルス（Ｋ、　Ａ、　Ｇ１
１ｌｅｓ）、ジェイ・ケイ・ハミルトン（Ｊ、　Ｋ、　
Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、ピー・エイ・レバース（ｐ。

Ａ　、　Ｒｅｂｅｒｓ）およびエフ・スミス（Ｆ　、　
Ｓ　ｍ１ｔｈ）、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎ
ａｌ、　Ｃｈｅｍ、）２８．１９５６年、３５０頁（文
献ｌ９））によると、Ｇａｌα１−＋４　Ｇａｌβ−０
−２−（カルボメトキシエヂルチオエチル）グリコシド
の標準的に希釈したものに相関していた。同時に、ＡＬ
Ｐに、酵素１モル当たり３９〜４０モルの糖が共有結合
していることがわかった。酵素活性（Ｉ，４μｋａｔ／
村）は、親酵素のそれ（活性！、８μｋａｔ／ｆｆＮ）
とほどんど同じであることがわかった。

（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｌ）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐ修飾ラテッ
クスビーズの特徴 修飾ラテックスビーズ（０，２１，０，８１℃１ｍ。

カルボジイミドカップリング法によって調製したもの）
の懸濁液の活性を、ビーズにｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートを加えることによって試験した。

親酵素を標準に使用した。活性は、ＡＬＰ９５〜１００
分子／粒またはＣａ１−Ｇａｌ約３約３７御０〜４００
０ の他のビーズに対する測定方法も同様であった。

（Ｇａｌ　−　Ｇａ１）ｎ　−　Ｂ　Ｓ　Ａおよびβ−
ガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼで修飾したビ
ーズの特徴 ビーズの活性の試験方法は、ｒ（ｃ　ａｌ　−　Ｇ　ａ
ｌ）ｎ　−ＡＬＰ修飾ラテックスビーズの特徴」の項に
記載した方法と同様であった。ペルオキシダーゼの基質
として５−アミノサリチル酸を、β−ガラクトシダーゼ
の基質として０−ニトロフェニルガラクトンドを使用し
た ビーズの活性は、β−ガラクトシダーゼ２２０、分子７
粒およびペルオキシダーゼ６０５分子／粒に相当するこ
とがわかった。

、′″小ビーブの　田宇１ｋ　ｌ）　−　７ノへゴ１１
丁士Ｉｎ蘭結合能を試験した。この結果は、感度が低か
ったことを除いては、ＡＬＰ結合ミクロビーズに対して
得られた結果（実施例１および第４図参照）に従ってい
た。

修飾ビーズの特異性試験 第３表で特徴付けられる異なるビーズの特異性を、凝集
試験によって試験した。特異的な凝集によって、株がＰ
−フィムブリエであるか非Ｐーフィムブリエであるか判
断された（文献１６）。表中のデータは、いずれの粒子
にも特異的な結合が得られないことを示す。しかし、Ｐ
−フィムブリエ大腸菌に対して特異性が最適でない場合
、Ｐ−フィムブリエおよび非Ｐーフィムブリエ株の凝集
感度に顕著な相異がある。

実施例１　　　　　。

Ｇａ１−Ｇａ１−ＢＳＡで被覆したポリスチレンフィル
ムに結合したＰ−フィムブリエ大腸菌の検出厚さ０．２
ｍｍの透明なトリサイトフィルムを、（Ｇａｌα１　−
＋４　Ｇａｌβ）ｓ＋　　Ｏ　　ＢＳＡ（Ｉ　０　ｏμ
ｇ／ｍＱ）溶液中で９時間インキュベートした。フィル
ムをＰＢＳで洗浄し、Ｐ−フィムブリエ大腸菌（腎孟腎
炎患者の尿から単離されたもの）のＩＱＩＯ１ＩＯ９，
１０’、１０７または１０”菌／ｊａｉｌｌ濁液と共に
０．５時間インキュベートした。Ｏ，１Ｍトリス−０，
０５Ｍ−ＮａＣ（ｌ緩衝液（ｐＨ７，５）および水で洗
浄後、透明なフィルムへのバクテリアの結合を顕微鏡で
観察した。高濃度のバクテリア懸濁液を用いると、高密
度の結合が得られた。非Ｐ−フィムブリエ大腸菌懸濁液
は、フィルムに結合したとしても、少量結合したに過ぎ
ない。フィルムへの結合の阻害は、最初にバクテリア懸
濁液をＧａｌαＩ−）４Ｇａｌβ−ＯＥ　ｔ（Ｉ００ｒ
ａｇ／酎および１０ｍｇ／ｘσ、ニス・ニス・エイ・フ
ァイン・ケミカルズ・ディビジョン製）と共にインキュ
ベートし、次いでフィルムをそのバクテリア懸濁液と共
にインキュベートすると確実であった。顕微鏡による視
覚的観察によると、そのフィルム上には少数のバクテリ
アしか検出されなかった。

次いで、バクテリアの結合したフィルムをビーズ懸濁液
（（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｌ）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐ修飾ラテ
ックス、０．８１μｍ）と共に０．５時間インキュベー
トし、トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した。バクテ
リア、が高濃度（Ｉ０”菌／村）の場合、フィルムは不
透明になり、裸眼で検出できた。バクテリアが低濃度の
場合、結合酵素ビーズを基質ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート（ＩＭジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９、８，
０，５ｍＭ　　ＭｇＣｈ含有）中１０ｍＭ）と反応させ
ることによって、結合したバクテリアを検出することが
できた。第１図は、バクテリア（２種の大腸菌株：ＧＫ
ｌおよびＣ６００）濃度の関数として、４０５ｎｍにお
ける吸光度を示す（操作は３回行った）。ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートを基質として使用した場合の検出限
界は、ＩＯ＠−１０７菌／ｆｆ１２であった。トリサイ
トフィルムの代わりにＥＬ　Ｉ　ＳＡマイクロタイター
プレートを使用して同様に実験を繰り返した。表面およ
び細胞の量は限定因子であるが、バクテリア濃度をｌ０
１ｌ菌／収まで低下しても検出可能であった。これらの
結果と既知のサンドウィッチ−ＥＬＩＳＡ法（文献２０
）による結果とを比較すると、検出能が拡大されている
ことは明らかである。ミクロビーズインキュベーション
工程の代わりに、（Ｇ　ａｌα１→４Ｇａｌβ）ｎ−Ａ
ＬＰ溶液でインキュベートし、次いで（洗浄後に）基質
でインキュベートした場合は、ＩＱＩＯ菌／ｚＱの濃度
でも固定化バクテリアの存在を検出することができなか
った（第４図）。

この実験においては、ミクロビーズを使用する実験と比
較して、バックグラウンドの吸光度も高かった。特異粒
凝集に対する検出限界（文献１６）は、ｔｏ”−ｔｏ’
菌／ＲＱテあった。

実施例２ Ｇａｌ−ＧａｌＢＳＡ−アガロースビーズに結合したＰ
−フィムブリエ大腸菌（ＧＫｌ）の検出Ｃａ１−Ｇａｌ
コンジュゲートしたＵＳＡ−アガロースおよびＢＳＡ−
アガロース（０，５ｊ！１２）（対照）を、底に多孔質
グラスフィルターのあるＰＶＣプラスチック管である３
個のカラム（８ｍｎ＋Ｘ　５０　ｍｍ）に充填した（２
個にはＣａｌ　−Ｇａ１Ｂ　Ｓ　Ａを、１個にはＢＳＡ
アガロースを入れる）。カラムをＰＢＳ（リン酸援衝含
塩液、ｐＨ７，２）で洗浄した。ＰＢＳに再懸濁させた
大腸菌ＧＫｌ株の懸濁液（０゜３ｘｉＪ、０Ｄ＝１．０
°３）を、ＢＳＡカラムおよび１個のＧａ１−Ｇａ１−
ＢＳＡカラムに通した。非Ｐ−フィムブリエ大腸菌Ｃ６
００株の懸濁液（０、３ｍＱ。

０Ｄ＝１．４０）を、第２のＧａ１−Ｇａ１−ＢＳＡカ
ラムに通した。

５分後、ゲルをＰＢＳ（３Ｘ０．９ｆｆ１２）で洗浄し
た。溶出液を集め、ＯＤ測測定た。加えたＧＫＩの１６
％は、Ｇａ１−Ｇａ１−ＢＳＡカラムに担持された。０
６００株は完全にカラムから溶出した。

ＧＫｌ株は、ＢＳＡアガロースカラムには付着しなかっ
た。

溶出工程の直後に、ミクロビーズ溶液２００ｕ　（２（
（Ｇ　ａｌ　−Ｇ　ａｌ）ｎ　−Ａ　Ｌ　Ｐで修飾した
３７％ｍディノスフェレビーズ（活性１０’ＡＬＰ／粒
）を各カラムに加えた。５分後、カラムを、ＰＢＳ（３
ＸＯ、９酎）、水（３ｍＱ）およびｌ　ｍＭ　−Ｗｌｇ
Ｃ（ｂ含有ジェタノールアミン（３酎）で連続して洗浄
した。０゜１ｍＭｔ）−二トロフェニルホスフェート溶
１２００μＱを加えることによって、酵素架橋ミクロビ
−ズを検出可能にした。大腸菌ＧＫ１株を吸着したカラ
ムは黄色に変わったが、他の２個のカラムは変化しなか
った（２０分間インキュベート後に観察）。ＧＫＩ株を
希釈して実験を繰り返した。

１０８菌／ｍρに相当するまで希釈を行っても、生成し
たｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍで分光学的に検出
することができた。ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸（ＮＡＤＰ）を基質として使用した場合は、
ＧＫＩ株の濃度が１０５菌／ｘ（ｌでも測定可能であっ
た。この実験においては、触媒量のＮＡＤＰがＮＡＤに
変化する。エタノール存在下にアルコールデヒドロゲナ
ーゼの作用によってＮＡＤからＮＡＤＨが生成する。ジ
アホラーゼがＮ　Ａ　Ｄ　ＨをＮＡＤに変換するのと同
時に、還元可能な物質（ＩＮＴ）が還元されて宵色物と
なる（文献２１）（第３図参照）。

実施例３ 抗−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＡＬＰビーズの薄層分離糖脂質へ
の結合 グロポテトラシルセラミドＧａｌα１→４Ｇａｌβ１→
４Ｇ１ｃｍβ−０（ＣＨｔ）＋７ＣＨａの混合物を、Ｈ
ＰＴＬＣ板（メルク社、西独）に適用した。展開溶媒と
してクロロホルム−メタノール−水（容積比６０：３５
：８）を用いて化合物を分離した。次いで、メチルメタ
クリレートの薄層を噴霧することによってプレートを被
覆した（文献１８）。乾燥後、炭水化物残基を検出する
ために、最初にプレートを抗Ｇａ１−Ｇａ１−ＡＬＰラ
テックスビーズ（０，２μｍ）の水懸喝液でインキュベ
ートし、次いで水中でプレートを洗浄した。プレートを
、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを含浸させたファツ
トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙で被覆った。１５分後に
反応を停止すると、狭い黄色のバンドを裸眼で検出する
ことができた。

実施例４ （Ｇａｌ−Ｃａｌ）ｎ−ＡＬＰラテックスビーズのマイ
クロタイタープレート固定抗体への結合５０　ｍｍｏ１
２Ｎ　ａＨＣＯ５ｌＩｉ衝液（ｐＨ９，６）で５〜０゜
１７ｕｇ／ａ（ｌに希釈した抗Ｇａ１−Ｇａｌ抗体１０
０μｅと共に室温で一晩インキユベートすることによっ
て、マイクロタイタープレートを被覆した。

洗浄後、ウェルを５０　ｍｇ／ｍＱＦ３　Ｓ　Ａ溶液で
処理した後、洗浄した。各ウェルに、（Ｇ　ａｌ　−Ｇ
　ａｔ）ｎ　−ＡＬＰラテックス（０，８１μｍ、活性
ＡＬＰ７５００分子／粒）の１０８粒／ｊｌ１２懸濁液
を加えた。０゜５時間インキュベートし、洗浄した後、
結合したミクロビーズ景を、ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートを基質として用いることによって検出した。

検出限界は０．１７μｇ／ｚＱ、で、この抗体溶液（Ｍ
ＷＩＯ”）の温度約０．２　ｐｍｏ１２／　Ｑに対応し
ていた。

実施例において調製および使用したミクロビーズの種類
並びに異なる大腸菌を用いた場合の凝集試験の結果を第
３表および第４表にまとめる。

実施例５ ラクトースアミン−ＢＳＡコンジュゲートで被覆された
ポリスチレンフィルムに結合したスタフィロコッカス・
サブロフィチカスの検出 スタフィロコッカス・サブロフィヂカスが糖コンジュゲ
ート含有ラクトースアミンに結合することは、赤血球凝
集の研究において既にわかっている（文献＋２）。

厚さ０　、２　ｍｍの透明なトリサイトフィルムを、ラ
クトースアミン−ＢＳＡコンジュゲート（Ｉ００ｕｇ／
ｙＱ、実施例１参照）で被覆した。トリス緩衝液（ｐＨ
７，４）で洗浄後、スタフィロコッカス・サブロフィチ
カス懸濁液（Ｉ０”−１０”菌／肩＆）と共にフィルム
を０．５時間インキュベートした。

水およびトリス緩衝液（ｐＨ７，４）でフィルムを注は
深く洗浄し、ミクロビーズ懸濁液（Ｉ０８粒／ＩＩＱ、
ラクトースアミン−〇ＳＡ／ＡＬＰで修飾したラテック
ス：活性５０００ＡＬＰ／粒）と共にインキュベートし
た。１０１０菌／酎の濃度で、フィルムは不透明になっ
た。より低い濃度では、実施例！に記載の基質インキュ
ベーション工程によって特異的結合を検出した。

引用文献： １、ニス・アブラミーズ（Ｓ、　Ａｖｒａｍｅａｓ）、
カル・トップ・ミクロビオル・イムツル（Ｃｕｒｒ、　
Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
）１０４．１９８３．９３頁。

２、ジエイ・エッチ・カスター（Ｊ、Ｈ，Ｃａ５ｔｅｒ
）、ジェイ・タリノ・イムノアッセイ（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ
、　Ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓｅｙ）７．１９８４．６４頁
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３、シー・ワグナ−（ｃ、　Ｗａｇｅｎｅｒ）ら、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、　Ｉｍ
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Ｍｅｔｈｏｄｓ）６ｇ、１９８４．２６９頁。

４、エイ・エム・シャニスディンおよびシー・シー・ハ
リス（Ａ、Ｍ、　Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎ　ａｎｄ　Ｃ，
Ｃ，Ｈａｒｒｉｓ）、アーカイブズ・オブ・パソロジー
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５、シー・パケットおよびディー・ワイ・トゥマシ（Ｃ
。

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６アール・エッチ・ヨルカン（Ｒ，Ｉｌ、　Ｙｏｌｋａ
ｎ）ら、ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メソッズ
５６．１９８３．３１９頁。

７、シー・ケンダル（Ｃ，Ｋｅｎｄａｌｌ）ら、ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ５６．１９８３
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８、エイ・ヨハンソン、シー・ジエイ・スタンシーおよ
びシー・エッチ・セルフ（Ａ、　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、
　Ｃ，Ｊ。

５Ｌａｎｌｅｙ　ａｎｄ　Ｃ，Ｈ，５ｅｌｆ）、クリニ
ック・キミカ・アクタ（Ｃ１ｉｎｉｃ　Ｃｈｉｍｉｃａ
　Ａｃｔａ）１４ｇ、ｌ９８５．１１９頁。

９、ビー・ポルツマン（Ｂ、　Ｐｏｌｔｓｍａｎｎ）ら
、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ６６．
１９８４．１７９頁。

１０、ノエイ・ジーメン、ティ・フレッジ、ジー・グロ
ンバーブ、ティー・ラーベ、ジー・マグヌソンおよびジ
ー・ノーリ（Ｊ、　Ｄａｈｍｅｎ、　Ｔ、　Ｆｒｅｊｄ
、　Ｇ。

Ｇｒｏｎｂｅｒｇ、　Ｔ、　Ｌａｖｅ、　Ｇ、　Ｍａｇ
ｎｕｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｎｏｏｒｉ）、カールハ
イドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ　。

比ジエイ・ジーメン、ティ・フレッジ、ジー・グロンバ
ーブ、ティー・ラーベ、ジー・マグヌソンおよびジー・
ノーリ、カールハイドレート・リサーチ１１８．１９８
３．２９２頁。

１２、ジエイ・ジーメン、ティ・フレッジ、ジー・マグ
ヌソン、ジー・ノーりおよびエイ・−ニス・カールスト
ーム（Ｊ、　Ｄａｈｍｅｎ、　Ｔ、　Ｐｒｅｊｄ、　Ｇ
。

Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　（ｊ、　Ｎｏｏｒｉ　ａｎｄ　
Ａ、−３，Ｃａｒｌｓｔｏｒｍ）、カールハイドレート
・リサーチ１２５．１９８４．２３７頁。

１３、エッチ・レフシーおよびシー・スパンボーグーエ
デン（Ｉｌ、　Ｌｅｆｆｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｓｖａｎ
ｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ）、バクチリアル・レクチンズ（Ｂ
ａｃｔｒｅｉａｌ　Ｌｅｃｔｉｎｓ）、ディー・ミレル
マン（Ｄ、　Ｍｉｒｅｌｍａｎ）編、１９８５゜１４、
エッチ・ジエイ・チッソおよびディー・ビー・スミス（
Ｉｌ、Ｊ、　Ｔｅｎｏｓｏ　ａｎｄ　Ｄ、Ｂ、　Ｓｍ１
ｔｈ）、ナサ・チク・ブリーフ（ＮＡＳＡ　ＴＥＣＩ［
ＢＲＩＥＦ）、マント・スペースクラフト・センター（
Ｍａｎｎｅｄ　ＳｐａｃｅｃｒａｆｔＣｅｎｔｅｒ）（
ＭＳＣ１３９０６）。

１５、アール・モルバイ、ジー・カレニウス、ティー＋
　声ｒ　ノ　、１−−１？　　÷　・ノ　　　：ｊ−１
−＾　、　・ｒ　、Ｉ　　　　Ｐ？）−よびニス・ビー
・スベンソン（Ｒ，Ｍｏ１ｌｂｙ、　Ｇ。

Ｋａｌｌｅｎｉｕｓ、　Ｔ、に、　Ｋｏｒｈｏｎｅｎ、
　Ｊ、　Ｙｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｓ、Ｂ。

５ｖｅｎｓｓｏｎ）、インフエクション（Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ）１１．１９８３．６８頁。

１６、エッチ・レフシーおよびシー・スパンボーグーエ
デン、インフエクシション・アンド・イムニテイ３４．
１９８１．９２０頁；ジー・カレニウス、ニス・ビー・
スベンソン、アール・モルバイ、ビー・セダーグレン、
エッチ・ハルトバークおよびジェイ・ウィンバーブ（Ｇ
、　Ｋａｌｌｅｎｉｕｓ、　Ｓ、Ｂ、　５ｖｅｎｓｓｏ
ｎ、　Ｒ。

Ｍｏ１ｌｂｙ、　Ｂ、　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ、　Ｉｔ、
　Ｉｌｕｌｔｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ。

胃ｉｎｂｅｒｇ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９
ｇ１．６０４頁。

１７、ジー・シー・ハンソン、ケイ・−エイ・カールソ
ン、ジー・ラーソン、エフ・ストロンバーブおよびジェ
イ・スリン（Ｇ、Ｃ，ｌ１ａｎｓｓｏｎ、　Ｋ、−Ａ。

Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｇ、　Ｌａｒｓｓｏｎ、　Ｎ、　
Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｔｈｕｒｉｎ）、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１４６．１９８５．
１５８頁。

１８、エム・ドウボイス、ケイ・エイ・ギルス、ジェイ
・ケイ・ハミルトン、ビー・エイ・レバースおよびエフ
・スミス（Ｍ、　Ｄｕｂｏｉｓ、　Ｋ、Ａ、　Ｇ１１ｌ
ｅｓ、　Ｊ、Ｋ。

１１ａｍｉｌｔｏｎ、　Ｐ、Ａ、　Ｒｅｂｅｒｓ　ａｎ
ｄ　Ｆ、Ｓｍ１ｔｈ）、アナリティカル・ケミストリー
（Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、）２８．１９５６．３５０頁
。

１９、イー・イングバル（Ｅ、　Ｅｎｇｖａｌｌ）、メ
ソッズ・イン９エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７０．４１９頁。

２０、シー・エッチ・セルフ、米国特許出願第３０７６
００号：エイ・ヨハンソン、シー・ジェイ・スタンシー
およびシー・エッチ・セルフ、グレン・キム・アクタ（
ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ）１４８．１９８５．
１１９頁。

２１、エイ・グナーソン、ビー・−エイ・マード、エイ
・ランドブラッドおよびニス・スベンソン（Ａ。

Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ、　Ｐ、−Ａ、　Ｍａｒｄｈ、　
Ａ、　Ｌｕｎｄｂｌａｄ　ａｎｄ　Ｓ、Ｓｖｅｎｇｓｏ
ｎ）、インフェクション・アンド・イムニテイ（Ｉｎｆ
ｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、）４５．１９８４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、高分子担体の修飾例、第２図は、本発明の方
法の好ましい態様を図示したものである。 第３図は、本発明のアッセイの感度（４０５ｎｍにおけ
る吸光度）を、バクテリア濃度の関数として示すグラフ
である。 第４図は、トリサイトフィルムに固定化し、■（Ｃａｌ
−Ｇａｌ）ｎ−ＡＬＰ（左のグラフ）またはミクロビー
ズ（右のグラフ）および■ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ートと共にインキュベートしたＰ−フィムブリエ大腸菌
の検出を示す。 第５図は、第２の循環酵素反応を用いたアッセイ系の感
度増大原理を示す図である。 特許出願人　ソツケルボラゲット・アー・ベー代　理　
人　弁理士　青白　葆　ほか２８第　２　図 結合したディツプスティック 試五で修飾したマクロ ピースを充填したカラム ■　：　　ＧＫＩ（Ｐ−フィムブリエ）・　：　　Ｃ６
００（非Ｐ−フィムブリエ）第４図 （Ｇａｌαｌ−４４Ｇａｌβ−０）ｎ−ＡＬＰ　　　　
（ＡＬＰｉ１度（濃度μｇ／ｚの　　　　　　　　　　
　　　　　１７９／１．Ｑ）口１ＧＫ１　　：　　Ｐ−
フィムブリエ大腸菌（Ｉ０”菌／＋１２）ロツＣ６００
：　　非Ｐ−フィムブリエ大腸菌（Ｉ０”菌／１１１２
）＆ｐＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液） 第５ １′ 有色生成物（赤色） ジアホラーゼ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の細胞、ウイルスもしくは循環体成分または
   それらに対する抗体の存在を検出する方法であって、 ａ）試料を、固体支持体に結合している試薬と接触させ
   、該試薬は、細胞、ウイルスもしくは循環体またはそれ
   らに対する抗体に結合し得、 ｂ）工程ａ）において試料と接触させた、固体支持体に
   結合している試薬を、工程ａ）で使用したものと同じま
   たは異なる試薬と接触させ、該試薬は、検出可能な生成
   物を生成する反応を開始し得る物質が多価結合している
   水不溶性高分子担体に結合しており、または水不溶性高
   分子担体に多価結合した、検出可能な生成物を生成する
   反応を開始し得る物質に結合しており、および ｃ）工程ａ）において試料と接触させ、工程ｂ）におい
   て水不溶性高分子担体結合試薬と接触させた前記固体支
   持体結合試薬を、検出可能な反応生成物の前駆体である
   か、または検出可能な最終生成物を生成するような反応
   を開始し得る化合物と反応させて検出可能な反応生成物
   を得る ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
   した細胞、ウイルスもしくは循環体またはそれらに対す
   る抗体の存在を検出する方法。 ２、試薬は、特定の細胞、ウイルスまたは循環体成分に
   結合し得るものである第１項記載の方法。 ３、工程ｂ）において使用する試薬が、工程ａ）で使用
   する試薬と同じである第１項記載の方法。 ４、試薬は、炭水化物もしくは炭水化物誘導体、ポリペ
   プチド、タンパク質または他の細胞もしくはウイルス表
   面成分または循環体成分、炭水化物もしくは炭水化物誘
   導体、ポリペプチド、タンパク質または他の細胞もしく
   はウイルス表面成分または循環体成分に対する抗体、金
   属コンジュゲートまたは一本鎖オリゴヌクレオチドから
   選択されたものである第１項記載の方法。 ５、炭水化物または炭水化物誘導体が、細胞、ウイルス
   または循環体成分のレセプターである第４項記載の方法
   。 ６、炭水化物または炭水化物誘導体は、ポリサッカライ
   ド、糖脂質、新糖脂質、糖タンパク質または新糖タンパ
   ク質から選択されたものである第４項または第５項記載
   の方法。 ７、工程ａ）において使用する試薬が結合している固体
   支持体がポリマーを含んで成る第１項記載の方法。 ８、固体支持体が、ポリマーが結合するマトリックスを
   含んで成る第７項記載の方法。 ９、ポリマーは、プラスチック、ポリサッカライド、シ
   リコンポリマー、イオン交換樹脂、ポリペプチド、シリ
   カもしくはシリケート、例えばボロシリケート、または
   セルロースから選択されたものである第７項または第８
   項記載の方法。 １０、プラスチックは、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル
   、ポリエチレン、ポリウレタン、ラテックス、ナイロン
   、テフロン、ダクロン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルア
   ルコールまたはそれらの適当なコポリマーから選択され
   たものである第９項記載の方法。 １１、ポリマーが、適宜修飾した官能基を有する第９項
   記載の方法。 １２、固体支持体は、プレート、フィルム、マクロ粒子
   、ディップスティック、フィルターまたは紙の形状であ
   る第１項または第７項記載の方法。 １３、試料は、病原体、非病原体、炭水化物もしくは炭
   水化物誘導体、ポリペプチド、タンパク質または他の細
   胞もしくはウイルス成分、炭水化物もしくは炭水化物誘
   導体、ポリペプチド、タンパク質または他の細胞もしく
   はウイルス成分に対する抗体、または試薬として使用す
   るものと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを含んで成
   る第１項記載の方法。 １４、病原体は、バクテリア、ウイルス、菌類、マイコ
   プラズマもしくはプリオンまたは細菌毒素から選択され
   る第１３項記載の方法。 １５、水不溶性高分子担体は、複数の活性部位を有する
   ポリマーである第１項記載の方法。 １６、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルおよびアシル基またはハライド含有基を含ん
   で成る群から選択される第１５項記載の方法。 １７、高分子担体は、ミクロビーズの形状である第１項
   記載の方法。 １８、ミクロビーズの大きさが０．０５〜２０μｍであ
   る第１７項記載の方法。 １９、ミクロビーズは、ポリマー、例えばプラスチック
   もしくはポリサッカライド、コポリマー、シリコンポリ
   マーもしくは適宜修飾された官能基を有するポリマー、
   ガラス、リボソーム、架橋ポリマーまたはシリカもしく
   はシリケート、例えばボロシリケートを含んで成る第１
   ７項記載の方法。 ２０、ミクロビーズは、複数の活性部位を有する第１９
   項記載の方法。 ２１、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルもしくはアシル基またはハライド含有基を含
   んで成る群から選択される第２０項記載の方法。 ２２、水不溶性高分子担体に多価結合する物質は、酵素
   、抗体および血液凝固因子から選択される第１項記載の
   方法。 ２３、酵素は、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース
   オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、
   ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ルシフェラーゼ、デ
   ヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびリゾ
   チームから選択される第２２項記載の方法。 ２４、工程ａ）および／またはｂ）において抗体を試薬
   として使用する場合、この抗体は、高分子担体に多価結
   合する物質として使用する抗体とは異なるものである第
   ２２項記載の方法。 ２５、血液凝固因子は、フィブリノーゲン（Ｉ）、プロ
   トロンビン（II）、トロンビン（IIａ）、組織性トロン
   ボプラスチン（III）、プロアクセレリン（Ｖ）、促進
   性グロブリン（IV）、プロコンバーチン（・）、抗血友
   病性グロブリン（VIII）、血漿トロンボプラスチン成分
   （IX）、オートプロトロンビンIII（Ｘ）、血漿トロン
   ボプラスチン前駆因子（Ｘ I ）、ハーゲマン因子（Ｘ
   II）およびフィブリン安定化因子（ＸIII）から選択さ
   れる第２２項記載の方法。 ２６、検出可能な反応生成物の前駆体であるか、または
   検出可能な最終生成物を生成する反応を開始し得る化合
   物は、血液凝固因子、抗体または酵素基質を含んで成り
   、これは酵素によって触媒されて、有色、蛍光もしくは
   発光生成物を生成するか、変色を起こすか、または生成
   物の色、蛍光もしくは発光の強度を弱めもしくは強める
   第１項記載の方法。 ２７、酵素基質は、オルトリン酸フェノールフタレーン
   、リン酸チモフタレイン、オルト−ニトロフェニルグリ
   コシド、ナフトール、アニリン、クマリン、テトラゾリ
   ウム色素、ダンシルおよびその誘導体、ＮＡＤＰまたは
   イソチオシアネートから選択される第２６項記載の方法
   。 ２８、ａ）固体支持体は、試薬が結合しているマクロ粒
   子を含んで成り、カラムに充填されているか、または固
   体支持体は、試薬が結合している多孔性フィルターを含
   んで成り、試料を、該カラムまたはフィルターに通し、 ｂ）高分子状担体は、前記と同じまたは異なる試薬を組
   み合わせられ、酵素が多価結合している１〜２０μｍの
   大きさのミクロビーズを含んで成り、該ミクロビーズの
   懸濁液を前記カラムに通し、および ｃ）酵素基質の溶液または懸濁液を前記カラムに通して
   、色、蛍光または発光を起こす ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
   した細胞、ウイルスまたは循環体の試料中における存在
   を検出する第１〜１２項および第１５〜２７項のいずれ
   かに記載の方法。 ２９、ａ）固体支持体は、試薬が結合しているディップ
   スティックまたはフィルムを含んで成り、該ディップス
   ティックまたはフィルムを試料に浸漬し、 ｂ）該ディップスティックまたはフィルムを、前記と同
   じまたは異なる試薬を組み合わせられ、酵素が多価結合
   している０．０５〜１０μｍの大きさのミクロビーズを
   含んで成る高分子状担体と接触させるために、該ミクロ
   ビーズの懸濁液に浸漬し、および ｃ）ディップスティックまたはフィルムが、細胞、ウイ
   ルスまたは循環体成分高濃度下で不透明になり、または
   ディップスティックを酵素基質の溶液または懸濁液に浸
   漬すると、色、蛍光または発光が起きる ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
   した細胞、ウイルスまたは循環体成分の試料中における
   存在を検出する第１〜１２項および第１５〜２７項のい
   ずれかに記載の方法。 ３０、ａ）固体支持体は、要すればウェルのある、試薬
   が結合しているフィルムまたはプレートを含んで成り、
   試料を、該フィルムまたはプレートに適用し、試料中の
   細胞、ウイルスまたは循環体成分が結合するのに要する
   時間後に除去し ｂ）高分子状担体は、前記と同じまたは異なる試薬を組
   み合わせられ、酵素が多価結合している１〜２０μｍの
   大きさのミクロビーズを含んで成り、該ミクロビーズの
   懸濁液を、前記フィルムまたはプレートに適用し、試料
   中の細胞、ウイルスまたは循環体成分が結合するのに要
   する時間後に除去し、および ｃ）酵素基質の溶液または懸濁液を前記フィルムまたは
   プレートに適用することによって、色、蛍光または発光
   を起こす ことによって、工程ａ）およびｂ）において試薬と結合
   した細胞、ウイルスまたは循環体成分の試料中における
   存在を検出する第１〜１２項および第１５〜２７項のい
   ずれかに記載の方法。 ３１、試料中の細胞、ウイルスまたは循環体成分が結合
   する前後に測定したミクロビーズ量を差し引くことによ
   って、工程ａ）において試薬に結合する細胞、ウイルス
   または循環体成分の量を定量する第２８〜３０項のいず
   れかに記載の方法。 ３２、ａ）細胞、ウイルスもしくは循環体成分またはそ
   れらに対する抗体に結合し得る試薬に組み合わせられ、
   検出可能な生成物を生成する反応を開始し得る物質が多
   価結合しているか、またはｂ）検出可能な生成物を生成
   する反応を開始し得る物質であって、前記試薬を組み合
   わせ、られた物質が多価結合している水不溶性高分子担
   体。 ３３、試薬は、特定の細胞またはウイルス成分に結合し
   得るものである第３２項記載の担体。 ３４、試薬は、炭水化物もしくは炭水化物誘導体、ポリ
   ペプチド、タンパク質または他の細胞もしくはウイルス
   表面成分または循環体成分、炭水化物もしくは炭水化物
   誘導体、ポリペプチド、タンパク質または他の細胞もし
   くはウイルス表面成分または循環体成分に対する抗体、
   金属コンジュゲートまたは一本鎖オリゴヌクレオチドか
   ら選択されたものである第３２項記載の担体。 ３５、炭水化物または炭水化物誘導体が、細胞、ウイル
   スまたは循環体成分のレセプターである第３４項記載の
   担体。 ３６、炭水化物または炭水化物誘導体は、ポリサッカラ
   イド、糖脂質、新糖脂質、糖タンパク質または新糖タン
   パク質から選択されたものである第３４項または第３５
   項記載の担体。 ３７、高分子担体は、複数の活性部位を有するポリマー
   である第３２項記載の担体。 ３８、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルおよびアシル基を含んで成る群から選択され
   る第３７項記載の担体。 ３９、高分子担体は、ミクロビーズの形状である第３２
   項記載の担体。 ４０、ミクロビーズの大きさが０．０５〜２０μｍであ
   る第３９項記載の担体。 ４１、ミクロビーズは、ポリマー、例えばプラスチック
   もしくはポリサッカライド、コポリマー、シリコンポリ
   マーもしくは適宜修飾された官能基を有するポリマー、
   ガラス、リボソーム、架橋ポリマーまたはシリカもしく
   はシリケート、例えばボロシリケートを含んで成る第３
   ９項記載の担体。 ４２、ミクロビーズは、複数の活性部位を有する第４１
   項記載の担体。 ４３、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルまたはアシル基を含んで成る群から選択され
   る第４２項記載の担体。 ４４、試薬を結合するか、または高分子担体に多価結合
   する物質は、酵素、抗体および血液凝固因子から選択さ
   れる第３２項記載の担体。 ４５、酵素は、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース
   オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、
   ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ルシフェラーゼ、デ
   ヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびリゾ
   チームから選択される第４４項記載の担体。 ４６、血液凝固因子は、フィブリノーゲン（Ｉ）、プロ
   トロンビン（II）、トロンビン（IIａ）、組織性トロン
   ボプラスチン（III）、プロアクセレリン（Ｖ）、促進
   性グロブリン（VI）、プロコンバーチン（VII）、抗血
   友病性グロブリン（VII）、血漿トロンボプラスチン成
   分（ I Ｘ）、オートプロトロンビンIII（Ｘ）、血漿ト
   ロンボプラスチン前駆因子（Ｘ I ）、ハーゲマン因子
   （ＸII）およびフィブリン安定化因子（ＸIII）から選
   択される第４４項記載の担体。 ４７、ａ）細胞、ウイルスもしくは循環体成分またはそ
   の抗体と結合し得る、固体支持体に結合している試薬、
   および ｂ）検出可能な生成物を生成する反応を開始し得、水不
   溶性高分子担体に多価結合している物質と組み合わせら
   れ、または検出可能な生成物を生成する反応を開始し得
   る物質が多価結合している水不溶性高分子担体に組み合
   わせられた前記と同じまたは異なる試薬 を含んで成る診断用組成物。 ４８、試薬は、特定の細胞、ウイルスまたは循環体成分
   に結合し得るものである第４７項記載の組成物。 ４９、工程ｂ）において使用する試薬が、工程ａ）で使
   用する試薬と同じである第４７項記載の組成物。 ５０、試薬は、炭水化物もしくは炭水化物誘導体、ポリ
   ペプチド、タンパク質または他の細胞もしくはウイルス
   表面成分または循環体成分、炭水化物もしくは炭水化物
   誘導体、ポリペプチド、タンパク質または他の細胞もし
   くはウイルス表面成分または循環体成分に対する抗体、
   金属コンジュゲートまたは一本鎖オリゴヌクレオチドか
   ら選択されたものである第４７項記載の組成物。 ５１、炭水化物または炭水化物誘導体が、細胞、ウイル
   スまたは循環体成分のレセプターである第５０項記載の
   組成物。 ５２、炭水化物または炭水化物誘導体は、ポリサッカラ
   イド、糖脂質、新糖脂質、糖タンパク質または新糖タン
   パク質から選択されたものである第５０項または第５１
   項記載の組成物。 ５３、工程ａ）において使用する試薬が結合している固
   体支持体がポリマーを含んで成る第４７項記載の組成物
   。 ５４、固体支持体が、ポリマーが結合するマトリックス
   を含んで成る第５３項記載の組成物。 ５５、ポリマーは、プラスチック、ポリサッカライド、
   シリコンポリマー、イオン交換樹脂、ポリペプチド、シ
   リカもしくはシリケート、例えばボロシリケート、また
   はセルロースから選択されたものである第５３項または
   第５４項記載の組成物。 ５６、プラスチックは、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル
   、ポリエチレン、ポリウレタン、ラテックス、ナイロン
   、テフロン、ダクロン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルア
   ルコールまたはそれらの適当なコポリマーから選択され
   たものである第５５項記載の組成物。 ５７、ポリマーが、適宜修飾した官能基を有する第５５
   項記載の組成物。 ５８、固体支持体は、プレート、フィルム、マクロ粒子
   、ディップスティック、フィルターまたは紙の形状であ
   る第４７項または第５３項記載の組成物。 ５９、高分子担体は、複数の活性部位を有するポリマー
   である第４７項記載の組成物。 ６０、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルおよびアシル基を含んで成る群から選択され
   る第５９項記載の組成物。 ６１、水不溶性高分子担体は、ミクロビーズの形状であ
   る第４７項記載の組成物。 ６２、ミクロビーズの大きさが０．０５〜２０μｍであ
   る第６１項記載の組成物。 ６３、ミクロビーズは、ポリマー、例えばプラスチック
   もしくはポリサッカライド、コポリマー、シリコンポリ
   マーもしくは適宜修飾された官能基を有するポリマー、
   ガラス、リボソーム、架橋ポリマーまたはシリカもしく
   はシリケート、例えばボロシリケートを含んで成る第６
   １項記載の組成物。 ６４、ミクロビーズは、複数の活性部位を有する第６３
   項記載の組成物。 ６５、活性部位は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、アミ
   ド、シアノ、イミノ、イミド、ケト、エポキシ、ニトロ
   、エステルまたはアシル基を含んで成る群から選択され
   る第６４項記載の組成物。 ６６、試薬を結合するか、または高分子担体に多価結合
   する物質は、酵素、抗体および血液凝固因子から選択さ
   れる第４７項記載の組成物。 ６７、酵素は、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース
   オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、
   ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ルシフェラーゼ、デ
   ヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびリゾ
   チームから選択される第６６項記載の組成物。 ６８、工程ａ）および／またはｂ）において抗体を試薬
   として使用する場合、この抗体は、高分子担体に多価結
   合する物質として使用する抗体とは異なるものである第
   ６６項記載の組成物。 ６９、血液凝固因子は、フィブリノーゲン（ I ）、プ
   ロトロンビン（II）、トロンビン（IIａ）、組織性トロ
   ンボプラスチン（III）、プロアクセレリン（Ｖ）、促
   進性グロブリン（VI）、プロコンバーチン（VII）、抗
   血友病性グロブリン（VIII）、血漿トロンボプラスチン
   成分（ I Ｘ）、オートプロトロンビンIII（Ｘ）、血漿
   トロンボプラスチン前駆因子（Ｘ I ）、ハーゲマン因
   子（ＸII）およびフィブリン安定化因子（ＸIII）から
   選択される第６６項記載の組成物。 ７０、固体支持体は、試薬が結合している複数のディッ
   プスティックを含んで成り、各ディップスティックまた
   はディップスティックのサブグループには異なる試薬が
   供給されており、各試薬は異なる細胞、ウイルスもしく
   は循環体成分またはその抗体に結合し得る第４７〜６９
   項のいずれかに記載の組成物。 ７１、固体支持体は、試薬が結合するウェルを複数個有
   するマイクロタイタープレートを含んで成り、各ウェル
   またはウェルのサブグループには異なる試薬が入ってお
   り、各試薬は異なる細胞、ウイルスもしくは循環体成分
   またはその抗体に結合し得る第４７〜６９項のいずれか
   に記載の組成物。