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JPS622161A - アミロイド物質の分析方法及びそのためのキツト - Google Patents

アミロイド物質の分析方法及びそのためのキツト

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Publication number
JPS622161A
JPS622161A JP61147220A JP14722086A JPS622161A JP S622161 A JPS622161 A JP S622161A JP 61147220 A JP61147220 A JP 61147220A JP 14722086 A JP14722086 A JP 14722086A JP S622161 A JPS622161 A JP S622161A
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JP
Japan
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sap
saa
carrier
group
ions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP61147220A
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English (en)
Inventor
ダン　セルバン
クリスティアン　ロルドルフ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy AG filed Critical Ciba Geigy AG
Publication of JPS622161A publication Critical patent/JPS622161A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、血清アミロイドＡ蛋白質（Ｓ　Ａ　Ａ）及
び血清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）の免疫学的分析法
、そのためのキット、並びにＳＡＡ及びＳＡＰの精製方
法に関する。
〔従来の技術〕
はとんどの態様での組織の損傷、感染又は炎症の後、多
数の血漿蛋白質の濃度が上昇し、そして次に治癒又は回
復に従って再び正常に戻る。この過程は急性期反応とし
て知られている。慢性炎症を有する個体においては高（
ルヘルの幾つかの急性期蛋白質が存在し続ける。
急性期反応体の例としてＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）及
び血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）が挙げられる。Ｓ
ＡＡは１１　、５００〜１４，０００ダルトンの分子量
の単一ポリペプチド鎖から成るα１グロブリンである。
健康な個体においては約１μｇ／ｍβ又はそれより低い
その血漿濃度が、組織の損傷又は炎症刺激への暴露の後
数日の間に実質的に上昇する。分子ｆｆ１２３５．００
０ダルトンの９．５Ｓα。
糖蛋白質である血清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）は急
性期反応体ＣＲＰと関連する。マウスＳへＰ濃度は炎症
において実質的に上昇するが、ヒトＳＡＰは、幾つかの
慢性炎症性疾患及び悪性疾患において中程度に上昇する
場合があるにしても主要な急性期反応体ではない（Ｍ、
Ｂ、Ｐｅｐｙｓ、Ｃ１１ｎｉｃｓｉｎ　１ｍｍｕｎｏ１
ｇｙ　ａｎｄ　Ａｌｌｅｒｇｙ、　Ｖｏｌ　　１　、　
ｐ７７−１０１（１９８１）　）。
ＳＡＰ及びＳＡＡは活性化されたマクロファージからの
刺激の後肝細胞により合成される。ＳＡＡ及びＳＡＰ誘
導因子は、モノ力イン・インターロイキン−１と同一で
はないにしても類似していることが示されている。
ＳＡＡ及びＳＡＰはそれぞれアミロイドＡ繊維及びアミ
ロイドＰ−成分と免疫学的に同一であり、すべてのアミ
ロイド−シス沈着の成分として見出される。アミロイド
−シスは慢性炎症に対して二次的に生ずる疾患である。
急性期蛋白質、すなわちＣＲＰ及びＳＡＡ、並びにＳＡ
Ｐの濃度及び比率の変化は、多数の急性及び慢性炎症性
疾患、例えばリウマチ状態、リウマチ性関節炎、若年性
多発関節炎、強直性を椎炎、ライチル症候群、乾唐性関
節炎又はリウマチ熱、脈管炎症候群、クロン病、自己免
疫状態、例えば全身性紅斑性狼癒又は多節炎、悪性疾患
、移植拒絶等の診断及び管理の目的のために重要である
。
急性期蛋白質及び関連蛋白質の変化を測定するための通
常の試験は、最近まで、赤血球沈澱速度であった。この
試験は安価であり且つ容易に実施されるが、しかし間接
的な方法であり、あまり正確ではなく、しかもあまり再
現性が良くない。これらの蛋白質に対して向けられた抗
血清の開発により、現在、急性期反応の個々の成分を測
定し、そして診断目的のための有益な情報を得ることが
可能である。ＣＲＰは従来から最も広範に測定されてい
る急性期反応体であり、そして現在なおそうである。し
かしながら、最近のデーターは、ＳＡＡ′ｌＪ＜ＣＲＰ
よりも鋭敏な炎症のマーカーであることを示唆している
（Ｒ，Ｅ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ　　等、Ａｎｎａｌｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ　ＤｉｓｅａｓｅｓＳ
４２．６６５（１９８３）　〕。すべての急性期蛋白質
が平行して生ずるとは限らないこと、及び他の有益な情
報が血漿中のＳＡＰレヘルの評価から得られることも明
らかになりつつある。
〔発明が解決しようとする問題点〕
ＳＡＡの定量のための既知の技法は基本的にはラジオイ
ムノアッセイ　（ＲＩＡ）及びエンザイム−リンクド・
イムノソルベントアッセイ　（ＥＩｊＳＡ）であるＣＧ
、Ｍａｒｈａｕｇ、５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　１８．３２９（１９８３）　）。これらのアッセイ方
法は、その現在の形ではあまり鋭敏ではなく、そして高
い再現性を欠く。従って、０．１μｇ　／　ｍｌ　〜２
０００μｇ　／　ｍＡの全濃度範囲で、単純で安全な試
薬を用いて少量の血清中のＳＡＡを測定することを可能
にする一層鋭敏で確実なアッセイ法の必要性が存在する
。
ＳＡＰは通常、ロケット免疫電気泳動により、間接的競
争ＥＬｒＳＡ（多量の精製されたＳＡＰを必要とする）
により、又は競争ＲＩＡ（放射性物質の調製及び取扱を
必要とする）により測定される。
これらの技法はいずれも十分に鋭敏ではなく、そして多
量の血清を必要とし日常的分析を繁雑なものとする。従
って、血清中１μｇ　／　ｍ　ｌ　＝　１００μｇ／ｍ
ｌｌの濃度範囲において、安全で且つ再現性ある方法で
、少量の血清中のＳＡＰの測定を可能にする鋭敏な方法
が望まれている。
以下余白 〔問題点を解決するための手段〕 驚くべきことに、血清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）が
カルシウムイオン又は関連２価イオン、例えば亜鉛イオ
ンもしくは第二銅イオンの存在下でプラスチック表面に
結合し、そしてさらに効果的には、カルシウムイオン又
は関連２価イオンの存在下で、ニトロ化されたフェニル
基を担持する有機又は無機担体に結合することが見出さ
れた。さらに、血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）が、
任意的にカルシウムイオン、亜鉛イオン又は関連２価イ
オンの存在下又は非存在下で、プラスチック表面に結合
し、そしてさらに効果的には、ニトロ化されたフェニル
基を担持する有機又は無機担体に結合することが見出さ
れた。大過剰の無関係の蛋白質の存在下での、プラスチ
ック表面及びニトロ化されたフェニル基を担持する担体
へのＳＡＡ及びＳＡＰの選択的結合がこの発明のＳＡＡ
及びＳＡＰの免疫学的分析方法の基礎である。
この発明は、血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）及び／
又は血清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）の免疫学的分析
方法に関し、この方法はＳＡＡ及びＳＡＰを担体のプラ
スチック表面又はニトロ化されたフェニル基を担持する
担体へ結合せしめ、この場合、ＳＡＰの結合のためには
カルシウム又は関連２価イオンを存在せしめることを特
徴とする特に、この発明は、適当な担体、例えばミクロ
タイタープレート、試験管、シート、ビーズ等のプラス
チック表面をＳＡＡ及び／又はＳＡＰを含有する溶液と
共に、カルシウムイオン又は関連２価イオン、例えば亜
鉛イオンもしくは第二銅イオンの存在下でインキュベー
トするか、あるいは追加のイオンの不存在下で、ＳＡＡ
を含有する溶液と共にインキュベートし、そしてそれ自
体既知の通常のイムノアッセイ技法のいずれかにより、
プラスチック表面に結合したＳＡＡ及びＳＡＰを検出し
そして定量することを特徴とする免疫学的分析方法に関
する。
この発明は特に、適当な担体、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレンもしくはポリ塩化ビニルのタイタープレー
トもしくは試験管の表面、ガラスもしくはプラス千ツク
製ビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸セルロースも
しくはニトロセルロースのシート等をニトロ化されたフ
ェニル基ヲ担持する化合物でコートし、そしてカルシウ
ムイオンの存在下でＳＡＡ及び／又はＳＡＰを含有する
溶液と共にインキュベートするか、あるいはカルシウム
イオンの不存在下でＳＡＡを含有する溶液と共にインキ
ュベートし、そしてそれ自体既知の通常のイムノアッセ
イ技法のいずれかにより担体に結合したＳＡＡ及びＳＡ
Ｐを検出しそして定量することを特徴とする免疫学的分
析方法に関する。
ニトロ化されたフェニル基を担持する化合物はポリペプ
チド、例えばアルブミン、例えばウシ血清アルブミン、
キーホールリンペット・ヘモシアニン、カゼイン、グロ
ブリン等、ポリサッカライド、例えばデキストラン、澱
粉、ゼラチン又はセルロース、あるいは合成ポリマー、
例えばポリアクリルヒドラジドである。ニトロ化された
フェニル基は、０−ｌｍ−もしくはｐ−ニトロフェニル
基、ジニトロフェニル基、例えば２，４−もしくは３゜
５−ジニトロフェニル基、又はトリニトロフェニルｉ、
例えば２，４．ｅ−トリニトロフェニル基である。
この発明の免疫学的分析の方法において、トリニトロフ
ェニル基、例えば２，４．６−トリニトロフェニル基を
担持する化合物、特に２，４．６−トリニトロフェニル
基を担持するキーホールリンペット・ヘモシアニンによ
りコートされた担体が特に好ましい。この好ましい担体
への効果的な結合は過剰の無関係の蛋白質の存在下にお
いても観察される。
担体に結合したＳＡＡ又はＳＡＰを検出しそして定量す
る免疫学的技法は当業界においてよく知られており、そ
して例えば酵素免疫測定、ラジオイムノアッセイ、又は
イムノフルオレッセンスアッセイにおいて典型的に使用
されるものである。
特に、結合したＳＡＡ及び／又はＳＡＰを担持する担体
をＳＡＡ又はＳＡＰに特異的な抗血清又はモノクローナ
ル抗体で処理する。このモノクローナル抗体又は抗血清
のポリクローナル抗体は、例えば放射性同位元素、酵素
又は螢光化合物により適切にラベルすることができ、そ
して直接的に、又は適当な酵素基質により発色した後に
測定することができる。あるいは、ラベルされていない
抗血清又は゛モノクローナル抗体を、適切にラベルされ
た第２抗体、好ましくは第１抗血清又はモノクローナル
抗体が由来する動物種の免疫グロブリンに対するポリク
ローナル抗血清により検出する。
免疫学的分析のこれらの原理の多くの変法が当業界にお
いて知られており、そしてこの発明は特定の化合物の検
出のための異る日常的方法に従うアッセイ法も包含する
。
免疫学的分析の好ましい方法はエンザイム・リンクド・
イムノアドソルベントアソセイ　（ＥＬＴＳＡ）であり
、この方法においては、担体をニトロ化されたフェニル
基、好ましくはトリニトロフェニル基を担持するポリペ
プチド、ポリサッカライド又は合成有機ポリマーにより
コートし、次にカルシウムイオンの存在下でＳＡＡ及び
／又はＳＡＰを含有する溶液と共にインキュベートする
か、あるいはカルシウムイオンの非存在下でＳＡＡを含
をする溶液と共にインキュベートし、次にＳＡＡ又はＳ
ＡＰに結合する特異的抗血情交はモノクローナル抗体の
溶液と共にインキュベートする。次に、結合したモノク
ローナル抗体又は抗血清のポリクローナル抗体を、第１
抗血清又はモノクローナル抗体が由来する動物種の免疫
グロブリンに対するポリクローナル抗血清中に含有され
る第２抗体により検出する。この場合、第２抗体は酵素
と接合している。第２の酵素接合抗体の結合量は酵素基
質による発色により可視化され、そして測定される。酵
素ラベル抗体の他に、アビジン−酵素接合体と共に抗体
−ビオチン接合体を使用することもできる。
この発明の方法において有用な酵素の例は、ホースラデ
ィツシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデ
ヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ又はウレアーゼである。好ましい酵素は、例
えば酵素基質５−アミノサリチル酸、０−フェニレンジ
アミン、３，３′−ジメトキシベンジジン、３．３’、
５．５’−テトラメチルヘンジジン又は２，２′−アジ
ノービス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホ
ン酸）等及び過酸化水素により発色し得るホースラディ
ツシュ・パーオキシダーゼ、並びに例えば酵素基質ｐ−
ニトロフヱニルホスフェートからｐ−二トロフェノール
を放出するアルカリ性ホスファターゼである。
この発明の好ましいラジオイムノアッセイ又は好ましい
イムノフルオレッセンスアッセイにおいて、好ましいＥ
ＬＩＳＡについて上に記載したのと同じ段階を行うが、
但し第２抗体がそれぞれ例えば＋２５１により放射性ラ
ベルされているか、又は螢光物質、例えばフルオレッセ
ンス接合しており、そして酵素基質による発色が省略さ
れる。
ここに記載するイムノアッセイは、血清、特にヒト血清
中のＳＡＡ及び／又はＳＡＰの量を、日常的に、０．１
ｍＡ以下の全血から調製された少量の血清を用いて決定
するために使用することができ、急性及び慢性の炎症性
疾患の医療的処置の診断及び管理が促進される。
この発明はまた、ＳＡＡ及び／又はＳＡＰの定性的及び
定量的測定のための試験キットに関し、このキットは前
記のイムノアッセイのために適当な抗体及び試薬を含ん
で成る。
ＥＬＩＳＡのためのこの発明の試験キットは、例えば、
担体、例えばプラスチック表面を有する担体、又はニト
ロフェニル基、好ましくはトリニトロフェニル基を担持
するポリペプチド、ポリサッカライドもしくは合成有機
ポリマーでコートされた担体、場合によってはニトロフ
ェニル基、好ましくはトリニトロフェニル基を担持する
化合物の溶液、ＳＡＡ又はＳＡＰを結合するモノクロー
ナル抗体又はポリクローナル抗体の溶液、及び前記第１
抗体が酵素によりラベルされていない場合には該第１抗
体と結合するポリクローナル酵素接合第２抗体の溶液、
固体又は溶解した形の酵素基質、ＳＡＡ及び／又はＳＡ
Ｐの標弔溶液、緩衝溶液、及び場合によっては、固体又
は溶解した形のカルシウム塩又は関連２価塩、例えば亜
鉛塩もしくは第二銅塩、及び場合によってはピペット、
反応容器、換算曲線、色度表等を含む。溶液は、使用前
に水又は緩衝液による稀釈を必要とする濃縮形又は凍結
乾燥形であってもよい。
好ましい試験キットは、トリニトロフェニル基を担持す
るポリペプチドによりコートされた担体、例えば２，４
．６−トリニトロフェニル基を担持するキーホールリン
ペット・ヘモシアニンによりコートされた担体を含む。
ラジオイムノアッセイ又はイムノフルオレッセンスアッ
セイのためのこの発明の試験キットは、前記と同じ担体
、試薬及びハードウェアーを含むが、しかし酵素接合抗
体及び酵素基質の代りに、それぞれ放射性ラベルされた
抗体又は螢光物質と接合した抗体を含む。
この発明はさらに、ニトロ化されたフェニル基を担持す
る固体単位上でのアフィニティークロマトグラフィーに
よるＳＡＡ及び／又はＳＡＰの精製方法に関する。
無機又は有機の担体材料、例えば適切に官能化された形
の珪酸塩、架橋されたアガロース、デキストラン、ポリ
アクリルアミド又はポリアクリルヒドラジドを、それ自
体既知の方法により、ニトロ化されたフェニル基好まし
くはトリニトロフェニル基を導・入する試薬と反応せし
める。例えば、反応性カルボニルヒドラジド官能基を含
有する担体材ｌＬヲ２　、４　、６−１−リニトロヘン
ゼンスルホン酸と反応せしめてトリニトロフェニル基を
導入し、又は２．４−ジニトロフルオロベンゼンと反応
せしめてジニトロフェニル基を導入する。他方、反応性
エステル官能基、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド
エステル基を含有する担体材料をｐ−ニトロフェニルヒ
ドラジン又はｐ−ニトロアニリンと反応せしめてニトロ
フェニル基を導入する。
好ましい担体材料は、トリニトロフェニル基、例えば２
　、４．　、６−　トリニトロフェニル基を担持する架
橋されたアガロースから成る。
ニトロ化されたフェニル基を担持するこのような担体を
、カルシウムイオン又は関連２価イオン、例えば亜鉛イ
オンもしくは第二銅イオンを含有する適当な水性溶剤、
例えば塩化カルシウムを含有する塩溶液、又は塩化カル
シウムを含有する緩衝液、例えば’ｌ’ｒｉｓ　（）リ
　〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）で緩衝化された
塩化カルシウム含有食塩溶液中に懸濁する。ＳＡＰを含
有する溶液、例えば血清又は他の生物学的液体をカルシ
ウム塩、例えば塩化カルシウム、又は関連２価イオンを
含有する塩で処理し、そして次に、例えばこれを担体を
収容するカラムの頂部に注入しそして重力又は外部圧に
より担体中を流過せしめることにより担体と接触せしめ
る。ＳＡＰは担体上に保持され、そして未結合蛋白質及
び他の不純物はカルシウムイオン又は類似の２価イオン
を含有する溶液、例えば塩化カルシウムを含有するＴ　
ｒ　ｉ　ｓ　Ｆｔ衝化塩溶液により洗浄除去する。イオ
ンキレート化剤を含有する適当な水性溶液、例えばエチ
レンジアミン四酢酸又は関連キレート化化合物を含有す
る塩溶液又はＴｒｉｓ緩衝化塩溶液、水性酸、あるいは
ｐ）１５以下例えばおよそｐ１１３の緩衝液、又はｐ−
二トロフェニルアルソン酸を含有する緩衝液により溶出
する。
ＳＡＡの精製のためには、ニトロ化されたフェニル基を
担持する担体を好ましくは亜鉛塩、例えば塩化亜鉛によ
り処理し、そして次に緩衝液で洗浄し、その後これにＳ
ＡＡ含有溶液、例えば血清を適用する。ＳＡＡは担体上
に保持され、他方他の蛋白質及び不純物は水性塩溶液、
例えば緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝化塩溶液により洗浄
除去する。洗剤を含有する水性溶液、例えば０．０１％
〜２％のポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテ
ル、ポリエチレングリコールアルキルフェノールエーテ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又は
イオン性洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムを含有す
るＴｒｉｓ緩衝化塩溶液により、あるいは水性酸又はｐ
１１５以下、例えばｐＨ３の緩衝液により溶出する。
場合によっては、この精製方法は、ニトロ化されたフェ
ニル基を担持する固体担体上で、しかしカルシウムイオ
ン、亜鉛イオン又は関連２価イオンの非存在下で、ＳＡ
、Ａ及び／又はＳＡＰ含有溶液を前処理することにより
、あるいは汚染物、例えば免疫グロブリンに対して特異
的な抗体を担持する免疫吸着担体により前処理又は後処
理することにより改良することができる。
ＳＡＡ及びＳＡＰはそれ自体既知の方法、例えばセファ
デックス上でのクロマトグラフィー、透析、電気泳動濃
縮等により精製された溶液がら単離される。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するもではない。
夷号 ＢＳ八　　　ウシ血清アルブミン ＤＮＰ　　　ジニトロフェノール ＥＤ’ｒＡ　　　エチレンジアミン−Ｎ　、　Ｎ　、　
Ｎ　’　、　Ｎ　’−四酢酸 ＥＧＴＡ　　　１．２−ジ（２−アミノエトキシ）エタ
ン−Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ　’　、　Ｎ　’−四酢酸ＥＬ
ＩＳ八へエンザイムーリンクド・イムノソルベント・ア
ッセイ ＦＳＣフルオレノセイニル Ｉｇ　　　　免疫グロブリン ＫＬＨキーホールリンペット・ヘモシアニンＰＡＩ＋　
　　ポリアクリルヒドラジドＰＣホスホリルクロリン ＳＡ４　　　血清アミロイドＡ蛋白質 ＳＡＰ　　　血清アミロイドＰ−成分 子ＢＳ　　　Ｔｒｉｓｉｌ衝化塩溶液 ＴＮＰ　　　　）リニトロフェニル Ｔｒｊｓ　　　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 肛　ＴＮＰで沃炉　乙されたポリペプチド６５％の硫酸
アンモニウム中ＫＬＨのスラリー（１８ｍｇ／ｍ＃、カ
ルビオケムーベーリング、う・ジョラ、ＣＡ、米国）１
１ｍｌを４ｍｌの水で稀釈し、０．１５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！
　／　２５　ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯｓに対して透析し、次
に２，０００　Ｘ　ｇにて１０分間遠心する。上清を０
．１　Ｍ　ＮａＨＣＯｚにて２５ｍ！！に稀釈し、そし
てその半分（１２，５ｍｊ２．８　ｍ　ｇ　／　ｍｌ！
のＫＬＨ）を、１ｍＡの０．３　Ｍ　ＮａＨＣＯ＋中１
２ｍｇの２．４．６−ドリニトロベンゼンスルホン酸（
フル力、プツチ、スイス）の溶液と混合する。暗中３７
℃にて４時間開いた後、混合物を２５ｍＭのＮａＨＣＯ
３を含有する塩溶液に対して透析し、そして０．４５μ
ｍのフィルター（ミレ・７クスー１（Δ−フィルター、
ミリホア）を通して濾過する。得られる接合体は、１０
０，０００ダルトンのＫ　Ｌ　Ｈ当り４３個のＴＮＰ残
基を含有し、そして長時間にわたり劣化することなく凍
結状態で保持され得る。
同様にして、ＴＮＰ−［ＩＳＡをＢＳＡ　（メルク、ダ
ルムスタソト、西独）及び２，４．６−ドリニトロベン
ゼンスルホン酸から調整する。ＢＳＡ分子当り１５個の
ＴＮＰ残基を有する接合体が得られる。
炭（ＳＡＰのためのＥＬＩＳＡ 平底ポリスチレンミクロタイタープレート（イムロン、
グイナテソク、ラグ、スイス）又はボリ塩化ビニルミク
ロタイタープレート（ミクロテストｍ、ヘクトン・ディ
・ノキンソン、オクスナルド、ＣＡ、ＵＳＡ）のウェル
を、ｉｏｏμｌの０．３ＭＮａＨＣＯｔのみ、１００　
ｐ　ｌの０．３　Ｍ　Ｎａ）ｌｃＯ＋中２μｇ／ｍｌｌ
のＫＬ）（、又は１００　ｐ　ｊ！の０．３　Ｍ　Ｎａ
ＨＣＯ。
中２ｔｔｇ／ｍ、１のＴＮＰ−にＬｌｌ（例１）と共に
１時間以上室温にてインキュベートする。ＴＮＰ−ＫＬ
Ｉ（でコートされたプレートは熱空気ブロワ−を用いて
乾燥させた後結合能力の喪失を伴わないで室温にて貯蔵
することができる。プレートを５　ｍ　Ｍ　ＣａＣ１。
で洗浄し、そして１００μｌずつのヒトＳＡＰ含有サン
プル（標準溶液又はＥＬＩＳＡ緩衝液中血清稀釈物と共
に２０℃にて２時間インキュベートする。
ＥＬＩＳＡ緩衝液は０．５％ＢＳＡ、０．０５％メルチ
オレート（チメロサール）及び５　ｍＭ　ＣａＣ１ｚを
含有するＴ　Ｂ　Ｓ　　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
！　、　ｐＨ７，８，０，１４Ｍ　ＮａＣ７！　）から
成る。プレートを５　ｍ　Ｍ　Ｃａ（Ｊ　２で洗浄し、
２０°Ｃにて２時間、ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：１０４に
稀釈したヒトＳＡＰ　（カルビオケム）に対するラビッ
ト抗血清１００μｌと共にインキュベートし、そして水
飽和雰囲気中２０℃にて一夜、ホースラディツシュ・パ
ーオキシダーゼと接合したロバ抗−ラビットＩｇ抗体（
アメルシャム社、アメルシャム、英国）１００μｍ　（
ＥＬＩＳＡ緩衝液により１　：５０００で稀釈したもの
）とインキュベートする。
プレートを洗浄し、次に０．０３％の１（２０□を含有
する緩衝化された０−フェニレンジアミン（４８，６ｍ
ｌの０．１Ｍクエン酸及び５１．４ｍｌの０．２　Ｍ　
ＮａＪＰＯイｐＨ５，０中１００ｍ　ｇ　）１００　ｉ
ｔ　ｌ　／ウェルにより暗中で２０℃にて１５分間発色
せしめる。２５μｉの２、５　Ｍ　１ｈｓＯ，を添加す
ることにより反応を停止し、そして酵素反応により生じ
た色の濃度をタイターチック・マルチスキャン・分光光
度針（フローラボラドリース）を用いて４９２　ｎ、ｍ
にて測走する。
マウスＳＡＰに対する対応する抗血清を使用すれば、同
じ方法をマウスＳＡＰの検出のために使用することがで
きる。
ＳＡＰはＣａ”　イオンで処理した後ポリスチレン及び
ポリ塩化ビニル表面に結合する。プラスチック表面をト
リニトロフェニル化された巨大分子、例えばＴＮＰ−Ｋ
ＬＨによってコートすることにより一層効果的な結合が
得られる（第１表）。
すべてのインキュヘーション溶液及び洗浄溶液中に０．
２５ｍＭ以上のＣａ（１”２の存在が必須である。
０．１２ｍ　Ｍ　ＣａＣｊ！　２を用いる場合、ＳＡＰ
の結合のシャープな減少が観察され、そしてＯ，０６ｍ
Ｍ以下のＣａＣ１ｚ？ａ度においてはＳＡＰは結合しな
い。
コートされていない（Ｃａ”処理はされている）プラス
チック表面、ＨＬＨがコートされたプラスチック表面、
及びＴＮＰ−ＫＬＨがコートされたプラスチック表面へ
の精製ヒトＳΔＰの結合 以下余白 第１図は、ＴＮＰ−ＫＬＩＩでコートされたポリスチレ
ンプレートを用いる場合、ＳＡＰ濃度に対する光学濃度
の直線的依存性が０．５〜Ｌｏｎｇ／ｍ！！の範囲にお
いて得られることを示している。従って、このアッセイ
法の感受性は、１〜２Ｘ１０’稀釈までの、正常ヒト血
清中のＳＡＰの確実な検出を可能にする。
ＳＡＰについてのＥＬＩＳＡの好ましい変法においては
、ＴＮＰ−ＫＬＨによりコートされたポリスチレンミク
ロタイタープレートを用いる。
炎主　」影旦ｙ遠Ｊ藁３藁ｊ１支先ム上例２に記載した
エンザイムーリンクドイムノアッセイのための試験キッ
トは次のものを含む。
◎　ポリスチレンミクロタイタープレート及び２０ｍ１
のＴＮＰ−ＫＬＨ（例１　）（０，３Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ
＊中２μｇ／ｍ７り；又はＴＮＰ−ＭＬｌｌでコートさ
れたポリスチレンミクロタイタープレート（例◎　ＥＬ
ＩＳ緩衝液中５Ｑｎｇ／ｍｌのＳＡＰ標準溶液　　　　
　　　　　　　　　　　１ｍｊ２◎　ヒトＳＡＰに対す
るラビット抗血清（１１１０′稀釈）　　　　　　　　
　　　　２Ｑｍｌ◎　ホースラディツシュパーオキシダ
ーゼと接合したロバ抗−ラビット１ｇ抗血清（１：５０
００稀釈）　　　　　　　　　　　　　２０ｍ１以下余
白 ◎　クエン酸／リン酸緩衝液（ｐ１４５．０）中〇−フ
ェニレンジアミン（１０ｍｇ／ｍり ０ｍ１ ◎　３％　］１□０□　　　　　　　　　　　　１ｍ６
◎　５ｍＭ　　塩化カルシウム　　　　２００　ｍ　Ｉ
ＴＮＰ−にＬｌｌでコートされたポリスチレンミクロタ
イタープレートを用いて例２の方法を繰り返す。
４Ｑｎｇ／ｍＮのヒｌ−３ＡＰを含有するサンプルを試
験されるべき化合物の稀釈物と共に２０℃にて２時間、
前インキュベートする。ＴＮＰ−ＫＬ）ＩへのＳＡＰの
結合の減少の％を阻害剤の非存在下でのＳＡＰ結合と比
較して計算する。。ＳＡＰの結合の最大値の半分（５０
％）の阻害をもたらす阻害剤の４度を第２表に示す。
以下余日 第一」Ｌ−表 ＴＮＰ−ＭＬｌｌでコートされたポリスチレンへのヒト
ＳＡＰの結合の５０％阻害をもたらす阻害剤の濃度 （ａ）　Ｎ、１．は２０ｍＭ又は１００μｇ／ｍｌにお
いて阻害せず。
ＴＮＰ−ＫＬＨでコートされた担体へのＳＡＰの結合は
、前記のようにＣａ”を要求する。従って、効果的なカ
ルシウムキレート化剤であるＥＤＴＡ及びｕＧＴＡが、
７ツセイ法において適用されるＣａ”“濃度と同じか又
はそれ以上の濃度においてＳＡＰ結合の阻害剤であるこ
とは合理的である。
予想通り、トリニトロフェニル化されたポリマー、例え
ばＴＮＰ−ＢＳＡ　、　ＴＮＰ−ＰＡＨ及びＴＮＰ−Ｋ
ＬＨ、並びに程度は低いがトリニトロフェノール（ピク
リン酸）は、ＴＮＰ−ＫＬＨでコートされたポリスチレ
ンへの結合に基くアッセイにおいて、ＳＡＰと効果的に
競争する。ジニトロフェノール及びジニトロフェニル化
ポリマーへのＳＡＰの結合は明らかに弱く、そしてこれ
らの化合物はこのアッセイ法において阻害剤ではない。
阻害性はさらに、ｐ−アミノフェニルアルソン酸、ｐ−
ニトロフェニルアルソン酸、フラビアン酸、ペクチン酸
、及びトリニトロフェニル官能基を有しないＫＬＨにつ
いても観察される。試験された２種類の非イオン性洗剤
〔ブリジ（Ｂｒｉｊ）３５　（商標）及びトウイーン２
０）はＴＮＰ−１０，）ｌへのＳＡＰの結合に影響を与
えない。
例２に記載したようにしてＴＮＰ−ＫＬＨによりコート
されたポリスチレンミクロタイタープレートを１００ｃ
ｒｊ！のＨＬＩＳＡ緩衝液中ウェル当つ２０ｎｇのヒト
ＳＡＰと共にインキュベートする。ＳｍＭＣａＣ１ｚで
洗浄した後、プレートを、１００ｐｆｆのＥＬＩＳＡ　
緩衝液中第２表に挙げた阻害剤の稀釈物と共に２０℃に
て２時間インキュベートする。ミクロタイタープレート
を例２に記載したようにして処理し、そしてＥＬＩＳＡ
緩衝液のみにより処理したＳＡＰサンプルに対して溶出
の％を計算する。
ＥＤＴＡ（１０ｍＭにて１００％）、ｐ−−−トロフェ
ニルアルソン酸（１０ｍＭにて９０％、２ｍＭにて４５
％）、及びアルサニル酸（ｌＯｍＭにて２８％）につい
てのみ有意な溶出が見られる。
７０ｇのセファロース４Ｂ（ファルマシア、ウプサラ、
スエーデン）を７ｇのＢｒＣＮ　（フル力）によりｐｌ
ｌｌｌ、２にて１０分間活性化し、そして８７０ｍｇの
アジピン酸ジヒドラジド（フル力）と４℃にて一夜反応
せしめる。４０ｍｌのこのＡＤＨ−セファロースを、６
３０ｍｇの２．４．６−トリニトロベンゼンスルホン酸
を含有する５０ｍ１！の０．ＩＮＮａＨＣＯ：＋中に懸
濁し、そして２０℃にて一夜インキユヘートする。ＴＮ
Ｐ−セファロースを水、ＩＭＮａＣｊ２．０．５　Ｍ酢
酸及び水で洗浄し、そして０．１％の水性ＮａＮ３中に
４℃にて保持する。活性化されたセファロース４Ｂをア
ジピン酸ジヒドラジドの代りに７０ｍｇのＰＡＨで処理
する場合、類似の生成物を得ることができる。
５ｍｆｆの正常ヒト血清を、ＴＢＳで平衡化された上記
ＴＮＰＮモーァロース５ｍｌを収容するカラムに適用す
る。カラムをＴＢＳで溶出し、そして蛋白質を含有する
両分をプールする。ＳＡＰはＣａ”イオンの非存在下で
はＴＮＰ−セファロース上に保持されない。プールされ
た百分に固体ＣａＣ７！２を加えて５０ｍＭの溶液とし
、そしてこれを、５０　ｍＭ　ＣａＣ１２を含有するＴ
ＢＳにより平衡化された第２のＴＮＰ−セファロースカ
ラム（５ｍ７りに適用する。このカラムを５０ｍＭＣａ
Ｃ（！　２　／　Ｔ　Ｂ　Ｓで洗浄し、そして１００ｍ
ＭＥＤＴＡを含有するＴ　Ｂ　Ｓ　（ｐｌ＋７．８　）
により、０．５Ｍ酢酸により、又はｌＯｍＭｐ−二トロ
フェニルアルソン酸を含有するＴＢＳによりＳＡＰを溶
出する。
導入された合計２００μｇのＳＡＰから最終ＥＤＴＡ溶
出液中に１８９μｇが回収される（例２のＥＬＩＳＡに
おいて測定）。検出される唯一の汚染物は正常免疫グロ
ブリンであり、このものは不溶化されたプロティンＡ又
は抗ヒト免疫グロブリン抗体を含むカラム上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーにより除去される。
ＴＮＰ−セファロースの代りに未処理セファロースを使
用する場合、２００μｇのＳＡＰ中１１２μｇが５０　
ｍＭ　ＣａＣ１！　／　Ｔ　Ｂ　Ｓにより洗い出され、
そして最終ＥＤＴＡ？８出液は８２μｇのＳＡＰを含有
するに過ぎない。
ｌ５ＡＡのためのＥＬＩＳＡ ポリスチレンミクロタイタープレートのウェルを、例２
に記載したようにＫＬＨ又はＴＮＰ−にＬｌ＋でコート
し、あるいはコートしないでおき、次に５ｍＭＣａＣ！
！２で洗浄し、そして患者の血清の逐次稀釈物により得
られたヒトＳＡＡを含有するサンプル１００μｌと共に
インキュベートする。２０°Ｃにて２時間の後、プレー
トを５　ｍＭ　ＣａＣ６２で洗浄し、ヒトＳＡＡに対す
るラビ・ノド抗血清（カルビオケム”）　（ＥＬＩＳＡ
緩衝液中１：２５００稀釈物）と共にインキュベートし
、そして例２に記載したようにしてホースラディツシュ
パーオキシダーゼに接合した抗−ラビット血清により発
色せしめる。ヒトＳＡＡはＴＮＰ−にＬｌ＋でコートさ
れたポリスチレンに非常に効果的に結合する。実質的な
結合がＫＬＨ−でコートされたポリスチレンに対して、
及びポリスチレンのみに対してさえ観察される第３表）
。ＴＮＰ−ＫＬＨでコートされたポリスチレンへの結合
効率のロスを伴わないでＣａ”を省略することができる
。
第３表 コートされない（Ｃａ”＋処理はされている）ポリスチ
レン、ＫＬＨでコートされたポリスチレン、及ヒＴＮｐ
−Ｋｔ、ｎでコートされたポリスチレンへのヒトＳＡＡ
の結合 （ａ）　　’Ｊリウマチ性関節炎有する患者からの血清
。
ＳＡＡサンプル及び洗浄液を調製するために使用する緩
衝液に洗剤、例えばブリジ（Ｂｒｉｊ）を添加する場合
、所与のＳ　Ａ　Ａ　？Ｍ度について光学濃度が１０分
の１以下に低下する。
ＳＡＡのためのＥＬＩＳＡの好ましい変法においては、
ＴＮＰ−ＫＨＬでコートされたポリスチレンミクロタイ
タープレートを使用する。
例」□　５ＡＡ−ＥＬＩＳＡのための一、キット例７に
記載したエンザイムーリンクドイムノアソセイのための
試験キットは次のものを含有する。
◎　ポリスチレンミクロタイタープレート及び２◎ｍｌ
のＴＮＰ−ＫＬＨ（例１　）（０，３ＭＮａＨＣＯ３中
２　μｇ／ｍｌ　　；又はＴＮＰ−ＫＬＨでコートされ
たポリスチレンミクロタイタープレート（例◎　リウマ
チ性関節炎を有する患者からのプールされた血清（約１
０μｇ　／　ｍ　１のＳＡＡに稀釈されたもの）　　　
　　　　　　　　１ｍ１◎　ヒトＳＡＡに対するラビ・
ノド抗血清（１：２５００稀釈）　　　　　　　　　　
　　　２０ｍｊ！◎　ホースラブイソシャバーオキシダ
ーゼに接合したロバー抗−ラビットＩｇ抗血清（１：５
０００に稀釈されたもの）２０ｍｌ ◎　クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５，Ｏ）中０−フェ
ニレンジアミン（１０ｍｇ／ｍｆ）２０ｍＡ◎　３％　
Ｈ２Ｏ２ｌ　ｍ１ ◎　ＴＢＳ　　　　　　　　　　　　　　２００ｒｒ＋
Ｊ！以下余白 劃」、工ＮＰ二鬼スＬ旦ニス左文人上二二竺上りウマチ
性関節炎患者からのＳＡＡに冨む血清６ｍｌを、塩化亜
鉛の溶液で前処理し、洗浄しそしてＴＢＳで平衡化した
ＴＮＰ−セファロース５ｍｌを収容するカラム（例６）
に適用する。ＴＢＳにより洗浄した後、０．１％のブリ
ジ（Ｂｒｉｊ）３５を含有するＴＢＳによりＳＡＡを溶
出する。
五刊、ヒト面ン”中ＳＡＡ　　びＳＡＰのン冗由来を異
にするヒト血清を、ＴＮＰ−ＫＬＩ＋でコートされたポ
リスチレンミクロタイタープレート上で例２及び例７に
おいて記載したＥＬＩＳＡを用いて分析する。次の結果
が得られる（第４表）。
以下余白 第−一し一表 由来を異にするヒト血清のＳＡＰ及びＳＡＡ含量 （ａ）ヒト血清の由来 ４１７〜５３０　（３ケタの数値）：健康な志願者ＨＦ
：肺炎患者 ＳＷ：全身性紅斑性狼癒関連疾患を有する患者　　。
Ｍ　ニアミロイド−シスを有する患者 ８９−６５〜９２−４１（４ケタの数値）：全身性紅斑
性狼癒を有する患者 Ｐ　：交通事故後の救急治療中の患者 （１））純粋なヒトＳＡＡは入手できない。ｌユニット
は（最大）７ｎｇのＳＡＡに相当する。使用される標準
は約１■／　ｍ　ｌの５ＡＡ（便宜上１４０．０００　
：Ｌ　ニーー／ト／　ｍ　（ｌとする）を含有する患者
の血清である。
第４表に示す結果は、この発明のイムノアッセイが正常
ヒト血清中、及び全身性紅斑性狼庶のごとき炎症状態を
有する患者の血清中のＳＡＰ及びＳＡＡの決定に有用で
あることを示している。Ｂ１的分析において、ここに開
示した方法により確実に測定するには低すぎるＳＡＰ又
はＳＡＡレベルを有する血清は見出されなかった。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明のＥＬＩＳＡ法におけるＳＡＰ濃度
と光学濃度との関係を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）及び／又は血清
    アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）の免疫学的分析方法であ
    って、該蛋白質を担体のプラスチック表面に又はニトロ
    化されたフェニル基を担持する担体に結合せしめ、ここ
    でＳＡＰの結合の場合にはカルシウムイオン又は関連２
    価イオンを存在せしめることを特徴とする方法。 ２、適当な担体のプラスチック表面をカルシウムイオン
    又は関連２価イオン、例えば亜鉛イオンもしくは第二銅
    イオンの存在下でＳＡＡ及び／又はＳＡＰを含有する溶
    液と共にインキュベートするか、あるいは追加のイオン
    の非存在下でＳＡＡを含有する溶液と共にインキュベー
    トすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。 ３、前記担体のプラスチック表面が樹脂性ポリマー有機
    物質から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又
    は第２項に記載の方法。 ４、前記担体のプラスチック表面が、ポリスチレン、ポ
    リプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル及びポリ
    酢酸ビニルから成る群から選択される樹脂性ポリマー有
    機物質から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    又は第２項に記載の方法。 ５、適当な担体をニトロ化されたフェニル基を担持する
    化合物によりコートし、そしてカルシウムイオンの存在
    下でＳＡＡ及び／又はＳＡＰを含有する溶液と共にイン
    キュベートするか、あるいはカルシウムイオンの非存在
    下でＳＡＡを含有する溶液と共にインキュベートし、そ
    して該担体に結合したＳＡＡ及びＳＡＰを検出しそして
    定量することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。 ６、ニトロ化されたフェニル基によりコートされた担体
    を、ポリスチレン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビ
    ニルのタイタープレートもしくは試験管、ガラス製もし
    くはプラスチック製ビーズ、濾紙、又はデキストラン、
    酢酸セルロースもしくはニトロセルロースのシートから
    成る群から選択することを特徴とする特許請求の範囲第
    １項又は第５項に記載の方法。 ７、ニトロ化されたフェニル基を担持する化合物が、ニ
    トロ化されたフェニル基を有するポリペプチド、ポリサ
    ッカライド又は合成ポリマーであることを特徴とする特
    許請求の範囲第５項に記載の方法。 ８、ニトロ化されたフェニル基を担持する化合物がニト
    ロ化されたフェニル基を有するポリペプチドであること
    を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ９、ニトロ化されたフェニル基がニトロフェニル基、ジ
    ニトロフェニル基、又はトリニトロフェニル基であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項、第５項又は第７
    項に記載の方法。 １０、ニトロ化されたフェニル基が２，４，６−トリニ
    トロフェニル基であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項、第５項、又は第７項に記載の方法。 １１、ニトロ化されたフェニル基を担持する化合物が２
    ，４，６−トリニトロフェニル基を担持するキーホール
    リンペット・ヘモシアニンであることを特徴とする特許
    請求の範囲第５項又は第７項に記載の方法。 １２、担体に結合した蛋白質を、ＳＡＡ又はＳＡＰに特
    異的な抗血清又はモノクローナル抗体とインキュベート
    し（ここで、抗血清中の抗体又はモノクローナル抗体は
    ラベルされているか、あるいは該抗血清中の第１抗体又
    は該モノクローナル抗体に対して特異的なラベルされた
    抗体を含有する抗血清とインキュベートする）、そして
    担体に最終的に結合したラベルされた担体の量を測定す
    ることによって、検出しそして定量することを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項、第２項、又は第５項に記載の
    方法。 １３、前記ラベルが、酵素／基質反応により測定される
    酵素である特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４、血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）及び／又は血
    清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）の定性及び定量測定の
    ための試験キットであって、該蛋白質を担持するプラス
    チック表面に又はニトロ化されたフェニル基を担持する
    担体に結合せしめ、ＳＡＰの結合の場合にはカルシウム
    イオン又は関連２価イオンを存在せしめる方法のために
    適当な担体及び試薬を含んで成る試験キット。 １５、プラスチック表面を有する担体又はニトロフェニ
    ル基を担持する化合物によりコートされた担体、場合に
    よってはニトロフェニル基を担持する化合物の溶液、Ｓ
    ＡＡ又はＳＡＰを結合するモノクローナル抗体又はポリ
    クローナル抗体の溶液、及び前記第１抗体が酵素により
    ラベルされていない場合には該第１抗体と結合するポリ
    クローナル酵素接合第２抗体、ＳＡＡ及び／又はＳＡＰ
    の標準溶液、場合によっては、緩衝液及び固体の形のカ
    ルシウム塩又は関連２価塩、例えば亜鉛塩又は第二銅塩
    、及び場合によってはピペット、反応容器、換算曲線、
    色度表等を含んで成ることを特徴とする特許請求の範囲
    第１４項に記載の試験キット。 １６、２，４，６−トリニトロフェニル基を担持するキ
    ーホールリンペット・ヘモシアニンによりコートされた
    担体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１５項に
    記載の試験キット。 １７、血清アミロイドＡ蛋白質（ＳＡＡ）及び／又は血
    清アミロイドＰ−成分（ＳＡＰ）の精製方法であって、
    該蛋白質を含有する溶液を、ニトロ化されたフェニル基
    を担持する固体担体上でアフィニティークロマトグラフ
    ィーにかけることを特徴とする方法。 １８、ＳＡＰを含有する溶液をカルシウムイオンで処理
    し、ニトロ化されたフェニル基を担持する担体と接触せ
    しめ、未結合蛋白質及び他の不純物をカルシウムイオン
    を含有する水性溶液により洗浄除去し、そしてＳＡＰを
    カルシウム・キレート化剤を含有する水性溶液により、
    水性酸もしくはｐＨ５以下の緩衝液により、又はｐ−ニ
    トロフェニルアルソン酸を含有する緩衝液により溶出す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の方
    法。 １９、ＳＡＡを含有する溶液をあらかじめ亜鉛塩により
    処理されたニトロ化されたフェニル基を担持する担体に
    接触せしめ、未結合蛋白質及び他の不純物を水性塩溶液
    で洗浄除去し、そしてＳＡＡを洗剤を含有する水溶液に
    より、水性酸により、又はｐＨ５以下の緩衝液により溶
    出することを特徴とする特許請求の範囲第１８項に記載
    の方法。
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