JPS62215386A - 付着性動物細胞の培養法および培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｕの番、　なう■ （産業上の利用分野） 本発明は付着性動物細胞を多孔性物質を被付着物体とし
て培養する付着性動物細胞の高密度培養法およびその培
養装置に関する。

（従来の技術） 動物細胞は、培養形態から２つの細胞群に大別される。

そのひとつは血液系の細胞に代表される浮遊性の細胞で
あり、他は、線維芽細胞や上皮性細胞のように細胞が付
着する面を必要とする付着性細胞である。浮遊性細胞は
培地中に懸濁した状態で増殖するため、微生物の培養に
準じた方法で容易に増殖が可能である。他方、付着性細
胞は。

増殖の足場となる付着面（被付着物体）が必要であるた
め、大量かつ高密度の培養が困難である。

近年、付着性動物細胞を比較的大量かつ高密度に培養し
うる方法として、マイクロキャリアー培養法、ホロファ
イバー培養法、セラミック多孔質管培養法、マイクロカ
プセル培養法などが提案されている。なかでも、マイク
ロキャリアー培養法は、複雑な装置を必要とせず、操作
が比較的簡単であるため好適に利用される。マイクロキ
ャリアー培養法は、被付着物体として直径が１００〜３
００μｍ程度の高分子微粒子（マイクロキャリアー）を
用いる方法である。マイクロキャリアーの素材としては
、ポリアクリルアミド、デキストラン。

ゼラチン、ポリスチレンなどがある。例えば、架Ｈ しｌ− を導入して表面荷電型としたマイクロキャリアー（サイ
トデソクス２　（Ｃｙｔｏｄｅｘ　２）　　；ファルマ
シア社製）が好適に用いられる。マイクロキャリアー培
養法における培養密度は９例えば上記サイトデックス２
を培養液１　ｍＪあたり３■の割合で用いてＶｅｒｏ細
胞（後述）の培養を行った場合、約２．０×１０ｈ〜４
．ＯＸ　１０’個／ＩＩＩＩｌ（マイクロキャリアー固
形分）であることが報告されている〔マイクロキャリア
ー　セル　カルチャー　プリンシブルズアンド　メソッ
ズ、ファルマシア　ファイン　ケミカルズ（Ｍｉｃｒｏ
ｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｓ＆　ｎｅｔｈｏｄｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、）　）　＊しかじ
、このマイクロキャリアー培養法では、いまだ十分に高
密度かつ大量培養が達成されえない。

動物細胞中に含有される微量の生理活性物質を得るなど
の目的で９付着性動物細胞の高密度かつ大量培養が可能
な方法の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、付着性動物細胞を高密度かつ大量に培
養しうる方法を提供することにある０本発明の他の目的
は、上記方法に使用されうる培養装置を提供することに
ある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明の付
着性動物細胞培養法は、多孔性物質に培地液を含浸し、
もしくは多孔性物質を培地液に浸漬し、該多孔性物質に
付着性動物細胞を付着させて該付着性動物細胞を培養す
ることを包含し。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明の付着性動物細胞培養装置は、多孔性物質に付着
して生育する付着性動物細胞を該多孔性物質と共に多孔
板上に収容する培養槽と、該培養槽に培地液循環路を介
して連結された濡壁塔と。

該濡壁塔に培地液供給路を介して連結された培地液供給
槽および気体供給路を介して連結された気体供給手段と
、を有し、該濡壁塔にて該培地液と該気体とを接触させ
、気体の供給された培地液を該培地液循環路を介して培
養槽に供給し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明に用いられる多孔性物質は、培養を目的とする動
物細胞により代謝を受けない物質で吸水能力があればよ
い。例えば１合成樹脂発泡体や海綿などの天然産生物が
利用されうる。合成樹脂発泡体としては９例えば、ポリ
ビニルアルコールやポリウレタンなどの発泡体が用いら
れる。特に。

ポリオキシエチレン構造を有するポリウレタンの発泡体
は優れた親水性と水保持力とを有するため好適に利用さ
れる。

このようなポリウレタンはポリオキシエチレン構造を有
するポリオールとポリイソシアネートとを反応させて得
られる。ポリオキシエチレン構造を有するポリオールと
しては９例えば、ポリエチレングリコール；ポリエチレ
ングリコールとポリプロピレングリコールとの混合物；
酸化エチレンと酸化プロピレンとの共重合体であるポリ
エチレングリコール−ポリプロピレングリコールなどが
挙げられる。塩基性ポリオールも使用可能である。

ここでいう塩基性ポリオールとは、エチレンジアミン、
ジエチレントリアミン、メチルアミン、ブチルアミン、
ピペラジン、エタノールアミン、プロパツールアミン、
Ｎ−メチルジェタノールアミンなどのアミン類に酸化エ
チレンをポリオキシエチレン状に付加させて得られる。

上記ポリオキシエチレン構造を有するポリオールとして
は２分子量約４００〜１０００のポリエチレングリコー
ルが好適に用いられる。ポリプロピレン成分がポリエチ
レングリコールに添加されるときには、その含量が約６
５重量部を下まわることが好ましい。過剰であると得ら
れる発泡体の親水性が低下する。

上記ポリイソシアネートとしては１例えば、芳香族系、
脂肪族系、ポリエーテル系など種々のポリイソシアネー
トが用いられる０例えば、トリレンジイソシアネート、
ジフェニルメタンジイソシアネート、ジフヱニルジイソ
シアネート、ナフタレンジイソシアネート、キシレンジ
イソシアネートブタンジイソシアネート、トリフェニル
メタン−４−４’４’−）ジイソシアネートなどが挙げ
られる。

ポリオキシエチレン構造をもたないポリオールを単独で
、あるいは上記ポリオキシエチレン構造を有するポリオ
ールと混合して用いられうる。このようなポリオールと
しては１例えば、グリセリン、トリメチロールエタン、
トリメチロールプロパン、１・２・６−ヘキサンドリオ
ール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、サッカロ
ース。

α−メチルグルコシドが挙げられる。ポリオールとして
、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキ
シメチルセルロースなどの天然高分子やその誘導体も利
用されうる。

ポリオールとポリイソシアネートとの反応時に。

反応系にコラーゲン、アルブミン、ゼラチンなどのベブ
タイドを共存させると１分子内にペプタイドマトリック
スが形成されたポリウレタンが得られる。分子内にペプ
タイドマトリックスが形成されたポリウレタンの発泡体
を多孔性物質として用いると多孔性物質の含水率が高（
なり、多孔性物質と培地液とのぬれが良好になる。その
結果、付着性動物細胞と多孔性物質との親和性が高くな
り。

該細胞の増殖がより速やかになる。

発泡体としては、半連続発泡体、連続発泡体のいずれも
が利用されうる。酸素を含む培地液が接触しやすいほど
よいため連続発泡体を用いることが好ましい。

多孔性物質の平均細孔径は１０μｍ〜５ｍｍ、好ましく
は１００μｍ〜１龍である。細孔径が小さすぎると細胞
が多孔性物質内部で増殖しにくくなり。

大きすぎると多孔性物質の内部表面積が小さくなる。こ
のような多孔性物質の見かけの比重は０．０２〜０．１
であり９発泡体であれば、その発泡倍率は約１０〜５０
倍である。

本発明の多孔性物質を用いた付着性動物細胞の培養法に
は静置培養法および充填層培養法が含まれる。

本発明の培養法を実施するためには、多孔性物質に付着
して生育する付着性動物細胞を該多孔性物質と共に多孔
板上に収容する培養槽と、該培養槽に培地液循環路を介
して連結され培地液に気体を供給する濡壁塔とを備えた
装置が用いられる。

濡壁塔には培地液供給槽が連結されている。

静置培養を行うには８培養槽の多孔板上に２例えば１０
龍以下、好ましくは１〜３重曹の細片とじた多孔性物質
を載置し、培地液を供給してこれを多孔性物質に含浸さ
せたのち、培地液もしくは多孔性物質に所望の動物性細
胞を接種（播種）する。

培地液の量としては、多孔性物質が吸収しうる培地液の
量以上であればよく、特に制限はない。静置培養である
ので培地液の循環は行われないが１〜３日に１度の培地
交換を行うことが好ましい。

そして、細胞の生育に必要な温度および雰囲気下で培養
を行うと、該動物性細胞は多孔性物質表面を足場として
速やかに増殖する。多孔性物質に対する培地液量が多い
程、動物性細胞の増殖速度が大きく、多孔性物質中での
動物性細胞の生育飽和密度が高い。例えば、ポリウレタ
ン発泡体（ＰＵＦ）を用いて後述のＶｅｒｏ細胞を培養
する（ＰＵＦ　２３■。

培地２ＩＩｌｌ）と、７．５Ｘ１０’個／ｄ！　（培地
液中ＰＵＰ）という高い飽和密度が得られる。

充填層培養法を実施するには、多孔性物質を培養槽の多
孔板上に多層に積層充填しそこに濡壁塔からの気体含有
培地液を生育温度下にて供給し。

所望の動物性細胞を接種する。そして、濡壁塔からの気
体含有培地液を培地液循環路を介して連続的に供給する
。このような充填層培養法によれば。

充分な酸素等の必要な気体の供給された培地液が動物細
胞に供給されるため、高密度培養が達成される。例えば
、　ＰＵＰ　５．８　ｇを用いてＣＯｌを含有する空気
を培地中に充分供給しながらＶｅｒｏ細胞の培養を行う
と、対数増殖期の細胞数倍加時間は７１時間であり、２
４日目には７５倍に増殖し、１．７Ｘ１０’個／ｄとい
う高密度培養が達成される。

上記装置を用い、培地液を連続して供給すると共に、得
られる生理活性物質等の培養生成物を連続的に系外へ取
り出すことにより、連続培養法が達成されうる。培養生
成物の取り出し手段としては９例えば、培養槽にパルプ
付培地液排出口が設けられる。低分子物質を選択的に取
り出す限外濾過膜等を用いることも可能である。

付着性動物細胞が多孔性物質表面から剥離しない程度の
緩速攪拌を行えば、攪拌培養が達成されうる。この場合
には細胞と酸素を多量に含む培地液との接触度合が上が
るため、該細胞の生育速度が速くなると共に、培養生成
物が培地液中に効果的に拡散するため生成物の収率が向
上する。攪拌手段は培養槽内に適宜設けられている。

（実験例） 本発明を実施するための予備的な実験例を以下に示す。

ここで使用した細胞はＶｅｒｏ細胞（その由来、特徴を
下に示す）である。

Ｖｅｒｏ細胞ニアフリカミトリザルの腎由来の付着性細
胞。形態は線維芽様。樹立細胞系であり。

無限増殖する。球形の細胞は直径約１３．５μｉ。

ウィルスＳＶ４０などの生産に用いられる。ペトリディ
ッシュ底面を付着面として培養すると約１８時間で倍加
する。

大狡皿上 ＤＭＥ合成培地（日本製薬社製）にＮａ）Ｉｃｅｓ、　
ＨＥＰＩＥＳ。

ペニシリンＧおよびストレプトマイシンを添加し。

最終濃度をＮａＨＣＯｓ１２．５ｍＭ、　ＨＥＰＥＳ　
５ｍＭ　、ペニシリンＧ１０’Ｕ／ｌおよびストレプト
マイシンＯ，Ｌｇ／１２に調整したのち、これにさらに
牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加して培地液とした。

分子内にペプタイドマトリックスの形成されたＰｔ１Ｆ
　　（発泡倍率２５倍）をミキサーにかけ、３１１以下
の細片に粉砕した。不純物を除き、蒸留水で水洗後オー
トクレーブにて滅菌を行なった。これを上記培地液に浸
漬し、　ＰＵＦ表面に血清中の付着糖蛋白質を充分に吸
着させた。このＰＵＰと上記培地とをクリーンベンチ内
でペトリディッシュに入れ。

Ｖｅｒｏ細胞をペトリディシュ内に播種した。これに５
％のＣＯＷを含有する空気を供給しながら３７℃でイン
キュベートした。数時間後にはペトリディッシュ底面と
ＰＵＦ・表面６ごＶｅｒｏ細胞が付着伸展したことが顕
微鏡により確認された。経時的に細胞が増殖することも
確認された。最終的にＶｅｒｏ細胞はＰＵＦ表面で飽和
状態まで増殖したことを確認した。定常期後半には、細
胞が丸くなり、細胞同士が凝集して大きな細胞塊が認め
られた。死滅器に入ると。

ペトリディッシュ底面の細胞は剥離し、　ＰＵＦ表面の
Ｖｅｒｏ細胞も著しく大きな凝集塊を形成した。

災狼燃１ 実験例１と同じ培地液を用い、かつ同様に処理され同一
の付着糖蛋白質の吸着したＰＵＰを用いた。

このＰＵＦと培地液とを直径５３１１のベトリディッシ
ュに入れ、５％のＣＯｔを含有する空気を３１／ｗｉｎ
の割合で供給しながら３７℃で３０分間インキエベート
した。このように処理したＰＵＦ　４０■と培地液４ｆ
ｆ１１とを含むベトリディッシュ培地を３組調製した。

培地中のこれら３組のＰＵＰに１０４個／ｍ　ｊ！　、
　１０’個７ｍ１ｌおよび１０６個／ｌａ１の割合でＶ
ｅｒｏ細胞をそれぞれ播種した。ここで、１０４個／ｌ
ｌｌ１とは、培地液を含んだｒ’ＵＦ１ｃｄあたり１０
’個の細胞を播種したことを示す。これを実験例１に準
じて３８時間培養し、細胞数を計数した。播種密度とＰ
ＵＰ　Ｉｇあたりの細胞数との関係を第１図に示す。第
１図から。

細胞がＰＵＰに付着する割合は播種密度によらずほぼ一
定であることが確認された。

（実施例） 以下に本発明を実施例について説明する。

ス隻斑上 実験例１におけると同じ培地液および同じＰｕＦを用い
た。２３ｍｇのＰＩＦと２ｍｆの培地液とを含むペトリ
ディッシュ培地を調製し、　ｐｕｔ表面にＶｅｒｏ細胞
を１．０４　Ｘ　１０”個／ｇ　（ＰＵＦ）（７）割合
で播種した。５％のＣｏｗを含有する空気を３　ｊ！　
／ｍｉｎの割合で供給しながら３７℃にて２３時間イン
キュベートしたのち、　ＰＵＦ表面から細胞が剥離しな
いように注意してサンプリングし、積数計数法を用いて
ＰＩＩＦに付着しているＶｅｒｏ細胞を計数した。細胞
数は約４．５×１０６個であり、細胞数がＰＵＰ表面で
ほぼ飽和していることが観察された。これは同じ大きさ
のベトリディッシェの底面を付着面として培養を行なっ
た際の細胞数とほぼ同様である。使用したＰＵＦは２３
■であるから、細胞密度は１．９５　Ｘ　１０’個／ｇ
　（ＰＵＦ）である。ＰＵＰの培地中での嵩体積は約２
６ｃＪ／ｇであるから、これは？、５　ｘ　１０’個／
−（培地液中のＰＵＦ　）に相当する。これは、従来の
技術の項で示したサイトデックス２を用いたマイクロキ
ャリアー培養法に比べても２〜３倍優れている。このよ
うに１本発明方法により高密度培養が効果的に達成され
る。

叉肱斑１ 実験例１と同じ培地液と同じＰＩＩＦを用いた。ｐｕｐ
９０＋＋＋ｇに２ｒａβの培地液を入れたベトリゾイソ
シュ培地、　ＰＵＦ　９０■に６ｍｌの培地を入れたベ
トリゾイソシュ培地、および５ｍｌの培地液のみを入れ
たベトリゾイソシュ培地をそれぞれ調製した。これにそ
れぞれ８Ｘ１０’個、８Ｘ１０’個および２Ｘ１０’個
のＶｅｒｏ細胞を播種し、実験例１に準じて培養を行な
った。培養時間と細胞個数との関係を第２図に示す。Ｐ
ＵＦを用いた上記培養時の対数増殖期における倍加時間
（Ｄ、Ｔ、）の測定を行なった。別に培地液の量を４１
Ｉ１１とし、添加するＰＵＦをθ■、５０■、７０■、
１９０■としそれぞれ実験を行い、対数増殖期における
り、Ｔ、を測定した。培地液中にＰＵＦが占める割合（
ｇ／　１　）とり、Ｔ、との関係を第３図に示す。

第２図および第３図より、　ｐｕｐに対し培地液量の多
い方が細胞の増殖速度が太き（、Ｄ、Ｔ、が小さいこと
がわかる。これは、　ｐｕｐに対し培地液量が少ないと
ＰＵＦ表面で増殖する細胞の物質交換が阻害されるため
と考えられる。ＰＵＦを入れないペトリディッシュで培
養を行なった場合は増殖速度が大きいが、短時間でベト
リディッシュ底面に飽和するため高密度に培養すること
はできない。

天皇±１ 培養装置は、第４図に示すように、培養槽１と。

濡壁塔２と、培地液供給槽３と、気体供給手段４とを有
する。培養槽１は内部に多孔板１１を収納しており、こ
の多孔板１１上にＰＵＦ　１１０が載置される。

この培養槽１には培地液循環路１２を介して濡壁塔２が
連結されている。この濡壁塔２には、培地液供給路２３
を介して培地液供給槽３および気体供給路２４を介して
気体供給手段４が連結されている。

濡壁塔２では培養槽１からの返送培地液（もしくは培養
液）が培地液流入口２０から流入し、塔内壁面に沿って
流下する間に、気体供給手段（例えば空気ボンベ４１お
よびＣＯｔガスボンベ４２などのガスボンベ）４から供
給される気体と接触し気体を吸収する。新鮮な気体を吸
収した培地液は培地液循環路２１を通って再び培養槽１
へ供給される。濡壁塔２ではこのように効果的なガス供
給システムが機能し、有用な気体が供給されて培養槽１
へ再び供給される。濡壁塔２の培地液流入口２０は濡壁
塔壁面に沿って液留部２００を有し、培養槽１からの返
送培地液がこの液留部２００に入り塔壁から徐々に溢流
して塔内へ流入する構成になっている。液留部２００か
ら塔内への流入量をより均一に保持するうえで、ガラス
ピーズなどのビーズ状物や多孔板などの層流創製手段２
０１をこの液留部２００内に配置することが行われうる
。濡壁塔２の上方にはコンデンサー２０２およびフィル
ター２０３が設けられる。気体供給路２４にも必要に応
じてフィルター２４０が設けられる。培地液循環路や培
地液供給路には、適宜ローラーポンプなどの液送給手段
６０゜６１が配置される。

上記装置を、培地液中に含有される生理活性物質などの
生成物を連続的に系外に取り出しうる連続培養に供しう
るように１例えば、培養槽１にバルブ付培養液排出口１
００が設けられる。この排出口１００と共に、もしくは
これに代えて、低分子物質を選択的に取り出す限外濾過
膜を培地液循環路もしくは他の適当な箇所に配置するこ
とも可能である。

上記装置を、攪拌を伴う培養に供しうるように。

攪拌手段を例えば培養槽１内に配置することも可能であ
る。

培地液供給槽３からの培地液を培地液供給路２３を介し
て下記の要領で上記装置の各部へ供給したのち、培地液
供給路２３のバルブ１０１を閉じた。そして、培養槽１
と濡壁塔２との間で培地液循環路１２および２１を介し
て培地液を１０Ｏｎ＋　１７ｍ１ｎの速度で１時間循環
させた。

培養槽１内ニＰＵＰ　５．８ｇソして培地液２００１Ｉ
ｌｌ；濡壁塔２内に培地液２００ｎＩｌ； および培地液循環路１２．２１およびローラーボブ６０
に培地液を合計量で１００ｍ１゜次いで、　ＰＵＦ　１
１０にＶｅｒｏ細胞を３．４　ｘ　１０’個播種し、２
時間静置後、　５０　ｎｊ！／ｌｌｌ１ｎで培地液を循
環させて充填層培養を開始した。培養時間とＰＵＦ単位
１ｆｆｉあたりの細胞数との関係を第５図に示す。

第５図において矢印は培養槽１のバルブ１００を開放し
て培養槽１内の培地液を回収すると共に、培地液供給槽
３から培地液を培地液供給路２３のバルブ１０１を開放
して上記要領にて装置各部へ供給したことを示す。

第５図より、培養１５０時間後の細胞数は３Ｘ１０’個
７ｇであり、高密度の培養が行われたことがわかる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように多孔性物質を被付着物体と
して付着性動物細胞が効果的に培養される。従来の例え
ばマイクロキャリアー培養法やホロファイバー培養法に
比べてもさらに高密度培養が達成される。本発明によれ
ば、静置培養法、充填層培養法のいずれを用いても細胞
が効果的に増殖する。特に充填層培養法を採用すると培
養のスケールアンプが容易であり、高密度かつ大量培養
が可能となる。ポリウレタン発泡体などの多孔性物質は
安価でもあるため付着性動物細胞の大量の培養が安価に
なされうる。本発明は、付着性動物細胞を用いたウィル
スの研究、付着性動物細胞が生産する生理活性物質の製
造や研究に好適に利用されうる。また、　ｐｕｐなとの
多孔性物質は、培養後、細胞の剥離も容易であり、再使
用可能である。

４、　ズ　　の　　°　なジ　日 第１図は本発明方法により付着性動物細胞の静置培養を
行なったときの播種密度と多孔性物質単位体積あたりの
細胞数との関係を示すグラフ、第２図は本発明方法と従
来法とによりそれぞれ付着性動物細胞を静置培養したと
きの、培養時間による細胞数の変化を比較したグラフ、
第３図は本発明方法の静置培養時の単位培地液あたりの
多孔性物質重量とり、？、との関係を示すグラフ、第４
図は本発明の培養装置の１実施例を示す概略図、第５図
は第４図の装置を用いて充填層培養を行なったときの培
養時間による動物細胞数の変化を示すグラフである。

１・・・培養槽、２・・・濡壁塔、３・・・培地液供給
槽。

４・・・気体供給手段、１１・・・多孔板、　１２．２
１・・・培地液循環路、２０・・・培地液流入口、２３
・・・培地液供給路。

１１０・・・ＰＵＦ　、　２００・・・液留部。

逮美ｔ４Ｉｖｌ 第３図 昂ｚ４藺

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔性物質に培地液を含浸し、もしくは多孔性物質
   を培地液に浸漬し、該多孔性物質に付着性動物細胞を付
   着させて該付着性動物細胞を培養することを包含する付
   着性動物細胞の培養法。 ２、前記多孔性物質がポリウレタン発泡体である特許請
   求の範囲第１項に記載の培養法。 ３、前記ポリウレタンの分子内にペプタイドマトリック
   スが形成された特許請求の範囲第２項に記載の培養法。 ４、前記ペプタイドマトリックスを形成するペプタイド
   がコラーゲン、アルブミンもしくはゼラチンである特許
   請求の範囲第３項に記載の培養法。 ５、前記ポリウレタン発泡体の発泡倍率が１０〜２０倍
   である特許請求の範囲第２項または第３項に記載の培養
   法。 ６、前記付着性動物細胞が、アフリカミドリザル腎細胞
   （Ｖｅｒｏ細胞）、正常コウモリ肺細胞（ＴｂｌＬｕ）
   、上皮細胞（９４０ｃ３）、マウス線維芽細胞（３Ｔ３
   ）、ヒト横紋筋サルコーマ細胞（ＲＤ）、ヒト横紋筋サ
   ルコーマ細胞（Ａ２０４）、初代ヒナ胚線維芽細胞、チ
   ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、乳児ハムス
   ター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細
   胞（ＣＨＯ）、初代ヒナ胚線維芽細胞、初代胎児頬細胞
   、ヒト２倍体細胞（Ｗ１−３８．ＭＲＣ−５）サル腎細
   胞（Ｖｅｒｏ、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＣＶ−１）、初代サル
   腎細胞、ヒト胚肺細胞（ＭＲＣ−５）、ウサギ腎細胞（
   ＲＫ−１３）、乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ブタ
   腎細胞（ＩＢＲ−５２）、イヌ腎細胞、乳児ハムスター
   腎細胞（ＢＨＫ）、ネコ肺線維芽様細胞または魚細胞で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の培養法。 ７、静置培養法、充填層培養法、連続培養法もしくは攪
   拌培養法である特許請求の範囲第１項に記載の培養法。 ８、多孔性物質に付着して生育する付着性動物細胞を該
   多孔性物質と共に多孔板上に収容する培養槽と、該培養
   槽に培地液循環路を介して連結された濡壁塔と、該濡壁
   塔に培地液供給路を介して連結された培地液供給槽およ
   び気体供給路を介して連結された気体供給手段と、を有
   し、該濡壁塔にて該培地液と該気体とを接触させ、気体
   の供給された培地液を該培地液循環路を介して培養槽に
   供給する付着性動物細胞の培養装置。 ９、前記多孔性物質がポリウレタン発泡体である特許請
   求の範囲第８項に記載の培養装置。 １０、前記ポリウレタンの分子内にペプタイドマトリッ
   クスが形成された特許請求の範囲第９項に記載の培養装
   置。 １１、前記ペプタイドマトリックスを形成するペプタイ
   ドがコラーゲン、アルブミンもしくはゼラチンである特
   許請求の範囲第１０項に記載の培養装置。 １２、前記ポリウレタン発泡体の発泡倍率が１０〜２０
   倍である特許請求の範囲第９項または第１０項に記載の
   培養装置。 １３、前記付着性動物細胞が、アフリカミドリザル腎細
   胞（Ｖｅｒｏ細胞）、正常コウモリ肺細胞（ＴｂｌＬｕ
   ）、上皮細胞（９４０ｃ３）、マウス線維芽細胞（３Ｔ
   ３）、ヒト横紋筋サルコーマ細胞（ＲＤ）、ヒト横紋筋
   サルコーマ細胞（Ａ２０４）、初代ヒナ胚線維芽細胞、
   チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、乳児ハム
   スター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣
   細胞（ＣＨＯ）、初代ヒナ胚線維芽細胞、初代胎児頬細
   胞、ヒト２倍体細胞（Ｗ１−３８．ＭＲＣ−５）、サル
   腎細胞（Ｖｅｒｏ、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＣＶ−１）、初代
   サル腎細胞、ヒト胚肺細胞（ＭＲＣ−５）、ウサギ腎細
   胞（ＲＫ−１３）、乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、
   ブタ腎細胞（ＩＢＲ−５２）、イヌ腎細胞、乳児ハムス
   ター腎細胞（ＢＨＫ）、ネコ肺線維芽様細胞または魚細
   胞である特許請求の範囲第１０項に記載の培養装置。 １４、前記培養槽が培養液中の生理活性物質を回収する
   手段を有する特許請求の範囲第８項に記載の培養装置。 １５、前記生理活性物質回収手段が限外濾過膜である特
   許請求の範囲第１４項に記載の培養装置。 １６、前記生理活性物質回収手段が前記培養槽に設けら
   れたバルブ付培養液排出口である特許請求の範囲第８項
   に記載の培養装置。 １７、前記培養槽に培養液攪拌手段を設けた特許請求の
   範囲第８項に記載の培養装置。 １８、前記濡壁塔の培地液流入口が該濡壁塔の壁面に沿
   って液留部を有する特許請求の範囲第８項に記載の培養
   装置。 １９、前記液留部に液流を層流にする層流創製手段を有
   する特許請求の範囲第１８項に記載の培養装置。 ２０、前記層流創製手段がビーズ状物である特許請求の
   範囲第１９項に記載の培養装置。