JPS62212569A - タンパク質ｃ―またはタンパク質ｓ―活性を測光により測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、特に血漿中のタンパク質Ｃおよび／まｔはタ
ンパクｖｉＳの活性を測光により測定する方法に関する
。

従来の技術 タンパク質Ｃは、血漿中の、ビタミンに関連の、２本側
鎖の糖タンパク質である。その合成は肝臓中で行なわれ
る。その際、まず初めに凝固生理的に不活性の前駆物’
Ｊｉ（デカルボキシ−タンパク質Ｃ）が形成される。ビ
タミンに依存性カルボキシラーゼによりタンパク質中の
γ−グルタミン酸基ｔカルボキシル化すると、タンパク
質Ｃが生じる。タンパク質Ｃ自体は酵素前駆体であシ、
トロンビンにより活性タンパク質Ｃに変わる。該活性タ
ンパク質は、活性凝固因子Ｖおよび■のタンパク質分解
不活住化によ択抗凝血物質として働く。活性タンパク質
Ｃの抗凝血作用は、補助因子タンパク質Ｓによ、り強化
される。タンパク質Ｓは、血漿中の１本鎖の、同様にビ
タミンに依存性塘タンパク質である。

活性タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓは、等モルの複合
体を形成する。タンパク質Ｃならびにタンパク質Ｓの血
中濃度の低下は、肝臓疾患、消費性凝固障害（ＤＩＧ　
）の患者においておよびワルファリン治療によっても報
告されている。

タンパク質Ｃまｍはタンパク質８の先天性欠乏は、静脈
血栓塞栓症の危険を伴なう。従ってタンパク質Ｃ１なら
びにタンパク／ＪＩＳは、生理的止血の場合ならびに多
くの疾病、とくに血栓症において重要でおる。

今まで市場で入手できるテスト方法では、血漿中のタン
パクｆＱＣの量が酵素で標識されｔ抗体に工す測定され
る。しかし、この方法は、測定に使用された抗体が上記
のデカルが卑シタンパク質Ｃとも反応するという欠点會
有する。デカルポキンタンパク質の血漿中濃度は、抗凝
固削処置の間にしはしは強く増加するので、この方法は
場合によっては間違つ九まｍは不十分な治療を生じる大
きな治療ミスをもたらす。

血漿中のタンパク／１ＩＣの免疫学的測定方法における
欠点は、該方法がタンパク質Ｃ分子の生物学的活性度に
関する情報を提供しないことである。名しく減少し丸生
物学的活性をホする異常なタンパクｉｃ（遺伝的変形）
の存在は、このような方法では見出すことができない。

Ｒ，Ｂ、フランシス（ｆ’１．Ｂ、　Ｆｒａｎｃｉｓ　
）およびＭ、、Ｔ、パッチＣＭ、、Ｔ、　Ｐａｔｃｈ　
）　［’　）　Ｈ７ポ７スーリサーチ（Ｔｈｒｏｏ＞ｂ
ｏｓｉｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　”第６２巻、第６０
５頁〜第６１３頁、１９８３年〕は、ヒトの血漿からの
活性タンパク質Ｃを部分的トロンボプラスチン時間の測
定（ＰＴＴ−テスト）により測定する方法を示している
。この方法では、クエン酸メリウムに吸着させて血漿か
ら分離し次タンパク質Ｃをトロンビンの添加により活性
化し、その後後者を抗トロンビンＩＧよびヘパリンの添
加に工り阻止する。ヘパリンは書度、そのつど新規に測
定すべき正確な量の硫酸プロタミンにより中和する。そ
の後、タンパクＣは部分的トロンボシラスチン時間によ
り測定される。この場合、指示系反応は、トロンビンに
より惹起されるフィブリノーゲンの分離およびフィブリ
ン凝血である。

ＬＭ、ペルチナ・工・アル（Ｒ，Ｍ、　Ｂａｒｔｉｎａ
ａｔ　ａｌ）　（’　）ロンルぐ・ヘモスタス（Ｔｈｒ
Ｏｍｂ。

）］ａｅｚｏｓｔａｓ　）”第５１巻、（１）第１頁〜
第５頁、１９８４）は、タンパク質Ｃ活性の測定の友め
の分光測光法を記載している。この方法は、６つの独立
した工程を包括している。

１、　　Ａｌ（Ｏ）１）３吸着によるタンパク質Ｃの単
離。

２、　血漿から分離され次タンパクｗｅのトロンビンで
の活性化、ならびに引続く等モル量の抗トロンビンＩお
よびヘパリンによるトロンーンの阻害。

３、　色原体基質（８２３６６”　Ｈｐ７Ｔｏ　−ｏｌ
ｕ　−Ｐｒ。

−Ａｒｇ−ｐＮＡ　）　ｆ用いる、単離され九活性タン
パク質Ｃのタンパク質分解活性の測定。

この方法は、この基質が同様に他の凝血ゾロテアーゼに
二っても分離されるので、タンパク質Ｃの特異性に関し
て不十分である。それにより、不正な結果が生じうる。

他の測光測定法においては、マムシ （Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　）
の蛇毒から得られ、２７パク質。活性剤プ。２ツク（Ｐ
ｒ。、Ｊ）〔ペンタファーム（Ｐａｎｔａｐｈａｒｔｏ
　）社製造１スイス在〕ならびに色原体タンパク質ｅｉ
償（２ＡｃＯＨ−Ｈ−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−１
）ＮＡ　）が使用される。この方法の場合、試料の鵡備
は断念し５る。しかし、この方法では、カルボキシル化
され九タンパク／１ＩＣとカルボキシル化されてないタ
ンパク’ｌｉｅと全区別することができない。

しかし、カルボキシル化され次タンパク質Ｃだけが生体
内で有効であることは公知である。従って、この方法で
は、タンパク質Ｃ分子の生物学的活性についての情報を
得ることはできない。

タンパクｗｅｔ測定する友めの他の公知の方法では、同
じくタンパク％Ｃ−活性剤としてゾ■ ロタツク　が使用される。その際、タンパク質Ｃの測定
は、活性剤添加後、内在性凝血システムに関する血餅形
成試験（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　−Ｔｅ５ｔ　）によって行
なわれる。この方法を用いると゛実際に、カルボキシル
化され窺タンパク質Ｃとカルボ中シル化されてないタン
パク質Ｃとを区別することは可能であるが、この方法は
、凝血形成（血餅形成）によって検出上行なわねばなら
ないという欠点を有する。それにより、特定の検出法〔
１ことえはへツケル（Ｈａｅｋａｌ　）法ま几はｌｉＢ
場法〕による測定は、妨害を受けやすくかつ自動化でき
ないことが立証されたことが判明している。

本出願人の以前の提案によればｐｃ−測定は、差肖りト
ロンビンを作用させて活性タンパク質ａｌ形成させ、そ
の後このトロンビンを不活性化し、引に６Ｃき凝固カス
クーｒＶｃよって新次に形成したトロンビンを、合成ト
ロンビン基質を用いて測定することによって行なわれる
。その場合芙際に、タンパク％Ｃなしで行った実験と比
較してトロンビン形成の緩慢化が測定される。

血漿中のタンパク質Ｓの蓋は、放射線免役測定試験、友
とえはペルチナ・工・アル（Ｂ＠ｔｒｌｎａｅｔａ１．
）”）ａ７ポ・ヘモスタス（ＴｈｒｏｍｂＨａａｎｏｏ
ｓｔａｓ　）″、第５６巻（２）、第２６８頁〜第２７
２頁ｒ１９８５年））により記載されているような放射
線免疫測定試験で測定することができる。しかしこの方
法は、測定のために使用される抗体が、非機能性タンパ
ク質＄１つまり九とえばデカルポ中シタンパク質Ｓま九
はＣ４ｂ−結合し次タンパク質により複合化されたタン
パク質Ｓと反応するという欠点を有する。この欠点は、
場合によっては、不正のタンパク質Ｓ値およびそ几によ
り不十分な治療を生じる。

同じ論文中に看者ベルチナおよび協力者は、ヒトの血漿
からの機能性タンパク質Ｓを測定することのできる方法
も記載している：ヒトの血漿に活性タンパク質ｃｅ７１
１＋合し、引続いてこの混合物の部分的トロンボプラス
チン時間（ＰＴＴ）を測定する場合、ＰＴＴは、機能性
タンパク質Ｓの濃度が大きければ大きいほどそれだけ長
（なる。この場合でも指示系反応は、トロンビンにより
惹起されるフイブリノーゲンの分離およびフィシリン血
餅形成である。従って、この方法は、妨害を受けやすく
刀１つ一般に自動化不可能な検出法である。該方法は、
精製され友活性タンパク質Ｃを添加しなければならず７
＋≧つ血漿中のタンパクｆＲＣおよびタンパク貿ｓ６同
時に測定することができないという他の欠点を有する。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、上述しｍ方法よりも簡単に実施できか
つ自動化可能である、生物学的に有効なタンパク質Ｃお
よび／またはタンパク質Ｓ七測光により測定する方法を
提供することである。

問題点を解決するための手段 この課題は、タンパク質（ｃ＆よび７１ｍはタンパク・
誓Ｓ′ｔ−同時に測定する九めに、蛇毒ρ１らのタンパ
クＩＭＣに対する活性剤、凝固系に対する活性剤および
色素トロンビン基質を同時に使用し、かつ凝固因子■′
ｉ？工びＶに対するタンパク質Ｃおよびタンパクｖｉ８
の作用上色素トロンビン形成の分離に１って測定するこ
とに孟って解決される。

本発明は、蛇″！Ｂからのタンパク質Ｃ−活性剤が他の
タンパクｗｅ−ｉ性剤と異なυ、トロンーン基質全分離
しないとい５篇くべき認識に基（Ｐｒｏｔａｃ■）、Ｉ
）Ｚ−’ｅ。作用が、。２ビｙ類似。２ンパク質Ｃ−活
性剤である丸め驚異的である。

それに従って、色素トロンビン基質もま上蛇毒−活性剤
ないしは活性剤とタンパク９ｉｅとの混合物にエリ変換
されることも期待される。それというのもトロンビンお
よび他の場合に公知のタンパク質Ｃ活性剤（例えばプラ
スミン、トリプシン）は色素トロンビン基質上変換する
からである。従って、この種のタンパク質Ｃ！古性削全
使用する場合、タンパク質Ｃの活性化の後に活性剤を不
活性化しなければならない。

引続いてはじめて凝固系に対する活性剤および色素トロ
ンビン基質を添加することができる。

しかし、蛇毒からのタンパク質Ｃ活性剤金使用する場合
、意外なことにこの不活性化工程を断念しうることが明
らかになる。むしろ、凝固系に対する活性剤シエび色素
トロンビン基質は既に測定開始の際に添加することが可
能である。

タンパク質Ｃ−活性剤としては、本発明の範囲内で、毒
蛇九とえばアゲ中ストロトン　コントルトリクス　コン
トルトリクス（Ａｇｋｉａ　ｔｒｏａｏｎｃＯｎｔＯｒ
ｔ、ｒｉＸ　Ｃ：ｕｎｃｏｒｔｒｌｘ　）、Ａ、Ｃ，モ
カセン（Ａ、Ｃ，ｍｏｋａａｅｎ　）、Ａ、Ｃ，ｔクチ
ガスター（Ａ、Ｃ，Ｐｉｃｔｉｇａｓｔａｒ　）、Ａ、
ビスシボウルス（Ａ、　ｐｉｓｃｉｖｏｕｒｓ　）、Ａ
、ｐ、Ｕイ＝＋ストマ（Ａ、ｐ、　　１ａｕｔ＝ｏａ℃
Ｏｍａ　）、Ａ、ピリネアトウス（Ａ、　ｂｉｌｉｎａ
ａｔｕｓ　）、ポトロゾス　モオジエニ（Ｂｏｔｈｒｏ
ｐａ　ｍｏｏｊｅｎｉ　）、Ｂ、シラトイ（Ｂ、　ｐｒ
ａｄｏｉ　）、セラステスセラステス（ｅｅｒａａｔｅ
ｓ　ｃａｒａｓｔｓａ　）、ピペラ　レペトリナ（Ｖｉ
ｐａｒａ　１ａｂｅｔｒｉｎａ　）またはＶ、ルセリイ
（Ｖ、　ｒｕａａθ１１１１）の蛇毒の溶液が使用され
る。

しかし、有利には、マムク（Ａｇｋｉａｔｒｏｄｏｎｏ
ｏｎｔＯｒｔｒｉＸ　　Ｃ０ｎｔＯｒｔｒｉＸ　）の蛇
毒から単離され次タンパク質Ｃ／２５注百〇が使用され
る。

有利には、血漿中でタンパクＩｌｌ　Ｃのみを活性化す
るｍ’１７ｔは毒成分が使用され、その際所望の毒成分
は蛇の毒から容易に分離することができる。

この几めには、一般に常用の方法、たとえば陰イオン交
換体クロマトグラフィー、タンパク質Ｃ？！−用いるア
フィニティークロマトグラフィー″！次は／および限外
濾過を使用することができる。

活性剤は、活性剤溶液１−あたりの単位（ＴＪ）で０．
０５〜５　Ｕ／　虹、有利には０−５〜Ｉ　Ｕ／　ａｔ
の濃度で使用される。この場合タンパクＩｔＩＣ活性剤
１単位（ＴＪ）は、正常のヒトのクエン酸血漿１ｒｕｂ
中に含まれている量のタンパク質Ｃ１に５７°Ｃ１ｐ８
７〜８で、血漿１容量部とタンパクｔＢｃ活性剤水溶液
４〜８容量Ｓからなる反応混合液中で完全に活性化する
量として定義され工いる。

活性タンパク％　ｃ　（ＡＰＣ）は凝固因子■お二び■
を不活性にし、その際タンパク質Ｓは補助因子として働
くので、本発明による方法の場合には有利に凝固系は、
凝固因子に対する活性剤または凝固因子自身の添加によ
って変えられ、因子Ｖないし■の不活性化はトロンビン
形成のできるだけ覇者な減少に現われる。

本発明方法のｗｋｌの実施態様によれは、これは有利に
、因子■に対する活性剤、文とえはケファリンを添加し
九エッグ酸を添加することによって達成される。このす
ぐれｔ方法の第２の実施態様によｎば、因子■の活性剤
、友とえばトロンボシラスチンおよび因子■の活性剤が
添加される。第３の実施態様によれば、因子■の活性剤
として、ケファリンを添加し次因子Ｘ＆が添加される。

通常は、この場合に使用される緩衝液はなカ符加的にカ
ルシウムイオンを含有する。

この有利な本発明の実施態様は、凝固パラメーターであ
る因子■、’ｉ［％　■、Ｘ１ｖおよび皿の濃度がトロ
ンビン形成時間に影響を与え、これらの因子の濃度が高
ければ高いほど、特定のトロンビン限界唾の測定はます
ます速く達成されるという事実を考慮する。

トロンビン形成は、本発明の範囲内では、自体公知の方
法で測定される。これに適しているのは部分−トロンボ
ブラステン時間（ＰＴＴ　）法である。これを実施する
場合には有利に、因子■の活性剤が添加される。トロン
ビン形成は、／ロトロンｔン時間方法によっても測定す
ることができる。この場合には、有利に因子■の活性剤
および因子Ｖａが添加される。

色素トロンビン形成としては、本発明の範囲内で、トロ
ンビン測定に通し九色素基質が使用される。有利には、
本発明の範囲内でＨ−Ｄ−Ｐｈａ　−Ｐｉｐ　−Ａｒｇ
−１）ＮＡまｔはＴｏｅ　−Ｇ１７−Ｐｒ。

−Ａｒｇ−ｐＮＡ　（式中ｐＮＡ　＝パラ・ニトロアミ
ンを表わす）が使用される。ｐＮＡは基質の色素成分で
あシかつトロンぎン形成により分離さｎるので、測光に
ニジ公知方法で測定することができる。

凝固系としては、九とえば因子■〜■ま九は基質血漿（
例えばタンパク質ｃ−ないしタンパク質Ｓ欠乏血漿）が
使用される。

本発明の範囲内では、さまざまな血漿を使用することが
でき、有利にはクエン酸血漿が使用される。

この方法は、中性まｍは弱アルカリ性−値、とくに−６
〜９０間のβ値に訃いて実施することができる。緩衝溶
液としては、この範囲において有効で生理的に懸念のな
い緩衝溶液、たとえば’ｒｒｔｓ　／　）１（Ｊが使用
される。さらに、凝固試験に常用の安定剤および保存剤
、九とえば牛血清アルブミン、メルチオレート等も同様
に添加することができる。

本発明による方法を用いると、タンパク質Ｃおよびタン
パク質Ｓは一緒にかまたはタンパク質Ｃないしはタンパ
ク質ｓｔ−それぞれ単独に測定することができる。

タンパク質ＣおＬびタンパク質ｓｔ−−緒に測定する場
合には、患者の血漿を直接に測定のｍめに使用すること
ができる。タンパク質Ｃ１−単独で測定する場合には、
試薬以外になおタンパク質Ｃを添加しなければならない
。これは有利に、タンパク質Ｓｔ−含有する、タンパク
質Ｃ欠乏血漿の形で行なわれる。この場合でも、少なく
とも予想されるタンパク質Ｓ濃度と同量のタンパク質Ｃ
が添加しなければならない。

タンパク質Ｓ−ないしはタンパク質Ｃ−欠乏血漿は、九
とえはベルチナおよび協力者”　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｂａ
ｅｍｏｇｔａｓ”（シュトットガルト）第５１巻第１頁
〜第５頁ｒ１９８４年）ないしはベルチナおよびＲ，Ｍ
、　、　ａｔ　ａｌ、”　Ｔｈｒｏｃｏｂ。

Ｈａｓｍｏｓｔａｓ、第５３巻第２６８頁〜第２７２頁
（１９８５年）に記載さ−ｎｍような免疫吸着りｃＩマ
ドグラフィーによって製造できる。

実施例 本発明を以下の実施例は、添付図面（第１図）と関連し
てさらに詳説するものである。格付図面には、タンパク
質Ｃ−活性測定の校正曲線が図示されている。活性剤を
有するかないしは有しないトロンボシラスチン時間の割
合（比）は、血漿中のタンパク質Ｃのパーセンテージ濃
度に対して７’ｏツトされている。

例１　マムン毒からの高純度のタンパク１ｆＲＣ活性銅
製剤の製造 −ｖ　Ａ　シ（Ａ、　Ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　）毒１．
１−水１０　Ｑｍｔに溶解し、この溶液のβ値１ｋＱ’
−ホスホン酸０．３モル／ｌで６．０にし、酸性の蛇毒
溶液を１０分間水浴中で７０±２°Ｃに保ち、引続き２
０００に冷却し、−値をカセイソーダ（１千））で７．
２にする。この個濁液を遠心分離し、上泄みｔ蒸留水で
体積１００祷に希釈し、こうして予備精製した樹画分を
得る。

予備精製した毒両分會、リン酸ナトリウム緩備液１１あ
ｇｇ　ｏ、ｏ　１５−ｖ＝ル（ｐ）１６．８　）で平衡
［Ｆ］ 化しＤＥＡＥ−セファデックス（５ｅｐｈａｃＬｅｘ　
　）　Ａ−５０を有するサイズ２．６Ｘ９０ｃｍＯカラ
ム上液０．０１５モル／１（ｐｋ１６．１３＞中の塩化
ナトリウム０．４−ｅル／ｌからなる直線勾配の混合液
で溶離しかつそれぞれ２０−の両分を捕集する。

個々の両分のタンパク質Ｃ活性作用を、ヒトのクエン酸
血漿０．１−に、試料（水に１　：３５０に希釈し皮画
分）　Ｃ１，１＋ａｊおよび試料・エラグ酸試乗〔アク
チン（Ａａｔ１ｎ■〕０．１−および０．０２５モル／
ｌの塩化カルシウム溶液０．１　ｄを加え、すぐにスト
ップウォッチを作動させ凝固までの時間を測定すること
により詞ぺる。タンパクｌｅ活性剤を含有する試料は、
活性剤含量に応じて、３４秒の凝固時間を２００秒にま
で延長する作用を有する。

（ｐ）１０．５　）により平衡し７’ｌ−１−１Ｃセフ
ァデックモル／ｌ中の塩化ナトリウム０．４モル／ｌか
らなる直線勾配の混合液で溶離し、それぞれ２０ｒＩＬ
ｔの両分を捕集し、該両分上上記方法に従ってタンパク
質Ｃ活性化作用を調べる。

タンパク質Ｃ活性化画分金−緒に混合し、限外濾過によ
りその容積ｋ　／２１５に濃縮し、蒸留溶離し、かつそ
ｎぞれ２０ＷＬｔの両分を捕集し、この画分を再び上記
方法に従ってタンパク質Ｃ−活性作用を調べる。

タンパク質Ｃ−活性画分を合しかつ凍結乾燥する。無地
の活性剤製剤が得られ、このものはポリアクリルアミげ
ｒルー電気泳動で唯一のパンＹおよび３５Ｕ／＃のタン
パク質Ｃ活性化の活性を示す。

タンパク／ｊｌＣ−活性剤の単位ｃ℃）は、正常のヒト
のクエン酸皿漿１ｍＡ中に含有さｎているタンパク質Ｃ
の量を完全に活性化する量である。

例２　部分的トロンボシラスチン時間を延長による活性
タンパク質Ｃの測定Ｃ例１によるタンパク／ｊ＆［Ｃ−
活性化剤の存在で）希釈しｔ血漿試料（０，９％の塩化
ナトリウム溶液により１＋４）２５μｌ十タンパク’ｍ
ｅ欠乏の正常血漿２５μｌおよび、トリス／Ｈα１０ミ
リ七ル／１（−７，６）中のケファリンおよびエラグ酸
からなる試乗５００μｌｋ、プラスチック製クベット中
で３７℃で温置する。正確に１分後、 １、例１によるタンパク質Ｃ−活性剤２０μｌ（濃度：
フラスコ内容物＝　０．９１のＮａ１ｌ溶液３−中３ｔ
））ま曳は ２、　０．９１ＯＮａｃｚ溶液２０　μｄ　ｔ−添加し
、混合しかつさらに温置する。正確に４分後、クロム１
００ミリモル／ｌからなる出発試６１５０μｌを添加し
かつ光度計中４０５　ｎｔｏで規定量の基質が新しく生
じたトロンーンにエリ’ｐｏｓ　−０１７−Ｐｒｏ　−
Ａｒｇおよびバラニトロアニリン（ｐＮＡ）に変換され
るまでの時間を測定する。変換されｋＭｉ質の測定量は
、限界吸光値（例えば茂＝０．２）によって定義される
。

記載され次条件下で、部分的トロンがシラスチン時間は
、活性剤プロタックを混合物中に添加し几場合、血漿試
薬中のタンパク質Ｃの濃度に比例して増加する。部分的
トロンボプラスチン時間はとりわけ血漿の因子含量に依
存するので、０．９％のＮａＣｊ−溶液により９値を一
緒に測定するのが有利である。活性剤を用いるＰＴＴ時
間と活性ＭなしのＰＴＴ時間との割合は、タンパク質（
：含量の尺度である。さまざまの公知タンパク質Ｃ濃度
の血漿試料を用いて得られる校正曲線により未知の血漿
試料のタンパク質Ｃ濃度全決定することができる。表に
は、３つの例、未知のタンパク實Ｃ濃度の血漿試料が含
まれている。

表　　１ 血漿希薄液および血漿試料中の活性タンパク質Ｃ１ＣＬ
るｎ゛ｒ１時間長 脣　ＢＭの！！：ＬＩ　８Ａ−テスト使用

【図面の簡単な説明】

第１図は、活性剤を肩する場仕と宿しない場合の部分的
トロンボプラスチ／時間の比を、血漿中のタンパク質Ｃ
の濃度（’４）に対してプロットしたタンパク質活性測
定の校正曲線図である。 ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質Ｃ−および／またはタンパク質Ｓ−活性
   を測光測定する方法において、測定すべきタンパク質Ｃ
   および／またはタンパク質Ｓを含有する試料を、蛇毒か
   らのタンパク質Ｃ−活性剤と共に、活性タンパク質Ｃお
   よび／または活性タンパクＳの形成下に温置し、かつ凝
   固因子およびその活性剤により仲介される、プロトロン
   ビンからのトロンビンの形成の減少を、色素トロビン基
   質を使用して測定することを特徴とするタンパク質Ｃ−
   および／またはタンパク質Ｓ−活性を測光測定する方法
   。 ２、タンパク質Ｃ−活性剤としてマムシ（アグキストロ
   ドン　コントルトリクス　コントルトリクス）の蛇毒ま
   たはそれらの成分の溶液を使用する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、タンパク質Ｃ−活性剤として蛇毒Ａ，Ｃ，モカゼン
   、Ａ，Ｃ，ピクチガスター、Ａ，ピスチポウルス、Ａ，
   Ｐ，ロイコストマ、Ａ，ビリネアトウス、ポトロプス−
   モオジユニ、Ｂ，プラドイ、セラーステス−セラステス
   、ビペラ−レベトリナまたはＶ，ルセリイを使用する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、色素トロンビン基質としてＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ
   −Ａｒｇ−ｐＮＡまたはＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒ
   ｇ−ｐＮＡを使用する特許請求の範囲第１項から第３項
   までのいずれか１項記載の方法。 ５、因子ＸIIの活性剤を添加する特許請求の範囲第１項
   から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６、ケフアリンおよびエラグ酸を添加する特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ７、因子VIIの活性剤を添加する特許請求の範囲第１項
   から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ８、因子Ｖならびに因子VIIの活性剤としてトロンボプ
   ラスチンを添加する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、因子IIの活性剤を添加する特許請求の範囲第１項か
   ら第４項までのいずれか１項記載の方法。 １０、ケフアリンおよび因子Ｘａを添加する特許請求の
   範囲第９項記載の方法。 １１、タンパク質Ｃ−欠乏血漿を添加する特許請求の範
   囲第１項から第１０項までのいずれか１項記載の方法。 １２、タンパク質Ｓ−欠乏血漿を添加する特許請求の範
   囲第１項から第１０項まてのいずれか１項記載の方法。