JPS62170850A - 免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サンドイツチ法による酵素免疫測定法の改良
法に関する。

〔発明の背景〕

生体中の多くの生理活性物質は抗原性を有する物質であ
り、これらの物質の抗体との免疫化学的結合反応が非常
に特異的且つ鋭敏であるので、この抗原−抗体免疫化学
反応を利用して抗原性被検物質又はそれらの物質に対す
る抗体を測定しようとする試みは数多く行われており、
既に多くの免疫化学的測定法が実用化されている。なか
でも抗原或は抗体を放射性同位元素で標識する放射免疫
測定法（ラジオイム／アッセイ法（ＲＩＡ））と酵素で
標識した酵素免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ法
（ＥＩＡ））は、他の方法に比べ測定感度が非常に高く
定量性に優れている為、その応用範囲は広く、種々の生
理活性物質の測定に応用されている。

ＥＩＡ及びＲＩＡの測定原理は共通しており、汎用の方
法は拮抗結合法及びサンドイツチ法である。例えば検体
試料（血清又は尿等）の中の未知抗原の検出の為の代表
的サンドイッチ技法に関しては、未知抗原検出用抗体を
固相担体表面に結合させ、これと被検抗原とを反応させ
る、固相担体表面を洗浄後、該表面と標識化抗体とを反
応させ、結合した標識抗体の量を指標として被検抗原量
を算出する。拮抗結合法に於ては固相担体表面に結合し
た抗体と被検抗原を反応させると同時に、標識抗原とも
反応させ、該表面上に結合した標識抗原の量から検体中
の未知抗原の量を算出する。同様に検体試料中の未知抗
体を検出する系も行うことが可能である。例えば固相担
体表面に抗原を固定化したものを被検抗体を含む試料と
反応させ、更に標識抗免疫グロブリン抗体と反応させる
ことによって固定化抗原−被検抗体一標識抗免疫グロブ
リン抗体のサンドイッチ複合体を形成し、かようにして
固相担体表面に結合した標識抗体の量を算出することに
より被検抗体の量を算出することができる。

標識剤としては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等が
あるが、放射性同位元素や蛍光物質を用いる方法では測
定にあたり特殊な専用施設や機器が要求される。一方酵
素を標識剤として用いた場合にはこれに対応する基質を
着色物質に変換することによって比色法での検出、測定
が可能となる。

酵素標識を用いるサンドイッチ型の比色免疫測定法によ
る液体試料中の被検抗原の検出法は、公知文献［例えば
Ｗａｄａ　Ｈ，Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃ
ｈｅｗ、。

υ、　１８８２−１８６１３　（１９８２）等］に述べ
られている通りである。即ち、通常は被検抗原に対する
２種類の抗体を用い、一方は水不溶性担体に結合させ、
他方は適当な酵素で標識する。そして、先ず被検抗原を
含む試料と担体に結合した固定化抗体とを反応させ、次
いで相分離及び洗浄後、固定化抗体に免疫反応によって
結合した抗原に、第二の酵素標識した抗体を反応させる
。再び相分離後、標識酵素に対応する基質を用い酵素反
応を固相又は液相の何れかで行い、被検物質を定量する
。

酵素反応を液相で行う方法としては１例えば、先ず、基
質含有溶液に水不溶性担体上に生成した酵素標識を含む
免疫化学反応生成物を接触させる。基質は酵素存在下に
変色を起こすが、この反応を停止させる為に化学的反応
停止剤を加える。

そうして、溶液中の可溶性基質の変色度を吸光度の測定
により或は肉眼的に判定する。しかしながら、このよう
な系では、先ず、酵素反応停止剤が必要であり、又吸光
度を測定する場合には測定機器が必要である。さらに、
このような溶液の場合試験成績の永久保存は実際的に不
可能である。又不溶性担体上から基質溶液中に遊離して
くる標識抗体による測定値のバラツキの可能性があるな
ど種々問題点が多い。

一方、酵素反応を固相上で行う方法では、例えば水不溶
性担体上に固定された免疫化学反応生成物を標識酵素に
対応する可溶性基質を含有する溶液と接触させ、この基
質を不溶性着色物質へ変化させ、これを固相上に沈積さ
せる。その後に固相を基質溶液から分離し、これを肉眼
的に読み取り被検抗原を定量する。この方法によれば固
相上での酵素反応は固相自身を基質溶液から分離し洗浄
することによって簡単に終結させることが可能となり、
化学的反応停止剤は不要である。又、呈色した固相担体
は、試験成績の記録として永久保存が可能である。遊離
した酵素標識抗体による反応は、固相上の酵素反応には
影響しないからバラツキの原因とはならない。

サンドイツチ法による酵素免疫測定法では、担体に固定
化した抗体と抗原、更に酵素標識した抗体の王者間の免
疫化学反応生成物を形成させるのに、通常、二つの方法
がある。その一つは担体に固定化した抗体と被検抗原を
含む液体試料を接触させる第１反応と、分離洗浄工程に
酵素標識抗体と反応させる第２反応の２段階のインキュ
ベーション反応工程を順次行う２ステツプ法であり、他
の一つは酵素標識抗体を予め被検抗原を含む試料溶液中
に添加しておくことによって免疫反応をｊ段階のインキ
ュベーション反応工程で行う１ステツプ法である。２ス
テツプ法はインキュベーション並びに分離洗浄工程が２
回あるので明らかに操作が煩雑である。これに対しｌス
テップ法は固定化抗体だけに関してみれば、１回のイン
キュベーション並びに１回の分離洗浄操作だけであり、
２ステツプ法に比べて操作が容易であるが、別に用意し
である標識抗体を予め被検抗原を含む試料溶液中に添加
、混和する操作があるので必ずしも充分満足し得るほど
簡便な方法であるとは云えない。

〔発明の目的〕

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、サン
ドイツチ法による酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於て、１
回のインキュベーション操作で不溶性担体上に固定化抗
体−被検抗原−標識抗体、又は固定化抗原−被検抗体一
標識抗免疫グロブリン抗体なる免疫反応生成物を形成せ
しめ得る、より簡便で、より効果的な方法を提供するこ
とを目的とする。

抗原又は抗体の測定方法に於て、測定対象の抗原又は抗
体に対応する抗体又は抗原を不溶性担体の表面に化学的
或は物理的に結合させて固定化した後、更に該固定化抗
体又は抗原の表面を、酵素で標識した、測定対象抗原に
対応する抗体又は抗免疫グロブリン抗体で重層、被覆し
た不溶性担体・抗体結合物又は不溶性担体・抗原結合物
を用いてこれを行うことを特徴とする抗原又は抗体の測
定方法である。

即ち、本発明者らは、不溶性固相担体上での比色定量に
より測定を行うサンドイツチ法酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ
　Ａ）に於て、免疫反応を１回のインキュベーション操
作で完了できるより簡便な方法を求めて鋭意研究を重ね
た結果、不溶性担体上に固定化した抗体又は抗原の表面
に更に酵素標識抗体を重層、被覆し、二重層として重層
固定化する技術を開発、該固定化物を用いることにより
測定対象抗原又は抗体を含む被検試料液に１回インキュ
ベーションするだけで不溶性担体上に固定化抗体−被検
抗原−標識抗体、又は固定化抗原−被検抗体一標識抗免
疫グロブリン抗体なる免疫反応生成物を容易に形成せし
めることが可能となり該免疫反応生成物を担持した不溶
性担体を、酵素反応により不溶性着色物質（不溶性色素
）を生成し得る該標識酵素の基質を含有する溶液と接触
させることにより求める抗原又は抗体を比色定量できる
ことを見出し本発明を完成するに到った。

本発明の方法によれば、測定すべき抗原又は机上に担持
させであるので、被検物質を含む試料との唯一回のイン
キュページ諺ンで不溶性担体上に免疫反応生成物を形成
でき、従って唯一回の相分離後、好ましくは洗浄し、次
いで酵素反応を行わせることにより被検物質を検出する
ことができる。

本発明に於て、被検物質に対する抗体又は抗原を水不溶
性担体表面に固定化する固定化の方法としては自体公知
のＥＩＡ又はＲＩＡに於て一般に行われている自体公知
の固定化方法が何れも例外なく挙げられる。即ち、固体
表面に物理的吸着によりこれを行ってもよいし、化学的
にアミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、メルカ
プト基、アミド基等の官能基を利用し架橋剤を用いてカ
ップリングさせることによりこれを行うこともできる。

本発明で用いられる不溶性担体としては例えば、ポリス
チレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、変性セルロース、ポリアクリルアミド等の高分子化
合物やガラス、シリカゲル、金属酸化物等の無機物質等
、ＥＩＡ、ＲＩＡに於て通常用いられる自体公知の担体
が何れも使用可能である。これら担体を本発明に於て使
用する際の好ましい形態としては、例えば球状、棒状、
シート状、薄板状（スティック状）等′が挙げられるが
これらに限定されるものではない。

本発明は上記した水不溶性担体に固定した抗体又は抗原
の上に、第２の抗体即ち酵素標識抗体を重層、被覆、固
定化するところに大きな特徴を有する。

本発明に於て第一層の固定相の上に第二層を重層固定化
させる方法としてより好ましい方法は、水溶性の層（又
は被膜）形成剤を用い、これらを含有させた酵素標識抗
体で簿い被膜を作ることにより、二重の層を形成せしめ
る方法である。水溶性の層（又は被膜）形成剤としては
、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマ
ー等の合成高分子化合物、デキストラン、可溶性デンプ
ン、ショ糖等のポリサッカライド、メチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース等のセルロース誘導体、水溶性ゼ
ラチン、カゼイン等の蛋白質、グリセリン等が挙げられ
る。

酵素標識抗体は安定化されてこれら水溶性の層（又は被
膜）形成剤を含む溶液に溶解し、物理的吸着によって、
第一の固定層の上に積層される。

第一の固定層の上に積層された水溶性の層（又は被膜）
形成剤を含む酵素標識抗体の層は、被検試料液中に於て
容易に剥離し、該酵素標識抗体は被検試料中の測定対象
抗原又は抗体と速かに反応して測定対象抗原−酵素標識
抗体、又は測定対象抗体−酵素標識抗免疫グロブリン抗
体なる免疫反応生成物を形成し、次いで該測定対象抗体
又は抗原と第一の固定層即ち不溶性担体に固定化された
抗体又は抗原と免疫化学的に反応することにより固定化
抗体−被検抗原−酵素標識抗体、又は固定化抗原−被検
抗体一酵素標識抗免疫グロブリン抗体なる、目的とする
免疫複合体サンドイッチが形成される。

本発明に於て標識酵素として用いられる酵素としては１
例えば、アルカリ（性）ホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ等が
挙げられる。

本発明に於て酵素反応を検出する為の基質としては、酵
素反応によって不溶性着色物質（不溶性色素）として固
相表面に沈積するものが望ましい。例えば表１に示した
ような基質が代表的なものとして挙げられれるが、これ
らに限定されるものではない。

表　　　１ 本発明に於て抗原を検出測定する為に用いられる不溶性
担体上に固定化される第１の抗体と、その上に重層、被
覆する、酵素で標識した第２の抗体とは同一の抗体であ
っても、異種の抗体であってもよい。これらの抗体は動
物で作られた抗血清から単離したポリクローナル抗体で
もよいし、細胞融合の技術で作製されたモノクローナル
抗体でもよいが、被検抗原に対して少なくとも２つ以上
の異なる抗原部位（エピトープ）を認識するものである
ことがサンドイツチ法を組む上で絶対不可欠である。

又、本発明に於て抗体を検出、測定する場合には、通常
、酵素標識抗原の代りに酵素標識抗免疫グロブリン抗体
が好ましく用いられる。

本発明の方法により測定可能な免疫学的に活性な物質と
しては、例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロヒ０ン（ｈＣＧ
）、ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）、プロラクチン、イ
ンスリン等のホルモン、或は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、
α−フェトプロティン（ＡＦＰ）等の癌抗原、或はγ−
グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、アミ
ラーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素蛋白、或は臨
床的に注目されているウィルス、例えば、ルベラウィル
ス、ヘルペスウィルス、肝炎ウィルス、ＡＴＬウィルス
、ＡＩＤＳウィルス等に対する抗ウイルス抗体等、或は
ハブテンとなり得る物質、例えば、コルチゾール、プロ
ゲステロン等のステロイドホルモン、トリヨードサイロ
ニン、サイロキシン等の甲状腺ホルモン、ジゴキシン、
モルヒネ、ニコチン等の薬物等が挙げられるが、これら
に限定されるものではなく免疫反応を利用して測定可能
な免疫活性物質は本発明の方法により何れも測定可能で
ある。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではな
い。

実施例１　固定化抗体及び酵素標識抗体の両方を担持し
た不溶性担体の製造 押出し成形されたポリプロピレンの浸漬片（スティック
）　（８，ＯＸ　８７Ｘ　３　ａｍ）の一端（抗体吸着
部分８×１５■鳳）をｈＣＧに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体１ａｇ／ａ／とＮａＣｌ　Ｏ，８Ｗ／Ｖを含
有する１０１１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ　Ｓ）　（ｐＨ７
，３）中に３７℃で２時間浸漬することによって不溶性
担体スティック上に抗ｈＣＧモノクローナル抗体を担持
させた。

該抗体は公知方法（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ。

↓、　４９５−４９９　（１９７５））に従ってｈＣＧ
を免疫したマウスの牌臓リンパ球とマウス骨髄腫細胞（
ＭＳ−１）との細胞融合及びその後のクローン化によっ
て得られたものを使用した。

過剰の抗体を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢｓで
洗浄除去した後、３％ショ糖及び１％ＢＳＡ　（牛血清
アルブミン）を含むＰＢｓ中に室温で２時間浸漬し、然
る後、これを取り出しスティックを風乾した。

別に、ｈＣＧのβ−サブユニットのカルボキシル末端部
分（構造アミノ酸配列１１１−１４５位に相当する）に
対する合成ペプチド［ペプチド合成は固相法（Ｇ、　Ｂ
ａｒａｎｙ、　ａｄ　Ｒ，Ｂ、　Ｎｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
、↑ｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、　２．１−２８４．１９８
０）を用いて公知文献（Ｓ、　Ｍａｔｓｕｕｒａ、　Ｈ
，Ｃ，Ｃｈｅｎ、　ａｄ　Ｇ、Ｄ、Ｈｏｄｇｅｎ、　Ｂ
ｉｏ−ｃｈｅｍｉｇｔｒｙ、　１７．５７５−５８０．
１９７８）に従ッテ行った。Ｊを家兎に免疫して作製し
たポリクローナル抗体を同様の方法でスティックに固定
したものを作製した。一方ｈＣＧのβ−サブユニットに
特異的なモノクローナル抗体を先に引用したＫｏｈｌｅ
ｒＨｄ　％１ｌｓｔｅｉｎの方法に従って作製し、次い
でこの抗体を公知の方法（Ｅ、　Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７０．４
１Ｌ４８３　　（１９８３））に従って牛腸内アルカリ
ホスファターゼと接合させ酵素標識抗体とした。得られ
た標識抗体は約２：１の酵素対抗体比を有していた。該
標識抗体を活性抗体量に基づき濃度的３０ｐ９／ｙｄで
８０％シヨ糖、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭＰ　Ｂ　Ｓに
溶解した。

この溶液中に先に作製したモノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体をあらかじめ固定したスティックの抗体
相持部分を３７℃で２時間浸漬し、然る後これを取り出
し風乾した。このようにして第一固定化抗体の上に酵素
標識抗体を重層被覆した、固定化ＪＭ４及び酵素標識抗
体の両方を担持した不溶性担体スティックを作製した。

実施例２　サンドイッチ型酵素免疫測定法によるｈＣＧ
の測定 ０〜１０００　ｔｍｌＵ／ｗ＝１のｈＣＧを含有する尿
試料の夫々の中に、実施例１で製造したスティックを抗
体を重層固定している先端部分が完全に浸漬されるよう
にして浸漬し、室温で１５分間保持した。

次いでこのスティックを尿試験より取出し、蒸留水を入
れたビーカー内でスティックをまわしながら充分洗浄し
た後、過剰の水を濾紙上で軽く吸いとりｌｄの基質溶液
中に入れた。この基質溶液は０．８Ｘ　ＮａＣ１，１ｍ
Ｍ　Ｍｇｃ１２．０．１Ｘ　ＮａＮ３を含む０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）中にＮＰＭＸ（３−ハイ
ドロキシ−２−ナフト−２’　、４’−キシリジンージ
ハイドロゲンホスフェー）　）　０．１ｍｇ／ｄ及びフ
ァーストレッＦＴＲ（５−クロロ−２−トルエンジアゾ
ニウムクロライド）　Ｏ，Ｂ＋＊ｇ／ａｄを溶解したも
のである。室温１０分間反応を行い、この時点でスティ
ックを基質溶液から取り出し水を吸取紙で吸取り風乾し
た。

試料中のｈＣＧ量に比例する桃色の呈色により尿中ｈＣ
Ｇの夫々の量がスティック上に示された。ｈＣＧを含ま
ない尿試料については、スティックは無色で呈色しなか
った。第１抗体に抗ｈＣＧのモノクローナル抗体を用い
た系も、抗ｈＣＧβ−カルボキシル末端ペプチドのポリ
クローナル抗体を用いた系も同様にｈＣＧを検出できた
。

同様にｈ　Ｌ　Ｈ（０−１０００１００Ｏ／１ｍ１）を
含む尿試料を用いて該測定法を応用した検出を行ったと
ころ、第一抗体に抗ｈＣＧのモノクローナル抗体を用い
たスティックでは、ｈＬＨ量に比例して桃色の呈色を示
し、ｈＣＧのみでなくｈＬＨも検出することが判明した
。

一方第一抗体に抗ｈＣＧβ−サブユニットのカルボキシ
ル末端ペプチドのポリクローナル抗体を用いたスティッ
クではｈＬＨの存在に起因する呈色反応は起らず、特異
的にｈＣＧのみを検出できた。

未知検体は、上述した標準ｈＣＧ試料での呈色と肉眼的
に比較することにより半定量的に測定することが可能で
あり定性的に肉眼判定することによって妊娠診断が可能
となった。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明はサンドイツチ法ＥＩＡの極め
て簡便で効果的な方法を提供するものであり、本発明の
方法によれば従来の１ステツプ法のそれと異なり、抗体
又は抗原を固定化した不溶性担体上に標識抗体又は標識
免疫グロブリン抗体も一緒に担持されているので、これ
らを別に用意したり、測定に際してこれらを予め被検試
料液中に添加混合したりする必要がなく、唯一回のイン
キュベーション及び洗浄操作で不溶性担体上に固定化抗
体−被検抗原−標識抗体、又は固定化抗原−被検抗体一
標識抗免疫グロブリン抗体なる免疫反応生成物を形成さ
せることができる点に甚だ顕著な効果を奏するものであ
る。

特許出願人　和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和６１年２月３日 １、事件の表示 免疫化学的測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目ｌＯ番地４、補正
命令の日付 ５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説明の欄
。

６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙の通り補正する。

（２）明細書４頁１３行目に記載の「反応させる、」を
「反応させる。」と補正する。

（３）明細書６頁１１行目から１２行目にかけて記載の
「接触させる。」を「接触させる。」と補正する。

（４）明細書９頁１３行目に記載の「測定対象抗原」を
「測定対象抗原又は抗体」と補正する。

（５）明細書１３頁１２行目に記載の［該測定対象抗体
又は抗原」を「該測定対象抗原又は抗体」と補正する。

（６）明細書１６頁ｌＯ行目に記載の「酵素標識抗原」
を「酵素標識抗体」と補正する。

（η明細書１７頁１９行目ニ記載）ｒＯ，８Ｗ／ＶＪを
ｒＯ，８Ｗ／Ｖ％」と補正する。

（８）明細書１８頁１６行目に記載のｒＢａｒａｎｙ、
　ａｄをｒＢａｒａｎ７　ａｎｄＪと補正する。

（９）明細書１８頁１８行目に記載のｒｃｈｅｎ、　ａ
ｄＪをｒＣｈｅｎ　ａｎｄＪと補正する。

員明細書２０頁７行目に記載の「尿試験」を「尿試料」
と補正する。

Ｃ１１ｌ明細書２２頁８行目に記載の「標識免疫グロブ
リン抗体」を「標識抗免疫グロブリン抗体」と補正する
。

以上 別　　　紙 ２、特許請求の範囲　　　□ （１）　　サンドイッチ型の酵素免疫測定法による抗原
又は抗体の測定方法に於て、測定対象の抗原又は抗体に
対応する抗体又は抗原を不溶性担体の表面に化学的或は
物理的に結合させて固定化した後、更に該固定化抗体又
は抗原の表面を、酵素で標識した、測定対象抗原区炭抗
１に対応する抗体又は抗免疫グロブリン抗体で重層、被
覆した不溶性担体・抗体結合物又は不溶性担体・抗原結
合物を用いてこれを行うことを特徴とする抗原又は抗体
の測定方法。

（２）　　標識酵素の基質として、酵素反応により不溶
性着色物質となって固相表面に沈積する基質を用い、固
定化抗体又は抗原の表面を、酵素で標識した、測定対象
抗原又抜五遵に対応する抗体又は抗免疫グロブリン抗体
で重層、被覆した不溶性担体争抗体結合物又は不溶性担
体・抗原結合物を、測定対象抗原又は抗体を含む被検試
料液中にインキュベートシて不溶性担体上に固定化抗体
−測定対象抗原−標識抗体、又は固定化抗原−測定対象
抗体一標識抗免疫グロブリン抗体なる免疫反応生成物を
形成せしめた後これを該基質を含有する溶液と接触させ
て固相上に不溶性の酵素反応生成物（不溶性着色物質）
を沈積させ、その着色を肉眼的に或は測定機器を用いて
測定することによりこれを行う特許請求の範囲第１項記
載の測定方法。

（３）水溶性の層（又は被膜）形成剤を用いて酵素標識
抗体又は酵素標識抗免疫グロブリン抗体を固定化抗体又
は抗原に重層、被覆する特許請求の範囲第１項又は第２
項記載の測定方法。

（４）　　水溶性の層（又は被膜）形成剤が、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレング
リコール、カルボキシビニルポリマー等の合成高分子化
合物、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等のポリ
サッカライド、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ
エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス等のセルロース誘導体、水溶性ゼラチン、カゼイン等
の蛋白質、又はグリセリンである特許請求の範囲第１項
〜第３項のいずれかに記載の測定方ン斂。

以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）サンドイッチ型の酵素免疫測定法による抗原又は
   抗体の測定方法に於て、測定対象の抗原又は抗体に対応
   する抗体又は抗原を不溶性担体の表面に化学的或は物理
   的に結合させて固定化した後、更に該固定化抗体又は抗
   原の表面を、酵素で標識した、測定対象抗原に対応する
   抗体又は抗免疫グロブリン抗体で重層、被覆した不溶性
   担体・抗体結合物又は 不溶性担体・抗原結合物を用いてこれを行うことを特徴
   とする抗原又は抗体の測定方法。
2. （２）標識酵素の基質として、酵素反応により不溶性着
   色物質となって固相表面に沈積する 基質を用い、固定化抗体又は抗原の表面を、酵素で標識
   した、測定対象抗原に対応する抗体又は抗免疫グロブリ
   ン抗体で重層、被覆した不溶性担体・抗体結合物又は不
   溶性担体・抗原結合物を、測定対象抗原又は抗体を含む
   被検試料液中にインキュベートして不溶性 担体上に固定化抗体−測定対象抗原−標識抗体、又は固
   定化抗原−測定対象抗体−標識抗免疫グロブリン抗体な
   る免疫反応生成物を形成せしめた後これを該基質を含有
   する溶液と接触させて固相上に不溶性の酵素反応生成物
   （不溶性着色物質）を沈積させ、その着色を肉眼的に或
   は測定機器を用いて測定することによりこれを行う特許
   請求の範囲第１項記載の測定方法。
3. （３）水溶性の層（又は被膜）形成剤を用いて酵素標識
   抗体又は酵素標識抗免疫グロブリン抗体を固定化抗体又
   は抗原に重層、被覆する特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の測定方法
4. （４）水溶性の層（又は被膜）形成剤が、ポリビニルア
   ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコ
   ール、カルボキシビニルポリマー等の合成高分子化合物
   、デキストラ ン、可溶性デンプン、ショ糖等のポリサッカライド、メ
   チルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロ
   キシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース
   、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース
   誘導体、水溶性ゼラチン、カゼイン等の蛋白質、又はグ
   リセリンである特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれ
   かに記載の測定法。