JPS62167465A - 電気化学的酵素測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は電気（ヒ学的酵素測定法（ｅｎｚ）・ｍｉｃ　
ａｓｓａｙ）に関するものである。特に本発明は免疫検
定法に有用な技術および装置に関するものであるが、こ
れに眼定されるものではない。特に本発明は例えば人間
または動物に対する広範囲な診断または調査の技術に１
吏用され、あるいは例えば食品化学またはプロセス化学
の調査および監視に１吏用される免疫検定法に関するも
のである。

既知の酵素を標識として用いる測定法の一例はエリザ゛
（ＥＬＳＩ八）（ｅｎｚｙｍｅ−１ａｂｅｌｌｅｄ　　
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）技術として知
られている不均一免疫検定法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏ
ｕｓ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である。普通採用され
ているサンドイツチ法において、代表的な例ではこの方
法は洗浄およびすすぎによって分離された次の三つの工
程： （ａ）　　適当な抗体を支持体表面、例えば重合体ビー
ズまたは場合によってはプラスチック容器壁またはプラ
スチック皿のくぼみの表面上に固定化する工程； （ｂ）前記固定化酵素を担持する表面と測定すべき試料
とを接触させて、試料中の特定の検体（ａｎａｌｙｔｅ
）を検体濃度に応じた割合で抗体と結合させる工程；お
よび （Ｃ）　　さらに前記表面と酵素で標識した抗体とを接
触させ、これによりこの酵素で標識した抗体を抗原のみ
に結合させ、かくして前記表面に試料中の検体濃度に対
応する測定可能濃度の酵素を提供する工程 からなる。

サンドイツチ法にはある限界があり、特にこの方法は少
なくとも２個のエピトープを有する検体分子を固定化抗
体および酵素で標識した抗体の両者と反応させる場合に
しか使用できない点に眼界がある。

特定の検体を測定するための別のエリザ競合法では、酵
素で標識した既知濃度の特定の検体を試料に加え、次い
てこの試料と既知濃度の抗体を担持する表面とを接触さ
せ、これにより標識検体および未標識検体を結合位置に
対して比例的に競合させ、次いで酵米濃度の測定によっ
て標識検体／非標識倹体の比を求める。

現在のエリザおよび他の酵素測定法の大部分は装置期間
の終りに発色団を放出する色形成基質（ｃｏｌｏｕｒ　
ｆｏｒｍｉｎｇ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用しており
、発色団の濃度は分光光度計によって測定することがで
きる。しかし、色形成基質の使用は、結果を得るのに必
要な時間の長さおよびある発色団の不安定性の点で欠点
を有することがある。従って測定法の改善が必要である
。

色の検出に代る方法として「アナリティカル・ケミスト
リＪ　（１９８４）　５６．２３５５に電気化学的検出
法が記載されており、この方法では測定に用いる酵素標
識によって電気的不活性物質が電気化学的に検出可能な
電気的活性物質に転化する。電気的活性化合物であるフ
ェノールは＋７５０　ｍＶの酸化還元電位を有しており
、この方法はそのままでは一役的には適用できない。そ
の理由は系が７５０　ｍＶの１δ位で酸化する他の成分
に出会うからである。従ってこの系は実際に血液または
血清の試料には採用できない。

本発明は特に応答の増幅を利用する測定法、特に検体が
特に１氏い濃度でかつ／または潜在的妨害物質との混合
物として存在している成分混合物中の１種または２種以
上の物質の存在を検出するかあるいは前記物質のレベル
を監視するための測定法であって、応答の存在または不
存在が特定の結合反応の程度に結び付いている測定法に
関するものである。

欧州特許第７８６３６号明細書は、酵素が基質における
酸化還元反応に触媒作用を及ぼす場合に、酵素と電極と
の間で電子を移動させるためにフェロセン誘導体のよう
なメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）化合物を使用する
ことを開示している。かかる方法は主としてレドックス
酵素としてグルコースオキシダーゼを採用することによ
り基質であるグルコースを電気化学的に検出するのに１
吏用されている。

比較的最近の欧州特許、例えばεＰ第１２５．１３９号
明細書には、基質濃度を一定とし、使用できるメディエ
ータ化合物の濃度を変動要因とする測定法が開示されて
いる。この方法では、欧州特許第７８、６３６号の方法
とは逆に、レドノタス酵崇と基質との組合せがメディエ
ータの電気化学的検出を可能にしている。

本発明はレドックス酵素およびレドックス基質を使用し
てメディエータレベルを電気化学的に検出することに基
づく一層進歩した測定法に閏するものである。

本発明の主目的は酵素を標識として用いる侵れた測定法
を提供することにある。

特に本発明の目的は漆れたエリザ法を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は酵素を標識として用いる新規な方法
に使用する試薬を提供することにある。

本発明は、レドックス酵素およびレドックス基質を使用
してメディエータレベルを電気化学的に検出することに
より、測定の際に、測定に用いる標識酵素による、メデ
ィエータ作用をしない化合物（ｎｏｎ−ｍｅｄｉａｔｉ
ｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の有効メディエータへの転化
を検出することを特徴とする電気化学的酵素測定法を提
供する。

従って、本発明は測定条件下にメディエータでない化合
物から生成する有効メディエータを検出する電気化学的
方法を使用する。有効メディエータは測定法において標
識として用いた酵素によって生成する。従って、検体を
定性的または定量的な意味で測定することができる。ナ
ノモル範囲において比較的高感度で迅速ブよ免疫検定法
を達成することができる。

条件は測定に用いる標識酵素に対する基質がメディエー
タとして有効でなく、かつ測定に用いる標識酵素が基質
を有効メディエータに転化させる作用をするように選定
する。メディエータ作用をしない化合物自体は、選定し
た条件下にこの化合物がメディエータとして有効でなく
、従って「メディエータ作用をしない」が、潜在的メデ
ィエータであることができる。

従って、本発明は、標識酵素を使用して電気化学的酵素
測定を行うに当り、レドックス酵素およびレドックス基
質を使用し、メディエータ作用をしない基質が前記標識
酵素によって無効メディエータから前記レドックス酵素
と電極との間の電子移動を媒介する有効メディエータに
転化する結果として前記７漂識酵累を電気化学的に検出
することを特徴とする電気化学的酵素測定法を提供する
。

測定に用いる標識酵素をメディエータ／レドックス酵素
系と一緒に使用することにより、既知の特定の結合測定
法（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）を従来達成されてい
たレベルより一層高いレベルに拡張することができ、し
かも妨害物質を除去するための試料の予備処理が不要に
なる。

本発明方法で［重用する上述の系とＰＣＴ／英国（ＧＢ
）特許第８６０００９５号明細書に記載されている系と
は、本発明ではレドックス基質が有効メディエータへの
転化前には自由に拡散するが、従来の系では活性成分が
固定化剤の比１校的大きい分子に結合することにより不
活性になる点において異なる。

本発明方法は代表的な例では免疫検出法である。

この方法ではサンドイツチ法または競合法を使用するの
が適当である。従って、好ましくは、本発明方法はサン
ドイッチエリザまたは競合エリザである。

サンドイツチ法の場合には、モノまたはポリクローナル
抗体を固定化し、試料を固定化抗体と接触させ、次いで
この系を酵素で標識した抗体と接触させ、基質をこの基
質がメディエータ作用しないような系の条件下に転化し
、しかる後にレドックス酵素およびレドックス酵素基質
を１吏用して有効メディエータの電気化学的測定を行う
。

競合法の場合には、試料および酵素で標識した検体を固
定化抗体と接触させ、メディエータ作用をしない基質を
添加し、電気化学的測定を行う。

普通、電気化学的検出の際には、メディエータ作用をし
ない基質自体がメディエータ作用をしないようになった
潜在低的メディエータであるのが好ましく、これの理由
は操作条件にある。このためには、電極を、レドックス
酵素に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電
位との中間であって、電極に維持されている電位より伐
い酸化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反
応を受けることができるような所定の電位に維持する。

所定電位において電子移動を示す生成物であって、前記
所定電位においてメディエータ活性を示さない基質から
酵素反応によって形成することができる生成物をメディ
エータとして使用することにより、前記基質の前記生成
物への転化程度、従って酵恣の存在または活性を測定す
ることができる。基質の生成物への転化が測定条件下に
おけるメディエータ活性の増大によって達成される種々
の測定法を実施することができる。

標識酵素に対する基質は測定条件下にメディエータ作用
をしないメディエータ誘導体である。この誘導体の性質
は標識酵素の性質に依存する。

基質の基剤を形成することができるメディエータ化合物
の例は、メタロセン；ルテニウム化合物；カルボラン；
　ＴＣＮＱの導電性塩；ハロアニル（ｈａｌｏａｎｉｌ
）およびその誘導体；　ビオロゲン；　キノン；アルキ
ル置換フェナジン誘導体；遷移金属のビス−シクロペン
タジェニル＜Ｃ９）　２ＭＸ、　錯体：　およびヘエロ
センーフェノールおよびインドフェノール化合物を包含
するフェノール誘導体である。かかる化合物は容易に誘
導体化して適当な基質を提供することができる。

空気の作用を受は難い水溶性誘導体を使用することによ
り、最小の予備処理を受けた生物学的流体試料について
測定を行うことができる。

所定の酵素に対する基質を提供する適当な誘導体は容易
に合成することができる。例えば、ホスフェート誘導体
は酸性またはアルカリ性のホスファターゼによって認め
られている。

ホスファターゼ標識酵素に対する基質はメタロセン誘導
体であるのが好適台であり、フェロセン誘導体であるの
が好ましい。

フェロセンの適当なホスフェート誘導体の例は次式（Ｉ
）および（■）： ○ で表される。本発明の特に好ましい例では、レドックス
基質はホスフェート化合物（１）で、この化合物は次式
； ％式％ で表わすこともでき、〔Ｎ−フェロセノイル〕−４−ア
ミノフェニルホスフェートと呼ばれる。この化合物は新
規な化合物で、本発明の一部を構成する。

化合’ＩＭ　［Ｎ−フエロセノイル〕−４−アミノフェ
ニルホスフェートは標準甘こう電極（ｒｓｃＥＪ　）に
対して３９０　ｍＶのＥ１７２を有する。この化合物を
ホスファターゼ、例えば酸性またはアルカリ性のホスフ
ァターゼで処理すると、この化合物は次式（）： ％式％（） で表されるフェノール誘導体に転化し、この化合物はＳ
ＣＥに対して＋１８０ｍＶの酸化電位を有する。

従って、電流測定をＳＣＥに対して約＋２３０　ｍＶで
行うと、化合′吻（八）による接触電流のみが検出され
、化合物（［）はこの電位において電極応答を示さない
。

本発明の他の好適例では、基質はフェノール誘導１本、
例えば２．６−ジクロロインドフェニルホスフェートで
、この化合物は次式（■）： て表される。

ホスファターゼは一例にすぎず、本発明は電気的に活性
な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に結合した任意の酵素基質に適
用することができる。従って、本発明は標識酵素として
ホスファターゼを使用する場合でもかかるホスフェート
化合物に限定されるものではない。メディエータ化合物
は容易に合成して池の酵素系に結合させることができ、
従って測定に用いる標識酵走によって触媒される反応の
性質は重要でない。例えば、酵素はプロテアーゼ、アミ
ダーゼまたはヒドロラーセとすることができる。

本発明の他の面において、本発明はは第１酵秦の活性を
検出する系を提供し、この系は：ａ）　前記第１酵諧に
よってメディエータ活性を示す生成物に転化することが
できて前記生成物の検出を可能にする自由に拡１）ｋす
る試薬と、ｂ）　レドックス酵素、該レドックス酵素に
対する基質、および電極からなる検出手段とを備え、活
性形態の前記第１酵素の存在下に前記試薬が　　　′前
記生成物に転化し、検出可能な変化が前記電極への媒介
された電子移動中に生じるように構成したことを特徴と
する。主として、前記生成物の特徴あるメディエータ特
性は所定の電極電位における電子移動である。

かかる系を使用して第１酵素測定法を提供することがで
き、第１酵素は標識酵素であってもなくてもよい。

本発明の池の面において、本発明は生物電気化学的電池
（ＢＥＣ）を提供し、この電池は、測定に用いる標Ｍｆ
！に酵素に対する基質が組込まれ、前記測定に用いる標
識酵素が前記基質を消費してＢＥＣからの出力に変化を
生じさせることにより前記酵素を検出できるように構成
され、さらに前記基質のメディエータへの転化を介して
電気出力を提供する第２酵素反応系を備えることを特徴
とする。

ＢＥＣで使用される第２酵素反応では、グルコースとグ
ルコースオキシダーゼとの反応において電子移動を媒介
させるにはフェロセンメディエータが好ましい。かかる
系では、フェロセン化合物のメディエータ作用により、
フェロセン化合物における酸化還元電位の変化の作用が
増幅される。

酵素がフェロセン化合物または他の基質を消費するにつ
れて生ずるフェロセン化合物または他の基質における変
化はメディエータ特性、従ってＢＥＣからの出力に著し
い影響を及ぼすことができる。

本発明のさらに他の面において、本発明は一定電位に維
持されている少なくとも１個の電極の存在下に非レドッ
クス酵素の活性を検出する方法を提供し、この検出法は
； ａ）　前記非レドックス酵素を含有すると思われる試料
を前記電極に維持されている電位より高い酸化還元電位
を有する試薬で処理し、この際前記試薬として、非レド
ックス酵素に対する基質であって、前記レドックス酵素
の活性によってメディエータとして作用しかつ前記電極
に維持されている電位より低い酸化還元電位を有する生
成物に転化することができる基質を使用し、 ｂ）　前記試料をレドックス酵素および該レドックス酵
素に対する基質で処理して、前記電極に維持されている
電位より低い酸化還元電位を有するメディエータ化合物
の存在下に前記電極への測定可能な電子移動を生じさせ
ることを特徴とする。

本発明は、酸化還元活性を示さないが、本発明の一つの
面においては測定条件下における基質のメディエータ特
性を有する生成物への転化に触媒作用を及ぼすことがで
きる酵素の活性を検出することを可能にする。

以下に本発明をホスファターゼ酵素について説明するが
、本発明の範囲は池の測定系および他の試薬に及ぶ。例
えば、試薬と反応してメディエータ特性を有する生成物
を生成することができる池の標識酵素を１吏用すること
ができる。

なお本発明は抗原の標識付けについて説明されているが
、酢酸の相捕的ストランド間におけるような他のタイプ
の特異的結合反応における標識酵素を使用することがで
きる。

第１図において、メディエータ化合物０．１　ｉ　）は
例えば化合物（Ｉ）である。この化合物は水溶性試薬で
あって、この試薬は、電極をＳＣＥに対して＋２３０　
ｍＶの電位に維持した場合にグルコースオキシダーゼ（
ＣＯＤ）　　とその基質グルコースとの間でメディエー
タ活性を示さない。

標識として存在するホスファターゼ酵素（Ｅ）の存在下
に、化合物（１）は化合物（Ａ）　に転化する。

化合物（八）はグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）　と
その基質グルコースとＳＣＥに対し＋２３０ｍＶ　＋、
：維持された電極との間でメディエータ活性（Ｌｅｄｌ
ｏｊ　を示ず。

従って、第１図の系はホスファターゼ酵素の活性の検出
を可能にする。電極において検出される電流は化合物（
八）の存在のみに起因する。

ｘｒｘ　を図において、ホスファターゼ酵素は抗体（八
ｂ）に対する標識であり、従ってホスファターゼ酵素の
濃度は抗体とこれに対応する抗原との間の特異的結合反
応の影響を受ける。抗体を抗原にさらす工程および結合
部分と遊離部分とを分離する工程は既知の免疫検定法の
技術によって実施することができる。別法では、ホスフ
ァターゼ酵素を抗原に対する。標識とすることができる
。

次に本発明を図面を参照して実験例について説明する。

実験例１ （ａ）式（Ａ）で表される化合物の製造「ジャーナル・
オブ・オルガニック・ケミストリー」、君、　　２−８
０〜２８１（１９５９）　に記載の方法によりフェロセ
ンモノカルボン酸をフエロセノイルクロリドに転化した
。

次いでフエロセノイルクロリド（１ｍＭ）を５ｄの水冷
乾燥ピリジン中に溶解した。この溶液に、ｐ−アミノフ
ェアフール（１，１ｍＭ）を５ｍＩ！の乾燥ピリジンに
溶解した溶液を１回に添加した。反応を４℃で２時間進
行させ、次いで反応溶液を室温まで加温し、さらに２時
間かきまぜた。しかる後に反応溶液を濾過し、溶媒を真
空下に除去した。次いで、残留物を最少量の耐酸エチル
中に溶解し、充填剤としてシリカを使用しかつ溶離剤と
して酢酸エチル／ヘキサン（３：　ｌｖ／ｖ）を１吏用
してカラムクロマトグラフィを行って化合物を精製した
。精製された化合物は、この化合物を最少量の酢酸エチ
ルに溶解した溶液中にヘキサンを緩徐に拡散させること
により、オレンジ色針状結晶として晶出した。

質量分光分析によってｍ／ｅ＝３２１において親イオン
のピークを得た。このピークは所望の化合物（八）に対
応していた。

（ｂ）式（Ｉ）で表され乞化合物の製造アルカリ性ホス
ファターゼ測定法に用いる基質を、「ザ・バイオケミカ
ル・ジャーナルｊ４７，９３〜９５　（１９５０）　お
よび同３３．　１１８２〜１１８４　（１９３９）に記
載されている方法の改良法によって製造した。

化合物（Ａ）　（１００ｍｇ、　０．３１ｍ）、４）を
５ｍｅの乾燥ピリジンに溶解し、この混合物を水浴中で
冷却した。

この溶液に新たに蒸留したオキシ塩化リン（３０μ！。

０、３２ｍＭ）を添加し、精製した混合物を０℃におい
て反応が完結するまでかきまぜた。反応後に溶離剤とし
て酢酸エチルを１吏用して薄層クロマトグラフィを行っ
た。

反応が完結した後に、少量（約５ｍ２）の水を添Ｊｒｔ
＞し、しかる後に飽和水酸化バリウム水溶液を０℃にお
いて溶液がアルカリ性になるまで添加した。

水酸化バリウムの添加後に、等容積の水冷エタノールを
添加してリン酸エステルのバリウム塩を沈殿させた。こ
のバリウム塩を信過によって捕集し、エタノール洗浄し
、真空下に乾燥した。

粗バリウム塩は僅かに水溶性であった。これを化学量論
理的分量の１Ｉ２３Ｏ４で処理した。生成した溶液を濾
過し、次いて凍結乾燥して遊離酸を僻だ。

実験例２ 式（ＩＩ）で表される池の基質の製造 ヒドロキシメチルフェロセン（２１６ｍｇ）　ヲ５ｉの
乾燥ピリジンに溶解し、次いで１１１μβの新鮮なオキ
シ塩化リンを１回に添加した。明るい黄色溶液は直ちに
暗赤色になり、塩化水紫ガスが放出された。この溶液を
約２時間かきまぜた。ヒドロキシメチルフェロセンの反
応は溶ν？ｉ剤として酢酸エチルを［重用する／リカ板
上の薄層クロマトグラフィによって６゛Ｎ認された。５
分間の反応後に、この混合物中にヒドロキシメチルフェ
ロセンは撥出てきなかった。

２時間後に、この溶液に僅かに塩基性の蒸留水（ｐ１１
約８）を添加し、次いて酢酸エチルで４回抽出してピリ
ジンを除去した。水性層をクロロホルムでさらに１１回
抽出し、次いで回転蒸発器において蒸発乾固した。残留
物を僅かに酸性の蒸留水〈ｐＨ５，５）中に４回溶解（
しａｋｅ　ｕｐ）　シ、繰返し蒸発乾固して残留ピリジ
ンを除去した。

生成物をエタノールに溶解して無機不純物を沈殿させ、
次いでこの不純物を濾別した。

最後に、この生成物を乾燥するために、生成物を最少量
の蒸留水に溶解し、次いで４８時間凍結乾燥した。

４℃で４８時間静置すると、結晶物質である化合物（Ｉ
Ｉ）が得られた。

実験例３ 酸化還元電位の測定 化合物（１）および（ＩＩ）の酸化還元電位を測定した
。

全作業電極、飽和けこう照合電極（ＳＥＣ）および白金
対向電極を１吏用し、ポテンシオスタットに連結して電
気化学的電池を組立てた。この清、浄な電気化学的電池
に、フェロセン誘導体（２ｍＭ）およびグルコース（８
０ｍＭ）をｌ　Ｑ　Ｑ　ｍ　１．１のトリスに溶解した
ｐＨ１０，１５の溶液を充填した。最終容積は４００μ
βであった。２種の異なる緩衝剤を使用して溶液を作っ
た。しかし、結果には影響が認められなかった。

電圧を５ｍＶ／秒の速度でＯｍＶから６００ｍＶまで変
えた。得られたポルタモグラムから化合物（Ｉ）および
（［）の酸化還元電位を計算した。

化合物（Ｉ）の場合には、酸化還元電位は約＋３９０ｍ
Ｖであった。

化合物（ＩＩ）の場合には、酸化還元電位は約＋３７０
ｍＶであった。

化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の酸化還元電位は検討した
範囲ではｐＨとは無関係であった。

実験例４ 式（ＩＩＩ）で表される池の基質の製造Ｉ ２．６−ジクロロインドフェノールのナトリウム塩５ｇ
を水に溶解し、塩化水素ガスを深青色沈澱が析出するま
で加えた。生成した固形物を濾別し、ジクロロメタンに
溶解し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。この溶液を濾
過し、溶媒を除去して２．６−ジクロロインドフェノー
ルを得た。

この２，６−ジクロロインドフェノールを乾燥ピリジン
に溶解し、かきまぜながら１当量のオキシ塩化リンを・
商工した。１５分後に氷を加え、溶液を炭酸す）　ｔＪ
ウムで中和した。溶媒を除去し、残留物を沸騰エタノー
ルで抽出した。エタノール層を濾過し、蒸発した。残留
物をエタノール洗浄して所望の化合物（ＩＩＩ＞を得た
。

実騨例５ アルカリ性ホスファターゼの活性の７ｊ、Ｈｌ　定２個
の隔室を有する電気化学的電池を１吏用した。

電池には、直径４　ｍｍのグラファイト円板の作業電極
のほかに、１ｃｍ２　白金金網の対向電極および照合電
極である飽和寸こう電極（ｒｓｃＥＪ　）を入れた。

直流における環状ポルクンメトリー実験はビーニーニス
（ＢΔ５）−１００エレクトロケミカルアナライザ（Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｒ）を
使用して行った。

子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（カルジム（（ａ
　ｌｚｙｍｅ）社から供給されたもの）をｐＨ１０，１
５の０．１　Ｍ　　）　＋）ス緩衝液中で透升した。最
終蛋白質濃度は０．８６　ｍｇ　／　ｍｌであった。

ＭｇＣ（！　２１０ｍＭおよびＮａＣｊ２５ＱｍＭを含
有する０、１〜１　トリス中のｐＨ１０，１５の２ｍＭ
基質溶液０．６ｍｊｌ！を電気化学的電池の試料室に入
れ、直流において環状ポルクモグラムを記録した。ピー
ク電流がある場合にはこれを１８０ｍＶで測定し、次い
で適当に希釈したアルカリ性ホスファクーゼ原液１００
μｇを添ＩＪＩ′ｌシ、電池の内容吻を室温で１５分間
温装した。温；１を後に環状ポルタモグラムを■び記’
ｐ、ＴＪ：　Ｉ、、１８０ｍＶで電流を測定した。この
操作をアルカリ性ホスファターゼの濃度範囲にわたって
繰返した。

フェノール性生成物におけるフェロセンの）工ＩＪ　ミ
ニラムイオンへの酸化による１８θ［ＩＩＶにおけるピ
ーク電流を使用してアルカリ性ホスファターゼの活性を
評価した。アルカリ性ホスファターゼ濃度の関数である
１８０ｍＶにおけるピーク電流は第２図に示す通りであ
る。

アルカリ性ホスファターゼの電池内（ｉｎ−ｃｅｌｌ）
　。

濃度１．２３ＸＬＯ−１２モル／！は電気化学的電池中
の酵素８．６Ｘ１０−１６モルに相当した。従って、比
較的穏やかな条件下に環状ボルタンメ）　ＩＪ−を使用
し、１５分間室温で温置した場合に（少なくとも３０分
間３７℃で温置するという免疫検定法においてかなり普
通に使用されている条件ではなく）、極少量のアルカリ
性ホスファターゼを測定することができた。

実験例６ 電流測定（ａｍｐｅｒＯｍｅＬｒｙ）　　によるＥ　Ｎ
　Ｄ　Ａ　Ｂ酵素の免疫検定法 電気化学的アルカリ性ホスファターゼ測定法の固有の感
度を示すために、酵素検定法の検出系を検討した。血清
中の非結合（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）エストリオー
ルのＥＮＤＡＢ酵素検定法用のキットをシーエムディー
（ＣＭＤ）社（英国）から購入した。

エストリオールキットを使用した場合の測定接作を第２
抗体沈澱工程まで行い、次いで操作を変更して本発明の
測定法を実施した。５０μ！の各エストリオール標準液
（０，１，３，１０，２０および４０ｎｇ　／　ｍｅ　
）をピペットで適当なガラス管に入れた。

非特異的結合（ｒＮｓＢＪ）を行わせるために、ＮＳＢ
管には５０μβのＱ　ｎｇ　／　ｍｅの標準液を入れた
。

次いで、２５μａのエストリオール−酵素結合体（ｃｏ
ｎ、ｉｕｇａｔｅ）をずべてのガラス管に加え、１００
μｌのエストリオール抗血清を加えた。ＮＳＢ管にはニ
ス）　ＩＪオール抗血清を加えず、代りに１００ＡｔＲ
のバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）試薬を加
えた。

これらの試薬を混合し、室温で２０分間温温置た。

次いで１　ｍｌの第２抗体分離試薬をすべての管に加え
た。これらの管を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分頭ト
シ、上澄液を廃棄した。次いでこれらの管を吸取紙につ
けて過剰液を除去した。

この時点で、分光光度計によるエストリオール測定用の
キットを使用する場合の特定の方法を行う代りに、抗体
に結合させたエストリオール−アルカリ性ホスファター
ゼを含有する遠心ペレットを、フェロセン結合基質を含
有する溶液０．ＩｇＣβ２１ＱｍＭおよびＮａＣｊ２５
０ｍＭを含有する０、ＬＭ）リス中のｐＨ１０，１５の
２ｍＭ溶液０，６ｍｅ）　中に懸濁させた。

この溶液を室温で１５分間温温置た。１５分間の温置後
に、溶液を電気化学的電池の試料室に移した。

この溶液のポルタモグラムをＳＣＥに対してＯ〜＋６５
０ｍＶの電位範囲にわたって記録し、１８０ｍＶにおけ
るピーク電流を測定した。

この操作を各血清エストリオール、１％　２％Ｄ液、す
なわ’Ｅ、Ｏ，ｌ、　３．２０および４Ｑｎｇ／ｍｆの
前記標２＜ｑ液について行った。

アルカリ性ホスファターゼの不存在下における基τ′ｊ
に関ずろ１．８０ｍＶにおけるバックグラウンド電流、
ずな４っぢ非特異的結合電流は１．１５μ八であった。

この（直を、血？ｎ標準液を１吏用して得た結果から引
算した。

各血清７漂準液に関する１８０＋ｙ＋Ｖにおける補正し
たピーク電流をキットに備えである。標章曲線紙上にプ
ロットした。

Ｎｎ　＋／ｉｏをエストリオール濃度（ｎｇ／ｍｇ＞に
対してプロットすると直線（ｙ＝０．０４Ｘ　＋０．４
３゜ｒ＝０．９８）となった。

電流測定法により検出を行うかかるＥＮＤＡＢ免疫検定
法は、標準キット法より短い温置時間および低い温度を
使用して行うことができた。

実験例７ （ａ）化合物（Ｉ）および（Ｉ［）の使用実験例３と同
じ装置を使用し、同様に電圧を変えた。

この実験では、１７５　ｍｇ／ｍｅの酵素グルコースオ
キシダーゼ（ＣＯＤ）１μｌを実験例３と同じ溶液に添
加して最柊容積を０．３５ｍｆｆにした。

前回と同様に電圧を変え、その結果である電流と電圧と
の関係を記録した。

１ヒ合′吻（Ｉ）および（（Ｉ）がグルコースオキ／ダ
ーゼ酵素反応に対するメディエータとして作用すること
、および酸化電位において生ずる電流が増幅されること
が分った。かかる増幅は酵素によるフェリジニウムイオ
ンの接触還元および次いで電極で起るフェロセンの再酸
化に起因する。

４５０ｍＶの一定電位における時間に対する電流の測定
を三電極系において行い、粗酸性ホスファターゼ溶液の
存在下にフェロセンのホスフェート基の加水分解を検出
する場合には化合物（■）（エタノール中５０μＭ）８
μβおよびｐＨ４，６６の１００ｍＭクエン酸緩衝液中
のグルコース（Ｉ　Ｍ　＞　５０μβを使用し、最終容
積を４００．ｄとした。実験中試料はすべてかきまぜた
。

次の４組について測定結果を記録した：（イ）化合物（
ＩＩ）プラス　グルコース、酸性ホスファターゼまたは
グルコースオキシダーゼはなし。

（ロ）（イ）と同じであるが、化合物（ＩＩ）およびグ
ルコースを３７℃で１０分間温装した後に２ｍＭグルコ
ースオキシダーゼ２５μβを添加した。この温匿は酸性
ホスファターゼ添加後に起る電流の減少が化合物（ＩＴ
）溶液における分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）に起因する
ものでないことを示すためであった。

（イ）と（ロ）との間には電流に明瞭な差異が認められ
、この差異はメディエータである化合物（ＩＩ）を介し
て作用するオキシダーゼ酸累反応に起因する。

（ハ）（ロ）と同じであるが、グルコースオキシダーゼ
添加前に１０μβの粗酸性ホスファターセ溶液を化合物
（ＩＩ）およびグルコースと共に３７℃で１０分間温コ
レた。

上述の（ロ）と比較して電流の減少が認められた。これ
は酸性オキシダーゼが化合物（ｎ）に作用してそのメデ
ィエータ特性を変えたためである。

（ニ）（ロ）と同じであるが、３０μβの酸性ホスファ
ターゼ溶液を添加した。

電流がさらに減少するのが認められた。これは酸性ホス
ファターゼ濃度と接触電流との間に逆比例の関係がある
ことを示す。

（ｂ）化合物（ＩＩＩ）の使用 実験例７（ａ）と同様にして、化合物（ＩＩＩ）に０．
１１４グルコースを加えたものの環状ポルタモグラムを
ｐＨ７，８において２０ｍＶ　／秒の走査速度を使用し
て測定し、第４図に示す曲線（ａ）、（ｂ）および（Ｃ
）を１等だ。

曲線（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ化合物（■
）、化合物（Ｉ）にアルカリ性ホスファターゼを加えて
から５分後、および化合物（［［Ｉ）にアルカリ性ホス
ファターゼおよびグルコースオキシダーゼを加えたもの
に関するものである。この場合にも増幅は顕著であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の測定法の原理を説明する線図、第２図
は本発明方法の一例で得た１８０ｍＶにおけるピーク電
流とホスファターゼ濃度との関係を示すグラフ、 第３図は本発明方法の池の例で得た１８０ｍＶにおける
ｔ市正済みピーク電流とエストリオール濃度との関係の
一例を示すグラフ、 第・′１図は本発明方法の池の例で得たボルフモダラム
を比較例と共に示す線図である。 Ａｂ　　抗体　　　　　　　Ｅ　ホスファターゼ酵累Ｇ
ＯＤ　　グルコースオキシダーゼ Ｍｉ　　メディエータ化合物 Ｍｒｅｄ　／。８　　メディエータ活性エストリオール
・屓２度（７＋ｆ／″Ｊ）Ｆｌｏ、３゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気化学的酵素測定を行うに当り、 レドックス酵素およびレドックス基質を使用してメディ
   エータレベルを電気化学的に検出することにより、測定
   の際に、測定に用いる標識酵素による、メディエータ作
   用をしない化合物の有効メディエータへの転化を検出す
   ることを特徴とする電気化学的酵素測定法。 ２、免疫検定法である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、エリザである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、電気化学的検出の際には、電極を、レドックス酵素
   に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電位と
   の中間であって、電極に維持されている電位より低い酸
   化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反応を
   受けることができるような所定の電位に維持する特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれか一つの項に記載の方法。 ５、レドックス基質がフェノール誘導体である特許請求
   の範囲第１〜４項のいずれか一つの項に記載の方法。 ６、標識酵素がホスファターゼである特許請求の範囲第
   １〜５項のいずれか一つの項に記載の方法。 ７、レドックス基質が次式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表される化合物である特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ８、標識酵素を使用して電気化学的酵素測定を行うに当
   り、 レドックス酵素およびレドックス基質を使用し、メディ
   エータ作用をしない基質が前記標識酵素によって無効メ
   ディエータから前記レドックス酵素ト電極との間の電子
   移動を媒介する有効メディエータに転化する結果として
   前記標識酵素を電気化学的に検出することを特徴とする
   電気化学的酵素測定法。 ９、免疫検定法である特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １０、エリザである特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、電気化学的検出の際には、電極を、レドックス酵
   素に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電位
   との中間であって、電極に維持されている電位より低い
   酸化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反応
   を受けることができるような所定の電位に維持する特許
   請求の範囲第８〜１０項のいずれか一つの項に記載の方
   法。 １２、レドックス基質がフェノール誘導体である特許請
   求の範囲第８〜１１項のいずれか一つの項に記載の方法
   。 １３、標識酵素がホスファターゼである特許請求の範囲
   第８〜１２項のいずれか一つの項に記載の方法。 １４、レドックス基質が次式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表される化合物である特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １５、第１酵素の活性を検出する系において、 ａ）前記第１酵素によってメディエータ活性を示す生成
   物に転化することができて前記生成物の検出を可能にす
   る自由に拡散する試薬と、 ｂ）レドックス酵素、該レドックス酵素に対する基質、
   および電極からなる検出手段とを備え、 活性形態の前記第１酵素の存在下に前記試薬が前記生成
   物に転化し、検出可能な変化が前記電極への媒介された
   電子移動中に生じるように構成したことを特徴とする第
   １酵素の活性を検出する系。 １６、生物電気化学的電池において、 測定に用いる標識酵素に対する基質が組込まれ、前記測
   定に用いる標識酵素が前記基質を消費して前記生物化学
   的電池からの出力に変化を生じさせることにより前記酵
   素を検出できるように構成され、さらに前記基質のメデ
   ィエータへの転化を介して電気出力を提供する第２酵素
   反応系を備えることを特徴とする生物電気化学的電池。 １７、一定電位に維持されている少なくとも１個の電極
   の存在下に非レドックス酵素の活性を検出するに当り、 ａ）前記非レドックス酵素を含有すると思われる試料を
   前記電極に維持されている電位より高い酸化還元電位を
   有する試薬で処理し、この際前記試薬として、非レドッ
   クス酵素に対する基質であって、前記レドックス酵素の
   活性によってメディエータ活性を有しかつ前記電極に維
   持されている電位より低い酸化還元電位を有する生成物
   に転化することができる基質を使用し、 ｂ）前記試料をレドックス酵素および該レドックス酵素
   に対する基質で処理して、前記電極に維持されている電
   位より低い酸化還元電位を有するメディエータ化合物の
   存在下に前記電極への測定可能な電子移動を生じさせる
   ことを特徴とする非レドックス酵素の活性を検出する方
   法。