JPS62115281A - 細菌性ｎ−末端のメチオニンペプチダ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換え技法を用いて、Ｎ−末端のメチオニン
を欠失するタン−９り質、特に外来性タンパク質の細菌
系における製造に関する。さらに詳しくは、それは、イ
ンビトロで使用され又はこれらのシステムにおいて成熟
タン・量り質の完全なプロセシングのために高いレベル
の（ゾチダー−Ｗを含む卓越した細菌宿主を製造するた
めに使用され得る、Ｎ−末端のメチオニンに対して特異
的なペプチダーゼに関する。

以下余白 〔従来の技術〕 細菌宿主での外来性タン・９り質の製造は、現在十分に
確立されている。比較的に標準の方法においては、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子配列が、宿主生来
の又は宿主と適合する調節配列の制御下に配置され、そ
して宿主細菌中に形質転換される。一般的に、これを達
成できる３つの主な方法が存在する： （１）　　目的とするタンパク質をコードするＤＮＡが
、細菌の調節配列の制御下ですでに細菌の遺伝子と読み
枠を合わせて融合され、１融合タン・９り質１を得るこ
とができ； （２）　　目的とするコード配列が、分泌タンパク質を
もたらす作用可能なリーダー配列と読み枠を合わせて触
合され；又は （３）　　目的とするコード配列が、′直接的な”発現
をもたらすＡＴＧ開始コＶンのすぐ下流に配置さね、１
成熟”タンパク質を得ることができる。この最後の場合
においては、成熟タン一り１は分泌されないが、しかし
しばしば封入体として細胞内域に見出される。

ＡＴＧ−先行のコード配列の直接的な発現によって形成
される成熟タンパク質が、ＡＴＧの翻訳生成物であるＮ
−末端のメチオニンを担持することは、言明されていな
いが、しかし当業者によっては良く認識されている。特
定の組換え体タンパク質及びその生成の状況に依存して
、仁のＮ−末端のＭｅ　を残基を除くことが多少、細胞
内でプロセシングされるが、しかし、一般的にほんのい
くらかであり、そして普通、生成された組換え体タン・
ヤタ質の実質的な部分は、この所望としない外来性残基
を担持する。その存在は完全無害である。この得られる
タン・！り質が治療上、使用される場合、通常、受容体
に対する自己由来のタン・量り質〔たとえば、ヒトに投
与されるようなヒト成長ホルそン（ｈｏｕ））であろう
ものが、該受容体に対してよく知られていない（ゾチＦ
配列を含んでいる。

その結果は予想できる。免疫反応は、そのよく知られて
いない配列に対して生まれる仁とができ、そして治療上
重要なペプチドが、今、免疫原になる。

外来性タンパク質の他に、成熟した生来のタン・々り質
及び他の属又は種からの細菌性タンノ４り質もまた、し
ばしば、不完全にプロセシングされる。

この現象の例は、Ｅ、コリのアスノ４ラギン酸トランス
カルバミラーぜ（Ｒ−鎖）、ヒコリのトリットファンシ
ンテターゼＡプロティン及びＥ、コリのバクテリオファ
ージＴ４リゾチームを含ｔｒ　（Ｆａ＠ｍａｎ　。

Ｇ、Ｏ，、Ｅｄ、、ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　
　Ｂｉｏａｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ＆　Ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒ　
Ｂｌｏｌｏｇｙ＊　ｍ　：　３０８〜３１３　）。

他の人は、Ｎ−末端のメチオニンを分解するために及び
Ｎ−末端の”　Ｍｅを一希少（１・■）”ペプチド又は
タン・母り質を生成するために種々の方法で試みて来た
。Ｂｔｘｔ＠ｒ　（アメリカ特許第４，３５０，７６４
号）は、交互の切断部位を保護した後、萌駆体タン７ｆ
り質を切断する丸めにプロテアーゼトリプシンによる処
置をインビトロで行なう。融合タン・量り質もまた合成
され、ここで、目的とするコード配列がＡＴＧによって
先行され、従ってＣＮＢｒによりて切断できる１内部”
メチオニンをその融合体中に提供する。これは、余分な
製造段階を含むのみならず、またタンー臂り質又はペプ
チドがその残存する配列中のいずれのメチオニン残基で
切断されるという一層重大な欠点を有する。ゾエネンテ
ックにより１９８４年１２月５日に出版されたＥＰＯ出
願第１２７，３０５号は、得られるｈＧＨの分泌をもた
らすためにある細菌宿主中において明らかに作用する生
来のｈＧＨリーダーペゾチドを含むコード配列を用いる
ことによってＭｅｔ−希少のｈＧＨの生成を開示する。

Ｇ１１ｂ＠ｒｔ　（アメリカ特許第４，３３８，３９７
号）は、多分、Ｎ−末端のＭｅ　ｔ　−希少のβ−グロ
ビンの分泌をもたらすためにべ二シリナーゼのリーダー
配列を用いている。同じ譲受人に譲渡され、そしてこの
開示を引用によねこの明細書中に組み込まれた、１９８
６年３月２５日に出願された、日本特許出願筒６４９９
５／８６は、いくらかの（但しすべてではない）組換え
体ペプチドの分泌をもたらすために、細菌のホスホジノ
４−ゼＡ　（ｐｈｏ　Ａ　）につｈてのリーダー配列の
使用を開示する。

前記の解決法は、その問題に対する普遍的な解決を提供
しない。Ｎ−末端のＭｅ　を−希少形で特定の組換え体
タンａ４り質を産生するための必要性に直面している当
業者は、産生されるべき特定のペプチドのために適切な
方法を、可能性あるし・臂−トリーから選択する必要が
ある。下記の発明の方法は、もう１つの・量ターンの適
応性を提供するたメニとのし・り一トリーを広げる。

〔発明の開示〕

本発明は、細菌的に産生された組換え体タンΔり質又は
他のタンｔ４り質からＮ−末端のメチオニン残基のグロ
セシングを保証するための便利な酵素を提供する。また
、別の段階を要しないでインピがで目的とするゾロ上タ
ンクをもたらすために、組換え宿主生物の遺伝子操作を
可能にする、この酵素をコードするＤＮＡが提供される
。従って、本発明のベゾチダーゼ酵素の有効性が、治療
的に使用される場合、免疫原性を減じている組換え体タ
ン・９り質の細菌宿主において産生を可能にする。

１つの観点においては、本発明は、あるタン・ヤク質配
列からＮ−末端のメチオニン残基を切断するイブチダー
ゼ、すなわち、メチオニンアミノ（グチダーゼ又はＮ−
末端エキソペゾチダーゼに関する。その酵素はこの明細
書でＭｓｔ−アミノペゾチダーゼとして言及されるであ
ろう。そのＭｅｔ　−アζノペデチダーゼ酵素は、定義
された特異性の活性（下を参照のこと）を有し、そして
第２図に示されているアミノ酸配列のタンパク質に対し
て生成された抗体と免疫沈殿するタン・童り質を含む。

そのＭｅｔ−アミノ−（ブチダーゼ酵素はさらに、この
活性を有し、そしてそれは、推定されるアＺ）酸配列を
コードする、第２図に例示されるＤＮＡに対して、特定
の条件下でハイブリッド形成するＤＮＡによってコード
されているタンノ４り質を含む。

本発明はまた、第２図に示されているアミノ酸配列のタ
ン・量り質と免疫反応性の抗体に関し、そしてを推動物
中にこのタンパク質を注入することによって高められた
抗体を含む。

他の観点においては、本発明は、Ｍｅｔ−アミノ（ブチ
ダーゼをコードする組換え体ＤＮＡ配列、この配列を相
持するプラスミド及びこれらのプラスミドにより形質転
換された微生物宿主、並びに本発明の物質を用いて、細
菌宿主又はインビトロでＮ−末端のＭｅｔ−希少の組換
え体タン・ｆり質を産生ずるための方法に関する。さら
にもう１つの観点忙おいては、本発明は、一般的Ｊｌ（
−４７″チダーゼー久失（但し、Ｍｅｔ−アミノペプチ
ダーゼ欠失ではない）の形質転換宿主（こζで該形質転
換体はそれ自体のダノムの一部を導入している）をスク
リーニングすることを含んで成る、高いｙ＠ｔ−アミノ
ベグチダーゼ活性を有する細菌株を得るための方法に関
する。

〔発明を実施するための態様〕

Ａ、定義 本明細書に使用される場合、′″ＭｅｔＭｅｔ−アミノ
ペプチダーゼド配列からＮ−末端のメチオニン残基を特
異的に切断し、そして内部のメチオニン残基又はメチオ
ニンよυも他のＮ−末端残基で切断しない＃索に関する
。本発明のＭｅｔ−アミノペプチダーゼは、位置２を占
める残基及び基質タン・９り質又は−ｅ７’チドの二次
又は三次構造に依存して、特定のペプチド配列に対して
特異的であるように思える。この事に関する酵素の正確
な特異性は、無数の基質をｔｌとんど試験しないでは測
定され得ない；しかしながら、大ざっばなやり方が、８
ｈ＠ｒｍａｎ、Ｆ’、、など、　ＢＩａ、Ｅａｍａｙｓ
（１９８５）３：２７〜３１によって示されている。

Ｓｈｅｒｍａｎなどは、ｖ＠ｔ−アミノ（グチダーゼの
特異性についての彼らの考えを、酵母からのイソ−１−
チトクローム−Ｃの突然変異体の観察形及び８２の成熟
の細胞内タン・９り質の公開された一次配列に置いた。

彼らは、メチオニンは普通、１．２９Ｘ又はそれよシも
小さならせん状の半径を有する側鎖を含む残基から切断
されるが、しかし一般的に、１．４　ｓ　ｌよシも大き
ならせん状の半径を有する残基からは切断されないと推
定される。原核及び真核系からの他の公開されたタン／
４り質の配列を考慮して得られた、突然変異的に使えら
れたイソー１−チトクローム−〇は、Ｎ−末端のメチオ
ニンカアラニン、システィン、グリシン、プロリン、セ
リン、トレオニン又はバリンの残基を先行するがしかし
、それがアラギニン、アスノ９ラギン、アズ／４’ラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイ
シン、リシン又はメチオニンの残基を先行しない場合、
Ｎ−末端のメチオニンが切断されることを示し、そして
この事は観察と一致する。これらの結果は、一般的に、
下の例示に示されている結果と一致する。しかしながら
、第２アミノ酸についてのらせん状の牛後が１．２９Ｘ
より大きく、そして第二及び第三構造体又は他の条件が
特に好ましい場合、いくつかの例外が存在する。従って
、この特異性の観点は、一般的なガイドラインとして意
図され、そして本発明を例示するために使用されるアミ
ノペプチターダの特異性さえ正確に測定されないことが
心に留められるべきであり、すなわち、すべての可能な
第三構造体は必ずしも試験されていない。従って、″″
ＭｅｔＭｅｔ−アミノペゾチダーゼ１に存在するために
は、内部のメチオニン残基の切断及びいずれかのペプチ
ドからメチオニン以外のＮ−末端残基の切断を伴わない
でＮ−末端のメチオニンの特異的な切断の必要条件を満
たすのみの酵素が必要である。

本発明の好ましいＭｅｔ−アンノペゾチダーゼは、第１
図に示されているものに実質的に等しいＮ−末端のアミ
ノ酸配列及び第２図に例示されているＤＮＡによってコ
ードされているものに実質的に尋しい全アミノ酸配列を
有する。′実質的に等しい”とは、たとえ小さな変化が
アミノ酸配列に存在したとしても、タンパク質が第二及
び第三構造体又はその次のアミノ酸残基に関して、同じ
根本的な特異性を基本的に有する特定のペプチド配列又
はタン・量り質配列からＮ−末端のメチオニン残基を特
異的に切断するととにおいて同じ活性を保持することを
意味する。少しも活性を変えない、配列中の１又は複数
のアミノ酸の変化、交換、付加又は欠失は、この定義か
ら特定のタンパク質を除外しない。

たとえば、保存性アミノ酸置換、たとえば位置４５．５
９，７８，１２６又は２４５でｌ又は複数ノシスティン
の代シにセリン又はアラニンの置換は、Ｍｅｔ−アミノ
ペプチダーゼ活性を保持することができるペプチドをも
たらす。さらに、ロイシン、イソロイシン及びバリン残
基の互換性が存在することができる。また、Ｎ−末端で
始めの７個のアミノ酸までを欠失することができ、そし
てアミノ酸２２８で始まるペプチドの下流領域の部分は
、活性のために必須でない。

モチろん、さらにＭｅｔ−アミノペプチダーゼの中性形
及び塩形、並びに付加の非タン・母り質成分、たとえば
グリコジル化、脂質残基又はアセチル化を含む形が含ま
れる。

１ペグチダーゼ欠失１の菌株は、Ｍｅｔ−アミノペプチ
ダーゼよりも他の少なくとも４個のペプチダーゼ（該（
！チダーゼは通常、野生型に見出される）を欠いている
菌株とみなす。

この明細書に使用される“Ｎ−末端のＭｅ　を−希少“
タン／４り質は、Ｎ−末端のメチオンを欠いているが、
しかしその−次構造においてどこかよそにメチオニン残
基を含むかも知れないタンパク質と言及する。そのタン
パク質のためのコード配９１）は、読み枠において、す
ぐ先行するＡＴＧ開始コドンを有するであろう。＠Ｎ−
末端のＭｅｔ一希少”は、この状態をとシまく条件が〈
如返し与えられる必要がないように、便利な速記語とし
て使用される。特に、１Ｎ−末端のＭｅｔ一希少“は、
タン・母り質配列中に必ずしもメチオニン残基が必要で
なく、最初にＮ−末端のメチオニンの可能性を持たない
タン・ザク質、たとえば融合タン・す１として又は分泌
されるタン・９り質として産生されるタンａ４り質を含
むことも意図されたいことを、本発明において意味する
。従って、本明細書に使用されるよりな″″Ｎ−Ｎ−末
端を一希少タンＩｆり質”は、　ＤＮＡ配列によってコ
ードされているタンパク質として見なされ、ここで該成
熟タンパク質は、読み枠のＡＴＧ開始コドンによってす
ぐ先行され、そしてＣＮＢｒ、）リゾシン又は他の試薬
によって実質的に切断されるべき融合体の一部でない。

組換え体タン・ヤク質の場合、その構成体は、明らかに
記されていて；生来の又は天然に組換られたＤＮＡ配列
のための構成体は、容易に定義され得ない。

Ｍｅ　を−先行のタン・辛り質”は、特定の成熟タン・
ｆり質に通常、見出される第１アミノ酸をすぐ先行する
Ｎ−末端のメチオニン残基を含むタン・９り質である。

“細胞”、′細胞培養物”、１宿主細胞”及び同様のも
のは１組換え体ＤＮＡ操作のための主細胞として見なさ
れる。本文から明らかであるように、これらの細胞は、
組換え技法に従って、新規ＤＮＡ配列の形質転換のため
の候補者であることができる。細胞によるＤＮＡ取シ込
みのために適切な技法は、インビトロでの形質転換を含
む。しかしながら、他の技法、たとえばトランスダクシ
璽ン又は接合もまた使用され得る。その定義はさらに、
直接的に関連する細胞の子孫を含む。そのような子孫は
、それらの親とＤＮＡ含有において、正確に同一でない
が、しかしたとえば突然の又は意図的な突然変異による
修飾が、それらの親によって示される性質に幾分か類似
する方法で、導入されたＤＮＡによって与えられる性質
を示すように細胞の能力を破壊しない限り、そのような
子孫は定義に含まれることが理解される。

Ｂ、一般的な説明 本発明は、Ｍｅｔ−アンノペゾチダーゼの使用によって
、細菌宿主中にＮ−末端のＭｅｔ一希少の組換え体タン
・ｆり質の産生を達成する。最も好ましい態様において
は、そのＭｅ　ｔ−アζノーｅグチダーゼは、高レベル
でその場で生成され、そして細胞宿主中においてインビ
♂で組換え体又は他のタン・ｆり質を処理する。しかし
ながら、宿主細胞から目的とする組換え体又は他のタン
・量り質を単離又は抽出し、そして細菌源から独立して
得られるＭｅｔ−アミノ−４７＃チダーゼによりインビ
トロで該抽出物を処理することがまた可能である。

Ｍｅｔ−アｔノペグチダーゼそれ自体に関して、この酵
素は生成され、そしてそれをコードするＤＮＡは、Ｅ、
コリ株をスクリーニングすることで容易に回収され、そ
してこれは、一般的に、それら自体のｒツム中にコード
されているＭｅｔ−アξノベプチ〆−ゼの増強された産
生について不完全なペプチダーゼである。この方法にお
いて、Ｍｅｔ　−アミノペゾチ〆−ゼをコードする、プ
ラスミドに担持され、且つ増幅されたＤＮＡ源を得、そ
して次に、その酵素がそれらの細胞から直接的に調製さ
れ、そして精製され得る。さらに、このプラスミドＤＮ
Ａ及び目的とする組換え体タンｚｆり質のための発現ベ
クターを含む組換え体宿主の同時−形質転換が、Ｎ−末
端のＭｅｔ一希少形の組換え体タンノｆり質の産生を、
その場でもたらす。

通常、野生型の細菌中に見出される多数のべ！チダーゼ
を欠いている多数のＥ、コリ株が知られている。たとえ
ば、Ｍ１Ｉｌｅｒ、　Ｃ，Ｇ、　、など、Ｊ、−Ｂａｃ
ｔ＠ｒｌｏ１．　（１９７８）±３５　　：６０３〜６
１１は、ペプチダーゼ欠失である多数の細菌株を開示す
る。

これらの菌株の１つ、すなわち０Ｍ８９　（これは、ペ
プチダーゼＮ、ペゾチダーゼＡ、ペプチダーゼＢ、ペデ
チ〆−ゼＤ及びペプチダーゼＱを欠いている）７ｊＸ下
の例示に使用された。しかしながら、細菌株の他のペプ
チダーゼ欠失の突然変異体も同じように使用され得た。

多分、これらの菌株のダノムは、Ｍｅｔ−アミノイプチ
ダーゼ活性をコードする配列をまだ含み、そして従って
、そのダノムＤＮＡが、適切な制限酵素により消化され
そして担体ベクター中にそのフラグメントをクローニン
グすることによって２イプラリイを構成するために使用
される。ｐＵＣシリーズ及びｐＢＲ３２２を含む、種々
のそのような担体ベクターが使用できる。次に、所望に
より、７’　７スミドＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの単
離及びスクリーニングのためにペプチダーゼ欠失の菌株
中への形質転換の前に、いずれか便利な野生型宿主を用
いて増幅され得る。

次に、形質転換されたペプチダーゼ欠失の細菌は、適切
な基質を切断するためのそれらの能力のために、粗抽出
物を検定することによりて、目的とするＭｅｔ−アンノ
ペゾチダーゼの産生についてスクリーンされる。次に、
高レベルのＭｅｔ−アミノイゾチダーゼを示す菌株は、
組換え体タンパク質のための発現ベクターによる同時−
形質転換のために、との酵素源として、又は！ラスミド
ＤＮＡ源として便利に使用される。

さらに、この菌株からの！ラスミドＤＮＡを使用し、適
切なＭｅ　ｔ−アミノペゾチダーゼをコードする配列の
ために野生型細菌のｒツムを！ローブすることができる
。適切な方法は、特に下に記載されているハイブリッド
形成条件の特徴のものである。これらの特定条件は、使
用される必要はないが、しかしそれらは相同する必要条
件を有する。

もちろん、これらの回収された配列はまた、それら自身
のプロモーターの制御下で又は当業界に知られている他
のプロモーター、たとえばｔｒｐ　７’ロモーター又は
ペニシリナーゼプロモーターヲ用いて、発現され得る。

本発明で産生されるＭｅｔ−アｉノペデチダーゼタンノ
ヤク質を精製し、そしてその精製されたタンパク質及び
適切な免疫方法を用いて抗体を得ることができる。その
精製は、細胞を破壊し、そして溶菌を含む上清液から酵
素を単離することによって行なわれる。この単離は、タ
ン・ｆり質が吸着され、次に適切な緩衝液による溶出を
含む条件下で、陰イオン交換樹脂による処置を含む。適
切な陰イオン交換樹脂は、種々の炭化水素支持体に接合
されているＤＥＡＥを含む。当業界で良く知られている
、他の陰イオン交換樹脂もまた使用され得る。

ウサギ、ラット又は他の哺乳類中で精蒙されたタンパク
質に応じて生まれる抗体は、種々の微生物からのＭｅｔ
−アミノペグチダーゼタンパク質ヲ同定することに有用
である。

多数の組換え体タンノリ１は、本発明の方法を用いて、
Ｎ−末端のメチオニンを含まない成熟タン・９り質とし
て生成するための候補者である。たとえば、リンフ才力
イン、たとえばＩＬ−２，ＩＬ−１：α−及びｒ−イン
ターフェロン（β−インターフェロンは通常、その成熟
形中Ｎ−末端のメチオニンを含む）；腫瘍壊死因子：及
びリン／４系に関連する他のタン・昔り質が産生される
。また種々のホルモン、たとえば成長ホルモン、インシ
工リン、ＡＣＴＨ、エンドルフィン及び他のベゾチドホ
ル七ンが組換え体により産生され得る。組換え体産生の
ための他の候補者は、酵素、たとえば組織シラスミノ−
ｒン活性化因子、ウロキナーゼ及び工業的用途に有用な
酵素、たとえばアルコールデヒドロゲナーゼを含む。他
のタンパク質は、毒素、たとえばジフテリア及びリシン
毒素及び種々の因子、たとえば上皮成長因子及び形質転
換成長因子を含む。前記のものは、単に典型的なもので
あり、そしていったんその遺伝子が得られた後、大体、
目的とするタンパク質が、すぐ上流のＡＴＧ開始コドン
に読み枠を整合してそれに結合し、そして必要な制御配
列を提供することによって成熟タン・ｆり質として発現
され得る。本発明の方法は、これらのタン・量り質のす
べてが、Ｎ−末端のメチオニンを含まないで便利に産生
されることを可能にする。

上に述べたように、Ｍｅｔ−アミノペゾチダーゼは、２
つの一般的な方法で使用され得る。九とえば、酵素は、
シラスオド相持のＤＮＡから比較的多量に酵素を産生ず
る特定の細胞から単離され、そしてインビトロの反応混
合物に添加し、Ｎ−末端のメチオニンプロセシングをも
たらし、又はインヒＩＮ７°ロセシングを可能にするた
めに、Ｍ＠ｌ−アζノペゾチ〆−ゼを＝−ドするプラス
ミドを、組換え体細菌宿主中に目的とするタンＩ４り質
のための発現ベクターと一緒に同時形質転換することが
できる。

インビトロアプローチにおいては、精製されたＭｅｔ−
アξノペノチダーゼを、プロセシングされていないタン
ａ４り質、適切な塩及び緩衝液を含む反応混合物に添加
する。その反応混合物を、約３０℃の温度で一晩インキ
鼻ペートシ、そのプロセシングを可能にする。その酵素
はコバルトイオンを必要とする。典型的な反応混合物は
、約１１９／ａｔの基質タン・量り質、−＝７〜８のリ
ン酸緩衝液中、約８０μｆ／／ｗｒｌの酵素及び約０．
２ｍＭのコバルトイオンを含むことができる。もちろん
、前記の典型的な混合物は単に例示的であり、そしてそ
の成分の濃度は、基質の性質及び使用される時間及び温
度の条件に依存して連続的に便化することができる。

完全なプロセシングは、切シ離されるメチオリン残基の
量を測定し、プロセシングされた及びプロセシングされ
ていないタンパク質をＳＤＳ　ＰＡＧＥ上でその移動度
を比較し、又は混合物中に含まれる基質材料を配列決定
することによって確かめられ得る。

インビ♂アプローチにおいては、プラスミドＤＮＡを、
Ｍｅｔ−アミノ−ｅノチダーゼ源の菌株から単離し、そ
してそれを用いて、すでに含む又はタン・母り質のだめ
の発現系を含むために付随的に又は続いて形質転換され
る細胞を形質転換する。細菌性酵素のための細菌源に用
いられる場合、プロセシングされていない基質を、微生
物によって通常、生成されるタン・量り質の補体の一部
として産生ずることができる。よシ一般的には、その場
で生成されるペプチダーゼを用いて、組換え体により生
成されたタン・量り質をプロセシングし、そしてその細
胞は、形質転換されるある点で、目的とするタン・々り
質のだめの発現系を含むべきである。

以下余白 Ｃ１標準的な技法 細菌の形質転換のための標準的な方法、マーカーを用い
ての好結果をもたらす形質転換体の選択、プラスミドベ
クターの製造及び遺伝子又はｃＤＮＡパンクのスクリー
ニングが技術的に良く理解されている。便宜上、下に示
されている例において特に有用な方法の選択がここに示
される。はとんどのそのよう表方法、又は他の可能な方
法が、Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓに見出される。

Ｃ０１，宿主及び制御配列 Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼを担持するベクターによる
同時形質転換のために適切な細胞及びタン・９り質のた
めの発現系は細菌である。最も頻繁に使用される宿主は
、種々の４２週株である。しかし寿から、他の細菌株、
たとえばバチルス（たとえば枯草菌）、種々のプソイド
モナス又は他の細菌株もまた使用され得る。そのような
原核系においては、宿主と適合できる種に由来する複製
部位及び制御配列を含むプラスミドベクターが使用され
る。たとえば、Ｅ、コリは、Ｂｏｌ　１ｖａｒ　＊など
、９ｖリー（１９７７）２：９５による駐種に由来する
プラスミド、すなわちｐＢＲ３２２の誘導体を用いて典
型的には形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリ
ン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、そ
して従って、目的とするベクターを構成することにおい
て、保持され又は破壊され得る付加マーカーを提供する
。転写開始のためのプロモーター、場合によってはオペ
レーター及びりがシーム結合部位配列を含むようにこの
明細書で定義されている、通常使用される原核生物の制
御配列は、β−ラクタマーゼ（ペプチダ−ゼ）及びラク
トース（ｌａｃ）プロモーター基（：Ｃｈａｎｇ＋など
、Ｎａｔｕｒｓ　（１９７７）１９８：１０５６）及び
トリシトファン（ｔｒｐ　）プロモーター基（Ｇｏｅｄ
ｄ＠ｌ　、などＮｕａｌ＠ｉｅ　Ａｃｌｄｍ　Ｒｅｓ、
　（１９８０）８：４０５７）並びにλ由来のＰＬプロ
モーターのような通常用いられるプロモーター及びＮ−
遺伝子のりがシーム結合部位（８ｈ１ｍａｔａｋ・、な
ど。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）２９２：１２８）を含み、
そしてこのカセットは、１９８４年２月８日出願された
同時係属出願第５７８，１３３号に示されている。

しかしながら、原核生物と適合する、いずれか有効なプ
ロモーター系が使用され得る。

Ｃ０２，形質転換 Ｃｏｈ＠ｎ、　Ｓ、Ｎ、　、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、
　Ａａａｄ、　　Ｓａｔ。

（Ｕ８Ａ）（１９７２）６９：２１１０　によって記載
されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処
理力又はＭａｒｉａｔｌ−１など、（繭記）に記載して
いるＲｂＣｔ２法を用いて、細胞を形質転換する。

Ｃ８３，ベクター構成 目的とするコード配列及び制御配列を含む適切なベクタ
ーの構成は、尚業界において良く理解されている標準の
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、Ｄ
ＮＡ配列又は合成されたオリがヌクレオチドを、目的と
する形に切断し、合わせ、そして再連結する。

部位特異的なりＮＡ切断を、当業界において一般的に理
解されている条件及び商業的に入手可能な制限酵素の製
造業者によって記されている詳報下で適切な制限酵素（
又は複数の制限酵素）にょ多処理することによって行な
う。たとえばＮ＠ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌｍｂｓ、
　Ｐｒｏｄｕａｔ　Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。一般
的に、約１　ｐ９のプラスミド又はＤＮＡ配列を、約２
０μｌの緩衝溶液中１ユニツトの酵素によって切断し；
本明細書での例においては、典型的には過剰の制限酵素
を用いて、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実にする。変動
は寛大に見られ得るが、約３７℃で約１〜２時間のイン
キュページ曹ン時間が用いられる。おのおののインキュ
ページ■ンの後、フェノール／クロロホルムによる抽出
によってタン・ｆり質を取り除き、そしてその後エーテ
ル抽出を行ない、そしてエタノールによる沈殿、次にＳ
＠ｐｈａｄ＠ｘ　Ｇ−５０スピンカラムを通すことによ
る水性画分から核酸を回収する。所望により、切断され
たフラグメントのサイズ分離を、標準技法を用いてポリ
アクリルアミドダル又はアガロースダル電気泳動によっ
て行なうことができる。一般的なサイズ分離の説明は、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８
０）　６５　：４９　’Ｊ−５６０に見出される。

制限することにより切断されたフラグメントを、５０ｍ
ＭのＴｒｌｓ　（ｐＨ＝　７．６　）、５０ｍＭのＮａ
Ｃ１゜６　ｍＭのＭｇＣｌ２．６　ｍＭのＤＴＴ及び５
〜１０μＭのｄＮＴＰ中において２０〜２５℃で約１５
〜２５分間のインキュベージ目ン時間を用いて、４種の
デオキシヌクレオチド　トリホスフェート（ｄＮＴＰ）
の存在下でＥ、コリのＤＮＡポリマラーゼ■の大フラグ
メント（Ｋｌ＠ｎｏｗ　）によ多処理することによって
平滑末端にすることができる。たとえ４種のｄＮＴＰが
存在しても、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントは５′付着端で
フィルインし、そして突出する３′の単一鎖をチェパッ
クスする。所望により、選択的な修復を、付着端の性質
によって受ける範囲内でたった１つの又は選択されたｄ
ＮＴＰを供給することによって行なうことができる。Ｋ
１＠ｎｏｖによる処理の後、その混合物を、フェノール
／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールによる
沈殿せしメタ後、Ｓ・ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカ
ラムを通す。

Ｓ１ヌクレアーゼによる適切な条件下での処理は、単一
鎖部分の加水分解をもたらす。

Ｍａｔｔ＠ｕｃｃｉ、など、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈ＠ｍ
、　Ｓｏａ、　（１９８１）１０３：３１８５のトリエ
ステル法又は商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチ
ド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調製する
。アニーリングの前又はラベリングのための単一鎖のキ
ナーゼ処理を、５０ｍＭのＴｒ　ｉｓ　（ｐＨ−７，６
）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ｍＭのジチオトレイトー
ル、１〜２ｍＭのＡＴＰ、１．７ｐモルのｆ　”Ｐ−Ａ
ＴＰ　（２，９ｍ１ｎ／ｍモル）、０．１　ｍＶのスペ
ルｉジン及び０．１ｍＭのＥＤＴＡの存在下において０
．１ｎモルの基質に対しておよそ１０ユニツトのポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて達成する。

次の標準条件及び温度：　２０　ｍＭのＴｒｌａ−Ｃｔ
（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭのＭｇ　Ｃｔ２．１０　ｍ
ＭのＤＴＴ、　３３　ｐｆｌ／ｍｌのＢＳＡ　、　１０
　ｍＭ〜５０　ｍＭのＮａＣＬ及び１４℃で４０μＭの
ＡＴＰ、　０．０１〜０．０２（Ｗ＠１ｍ１）ユニット
のＴ４のＤＮＡリガーゼ（１付着端”の連結のための）
又は１４℃で１　ｍＭのＡＴＰ、　０．３〜０．６　（
Ｗｓｉｓａ）のユニットのＴ４のＤＮＡ　リガーゼ（“
平滑端１の連結のための）のいずれか下で、連結を１５
〜３０μ！の体積で行なう。分子間の“付着端″連結は
、普通、合計のＤＮＡ濃度のｌｌ当ｊｌｌ　３３〜１０
０ｆｉ＆　（５〜１００　ｎＭの合計最終濃度）で行な
われる。分子間の平滑端連結（普通１０〜３０倍のモル
過剰のリンカ−を用いる）を、１μＭの合計最終濃度で
行なう。

“ベクターフラグメント”を用いるベクター構成におい
ては、５′のリン酸を取り除き、そしてベクターの再連
結を妨げるために、細菌性アルカリホスファターゼ（Ｂ
ＡＰ）によりベクターフラグメントを通常、処理する。

ＢＡＰによる消化は、ベクターのμｌ当り約１ユニツト
のＢＡＰを用いて６０℃で約１時間、Ｎａ＋及びＭ、２
＋の存在下でおよそ１５０ｍＭのＴｒ％ｐ（ｐＨ＝８）
　　中において行なわれる。核酸フラグメントを回収す
るために、調製物ラフエノール／クロロホルムにより抽
出し、そしてエタノールにより沈殿せしめ、そして８＠
ｐｈａｄ＠ｘ　Ｇ−５０スピンカラムに適用するととに
よって脱塩化する。他方、所望としないフラグメントの
追加の制限酵素による消化によって二重消化されている
ベクターにおいて、再連結を妨げることができる。

配列の修飾を必要とする、ａＤＮＡ又はｒツムＤＮＡに
由来するベクターの部分のために、部位特異的プライマ
ーにより指図された突然変異誘発を、Ｚｏｌｌ＠ｒ、　
Ｍ、　Ｊ、　、など、　Ｎｕｃｌｓｌａ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ。

（１９８２）１０：６４８７〜６５００の方法に従って
用いる。これは、突然変異誘発されるべき（但し、ミス
マツチングを限定する）単一鎖の７７−ジのＤＮＡ　Ｋ
相補的なブライマー合成オリがヌクレオチドを用いて行
われる。手短に言えば、合成オリがヌクレオチドは、そ
のファージに相補的な鎖の合成を指示するプライマーと
して用りられ、そしてその得られる二重鎖ＤＮＡは、フ
ァージ支持の宿主細菌に形質転換される。形質転換され
た細菌の培養物をカンテン上にプレートシ、ファージを
含む単一の細胞からプラーク形成を可能にする。

理論上、新プラークの５０チが、単一鎖とじて突然変異
形を有するファージを含み；他の５０％が元の配列を有
するであろう。得られるプラークは、正確なマツチのハ
イブリッド形成を可能にする温度で、キナーゼ処理され
た合成ブライｉ−によりバイブリッド形成されるが、し
かしこむで、元の鎖とのミスマッチは、十分にハイブリ
ッド形成を妨げる。次に、そのプローブと共にハイブリ
ッド形成するプラークを得、培養し、そしてそのＤＮＡ
を回収する。部位特異的な突然変異方法は下の特定の例
に詳しく説明される。

ｃ、４．＠成の確認 ！ラスミド構成のための正しい連結を、Ｅ、コリＧ＊ｎ
５ｔｌｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ＠ｎｔ＠ｒ、ＣＧＳＣす６１
３５から得られた４ヱ」株ＭＭ２９４又はその連結混合
物を有する他の適切な宿主をまず形質転換することによ
って確かめる。好結果をもたらす形質転換体を、当業界
に知られているよりなアンピシリン、テトラサイクリン
又は他の抗生物質耐性により又はプラスミド構成の態様
に依存して他のマーカーを用いることによって選択する
。次に、その形質転換体からのプラスミドを、ＣＩ＠ｗ
＊１１．Ｄ、Ｂ、　ｒなど、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　（ＵＳＡ）　（１９６９）　６
２：１１５９　の方法、場合によっては続いて、りｐう
人フェニコール増幅［Ｃ１＠Ｗ＠１１．　Ｄ、　Ｂ、　
。

Ｊ、　Ｂａｅｔ＠ｒｌｏ１．　（１９７２）　１１０　
：６６７　）に従って調製する。その単離されたＤＮＡ
を制限処理によって分析し、そして／又はＳａｎｇ＠ｒ
、Ｆ’、、など、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａａａｄ、
　８ｏ１．　（Ｕ８Ａ）　（１９７７）７４：５４６３
、さらにＭＢｓｌｎｇｓなど、（１９８０）６５：４９
９　のジデオキシ法によって配列決定する。

Ｃ６５９例示された宿主 本発明でクローニング及び発現に使用される宿主株は次
の通りである　： クローニング及び配列決定のためには、及びほとんどの
細菌！ロモーターの制御下で構成体の発現のためには、
Ｅ、コリ株ＭＭ２９４（前記）を宿主として使用したＴ
ａｌｍａｄｇ＠、　Ｋ、、など、Ｇ＠ｎｅ　（１９８０
）１２　：　２３５　；　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、、
など、Ｎａｔｕｒｅ（１９６８）２１７：１１１０゜Ｐ
ＬＮ□８プロモーターの制御下での発現のためには、ｌ
、＝ｒｌＪ株に１２ＭＣ１００Ｏλ溶原菌＃　Ｎ７Ｎ５
３ｏＩ８５７ＳｕｓＰＨ。

ＡＴＣＣ３９５３１（この後、時々ＭＣ１００Ｏ−３９
５３１として言及する）を用いる。挿入体の存在を確か
めるために、その挿入体の領域における主鎖ベクターの
特徴を相定する菌株を使用する。たとえば。

ｐＵＣシリーズのためには、挿入体の不在下でメーｒル
指示培地上で青色のコロニイー及び挿入体の存在下で白
色のコロニイーを生成するＥ、コリ株ＤＧ９９を用いる
。

以下余白 ００例 次の例は本発明を例示するものであって、限定するもの
ではない。

Ｈａｌｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎ＠ｗ　Ｙ
ｏｒｋ　、　１３７〜１３９の方法によりて、Ｅ、コリ
株ＣＭ８９　（前記〕から染色体ＤＮＡ１抽出し、そし
て１０ｍＭのＴｒｌｍ及び１　ｍＭのＥＤＴＡ　（Ｔ　
Ｅ）緩衝液（ｐＨ＝８．０）中に保存した。そのＤＮＡ
を、０．ＩＵ／μｇ及び０．２Ｕ／μｇで１時間３７℃
で５ａｕａＡＴにより消化した。反応を停止し、そして
エタノールによる沈殿せしめた後、一部消化されたＤＮ
Ａをゾールし、そしてＢｅｃｋｍａｎｎ　ＳＷ２　Ｂ　
ローターを用いて２６．００　Ｏｒｐｍで２４時間、１
５℃で１０〜４０％のスクロースグラジェント上で画分
した。４’−８ｋｂのフラグメントラ含む画分をノール
し、Ｉ）Ｅ５２　カラム上で精製し、溶離剤からエタノ
ールにより沈殿し、そしてＴＥ緩衝液中に保存した。

次に、染色体ＤＮＡの４μｇ部分を、Ｂａｍ）（Ｉによ
り消化された。　ＲＡＰ処理されたｐＵｃ’１８ベクタ
ーフラグメント０．５μｙと共に連結した。その連結混
合物を用いて、Ｅ、コＩＪＩ）Ｃ９９を形質転換し、そ
してラクトース指示器プレート上に置き、プラスミド中
に挿入体の存在を確めた。更に、形質転換体のおよそ９
４憾がおよそ４ｋｂのＤＮＡ挿入体を含んだ。

従って、１８μノの連結混合物を用いて、Ａｍｐ”に対
してＥ、コリＩｖ！Ｍ２９４　’ｅ形質転換し、その遺
伝子ライブラリィを得た。好結果をもたらす形質転換体
を得、そしてそれを用いて、プラスミドＤＮＡ調製のた
めにアンピシリン含有の培養基７００ｍ１に接種した。

上のＣ，４，（Ｃ１＊ｗ＠１１．　Ｄ、Ｂ、、　Ｐｒｏ
ｅ、　Ｎａｔｌ。

るようにして、プラスミドＤＮＡ　ｉ細胞から得、そし
てそれを用いてＥ、コＱＣＭ８９を形質転換した。

Ａｍｐ”　ｔｓ対もに選択された、好結果の形質転換体
を、スクリーニングのためにマイクロタイタートレイ中
に置き、そしておよそ１，０００コロニイをスクリーン
した。

２ＸのＬ−Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ）　＋　１４のＮａ
Ｃｔ、　１０優のカサミノ酸及びＩＯＸの酵母窒素塩基
のそれぞれを５優マ／Ｖで補足された最小培地（たとえ
ばアメリカ特許第４，５１８，５８４号を参照のこと、
そしてこの開示を引用によりこの明細書中に組み入れる
）２００μを中に、単一のコロニイーを取った。３７℃
で１晩、増殖した後、細胞を０．１ＭのＴｒ　ｉ　ｓ　
−ＨＣＬ　（ＰＨ＝　７．４　）で２度洗浄した。その
細胞を、同じ緩衝液中１睨／ｄのリゾチーム溶液２０μ
ｌを添加することによって細胞溶解し、次に凍結融解を
３度くり返した。次に、７２μＩのＭｅｔ−Ｇｔｙ−Ｍ
ｅｔ−Ｍａｔ　、　３６μｇのＬ−アミノ酸オキシダー
ゼ、４〜５μＩのホースラディシュ　ペルオキシダーゼ
、及び１８μｇのＯ−ジアニシジンジヒドロクロリドを
含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＯ４）（ｐ
Ｈ＝　７．４　）　＋　０．２　ｍＭ　ＣａＣｌ２の溶
液１８０　ｐｉを、おのおののウェルに添加し；　Ｍｅ
ｔ−アミノ（ブチダーゼ含有の細胞溶解物において、色
の形成は明らかであった。スクリーンされたおよそ１，
０００のコロニイーのうち１０のコロニイーカ、Ｍｅｔ
−Ｇｊｙ−Ｍｅｔ−ＭｓｔからＭｅｔを放す速度を上昇
することを示し、そしてさらに、同じ条件下でＬａｕ−
ａｚｙ−ａｚｙからＬ＠ｕ　ｋ放すことができないもの
についてスクリーンした。１つの好結果をもたらすコロ
ニイーを、ｐＳＹＣ　１１７４と名づけた。Ｅ、コリの
ｐＳＹＣ　１１７４を、１９８５年８月２７日、Ａｍ＠
ｒｌｅａｎ　Ｔｙｐ＠Ｃｕ１ｔｕｒ＠Ｃｏ１１＠ｃｔｉ
ｏｎに寄託し、そして寄託番号５３２４５を得た。

配列の回収 ｐＳＹＣ　１１７４を有するＥ、コリ株（また１８Ｅ７
と名づけられた）は、上に記載しているようにして一般
的に行なわれた、Ｍｅｔ　−ＧＬｙ　−Ｍｅ　ｔ−Ｍｅ
ｔ基質介在のイン　ビトロ検定において、およそ１００
倍の高い活性を与えた。

プラスミドＤＮＡ１、菌株１８Ｅ７から単離し、そして
Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードするゾラスミドｐ
ＳＹＣ１１７４’ｔ”単離した。ｐｓＹｃ１１７４は、
ＢａｍＨＩ部位で、ｐＵ０１８ベクター中に３．２ｋｂ
の挿入体を担持した。１．２ｋｂのフラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩ／Ｃム」による消化によって該挿入体の５′末
端から切り出し、そしてｐＵｃｌＢ及びｐＵｏ　１９中
に挿入し：　ｐＳＹＣ　１１７４　ｆｆｉ、Ｃ１＊　Ｔ
により消化し、Ｋｌｅｎｏｗにより平滑にし、そして次
にＥａｏＲＩにより消化し、１．２ｋｂのＥａｏＲＩ／
平滑フラグメントを切り出した。このフラグメントを、
Ｅａａ　ＲＴ　／　Ｓｍａ　Ｔにより消化されたｐＵｃ
　１８又はｐＵｃ　１９中に挿入し、そしてこれは宿主
プラスミド上でｔａａプロモーターに対して反対の方向
をもたらす。０Ｍ８９中にトランスフェクトされる場合
、得られるベクターｐＳＹＣ　１１８７及びｐ　５ｙｃ
１１８８の両者は、ｐｓＹｃ１１７４によりて示される
レベルに匹敵するアミノペゾチダーぜ生成のレベルを示
した。これらの結果は、Ｍｅｔ−アミノ−（！チダーゼ
の遺伝子及びそのプロモーターの両者が１、２　ｋｂの
フラグメント内に位置していることを示す。

第２図は、ジデオキシ配列決定によって決定された１、
　２　ｋｂのフラグメントの完全なヌクレオチド配列を
示す。ＡＴＧから開始する読み取り枠（ｏｐｅｎｒｅａ
ｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）は、位置２１９〜１０１０で
あり、そして２９，３３３の計算分子ｔを有する２６４
個のアミノ酸の推宇タンノ９り質をコードする。推定さ
れる最初の６４個のアミノ酸は、下のり、３に記載され
ているようか精製タンパク質のアミノ醸配列決定を用い
て得られるアミノ酸に対応する。

この読み取り枠に関連する２つの並んだプロモーターの
位置がまた示され、セしてＰｌ及びＰ２としてラベルさ
れている。（左のカラムの数字はヌクレオチドを示し、
右のカラムの数字はアミノ酸を示す。） 上の１．２ｋｂのフラグメントを、サザン法によってＥ
、コリのｒツムＤＮＡ　ｅゾローデするために使用し、
そしてそれぞれＰａｔ　Ｉ　、　Ｅｃｏ　Ｒ１及びＢｓ
ａＨＩＩによる消化によって生成されｆｃ３．６゜５．
２及び１．３５　ｋｂのバンドに対してノ為イブリッド
形成しく但し、染色体の他の領域に対してはノ・イブリ
ッド形成しない〕、従って、その遺伝子は、Ｅ、コリ中
において単純複写として存在することを示す。その遺伝
子の３′末端での配列の測定はまた、Ｎｅｔ−アミノペ
プチダーゼから下流に同時転写された遺伝子がたぶん存
在しないという結論を導ひく。５′末端での配列の測定
は、並列のプロモーターの存在を示す。

推定されるアミノ酸配列１〜２６４（又はその補体）を
コードする、第２図に示されるヌクレオチド配列は、一
般的に、追加のＭｅｔ−アミノ（ブチダーゼをコードす
る配列のために細菌性ｒツムＤＮＡ−１プローブするの
に有用である。従うて、この挿入体は、たとえばパシラ
スサゾチリス、！ソイトモナス又は酵母からこの目的と
するＤＮＡ′ｆｔ得るための便利な道具である。）・イ
ブリッド形成に関連する適切な方法は、６　Ｘ　ＢＳＣ
％０．ＯＩＭのＥＤＴＡ、　５　Ｘ　Ｄ＠ｎｈａｒｄｔ
ｓ、０．５憾の１３ＤＢを含む緩衝液中において、６５
℃で反応を完結するのに十分な時間反応せしめ、次に６
５℃で３　ｘ　Ｓａｃにより洗浄することである。すな
わち、これらの条件下で上のニックトランスレーション
された！ロープに対してハイブリッド形成し、そして本
明細書に定義されているよりなＭｅｔ−アミノペプチダ
ーゼ活性を有するタンｉＪ？り質をコードするＤＮＡが
、本発明内に含まれ、そして本発明内のＭｅｔ−アミノ
ペプチダーゼ　タンｉ９り質をコードする。

Ｍｅｔ−アミノ（ブチダーゼを、Ｅ、コリのｐ８Ｙｃ１
１７４の粗抽出物から精製し、そしてその精製されたタ
ン・苧り質を、種々のぼデチド基質を用いてアミノ酸を
放す能力について分析した。

精製のためには、Ｂｒａｌｎ　Ｈｅａｔ　Ｉｎｆｕｉｉ
ｏｎブイヨン中でのＥ、コリのｐｓＹｃ１１７４の一晩
の培養物を、０．２　ｍＭのＣｏ　Ｃ１０を含むＫＰＯ
４緩衝液（２０ｍＭ。

ｐＨ＝７．４）で２度洗浄し、そして音波処理した。

ＰＭＳＦ　（０，１ｍＭ　）　ｔ”、その音波処理物に
添加した。

その音波処理物を、遠心分離し、そしてその上清ｆｆｔ
＝、　ＤＥＡＥ−七ファロース　ファースト　フローに
通した。酵素を、同じ緩衝液中、ＮａＣＬグラジエンド
（０−０，２５Ｍ）により溶離した。Ｍｅｔ−アミノ（
ブチダーゼ活性を有する両分をゾールし、分子１１３０
．０００のＣ５ｎｔｒｉａｏｎ）４ルターを用いて濃縮
し、そして同じ緩衝液＋１ｍＭのメチオニンを含むＳ−
２００セフアクリルカラムを通した。活性画分をプール
し、そして前のようにして濃縮した。

サブユニ、トの分子酸が、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　（ＳＤＳ
ポリアクリルアミドダル電気泳動）によっておよそ３２
．０００であることが測定され［Ｌａｅｍｍｌｉ　＋Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．（１９７３）８０：５７５−５９
９］そして酵素純度は９５係であることが推定された。

従って、そのタンノクク質は、２６４のアミノ酸のタン
パク質についてこのおよその予定サイズである。染色さ
れたｒルのデンシナメーターに基づく鎗の推定値は、Ｍ
ｅｔ−アミノ−′Ｉ！７′チダーゼが約１５〜２０チの
細胞タン・豐り質であることを示した。

Ｎ−末端の配列決定を、精製されたべ！チダーゼに対し
て行なった。初めの６５個のアミノ酸についての結果は
第１表に与えられている。

変形されたし一アミノ酸オキシダーゼーＨＲＰ　−０Ｄ
ＡＤ検定を用いて、一般的には、上に記載しているよう
に及びＴＬＣ法によって、精製されたＭｅｔ−アミン（
ブチダーゼが種々の−ｅｆチド基質からアミノ酸を放す
能力について分析された。初めにふれた検定のためには
、タンパク質溶液（この場合、細胞溶解物）１０μｔを
、４　ｍＭのＭｓ　ｔ　−Ｇｔｙ　−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ１
０．Ｉ　Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐｉ−１＝７．５
及び０．２　ｍＭのＣｏＣ６２（ｉｌ−含む基質溶液９
０　μｉ中に添加した。その反応混合物を含むチューブ
を、３０℃で１０分間インキユペートシ、そして熱湯槽
中に２分間、そのチューブを置くことによって、その反
応を停止せしめた。０．９　ｍの発色混合物（Ｌ−アミ
ノ酸オキシダーゼ０．２■、ホースラディ、シー　イル
オキシダーゼ０．０３η及びＯ−ゾアニシデン　ジヒド
ロクロリド　０．２Ｉｎ９’ｅ含む０．１ＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｔ（ＦＪ−（＝７．４　）　）　ｋ添加した後、
そのチューブを、３０℃で３０〜６０分間インキ、ベー
トし、そしてその光学密度ｆｔ４４０　ｎｍで読取りた
。

ＴＬＣ法は、ｎ−ブタノール−酢酸−水（１２０：５０
　：　３０　ｖ／ｖ　）溶媒混合物を含むシリカｒル！
レートヲ使用した。ニンヒドリン試薬によりそのプレー
トをスプレーした後、放出されたアミノ酸を検出し、そ
して同定した。

メチオニンは、次の（グチドから放された：Ｍｅｔ−Ａ
ｔａ−Ｍｅｔ　： Ｍｅｔ−ＧＡｙ−Ｍａｔ−Ｍｅｔ　： Ｍｓｔ−Ｇｔｙ−Ｍｅｔ　： Ｍｅｔ−Ａｔａ−８ａｒ　： Ｍｅｔ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　： Ｍｅｔ−Ａｔａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−８
ｓｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｔｎ−Ｌｅ
ｕ　：及びＭｓｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙａ−Ｌｙｓ−Ｇｔｎ−Ｌ＠ｕ−Ｃ
ｙｍ。

アミノ酸は、次のベゾチドからは放されなかった： Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｔｙ　： Ｍｅｔ−Ｐｈａ−Ａｔａ−Ｇｔｙ　　：Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｓ　： Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　　： Ｌ＠ｕ−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ　　： Ｌ＠ｕ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　　： Ｍｅｔ−Ａｔａ　　： Ｌ＠ｕ−ＧＺｙ　　”。

Ｌｅｕ−ＡムーＰｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−８ｏｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｔｎ−Ｌｅｕ
　　：Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｍａｔ−Ｍａｔ　　：Ｍ
ｅｔ−Ｐｌ＋ｅ　　： Ｍｅｔ−Ｓｅｒ　　： ＶａＬ−１ｆｆｔｙ−Ｇｔｙ　　； Ｔｈｒ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　　： Ｔｒｐ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　　： ｐｈ・−ｃｚｙ−ａｚｙ　　： Ｍｅｔ−Ｇｔｕ−Ｈ１＆−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｙ−Ｇ
Ａｙ　　：Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｇｔｙ−Ｐｈｅ−８＊ｒ−Ｐｒｏ−ｐｈ・−Ａｒｇ　　
： ａｔｙ−＜ａｔｙ）、−ａｔｙ　； ｐｈ・−ａｚｙ−ａｚｙ　　； Ｓｅｙ−Ｓｅｒ−Ｂ＠ｒ　　： Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−８ａｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｔｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　　： Ａｔａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ｓｒ−Ｓｅｒ−８ｏｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｊｎ−Ｌｅｕ　　： Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ｌ＠ｕ　　： Ａｒｇ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　　： Ａｈｍ　−（Ａム）ｚ−ＡＺａ　： Ａｔａ−Ａｔａ−Ａｔａ　　：　　　。

Ｇｔｕ−Ｇｔｙ−Ｐｈｓ　　： Ｌ＠ｕ−Ｌｓｕ−Ｌｓｕ　　： Ｔｙｒ−Ｇｔｙ−Ｑｔｙ　　： ＩＡｅ−Ｇｔｙ−Ｇｔｙ　　： Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅア七テート。

そのペプチダーゼ活性は、１ｍＭのＥＤＴＡによって完
全に抑制され、そして最大の活性のためには、約１〜２
００ｍＭのリン酸イオン及び０．０２〜２．ＯｍＭのＣ
ｏ　　を要する。

Ｃｏ＋２ｋ、Ｍｎ＋２．　Ｃｕ＋２．　Ｚｎ÷２又はＭ
ｇ＋２イオンと取り替えることはできなかり几。リン酸
カリウム緩衝液の代りにＴｒｌｍが用いられる場合、そ
の活性はまた、激しく減少するが、しかしこの活性は、
ナトリウム又はカリウム塩の添加によってもとに戻され
得る。

前記結果から、−１！！チダーゼは、Ｎ−末端のメチオ
ニンのみを切断し、そして他の特異的必要条件もまた有
することが明らかである。配列中の第２及び第３アミノ
酸の性質は、重要であるように思え、そして（デチド中
に最少の３個のアミノ酸が必要とされるように思える。

しかしながら、短鎖ペプチドに基づく結果は、大きなタ
ンパク質の折りたたみが、残基２及び３に関しての特異
性を変える二次及び三次構造を提供することができる場
合、続くアミノ酸のための必要条件の点から完全に決定
的であることができない。さらに、その特異性は、条件
に依存し、そして使用される特定の条件下で加水分解を
受けていないペプチドは、もしその条件が変えられるか
ら、まだ加水分解され得る。

第二残基が１．２９Ｘよりも小さならせん半径を有する
側鎖を持つ場合、一般的にＭｅｔ−アミノ（ブチダーゼ
がＮ−末端のメチオニンを切断し、そしてその側鎖のサ
イズが１，４３１よりも大きな場合、一般的に切断が起
こらないであろうと思われるが、下に記載されているり
シンＡにおいて著しい例外が存在し、ここでＩｔ・、す
なわち第ニアミノ酸についてのらせん半径が１．５６Ｘ
である。従って、隣接するアミノ酸の影響及び基質の二
次及び三次構造がまた、その特異性に対して影響を及ぼ
すように思える。

さらに、上のようにしてｐＳＹＣ　１１７４から精製さ
れたＭｅｔ−アミノペプチダーゼを、標準の方法及びア
ジュ・噌ントを用いてウサギに注入し、Ｍｅｔ−アミノ
ペプチダーゼと特異的に反広する抗血清を得た。

ｐＳＹＣ　１１４３を担持するＥ、コリＭＭ２９４、す
ｆＺｂチ、ｔｒｐ　７’ロモーターの制御下で、成熟タ
ンパク質中においてＮ−末端配列：　Ａｔａ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ｓｅｒを有する組換え体ＩＬ−２ムティンのた
めの発現ベクターを、Ｅ、コリｐＳＹＣ１１７４から調
製されたプラスミドＤＮＡ　（ｐＳＹＣ　１１７４　　
と名づけられた）と共に形質転換した。目的とする両プ
ラスミドの存在を示す、好結果をもたらす形質転換体を
、Ａｍｐ　”及びＴ＠ｔ”によって選択した。

両プラスミドを含む細胞ヲ、トリシトファン５０１１１
９／ｌ、カサミノ酸５１１／ｌ　、アンピシリン５０ｍ
９／ｌ及びテトラサイクリン５ｍ９／ｌを含む最少培地
中で１晩３７℃で増殖した。次に、その培養物を洗浄し
、ＩＬ−２合成全抑制解除するためにトリットファンを
含まない同じ培地中に再懸濁し、そして３７℃で４時間
インキュベートした。

このようにして産生されたＴＬ−２は、細胞内のＲ体中
に含まれる。その８体を、くり返し音波処理することＫ
よって精製し、８ｍＭのＥＤＴＡにより洗浄し、そして
最後に５４　ＳＤＳ中に再懸濁した。

そのＩＬ−２を、Ｖｙｄａｅ　Ｃ４逆相カラム及び０．
１４トリフルオロ酢酸中アセトニトリルに対する水のグ
ラジェントを用いるＨＰＬＣによってさらに精製した。

その精製されたＩＬ−２のためのＮ−末端配列を決定し
、そしてその配列は次の混合物を示した： Ｍｅｔ−Ａｔａ−Ｐｒｏ−０〜５　％ Ａｔａ−Ｐｒｏ−２５〜３０　’Ｉ Ｐｒｏ−７０〜７５４　　。

上のようにして増殖され、そして誘導された対照培養物
（但し、ｐｓＹｃ１１４３のみを含む）は、生成された
ＩＬ−２を与え、ここでその精製されたタンパク質は、
７０係のＭｅｔ−Ａｔａ−Ｐｒｏ及び３０％のＡｔａ−
Ｐｒｏの組成物を有する。

（ｐｓＹｃ１１４３は、ｔｒｐゾｏモーター及びｃｒｙ
位置の正のレトロレギュレーター配列の制御下でＩＬ−
２配列を含む。それはｐＦＣ５１，’ｒ　（０，９５ｋ
ｂのＥａｏＲＩ　フラグメントとしてこの発現系を含み
）及びｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｍ”　マーカーを担持する
ｐＵＣ１８と適合する宿主ベクターである）から製造さ
れる。その発現系は、ｐＦｃ５１．ＴのＥｅｏＲＩ　消
化物として製造され、セしてＥａｏＲＩ　により消化さ
れりｐＡｃＹｏ　１８４　Ｋ連結され、ｐｓＹｃ１１４
３を得る。

ｐＦｃ５１．Ｔは、１９８５年８月３１日に出願された
日本特許第１９０９７６／８５号に広く記載され、そし
てこの開示を引用によりこの明細書中に組み入れる。〕 精製されたＭｅｔ−アミノペプチダーゼをまた用いて、
精製されたＩＬ−２をイン　ビトロでノロセシングした
。その反応混合物は、０．０５　ｑ６ＳＤＳ中、上で調
製された１、７η／ｍｌのＩＬ−２を含む原液５０μ’
　：　０．２　ｍＭのＣｏ　Ｃ１２を含む０，１Ｍリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ−７，５）　４０　Ｉｌｌ　：
及び８　ｒｙｙ／ｒｎｌのＥ、コリｐｓＹｃ１１７４か
ら精製されたＭｅｔ−アミノ（ブチダーゼの１：１０希
釈醇液１０μｌを含んだ。その反応混合物を、３０℃で
１晩インキユベートシ、そしてグロセシングの度合は、
５ＤＳＰＡＧＥ及びＮ−末端の配列決定を用いて査定し
た。

第３図は、未反応のＴＬ−２及び酵素の存在におけるＩ
Ｌ−２に対して行なわれたＳＤＳ　ＰＡＧＥの結果を示
す。インキュベージ、ンの後、わずかに低い分子量のタ
ンパク質の存在が、元のＭｅｔ一先行のタン・母り質に
よって示されるバンドを補充する。

酵素処理の前、その精製されたＩＬ−２のためのＮ−末
端配列は、７４係のＭｅｔ−Ａｔａ−Ｐｒｏ及び２６係
のＡｔａ−Ｐｒｏであり；酵素処理の後、　それは９４
　％　Ａｔａ−Ｐｒｏ及び６憾のＭｅｔ−Ａｔａ−Ｐｒ
ｏであった。

ｐｈｏＡｆロモーター、リーダー配列及び該リーダー配
列のＣ−末端でＮａｒＩ部位を提供するよう一ターを含
む、リシンＡ配列のための宿主４クター、すなわちｐｓ
Ｙ０１０８９　ｅ次のようにして構成した。

！ラスミドｐＥＧ２４７、すなわちＨｌｎｄｌ［Ｌ／Ｘ
ｈｏ　Ｉフラグメントとして２．６ｋｂのｐｈｏＡｍ造
遺伝子全遺伝子　５　ｋｂのプラスミドｆ、ｐｈｏＡ遺
伝子の源として使用した。このプラスミドｆ　Ｍ、　Ｃ
ａ５ａｄａｂａｎから得、そしてＧｒｏｉｓｍａｎ　、
　ＬＡｅ　、など、Ｐｒｏｅ。

１８４０〜１８４３に示されている方法に類似する方法
により構成した。更に、前記の文献に示されている方法
を適用することによって、ｐｈｏ　Ａ遺伝子を、いづれ
かの目的とする主力ベクター中に便利にクローンするこ
とができる。

ｐｇＧ　２４７からのＨｌｎｄ　［１／Ｘｈｏ　Ｉによ
る２、６ｋｂフラグメントを、精製し、モしてｐＵｃ　
１８中にクローンした。この２，７ｋｂプラスミドは、
アンピシリン耐性マーカー及び目的とする配列の便利な
挿入を可能にするポリリンカーを含む。ｐＵＣ１８ｆ：
Ｔ（ｉｎｄｎｌ／８ａＡＩにより消化し、そしてその線
状ベクターを、単離されたｐｈｏ　Ａフラグメントと連
結した。その連結混合物を用いて、Ｅ、コｌＪＪＭ１０
３又はＪＭ１０６、Ｋ匹敵する株のＥ、コリｒ）Ｃ９９
をＡｍ　ｐ　”に対して形質転換し、そしてｐＵｃ１８
中への挿入体についてスクリーンされた、好結果をもた
らす形質転換体における中間の！ラスミドｐＳＹＣ　９
９９の構成を確めた。

目的とするＮａｒＩ変性を含むｐＳＹＣ　９９７　ｅ、
特定部位の突然変異誘発によってｐＳＹＣ　９９１から
製造した。Ｐｖｕ　■／　Ｐｖｕ　ｌによる７７０個の
塩基対フラグメンｉ、ｐＳＹＣ９９１から得た。それは
ｐｈｏＡグロモーター及び成熟のアルカリ性ホスファタ
ーゼの上流のＮ−末端配列の部分、及び従って、完全な
リーダー配列もまた含む。このフラグメントを、Ｍ１３
ｍｐＨのＳｍａ　Ｉ部位に連結し、そして単鎖ファージ
を、突然変異誘発のための鋳型として調製した。こｑ突
然変異誘発においては、次の合成の２６−ｍｅｒ。

５’−ＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＧＧＣＧＣＣＴＴＴＧＴＣ
ＡＣＡＧ　−３’（上に書いた線はＮａｒ　Ｉ部位を示
す）は、！ライマー及び！ローブとして使用された。次
に、突然変異誘発されたファージ粒子を用いて、Ｎａｒ
Ｉ部位を含む、目的とするリーダー配列のための源とし
てＲＦ−ＤＮＡｆ調製した。

フタ− クロラムフェニコール耐性を提供するｐｓＹｃ１０１６
、レプリコン及びｐｈｏ　Ａ遺伝子における適切な制限
部位をまたｐＳＹＣ　９９１から構成する。まずｐｓＹ
ｃ９９１’ｋ、Ｔ（ｌｎｄ　ＩＩＩ／ＢａｍＨＩにより
消化し、そしてｐｈｏ　Ａ遺伝子を含むおよそ２．６　
ｋｂのフラグメントを精製し、そしてＨｌ　ｎｄ　ＤＩ
／ＢａｍＨＩにより消化されたｐＡＣＹＣ１８４からの
、精製された３、６５ｋｂのベクターフラグメントと連
結した。ｐＡｃＹｃ　１８４はＡＴＣＣから入手可能で
あり、そしてクロラムフェニコール遺伝子（Ｃｍ”　）
、細菌性レゾリコン及ヒテトラサイクリン耐性遺伝子に
おけるＨｌ　ｎｄ　■　　及びＢａｍＨＩ　部位を含む
。その連結混合物を用いてＣｍ”に対するＥ、コリＭＭ
２９４’ｉ形質転換し、そ１２てｐｓＹｃ１０１５の構
成を、制限分析及び配列決定によって確めた。

２つの付加中間体！ラスミド、ｐｓＹｃ１０５２及びｐ
ｓＹｃ１０７８が、Ｂ、スリンジエンシスの正のレトロ
レギュレーターの九めの適切な宿主ベクターを提供する
ために構成された。

変性されたリーダーｐｓＹｃ９９７からのｐｈｏＡ　７
’ロモーター及びＮａｒＩ部位を含む、精製された小さ
なＨＩｎｄＩ［ｌ／Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを、Ｈｌ
　ｎｄ　Ｉｌｌ／Ｂｓ５ＨＩＩにより消化されたｐ８Ｙ
ｃ１０１５（従って、これは変性されていない欠失した
ｐｈｏＡ配列を有する）に結することによってｐｓＹｃ
１０５２　ｔ”構成した。この得られるベクターｐｓＹ
ｃ１０５２全、Ｃｍ”に対するＥ、コリ形質転換体にお
いて確認した。

ｐｓＹ０１０７８は、欠失されたｐｈｏ　Ａゾロモータ
ーの前にＢａｍＨＩ部位を有するｐｓＹｃ１０５２の変
性された形である。このＢａｍＨＩ　部位を削除するた
めに、ｐｓＹ０１０５２ｋ、部分的なりａｍＨＩ消化に
ゆだね、４個のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリマラーゼ
Ｉ（Ｋｌａｎｏｗ　）　ｆ用いてフィルインし、そして
平滑末端条件下で再連結した。ｐｈｏ　Ａ遺伝子のちょ
うど３Ｉで唯一のＢａｍＨＩ　部位を含む、この目的と
する得られた！ラスミドを、好結果をもたらすＣｍ”形
質転換体をスクリーニングした後、確認した。

ｐ）ＩＣＷ７０１　ニレトロレギュレーターの源上流の
コード配列の発現を促進するために、Ｂ、スリンジエン
シスからの結晶タン／ｆり質をコードする遺伝子（Ｃｒ
ｙ遺伝子）の３′配列の能力は、１９８４年８月３１日
に出願され之アメリカ同時係属出願第６４６，５８４号
に記載され、そして特許請求されていて、そしてこの開
示を引用によりこの明細書中に組み入れた。要約すれば
、これらの配列は、約４３憾のシトシン−グアニン残基
含有物を有するステム及びルー！構造を形成することが
できる、対応する１’ｔＮＡ転写物に転写するＤＮＡ配
列によって特徴づけられている。遺伝子の３′末端から
の約３０〜３００のヌクレオチドを連結する場合、正の
レトロレギュレーター効果がその遺伝子発現上に示され
る。その正のレトロレギュレーターは、４００　ｂｐの
ＥｅｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントとして製造さ
れ、そしてそれは平滑末端化され、そしてｐＬＷｌ　、
すなわちインターロイキン−２のための発現ベクター中
に連結された。

（ｐＬＷｌは、Ｅ、コリ中で効果的なレプリコン、Ｔ＠
ｔ”遺伝子、Ｅ、コリのｔｒｐゾロモーター、り破シー
ム結合フラグメント及び７０６　ｂｐのＨｌ　ｎｄ　Ｉ
ＩＩ／ＰａｔＩＤＮＡフラグメント（ヒトＩＬ−２のた
めの遺伝子を含む）を含むｐＲＢＲ３２２誘導体である
。

ｐＬＷｌは、ブダ（スト条約下でＡ’ｒＣＣに寄託され
、そして寄託番号３９７５７金得る。〕 Ｋｌｅｎｏｗ及び２個のｄＮＴＰによりｅｒ７遺伝子の
正のレトロレギュレーターを含む４００　ｂｐのＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＴ　　フラグメントを平滑末端化し、そ
してＴ４りが一ゼを用いて５ｔｕＩにより消化された！
ラスミドｐＬＷｌ中にその平滑末端化されたフラグメン
トを連結することによってｐＨＣＷ７０１を完結した。

制限処理分析によって容易に区別できる、挿入体の２つ
の可能な方向を得ることができる。ｐＩ（ＣＷ７０１と
名付けられた目的とするプラスミドは、ＩＬ−２遺伝子
の３′末端の近くに、再構成されたＢａｍＨＩ部位を有
する。このプラスミドは、シダ（スト条約下でＡＴＣＣ
に寄託され、そして寄託番号３９７５７号を得る。

ｐｓＹ０１０８９の完結化 ｐｓＹｃ１ｏ８９　’ｒ、完結化するたメニ、ｐＨＣＷ
７０１ｉＥａｏＲＩ　により消化し、　Ｋ１＠ｎｏＷ及
び４個のｄＮＴＰ　ｆｆｉ用いてフィルインし、次にＢ
ｉｍＨＩにより消化し、そして正のレトロレギュレータ
ーを含む４００　ｂｐのフラグメントを回収した。９８
Ｙ０１０７８＠ＡｖａＩにより消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及
び４個のｄＮＴＰによりフィルインし、そして次にＢａ
ｍＨＴにより消化した。その連結混合物を、Ｅ、コリＭ
Ｍ２９４　　中に形質転換し、そして目的とするプラス
ミドｐｓＹ０１０８９、すなわちＣｍ”を与える６、５
ｋｂのプラスミドを確認した。ｐｓＹ０１０８９は、ｐ
ｈｏＡプロモーターのための配列及びリーダー（Ｎａｒ
Ｉ部位を有する）配列並びにＢａｍＨＩ　部位のすぐ上
流に構造遺伝子、次にｃｒｙ遺伝子の正のレトロレギュ
レーター配列ヲ含む。

リシンＡ リシンＡのコード配列を、ｐＲＡ１２３から、より詳し
くは、ｐＲＡＴ　１の構成全通して、下記のｐＲＡ１２
３のＭ１３サブクローンから得た。ｐＲＡ１２３は１９
８４年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託番
号＠３９７９９号を得た。ｐＲＡ１２３　　か。

らのｐＲＡＴ　１の構成は、１９８４年９月２０日に出
願されたアメリカ特許第６５３，５１５号に広く記載さ
れ、そしてその開示を引用によりこの明細書に組み入れ
た。要約すれば、完全なりシンＡのコード配列（第４図
を参照のこと〕を含むｐＲＡ１２３に変性し、アミノ酸
２６５の後の正しい位置に終止コドン及び成熟配列のす
ぐ先の位置に開始コドン會有するＨｌ　ｎｄ　ＩＩＩ／
ＢａｍＨＩカセットとしてこの配列を提供する。ｐＲＡ
１２３’！ｒＢａｍＨＩにより消化し、およそ８９６　
ｂｐのＢａｍＨＩ　／　ＢａｍＨＩフラグメントを単離
し、モしてＭ１３ベクターにおけるＬｅａｆロモーター
に関してアンチ−センス方向においてＭ１３ｍｐ１８中
にサブクローンした。そのファージの単鎖ＤＮＡ　ｌ、
！ライマーとして１次の配列：５’　−ＣＡＣＡＧＴＴ
ＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＧＧ　−３’、（ここで
、リシンＡ鎖のＣ−末端のａｅｒ−ｇ７ｎ−ｐｈａ配列
の末端で正しく読み枠を合せてＴＡＡ終止コドンを配置
し）、次に、次の配列： ５シーＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴ
ＧＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣ−３１（ここで、リシン
ＡのＮ−末端の１ｔｅ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ｔｙｓ配列の
すぐ上流に目的とするＨｌ　ｎｄ　［１／ＡＴＧ開始コ
ドンの２回対称軸を配置している）を用いて２段階のブ
ライマー指図の突然変異誘発にゆだねた。プローブとし
て適切な上の！ライマーを用いておのおのの突然変異誘
発の後、変性されたファージを同定した。次に、目的と
する構成体を、Ｈ％ｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩにより二
重消化し、そして適切なリジンＡをコードするフラグメ
ントを単離し念。

）（１ｎｄＩ［１／ＢａｍＨＩにより消化されたｐＴＲ
Ｐ３と旧ｎｄＩ［［／Ｂａｍ１（Ｉフラグメントとの連
結によりｐｌ’ｔＡＴ　１　’ｉ完結し念。ｐＴＲＰ　
３は、下流のＨｌ　ｎｄ　Ｉ！１部位と共にｔｒｐプロ
モーターを含む、ｐＢＲ３２２基礎のベクターであり：
　ｐＴＲＰは１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託
され、そして寄託番号第３９９４６号を得た。

ｐＲＡＴ　１から完全に由来したコード配列を用いて、
ｐＲＡＰ２２９を構成した。それは、（１）順に、Ｂ、
スリンジエンシス−正のレトロレギュレーター配列、ク
ロラムフェニコール耐性ツーカー、適合可能なレプリコ
ン及びｐｈｏＡニア’ロモーター及びリーダー配列を提
供する、Ｎａｒｄ／ＢａｍＨＩレプリコン含有のｐＳＹ
Ｃ　１０８９　のフラグメン）：（２）　　適切に終結
され次ＩＪシンＡのＣ−末端部分をコードする５００ｂ
ｐフラグメントを提供する、Ｃ１ｈ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ
により消化されたｐＲＡＴｌ　：及び（３）　　ｐＲＡ
’ｒ　１からのおよそ３５０　ｂｐのＣｔａ　Ｉ／Ｃｔ
ａ　Ｉフラグメントによって提供されるよりなＮ−末端
配列の３通りの連結によって得られた。リシンＡ配列は
また、ｐＲＡＴ　１からのＣｔａＩ（一部）／ＢａｍＨ
Ｉにより切断されたフラグメントとして製造され得る（
そして好ましくは製造され得る）ことが明らかである。

その得られる融合体は、（１）イソロイシン残基金先行
するりシンＡ鎖の開始コドンを保持し；（２）７ｂｐづ
つ及び従って、リーダー配列に対する読み枠から分離さ
れ：（３）　　ｔ’リペゾチドのＩｔａ　−８ｏｒ−Ｌ
ａｕによってｐｈｏ　Ａリーダを延長し；そして（４）
　　リシンＡの開始コドンを有するフレームの外にある
が但し、すぐ近くのＴＧＡコドンでリーダー配列の終結
を可能にする。ｐＲＡＰ　２２９は１９８５年３月８日
にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託番号第５３４０８号
を得る。

Ｄ、７．　　　Ｅ、コリにおけるリシンＡの製造及びプ
ロセシング Ｅ、コリＭＭ２９４を、ｐＲＡＰ２２９のみにより形質
転換し、又は、ｐＲＡＰ　２２９及びｐ８Ｙｃ１１７４
　Ｋより同時形質転換した。その形質転換培養物を、Ｍ
ｌｃｈａｅｌｉｍ、など、Ｊ、Ｂａｅｔ、　（１９８３
）　１５４：３５６〜３６５に記載されている条件に類
似する条件下で増殖せしめた。外因性リン酸塩濃度金低
め、そしてその培養物を１６〜１７時間維持することに
よって、その細胞を誘発する。

その細胞を収穫し、そして界面活性剤の不在中で音波処
理によって調製された全細胞抽出物を、天然のりシンＡ
に対するウサイ抗血清を用いるウェスターン法を用いて
、発現について検定した。

Ｎ−末端のメチル化を査定するために、そのリシンＡ’
ｔ＝精製し、そして定量分析のためにエドマン分解にゆ
だねた。その細胞を、ｐＲＡＰ　２２９により形質転換
する場合、リシンＡの４０チがＮ−末端のメチオニンを
含んだ。同時形質転換された細胞は、メチル化された鎖
の９％のみを有するリシンＡを産生じた。

ング ｐＲＡＰ　２２９により形質転換された細胞溶解物から
の精製されたりシンＡ（６００μ、ｌｅ、０．２ｍＭの
塩化コバルト及び０．１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（
ＰＨ＝７．５　）　（０，３ｍｌの合計体積ｅ−［ｔル
）　中において、Ｅ、コＩＪｐＳＹＣ１１７４から精製
されたＭａｔ−アミノ（ゾチダーゼ２４μＩと共に混合
した。

その反応混合物を３０℃で１晩インキユベートし、そし
て熱湯槽中で加熱することによって停止した。

その反応混合物を脱塩化した後、Ｎ−末端配列をエドマ
ン分解によって決定し念。Ｎｅｔ−アミノ（ゾチダーゼ
を含まない対照混合物は、Ｎ−末端のメチオニンを有す
るリシンＡの４０１を示し、その同じ画分は、上に記載
されているように、細胞溶解物中に通常見出された。Ｎ
ｅｔ−アミノペプチダーゼ酵素を含む反応混合物は、タ
ンパク質の８係のみがＮ−末端のメチオニンを含んでモ
ふりシンＡを含み、そしてｐＲＡＰ　２２９／ｐｓＹｃ
　１１７４　Ｋより形質転換された細胞から得られる画
分と実質的に同じであった。

１９８５年８月２７日、Ｅ、コリ株ｐ８Ｙｃ１１７４を
、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するプダ（
スト条約及びそれに基づく規則（ゾ／−（′スト条約）
に基づいてＡｍｅｒｌｏａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅＣ＠Ｉｌｅｅｔｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ番号５３２４
１得た。

これは寄託の日から３０年間保証される。微生物はブダ
イスト条約の元で、そして適切なアメリカ特許の発行後
には無制限の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣ０
間の契約に基づいて、寄託された菌株はＡＴＣＣにより
入手可能圧されるであろう。

特許法に従うて、いずれかの政府の権威下で与えられた
権利に反してこの発明を実施する許諾であると解釈して
はならない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＮｅｔ−アミノペプチダーゼのタン
パク質から決定されたＮ−末端のアミノ酸　。 配列を示す。 第１図中の１〜４は次の意味を有する。 １：同量のＰＴＵ−Ｍ＠　ｔが、その製造における遊離
メチオニンのために、サイクル１に観察された。 ２：サイクル３６及び３７の生成物は、サンデル調製の
間、偶然に混合された。サイクル３８へのキャリーオー
バー（Ｃａｒｒｙｏｖｅｒ　）の定曖分析は、アミノ酸
の順序がＴｈｒ−８ｅｔよりかむしろＳｅｙ−Ｔｈｒで
あることを提案する。 ３：サイクル４３においては確認され得なかった。しか
しながら、　　ＰＴＭ−デヒドロアラニンの実質量が観
察された。この誘導体は、セリン及びシスティンの両者
から形成される。 ４：配列決定機（ｍ＠ｑｕ＠ｎｏｅｒ　）におけるフラ
クションコレクター問題を、誘導されるべき複数のサン
プルに引き起こした。 第２図は、第１図に例示されているＭｅｔ−アミノ（ブ
チダーゼをコーＦするｐｓＹｃ１１７４の１．２ｋｂ挿
人体を示す。 第３図は、本発明の酵累によりプロセシングされる前及
びプロセシングされ念後の精製された組換え体ＩＬ−２
のＳＤＳダルを示す。 第４図は、リシンＡについての遺伝子を示す。 手続補正書（オ弐） 昭和６１年１り月／乙日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２２０９８３号 ２、発明の名称 細菌性Ｎ−末端のメチオニンペプチダーゼ３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人 名称　シタス　コーボレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号６、
補正命令の日付 昭和６１年１１月２５日（ａ、 ６、補正の対象 （１）明細書の１図面の簡単な説明」の欄（２）図面 ７、補正の内容 （１）明細書第７１１１第１９行、「ＳＤＳゲルを示す
。」をｒＳＤＳゲルを示し、そしてこれは図面に代わる
写真である。Ｊと補正する。 （２）図面の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有するＭｅｔ−アミノペプチダ
   ーゼ。 ２、１〜２６４の番号をつけられた第２図のアミノ酸配
   列を有する特許請求の範囲第１項記載のＭｅｔ−アミノ
   ペプチダーゼ。 ３、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＭｅｔ−アミノペプチ
   ダーゼ。 ４、１〜２６４の番号をつけられた第２図のアミノ酸配
   列を有するＭｅｔ−アミノペプチダーゼと免疫反応性の
   抗体。 ５、特許請求の範囲第４項の抗体と免疫反応性であるＭ
   ｅｔ−アミノペプチダーゼ。 ６、Ｍｅｔ−ｙ−ｚ（ここでｙはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌ
   ｅ又はＧｌｙであり、そしてｚはアミノ酸残基である）
   からＮ−末端のＭｅｔ残基を加水分解する特許請求の範
   囲第５項記載のＭｅｔ−アミノペプチダーゼ。 ７、ジペプチドをまた加水分解しない特許請求の範囲第
   ５項記載のＭｅｔ−アミノペプチダーゼ。 ８、第２図において示されるような第２図のＤＮＡ（又
   はその補体）にハイブリッド形成するＤＮＡによりコー
   ドされる特許請求の範囲第１項記載のＭｅｔ−アミノペ
   プチダーゼ。 ９、前記ハイブリッド形成条件が、６×ＳＳＣ、０．０
   １ＭのＥＤＴＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ及び０．５％の
   ＳＤＳを含む緩衝液中において、６５℃で反応を完結す
   るのに十分な時間、ハイブリッド形成し、次に、６５℃
   で３×ＳＳＣによって洗浄することに相当する特許請求
   の範囲第８項記載のＭｅｔ−アミノペプチダーゼ。 １０、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−
   Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有する細菌性Ｍｅｔ−アミノ
   ペプチダーゼを得るための方法であって： 第１細菌株からプラスミドを担持する遺伝子ライブラリ
   ィを調製し； 前記遺伝子ライブラリィを、ペプチダーゼ活性を欠失す
   る第２細菌株中に形質転換し；そしてＭｅｔ−アミノペ
   プチダーゼ活性について形質転換細胞をスクリーニング
   することを含んで成る方法。 １１、前記第１細菌株がペプチダーゼ活性を欠失する特
   許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記第１細菌株及び第２細菌株が同じである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−
   Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有する細菌性Ｍｅｔ−アミノ
   ペプチダーゼを得るための方法であって： Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ活性について形質転換細胞
   をスクリーニングし、ここで該形質転換細胞が、 第１細菌株からプラスミドを担持する遺伝子ライブラリ
   ィを調製し；そして 前記遺伝子ライブラリィを、ペプチダーゼ活性を欠失す
   る第２細菌株中に形質転換することによって調製される
   ことを含んで成る方法。 １４、前記第１細菌株がペプチダーゼ活性を欠失する特
   許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記第１細菌株及び第２細菌株が同じである特許
   請求の範囲第１３項記載の方法。 １６、前記細菌株がＥ．コリＣＭ８９である特許請求の
   範囲第１５項記載の方法。 １７、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−
   Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有するＭｅｔ−アミノペプチ
   ダーゼをコードするＤＮＡを得るための方法であって： 第２図のＤＮＡ（又はその補体）を含有するラベルされ
   たＤＮＡを有する微生物性ゲノムライブラリィをスクリ
   ーニングすることを含んで成る方法。 １８、Ｎ−末端にメチオニンを含まないタンパク質を製
   造するための方法であって、有効量のＭｅｔ−アミノペ
   プチダーゼによりＭｅｔ先行のタンパク質を処理するこ
   とを含んで成る方法。 １９、前記ペプチダーゼを、Ｅ．コリに由来し、そして
   前記Ｍｅｔ先行のタンパク質がＩＬ−２又はリシンＡで
   ある特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、前記Ｅ．コリが菌株ｐＳＹＣ１１７４である特許
   請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードするプラス
   ミドＤＮＡ及び目的の組換え外来性タンパク質のための
   発現ベクターを含む組換え体細胞。 ２２、細菌宿主中でＮ−末端にＭｅｔをほとんど持たな
   い組換え体を製造するための方法であって：前記組換え
   体タンパク質をコードする遺伝子の発現のために適切な
   条件下で前記宿主を培養し；ここで前記宿主がＭｅｔ−
   アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を発現できるベ
   クターにより形質転換されていることを含んで成る方法
   。 ２３、前記組換え体タンパク質を、ＩＬ−２及びリシン
   Ａから選択する特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする単一の
   クローン化された組換え体細胞から製造された組換え体
   ＤＮＡ。 ２５、前記Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼをコードする部
   分をＥ．コリに由来する特許請求の範囲第２４項記載の
   ＤＮＡ。 ２６、プラスミド上に配列されている特許請求の範囲第
   ２５項記載のＤＮＡ。 ２７、前記プラスミドを、Ｅ．コリｐＳＹＣ１１７４に
   由来する特許請求の範囲第２６項記載のＤＮＡ。 ２８、ペプチダーゼを欠失する細菌（該細菌は、細菌性
   ゲノムに由来する、プラスミド担持の遺伝子ライブラリ
   ィにより形質転換され、そして前記形質転換の後、該細
   菌は、増強されたペプチターゼ活性を示す）に由来する
   プラスミドＤＮＡ。