JPS62102157A - 抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は抗体に関し、更に詳しくは、ヒトＢリンパ球
を抗体産生細胞へ分化させる因子であると）Ｂ細胞分化
因子（以下ＢＣＤＦと称する）に対する抗体に関する。

このような抗体は、人の免疫機能の診断薬として使用で
きる。

従来の技術 化体内でＢ＄Ｉ胞が抗体産生を行なうに到る経路におい
て、Ｔ細胞から産生される蛋白性の因子によりＢ細胞が
活性化される必要がある。これら因子の中でＢ細胞の増
殖は促進せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化のみを誘
導する゛因子はＢＣＤＦと名付けられている（Ｔ、　Ｋ
ＩＳＨＩＭＯＴＯら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ
↓、１１７〜１２０．１９８３）。

人間が免疫機能を維持するためには、Ｔ細胞が適正な刺
激を受けてはじめて正常な形のＢＣＤＦを産生ずること
やＢ細胞がＢＣＤＦに正常に反応して抗体産生細胞へ分
化することが必要である。

たとえば自己免疫疾患のモデルであるＭＲＬ／ＡＰｒマ
ウスでは、Ｔ細胞が自発的にＢＣＤＦを−産生し続ける
ために自己免疫疾患が生ずることが病因の１つとされて
いる（Ｇ、Ｊ、ＰＲＵＤＨＯＭＭＥらＪ、　Ｂｘｐ、　
Ｍｏｄ、　　１５７．　７３０〜７４２．１９８３）。

人間の自己免疫疾患でも同様の病因が想定されている（
鈴木登ら、医学のあゆみ、１２５，５４９〜５５５．１
９８３）。このようにＢＣＤＦは人間の生命維持に重要
な働きをしており、ＢＣＤＦの産生や分子形体の異常は
重篤な疾病を引きおこす。

このようなりＣＤＦに対する抗体は、従って、ヒトの免
疫不全の診断に使用できる。

発明が解決しようとする問題点 この発明の目的は従って、ヒ）ＢＣＤＦに対する抗体を
得ることにある。ＢＣＤＦに対する抗体はヒトの免疫不
全の診断薬として使用できる。

問題を解決するための手段 このような状況下において、本発明者らは、ＢＣＤＦの
アミノ酸配列（以下「抗原ペプチド」と記す）を抗原と
してＢＣＤＦに対する抗体を得ることに成功した。

抗原ペプチド Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ 抗原ペプチドを用いて抗血清を得るには、抗原ペプチド
と適当なキャリヤー蛋白と結合せしめた後、抗原として
用いる。

キャリヤー蛋白としては、キーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）、　　ウシ血清アルブミン。

卵白アルブミン（ＯＶ　Ａ）等従来知られているものの
いずれも使用できる。キャリヤー蛋白と抗原ペプチドと
を結合せしめる方法も、又、マレイミドを用いる方法（
Ｒ，ＪｕｌｉａｎらＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１３２．６８　（１９８３）］及びグルタルアルデヒド
を用いる方法（Ｇ、　Ｗａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　７７．　５１
９７　（１９８０）及び水溶性カルボジイミドを用いる
方法（Ｗ、　Ｇ：Ｂｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　８０゜２
８３４　（１９８３））　、サクシンイミドを用いる方
法（Ｔ、　Ｋｉｔａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　　７９゜２３３　（１９７６）”）等
通常の方法を用いても特に支障はない。

キャリヤー蛋白と抗原ペプチドとの結合物を用いて、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も通常の方法でよい。

得られた抗血清より本発明の抗体を得る方法も従来知ら
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば採血後、抗血清を作成する。抗ペプチド活性の測定は
酵素免疫測定法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）又はラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩ　Ａ）にて行なう。

抗血清゛の抗ヒ１−ＢＣＤＦ活性があるか否か判定する
には下記の方法を用いる。

まず抗原ペプチドを結合したカラムを用いて、抗ペプチ
ド抗体を特異的に吸着させて、精製抗ペプチド抗体を得
る。

さらに精製抗ペプチド抗体を結合したカラムに対するヒ
トＢＣＤＦの吸着を検出することにより抗ペプチド抗体
が抗ヒ１−ＢＣＤＦ活性を持つことを判定できる。（実
施例参照） あるいは上記のように免疫した動物のリンパ球とミエロ
ーマとを融合させ、本発明の抗体を特異的に産生ずるハ
イブリドーマを得、これによってモノクローナル抗体と
して、本発明の抗体を得ることもできる。

このようにして得られた免疫グロブリンは、以下のよう
な性質を有するものである。

１）免疫グロブリンの種類：１ｇＧ ２）分子量　　　　＝１５０×１０３ダルトン３）分子
吸光係数　：　Ｅｊ２．　２８０ｎｍ＝　１４．０４）
得られた抗体はヒ１−ＢＣＤＦ蛋白と結合する。

作用 本発明の抗体は免疫不全症の診断薬として使用できるほ
か、免疫不全症の治療薬として使用できる可能性がある
。

実施例 実施例１ （１）　　Ｖ　Ｔ　−１１，、：よるＢＣＤＦの製造２
１容プラスチツクローラ培養器（ファルコン＃３０２７
）（以下ローラーと称する）中の１１の２０％ＦＣ３含
有ＲＰＭ１１６４０培地（，２ｍＭグルタミン、５ｘｌ
Ｏ−’、Ｍ　　２ＭＢ、１００単位／ｍｌペニシリン、
１００μｇ／ｍβ　ストレプトマイシン、２０μｇ　／
　ｍ　ｌ　　ゲンタマイシン、１６　ｍＭ　　Ｎ　ａ　
ＨＣＯｔを含有）に２Ｘ１０’／ｍｊ！細胞数にＶＴ−
１を接種し、８　ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃
で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集め
ＲＰＭ１１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２
ｊ２容ローラー中１１のＲＰＭ１１６４０培地にＩＸ１
’Ｏ’／ｍｊ！細胞濃度に懸濁した。ローラーを８　ｒ
ｐｍで回転させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後
培養物を遠心分離して、培養上清を得た。

上述のように、ＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞
上清Ｉｏｎを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃｄの圧力
をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１　００ｍｌの濃
縮液をさらに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着
した限外濾過装置（アミコン、スタンダードセル５２型
）を用い窒素ガスにより４　ｋｇ　／　ａＪの圧力をか
けて濾過した。濾過膜上部に残った５ｍｌの濃縮液を採
取した。

上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、Ｓｗｅｄｅｎ、、　２．６　
Ｘ　９０　ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムを
あらかじめＰＢＳ　（ホスフェート・バッファーセイラ
イン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェート・
パンファー、ｐ　Ｈ７，０）で平衡化した。濃縮上清を
ＰＢＳで溶出し、溶出液を５　ｍ　ｌずつ分取し、分取
液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する分
画は分子量（３，５±０．５Ｘ１０’ダルトンに相当す
るフラクションにＢＣＤＦが含まれていることがわかっ
た。ゲル濾過カラムは次の分子量マーカーで検定した。

ブルーデキストラン２０００　　（ファルマシア・ファ
インケミカルス、スウェーデン）２Ｘ１０ｂ％フェリチ
ン４．５×１０’、　フルＶラ−Ｍ１．５８　Ｘ　１０
’、オブ７）Ｌｉブミン４．５ｘｌＯ’、キモトリプシ
ノーゲン２．５×１０４、チトクロームＣ１，１７ｘｌ
Ｏ’また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾
過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置を
用いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）
に置換した。

クロマトフオーカシング ＡＣＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎ。

Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩衝液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４
　０　ｍ　ｉｔの１／１０希釈ポリバツフアー７４　（
ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）で
溶出した。カラム操作はファースト・プロティン・リキ
ッド・クロマトグラフィ＋、ＦＰＬＣ（ファルマシア・
ファインケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎
分０．５　ｍ　ｌで行なった。溶出液を１ｍｌずつ分取
し、ＢＣＤＦ活性とｐ　Ｈを測定した。ＢＣＤＦ活性は
ｐ　Ｈ４，９〜５．１の位置に溶出された。

Ｍｏｎｏ　Ｐカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１
％　ＴＦＡ　（１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラムＰｒ。

ＲＰＣＨＲ５／１０　　（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ）にかけ、溶出液、００１％　ＴＦＡ中のアセ
トニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢ
ＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出
される。Ｏ，Ｄ、　２１１０のピークは他のＯ，Ｄ、、
、。のピークとは完全に分離しており、このピークに対
応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾
燥して精製ＢＣＤＦを得た。

ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために６μｇの
精製ＢＣＤＦをプロティン・セクエンサ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏ、、　Ｃａ１ｆ、　Ｍ
ｏｄｅｌ　４７０Ａ）に導入した。アミノ酸配列の決定
方法はＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、１９３．２６５〜２７５　（１９５１）に
記載されている方法により行なった。

Ｎ−末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。

Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｌａ　Ａｌａ
　　・・ （２）　　抗原蛋白の調製 ＢＣＤＦの部分構造決定より得たアミノ酸配列に従って
、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾
１ａなる抗原ペプチドを合成した。

本ペプチドの合成はベックマン社９９０Ｂ自動ペプチド
合成装置を用い固相法で行なった。

合成されたペプチドを、７５％フン化水素／２５％アニ
ソール中で３０分間Ｏ℃で加温することにより樹脂から
脱離した。合成されたペプチドは、ｓｐ−セファデック
スカラム（２，５ｃｏ＋Ｘ５０ｃｍ）　　（０，０５Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐ　Ｈ７，０及び１ｍＭジチオスラ
イトールと平衡化）に吸着させた。５００ｍｌ！の同緩
衝液と、０，５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ｍＭジチオス
ライドールｐＨ７，０，５００ｍｇのグラジェントで目
的のペプチドを分画精製した。各両分をフルオロレスカ
ミンでペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃
縮した。３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１
０カラム（Ｉ　ＱｃｍＸ　５０ｃｍ）に上記濃縮液を加
え蛋白画分を集めた。得られたペプチド画分を濃縮乾固
した。ペプチドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ
塩酸で１２０℃１晩の加水分解により調べた。加水分解
物はアミノ酸アナライザーを用いて測定した。

ペプチドのアミノ酸組成は以下の通りであった。

Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　
Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａこのペプチドにキャリヤー
蛋白を以下のように付加させた。

１）ＳＨ基導入ペプチドの作製ＣＲ，ＪｕｌｉａｎらＡ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１３２．　６８　（１
９８３）　）ペプチド２■を０．５　ｍ　ｌの１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４−ＮａｚＨＰＯ４
バッファーｐ　Ｈ７，５に溶解し、ＬＯｔｔｌのｄｉｍ
ｅｔｙｌ　ｆｏｒｍａｍｉｄｅに溶解した１、２■のＳ
　Ａ　Ｔ　Ａ　（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｄｙｌＳ−ａｃｅ
ｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａＬｅ）を混合し、室温で１０
分攪拌した。１００．ｃｉ！の３６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１ｐＨ７，８を加えて反応を停止した。反応液を
０．１％　Ｔ　Ｆ　Ａ　（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ）水溶液で緩衝化したＣ１逆層カラーム
（バイオラド）に注入し、０．１％ＴＦＡアセトニトリ
ルの０〜１５％の直線的濃度自記により溶出した。流速
は１．５ｍｆｆ／分とした。ペプチド−３ＡＴＡ結合画
分を集め減圧乾固した。これをＱ、５ｍ４の０．０５　
ＭＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ。

Ｎ　ａ　ｚ　ＨＰ　Ｏ４バッファーｐＨ７，５に溶解し
、５０ｍ１のｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ溶液（５００ｍ
Ｍｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ、　　２５　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　ＡをＮ　ａ　
ｚ　ＨＰ　Ｏａでｐ　Ｈ７，５に調整した）を加えて、
室温で１時間攪拌した。

ｉｉ）マレイミド基導入オブアルプミンの作製（Ｓ、　
Ｈａｓ’ｈｉｄａら、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ　　６．　５６３．４ｍｇのＯＶＡを含む３００μｌ
の０．１　Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，０と
０．８７ｍｇのＣＭ　Ｂ　Ｓ　（Ｎ　−Ｔ　−Ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）
を含む３０μｌのＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）を
混合し、３０℃で３０分攪拌した。反応液を０．１Ｍ　
リン酸ナトリウムバッファーｐＨ６，０で緩衝化したＰ
Ｄ−１０カラムでゲル濾過しマレイミド基導入オブアル
ブミン分画を得た。

ｉｉｉ　）マレイミド−ＯＶＡ分画（約１ｍｊりとＳＨ
−ペプチド溶液（５５０μＩりを０．１　Ｍリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ６，８）中にて反応（４℃。

２０時間）後、反応液をセファデックスＧ−２５を用い
てカラムクロマトグラフィーを行って、ＯＶＡと抗原ペ
プチドとの結合物を得た。

（３）　　抗体の調製 得られたキャリアーとペプチド結合物７００μｇをフロ
イントの完全アジュバントと共にウサギの指軍部に注射
した。以後７日間隔で３回キャリアー・ペプチド結合物
７００μｇをフロイントの不完全アジュバントと共にウ
サギの背皮下に免疫した。

最終免疫の後１０日ロー採血し血清を得た。血清を遠心
（１００００Ｘｇ、５分）した上清に飽和硫安溶液（ｐ
Ｈ７，４）を加えて５０％飽和とした。

−晩水冷下で攪拌した後、ＩＱＯＯＯＸｇにて５分間遠
心し、沈澱物を得た。沈澱物を蒸留水に溶かし、２００
倍量の０．１５ＭＮａＣ１に対し、３６時間透析した。

得られた抗血清’１ｍ１ｌを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２＞で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワット
マンＤＥ３２）カラム（１ｃｍ　Ｘ　ｌ　５　ｃｌＢ）
に添加した。免疫グロブリンＩｇＧ画分は素通りして溶
出されるので、この両分を回収した。’１ｍｌの抗血清
から２４■のＩｇＧが得られた。集めたＩｇＧを０．１
　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に透析した。

次にキャリヤー蛋白に用いたＯＶＡに対する抗体を除去
するため、キャリヤー蛋白−結合セファロース４Ｂカラ
ムを用いてキャリヤー蛋白抗体を結合させた。すなわち
、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア製
１７−０４３１−０１）０．５ｇを０．１　Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，０）５ｍｊ！に投入し、ただちに、０ＶＡ
２５■を加え、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セフ１０−ス４Ｂを
Ｑ、５ａａＸ２０ｃｍＯカラムにつめ、このカラムにＩ
ｇＧ画分画分２壱ｌせた。洗浄用緩衝液（０，１５ＭＮ
ａＣ１１０，０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０
）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をすべて集めた
。

得られたＩｇＧはさらにペプチドを結合させたアフィー
ゲル力ラム（バイオラド）で精製した。このペプチド結
合アフィーゲルカラム（０，５ｃｍｘ２０ｃｍ）に上記
で得られたＩ’ｇＧ画分をのせ、洗浄用緩衝液（０，１
５ＭＮａ（１！１０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ８，０）で十分洗浄し、３Ｍでカラムに吸着した抗ペ
プチド抗体を溶出させた。

集めた溶出液を０．１５ＭＮａＣ／に対して透析し、限
外濾過で濃縮した。このようにして１０■の精製抗体を
得た。

（４）抗ＢＣＤＦ抗体の性質 （４）　−１ＩｇＧであることの証明 精製した抗ＢＣＤＦ抗体がＩｇＧクラスであることは、
抗体のクラス別に作成された抗１ｇ抗体で免疫沈降する
かどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩｇＧ抗体（
カンベル社製ｍ０２１２−０１２４）、抗つサギＩｇＭ
抗体（カッペル社製Ｎａ０２１２−０２１０）、抗ウサ
ギＩ　ｇＡ＋　Ｉ　ｇＭ十ｌ−ｇＧ抗体（カッペル社製
１１ｈ０２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。方
法はオフタロニー法を用いた。すなわち、１％の寒天中
にあけた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、まわ
りの穴には抗体に対して１／２０量から２倍づつ希釈し
た精製抗ペプチド抗体を入れる。０℃で１晩放置後形成
された沈降線を観察した所、精製抗ペプチド抗体は抗ゲ
サギＩｇＧ抗体及び抗ウサギＩ　ｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ
抗体とのみ沈降したことがらＩｇＧであると確認できた
。

←ツー２　分子量 精製した抗ペプチド抗体の分子量はセファデックスＧ−
１００を用いるゲル濾過法により求めた。

すなわち０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化させ
たセファデックスＧ−１″００（１ｃｍＸ１００ｃ＋＋
＋）カラムに１ｍｇの精製抗ペプチド体をのせ、同緩衝
液で展開した。２８０　ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検出
し、分子量測定スタンダード（バイオランド社製Ｎａ１
５１−１９０１．チログロブリン分子量６７００００．
　　γ−グロブリン１５８０００゜卵白アルブミン４４
０００．　　ミオグロビン１７０００、　ビタミンＢ−
１２１３５０）の溶出パターンと比較した所分子１１５
００００の所に抗ペプチド抗体が溶出した。

（４１−３分子吸光係数 １■の精製抗ペプチド抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）１ｍｌに溶解し、２８０　ｎｍの吸光度を測
定した所、１．４０を示したので、本蛋白の分子吸光係
数Ｅ１λ＝１４．０である。

Ｔ４１−４　　抗体の免疫特異性 ｉ）精製抗ペプチド抗体を０．１　Ｍ炭酸バッファー　
（ｐＨ９，０）ｐＨ８，３，０，５Ｍ食塩を含む）中で
ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマシ
ア）に結合（２■抗体／ｍｌ（セファ０−ス・ゲル）さ
せた。抗ペプチド抗体結合セファロースをカラム（０，
５ｃｓａｘ２０ｃｍ）につめ、０．１Ｍリン酸バッファ
ーｐ　Ｈ７，４で洗浄後、同バッファーに溶解した４０
００単位のＢＣＤＦをカラムに添加した。カラム通過分
画（非結合分画）を回収した。次にカラムを０．１　Ｍ
リン酸バッファーｐＨ７，４で洗浄後、３Ｍ　　ＫＳＣ
Ｎで結合蛋白を溶出した。溶出液をＰＢＳ　（ホスフェ
ートバッファーセイライン）に透析し溶出分画とした。

非結合分画と溶出分画のＢＣＤＦ活性を測定した。表１
に示す通り、抗ペプチドカラムより６２７単位（１６％
）のＢＣＤＦ活性が回収されたが、対照として用いた抗
ＯＶＡカラム（抗ＯＶＡ抗体を抗ペプチド抗体と同様に
セファロースに結合させたもの）よりは１０単位（０，
３％）のＢＣＤＦ活性しか回収されなかった。この結果
は明らかに、抗ペプチド抗体がＢＣＤＦと結合している
を示すものである。

表　　１ ｉｉ）精製ＢＣＤＦをペルオキシダーゼ法にて１１２５
を標識した。抗ペプチド抗体結合セファロースＣＬ−４
Ｂ４０（１１！　（抗ペプチド抗体４ｎｍｏｌ相当）と
Ｉ”’−ＢＣＤＦ４００ｕｌ（１２ｐｍｏｌ）を０．１
　Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，４中４℃、１晩反応さ
せた後、セファロースゲルを０．　Ｉ　Ｍリン酸バッフ
ァー、ｐＨ７，４で洗浄し、さらに５ＤＳ−ＰＡＧＥサ
ンプルバッフｙ−（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５％２−
メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ。

０．０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ６，８）　　１
００μ！で溶出した。溶出液を２メルカプトエタノール
存在下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

泳動したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ
ィーを行ない、分子１２０．０００の位置に単一の放射
活性バンドを認めた。対照実験として、抗ＯＶＡ抗体結
合セファロースを用いて同様の操作を行なうと分子量２
０．０００の位置に放射活性のバンドを認めなかった。

ＢＣＤＦの分子量は２０．０００であるから、上述の結
果は明らかにＢＣＤＦが抗ペプチド抗体と結合したこと
を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記のペプチドを抗原として得られる抗体 Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
   ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌ
   ａ