JPS6150925A - 抗原または抗体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗体または抗原を結合しり膏体を用いたアフィ
ニティークロマト法による抗原、抗体の精製方法に関す
るものであり、特にインターフェロンの精製に適した方
法に関するものである。

〔従来の技術〕

細胞がウィルス等の刺激によってつくり出すインターフ
ェロンは、抗ウィルス作用、抗ｔｉｅ作用など多面的は
生物活性をもち、Ｂ型肝炎、岬 ヘル≠ス、インフルエンザ等のウィルス性疾患治療薬ま
たは予防薬として、さらに脳腫瘍、骨肉腫、白血病その
他の抗ガン剤としても期待されている。

インターフェロンにはα、βおよびγと三種類知られて
おり、たとえば、ヒトインターフェロンαはヒト白血球
細胞によって産生されるインターフェロンに代表され、
ヒトインターフェロンβはヒト２倍体線維芽細胞によっ
て産生されるインターフェロン（ヒトフィブロプラスト
インターフェロン）に代表される。

またヒトインターフェロンγはＴリンペ球細胞によって
産生されるインターフェロンである。

これらインターフェロンの精製には多（アフィニティー
クロスト法が用いられているが、なかでも抗体を結合さ
せた不溶性担体（以下、抗体結合担体と略す）を用いる
抗体クロマト法はその特異性、有用性の点で特にすぐれ
た操作法である。

ところがインターフェロンは一般的な蛋白質に比べ疎水
性が高く、抗体カラムクロマト操作の際、疎水結合によ
るカラム中の抗体あるいは不溶性担体等との相互作用で
非特異的な吸着を起こしやすく、通常の抗体カラムクロ
マト操作が困難な場合が多い。

また近年、遺伝子組換え技術の発達により、インターフ
ェロン遺伝子を大腸菌、酵母などの微生物あるいは哺乳
動物細胞に導入し、天然インターフェロンとは異なる産
生法による遺伝子組換え型インターフェロンの産生が可
能となったが、このインターフェロンはｖｊ鎖の欠除な
どにより天然型インターフェロンに比べ疎水性がより高
いと考えられる。

従って、抗体カラム操作の上ではより顕著に非特異的吸
着が起こりやすいと言える。

このように、疎水性の高い蛋白質を抗体結合担体を用い
て精製するには、その溶出法を十分考慮しなければなら
ず、少なくとも疎水結合による相互作用を減少させるこ
とにより回収率は高められる。

抗体結合担体によるインターフェロン精製法で有効な溶
出法として知られている方法にＯｋａｍｕｒａらによる
酢酸溶出剤（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ旦、　３８３０
１９８０））　、およびＮｏｖｉｃｋ　　らによるクエ
ン酸緩衝液の溶出剤（Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６９
．９０５（１９８３）　）等の酸性溶出剤による方法が
知られている。

しかし、いずれも高収率でしかも安定なインターフェロ
ンが得られるとは限らず、効率の良い精製方法とは言え
ない。

この他抗体結合担体を用いたアフィニティークロマｊ・
法によるインターフェロン精製の実施例には単純な酸性
緩衝液だけでは高収率が得られず、高濃度の塩化ナトリ
ウム（Ｍａｅｙｅｒ　ＧｕｉｇＡ、−ト ａ＃、ｄ　Ｎａｔｕｒｅ　２７Ｌ　６２２（１９７８）
）、エチレングリコールよグリセリンのような多価アル
コール（Ｓｅｃｌｅｅｒ　ａｎｄ　Ｂｕｒｋｅ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２８５．４４６（１９８０）、　Ｙｏｎｅｈ
ａｒａ　　ｅＬ　　ａｌ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ會ｍ
、２５６．　３７７０（１９８１））　　、あるいはポ
リオキシエチレンパラオクチルフェニルエーテル（トリ
トンＸ−１００）のような非イオン性界面活性剤（Ｓｔ
ａｅｈｅｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈ針
、」剋、　９７５０（１９８１））の添加が試みられて
いるが、これらの回収剤はいずれもインターフェロンを
不安定にするため好ましくない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、高純度でかつ安定性の高い抗原、抗体
（特にインターフェロン）を高収率で得ることにある。

抗体または抗原を結合させた不溶性担体に接触させ、該
抗原または抗体を吸着させた後、イオン強度０．０５以
下、ｐＨ１，５〜３．０の酸を用いて該抗原または抗体
を回収することを特徴とする抗原または抗体の精製方法
を提供するものである。

以下、本発明方法を抗原としてインターフェロンを使用
した実施態様を中心に説明するが、本発明はこれに限定
されるものではない。

インターフェロンの精製方法の具体的な繰作は次の様に
行う。

即ち、粗インターフェロン溶液を抗インターフェロン結
合担体と接触させ、該インターフェロンを吸着させた後
、未吸着の蛋白質を十分に洗浄除去する。

その後、イオン強度０．０５以下、ｐｔｌ　１．５〜３
．０の酸性溶液を通液し、該インターフェロンを溶ン夜
として回収する。

本発明方法に適用される粗インターフェロン溶液として
は、酸性条件下でもその抗ウィルス活性を失わず安定な
構造を保つことからインターフェロンα及びβ含有溶液
が好ましい。

たとえば、ヒトインターフェロンβの場合にＣなどで誘
発処理した後、培養液中に産生せられるヒトインターフ
ェロンβ含有溶液をいう。

また本発明方法に適用されるヒトインターフェロンとし
ては、上記のヒト線維芽Ｘ■胞等を培養し、誘発処理後
産生ぜられた天然型ヒトインターフェロンの他に、ヒト
インターフェロンの遺伝子を組込んだ大腸菌、酵母等゛
の微生物の他、哺乳動物細胞などを含め遺伝子組換え可
能な細胞によって産生せられる遺伝子組換え型ヒトイン
ターフェロンも含まれる。

本発明方法に用いられる抗インターフェロン抗体は、イ
ンターフェロンを結合し得る抗体であれば特に限定はな
いが、細胞融合技術によるマウスモノクロナール抗体が
代表されるモノクロナール抗体、あるいは常法により動
物に免疫して得られる抗体などが精製効率の点から好ま
しくない。

また抗インターフェロン抗体結合担体とは、抗インター
フェロン抗体をセルロース、アガロース、架橋デキスト
ラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスなど不溶性担
体に結合させたもので、この結合は抗体であるポリペプ
チド中の７ミノ基あるいはカルボキシル基と担体に扉入
された活性化置換基との反応によるものである。

担体の主な置換基には、シアン化ブロム活性基（たとえ
ば“ＣＮＢγ活性化セファロース４Ｂ”；ファルマシア
）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（たとえ
ば、“活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ”；ファルマシア
社、“アフィゲルｌＯ”；バイオランド社）、ヒドラジ
ド誘導体（ヒドラジドポリアクリルアガロ−五；マイル
ス社）、オキシラン基（″オイパーギフトＣ′；ローム
・ファーマ社）、アンヒドリド基（“オイパーギットＡ
”；ローム・ファーマ社）などがあげられる。

不溶性担体への抗体結合量は通常１ｍｇゲルあたり０．
１〜１０ｍｇとする。

抗体結合担体と粗インターフェロン溶液との接触には、
バッチ法とカラム法とがあり、どちらも存効である。

抗体結合担体と接触させるインターフェロン溶液は通常
ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９の範囲をもつこと
が必要であり、また不溶物が存在する場合には、前もっ
て遠心分離または濾過等の手段によって不溶物を除去し
ておくことかすすめられる。またこの接触にはインター
フェロンの抗体結合担体への吸着が実質的に完了するま
で行うことが好ましい。

カラム法の場合、単位体積あたりの流速（Ｓ／Ｖ）０．
５〜５５．ｐ”−、、好ましくは１〜２な−・での通液
が望ましく、またバッチ法の場合、１〜１００時間の接
触が行われる。

接触終了後、抗体結合担体を１モル塩化ナトリウム及び
３０％以下のエチレングリコールを含むリン酸緩衝液さ
らには酢酸緩衝液等で洗浄することによりインターフェ
ロン以外の夾雑物の大部分を除去することができる。

この抗体結合担体に吸着したインターフェロンを回収す
るには、イオン強度０．０５以下、好ましくは０．０２
以下でかつｐＨが１．５〜３．０、好ましくは２．０〜
２．５の酸含有溶液が回収剤として用いられる。

本発明の酸は、上記範囲を満足する酸であれば１種でも
２種以上の混合でも特に限定されないが、たとえば塩酸
、硫酸、ギ酸、クエン酸な具体的には例えば、０．０１
規定の塩酸はイオン強度０．０１、ａｌ１２である。

回収剤の量は特に限定されるものではないが、実質、的
に吸着しているインターフェロンを回収するのに必要な
量が用いられる。

回収率は、たとえば０．０１規定の塩酸で常に９０％以
上と高い値が得られる。

なお、本発明はインターフェロンにかぎらず、疎水性の
強い抗原への応用も可能である。

たとえば、アポ−Ａ−ＩＳＡ−１１、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−
Ｉｔ、Ｃ−■等の血漿リボ蛋白質の構成蛋白質、今喧？
Ｉアルブミン用井ヰ序などが挙げられる。

この他、本発明での低イオン強度による中回収剤を用い
、目的抗原の精製とは逆に各種特異抗体も精製すること
ができる。

この場合には精製すべき抗体に対応する抗原を不溶性担
体に結合′させた抗原結合担体を作製し、精製すべき抗
体を含む溶液と接触させ、抗収剤で目的の特異抗体を回
収し精製する。

この時、回収された梱肯呵九体溶液に濃い中性緩衝液を
添加することにより、安定な中性溶液状態に飢とができ
る。

これらはいずれも回収剤の緩衝作用が弱いことにより目
的物を安定なｐＨにただちに移すことができるわけであ
る。

（発明の効果〕 本発明の抗体結合担体を用いたインターフェロン精製法
は高牧率及び高精製度が得られるのはもとより、次の点
ですぐれている。それは１）回収されたインターフェロ
ンの安定性、２）回収溶液の溶媒、ｐＨ変更のしやすさ
３）また揮発性溶媒（ＨＣＮ、ギ酸）であれば、回収物
質の各種分析操作も筒車である。

さらに詳しく説明すれば、現在まで知られている回収剤
に比べ、本発明での回収剤ではインターフェロンの安定
性がはるかに良い。

たとえば、０．０１規定塩酸では冷蔵庫中（４〜８℃）
、１ケ月間保存でも、まったくインターフェロンの失活
はみられない。

また、本発明の回収剤で回収したインターフェロン溶液
は低イオン強度で、しかも緩衝作用が弱いため、適当な
物質の添加により希望の溶液組成に変えることができる
。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

合させ、抗体結合担体をつくる。

この担体Ｑ、２ｍｌを用い、４Ｘ１０’単位の大腸菌産
生遺伝子＆ｌＩ＃Ａえ型ヒトインターフェロンβを含む
溶液をパンチ式に接触させ、ｖＩＬ着させる。

所定の洗浄液で洗浄した後、吸着したインターフェロン
βを数種の回収剤にバッチ式で接触させ、回収率、精製
倍率を比較した。

結果を表１に示す。

表１ 実施例２ 抗体カラムからの回収インターフェロンの溶液安定ｗｈ
施例１と同様の抗体結合担体のカラムに２　ｍ　Ｉｌゲ
ルを充填し、これに大腸菌産生遺伝子組換え型インター
フェロンβ（比活性３Ｘ１０　’　ｊｉ′Ｌ位／ｍｇ）
を接触、吸着させる。

所定の洗浄液で十分洗浄した後１０ｍＭ塩酸（ｐ　Ｈ２
，２、イオン強度０．０１）により抗体カラムよりイン
ターフェロンβを？容出させた。

回収率９２％、精製倍率５０倍、比活性１．５×１０１
単位／ｍｇあった。

この回収インターフェロンβを３７℃でｌＯ日間保温し
、インターフェロン力価の経日変化を追った。

結果を表２に示す。

表２ 実施例３ 抗ヒトインターフェロンβマウスモノクロナール抗体を
不溶性担体（アフィゲル１０）にゲルｌ　ｍ　ｌあたり
約７ｍｇ結合させ、抗体結合担体をつくり、このｔ旦体
１リットルをカラムにつめる。

このカラムに１．７５Ｘ１０”単位の大腸菌産生遺伝子
組換え型ヒトインターフェロンβを含む溶液（ｐＨ７，
４）を通液し、完全に吸着させる。

所定の洗浄液で洗浄した後、０．Ｏ１規定塩酸（ｐＨ２
，２、イオン強度０．０１）でカラム中の担体に吸着し
たインターフェロンβを溶出させると、１．７０ｘｌＱ
ｌｌ＋単位のインターフェロンβが回収され、収率９７
％、精製倍率約６倍、比活性８Ｘ１０’単位／Ｉ１ｇで
あった。

このように大型カラムでのインターフェロン精製も可能
である。

実施例４ 実施例３と同様の抗体結合担体２ｍ１ｌをカラムに充填
し、これに２．２　ＸＩＯ’ＩＯ’チャイニーズハムス
ター培養細胞産生遺伝子組換え型インターフェロン−β
（比活性６．Ｉ　ＸＩＯ’単位／単位／ｍ液を通液し、
カラム中の抗体と接触させ、吸着させる。

所定の洗浄液で十分洗浄した後、ｏ、ｏｉｓモル塩酸（
ｐＨ２，０、イオン強度０．０１５）を通液し、抗体？
、３ｒ。

×１０７単位／Ｂで精製倍率は許剰吟倍であった。

実施例５ 実施例３と同様の抗体結合担体１０ｍＪをカラムに充填
し、これにヒト線維芽細胞産生天然型インターフェロン
−β（比活性２．５　ＸＩＯ’単位／単位／ｍ液を低い
流速で通液し、吸着させる。

所定の洗浄液で十分洗浄した後、０．０１モル塩酸（ｐ
Ｈ２，２、イオン強度０．０１）によりインターフェロ
ン−βをカラムから溶出させると、回収率９０％、比活
性ｌＸｌ０”単位／ｍｇで精製倍率は４００倍であった
。

実施例６ インターフェロン結合担体カラムによる抗インターフェ
ロン抗体の精製。

精製された遺伝子組換え型ヒトインターフェロンβを不
溶性担体（アフィゲル１０）にゲル１ｍＪあたり２．４
ｍｇ結合させ、インターフェロン結合担体をつくる。

このｔ■体Ｉ　Ｑｍｊ！をカラムにつめ、抗ヒトインタ
ーフェロンβ抗ウサギ血清より流安分画により集めたイ
ムノグロブリンフラクションを通液する。

カラムを所定の洗浄液で洗浄した後、１５ｍＭ塩Ｆｊｌ
　（ｐＨ１２，ｏ　、イオン強度０．０１５）で抗イン
ターフ二ロンβ特異抗体を溶出させると、９６％の抗体
中和能が回収され、精製度は５００倍以上であった。

実施例７ 抗大腸菌蛋白質抗体の精製。

ン 大腸菌菌体をマントニーゴーリン法で破砕し、遠心によ
り不溶性成分を除いた後、ポリエチレンイミンにより除
核酸を行う。

この後、７０％飽和流安により可溶性蛋白成分を濃縮し
、目的の可溶性大腸菌蛋白質を得る。

この大腸菌蛋白質を不溶性担体（アフィゲル１０）にゲ
ル１ｍｌあたりｔ、ｉｍｇ結合させ、大腸菌蛋白結合担
体をつくる。

この担体Ｉ　Ｑｍｌをカラムにつめ、抗大腸菌蛋白抗ウ
サギ血清より流安分画により集めたイムノグロブリンフ
ラクション（ＰＢＳ溶解液）を通液する。　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１その後カ
ラムをＰＢＳで十分洗浄した後、１５１塩酸（ｐＨ２，
０、イオン強度０．０１５）で抗大腸蘭蛋白特異抗体を
溶出させると、はじめにカラムにかけた抗体中和価の約
８０％が回収され、精製度は約１０倍と算出され、一般
的にいわれているイムノグロブリンフラクション中に存
在する特異抗体含量にほぼ等しい、Ｆ 【 ミ 特許出願人　　東し株式会社　　　　　　　　　　　。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原または抗体を含む溶液を、それに対する抗体
   または抗原を結合させた不溶性担体に接触させ、該抗原
   または抗体を吸着させた後、イオン強度０．０５以下、
   ｐＨ１．５〜３．０の酸を用いて該抗原または抗体を回
   収することを特徴とする抗原または抗体の精製方法。