JPS61502795A

JPS61502795A - 酵母クロ−ニング　ビ−クル

Info

Publication number: JPS61502795A
Application number: JP50313085A
Authority: JP
Inventors: レモント，ジエフリー・エフ; ベツク，アントン・ケイ; シル，グレゴリー・ピー; バーンステイン，エドワード・ジー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-07-09
Filing date: 1985-07-09
Publication date: 1986-12-04
Also published as: WO1986000638A1; EP0189463A4; DK103786D0; EP0189463A1; DK103786A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔背景技術〕本発明はタンノぞり實の生産のだめのクローニングビークルに関する。（本明細書で使用される術語“タンパク質“は不確かな大きさのＲプチドも包含する。）酵母のごとき真核細胞を特定のタンパク質のだめの配列をコードシている遺伝子または相補ＤＮＡ（ＣＤＮＡ）の発現のだめの宿主として使用する事に対する興味が増大している。典型的には、真核細胞から分泌されるタンパク質は、前駆体タン・ミク簀の合成（アミノ末端゛シグナル“ペゾチド領域を含む）、特異的シグナルペプチド切断に続く、小胞体膜を通っての移動、炭化水素付加を含む更なるプロセッシング（グリコジル化）および最終的な細胞外への成熟生成物の分泌を伴う分泌間）ｌ！！！経路においてプロセッシングされる。酵母、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃθｓｃｅｒｅｖｉｇｉａθ）はそのような分泌経路を持っている事が知うれている〔シェフマンおよびノウ゛インクによる１分泌過程−パーラボラトリー、ｌ９８２を参照されたい〕。さらに一部の原核生物種に存在する類似の分泌経路と異り、酵母分泌機構はタンパク質をグリコジル化できる組成物を提供する。ヒンツエマンらはサイエンス２１９：６２０−６２５（１９８５）において、インターフェロンシグナル情報を含んだコード領域に基づいて、酵母におけるヒトインターフェロンの発現および分泌について報告している。ヒラチェマンらにより報告された成熟分泌タンパク質は不正確なシグナルにプチビ切断を示している。

ヒン不ンらは微生物学の国際会議（ボストン、マサチューセ列の５′末端の８０％を含んでいる）の成熟タンノ々り質配列およびヒトアルファインターフェロンのシグナル配列の３′末端の一部をゴー）”したｃＤＮＡフラグメントへの融合について報告している。ＰＨ０５は大部分の抑制可能（リン酸塩により）酸性ホスファターゼ（この酵母における分泌酵″Ｊ＜）をコードしている。伝えられる所によればヒンネンらの構成ではＰＨ０ｓシグナルはプチドの最後の３つのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列が欠けており、ハイブリッドシグナルの最後の３つのアミノ酸はヒト前駆−インターフェロンシグナル情報のアミノ酸。ヒンネンらにより構成されたプラスミドはビール酵母菌の形質転換に使用された。形質転換体はリン酸塩制御下インターフェロン活性を示す事が報告されている。インターフェロンの局在化は（細胞内または細胞外）議論されていない、し発明の概要」本発明の第１点は一般的には細胞によるタンパクｄの発現および分泌のため、宿主細胞（良好でおるのは酵母細胞）の形質転換に使用するクローニングビークル全特色としている。このクローニングビークルは転写のＩ［に：酵母転写制御ＤＮＡ配列。

完全酵母シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒト受脂性ホルモンまたはそれらのサブユニットをコードシているＤＮＡ配列を含んでいる。

良好な実施態様においては、ホルモンはヒト絨毛性ゴナトド上記のクローニングビークルは、ヒト受脂性ホルモンまたはそれらのサブユニットを酵母内で発現する事を可能にし、ホルモンは酵母により周囲の培地へ分泌さハる。さらに、タンパク質はプロセッシング後（すなわち、酵母のシグナル配列の除去後）成熟型で回収さＪする。以下に記載するごとく、シグナル配列の配置および間隔の調整により、所望の受胎性ホルモンを発現させ、シグナル配列の切断が正しい部位で起き、成熟型のホルモンが分泌されるような宿主微生物による７０セツシングが可能であろう。

成熟タンパク質の正しいプロセッシングに必要な情報は酵母シグナルＤＮＡ配列中に含まれており、外因性タンパク′倫をコードシているＤＮＡ配列の性質には依存しない。

〔発明全実施する為の好ましい形態〕

図の簡単な説明：ＡＪｒ、１図はプラスミド９９ＮＭ１ｕ−アルファを示す図である。

第２図はプラスミド９９Ｎを示す図でちる。

第３図はプラスミド’ｇｇＮＭ１ｕを示す図である。

第４図はプラスミド９９Ｎ−アルファを示す図である。

第５図はｐＢＲ３２２内へクローン化したＤＮＡフラグメントの部分制限地図であり、成熟アルファＨＣＧの最初の３０のヌクレオチドをコ−ドシでいる配列を含んでいる。

りｏ−ニングビークルの構造クローニングベクターまたはビークルの成分は図１に示したプラスミド”９９ＮＭ１ｕ−アルファにより、さらに図４のＴ）９９Ｎ−アルファにより図示されている。プラスミドは機能性プロモーター領域および転写開始部位から成る転写制御配列を含んでいる。

機能性酵母プロモーター領域は、転写を開始する為に、例えば天然に存在する完全な酵母プロモーターのごとき充分な配列を他のプラスミド成分の」二流に含んでいなければならない。

（ある棟の欠失を３′末端に含む天然に存在する酵母転写制御ＤＮＡ配列もまた機能性プロモーターである。）ＢａｍＨＩ部位（−５５３）からＡｉｌ方のＡＴＧトリプレット（＋１．＋２．＋３と定義する）ヌクレオチド１での５′から３ ’ＤＮＡ配列は転写を開始するのに光分な上流にある配列を持つ機能性月匹臣プロモーター領域である。ＰＨ０５転写制限領の３′末端にある種の欠失のあるものもまだ機能性プロモーターである。

転写制御配列と読み取り枠内で融合された、酵母分泌タンノξり簀のシグナルペプチドへ転写および翻訳される配列が存在する。シグナルベブチドヲコードするｐ９９ＮＭｌｕ−アルファ（ＰＨ０５シグナルにブチドと同一ペプチドをコートする）は次のアミノ酸配列を持つ：Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｖａｌ− Ｖａｌ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−工１ｅ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｌｅｕ− Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ。

ｐｇｇＮＭ＞、ｕ−アルファ上のシグナルベプチト９をゴーに−ｉるＤＮＡ配列は上記の酵母ＤＮＡ配列は所望の外因性タンパク質とをコードするＤＮＡ配列と攪み取り枠装置される。”外因性タンパク質″とは天然に存在する系においては、ビークルの酵母プロモーターの制嶺１下では生産されずまたビークルのシグナル２プチドでは生産されないタンパク質を意味する。この術語はｖｌ、母タンパク質も包含するが、良好であるのは外因性ＤＮＡ配列がコードする非酵母タンパク ′Ｃの成熟型である。

シグナル配列の成熟タン、ａり質をコードする配列への融合を容易にする為天然に存在するシグナルＤＮＡ配列を修飾する事ができるが、生じるシグナルにプチドのアミノ酸配列に反映される修飾は避けなければならない。配列間に余分なヌクレオチド金入れないためシグナルＤＮＡ配列の３′末端を外因性ＤＮＡ配列の５′末端に連結する。このようにすれば、形成期のタンパク質は所望の成熟タン・ξり質に直接的に隣接したシグナル２プチドを含むであろうし、分泌されるタンパク質は外部のアミノ酸を含まないであろう。

良好なりローニングビークルの他の成分には、ＤＮＡ複製起点およびシラスミド選択のだめの表現型の基準を与えるＤＮＡフラグメントが挙げられる。ｐ９９ＮＭ１ｕ−アルファにおける詳細な特徴は以下の、その前駆体（プラスミドｐ９９Ｎ）およびｐ９９Ｎからｐ９９ＮＭｘｕ−アルファの作製方法の記載によシ例示される。

クローニングビークルの構成および＾ＩＪ駆体前体前記ローニングビークルは多目的クローニング部位を提供するように修飾された、酵母転写制御配列および酵母シグナル配列を含むベクターの遺伝子工学的処理により構成できる。

プラスミド９９ＮＭ１ｕ（図３）はクローニング部位及ｔｕＩを含むそのようなベクターでちる。制限消化または合成リンカ−の使用により遺伝子工学的処理を受けた所望の分泌捷たは非分泌タンパク′ぼをコードシている任、伏の外因性ＤＮＡ配列がプラスミドｇｇＮＭ］、ｕの及す１部位に挿入され、所望のタンパクｉｆまたはペプチドの発現および分泌を達成するためには３１１限部位は酵母シグナルＤＮＡ配列の末端に寸たはその近傍に位置していなければならない。どこに制限部位が位置しているか、および何の配列が必要とされているかに依存して、使用されるリンカ−は、無傷の天然に存在するシグナルＤＮＡ配列を維持するように遺伝子工学処即金受けるが、遺伝子コードの不要部分が実施される工学的工程に若干の融通性を与える。同様に、シグナル配列への抗敗り枠内融合を保証する為、遺伝子工学処理およびヌクレオチド付加が外因性ＤＮＡ配列の５′末端で必要とされる。そのようなリンカ−の構造および構成の例は以下のｐ９９ＮＭ１υ−アルファに略述しである。

以下に、ｐ９９Ｎについての特定の記述およびその構成を、そしてさらに、制限部位Ｍｘｕ工の挿入によるｐ９９Ｎからのｐ９９ＮＭｌｕの構成を記載する。外因性ＤＮＡをｐ９９ＮＭ１．ｕヘスブライシングしてｐ９９ＮＭ１ｕ−アルファを得る。本構成で使用されるであろう日常の組換えＤＮＡ操作はマニアチスら（モレキ六２−−クローニンク：アラホラトリーマニュアル、コールビスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールトスプリングツ・−）之−１１９８２）により記載されている。

プラスミド９９Ｎプラスミ）’９９Ｎは以下のＤＮＡセグメントを包含している（ＥｃｏＲＩ部位より反時計回りに）：１、キンゲスマンら（ジ：Ｚユ、１４１−１５２（１９７９））およびチュムノで−およびカーボン（２二Ｚ胆、１５７−１６６（１９８０１）により記載されているクロモンーム４かもの１．４５ｋｂＥｃｏＲ工・ＹツムＤＮＡフラグメント中に含まれている酵母からの機能性１漣」遺伝子。このフラグメントは１０３ｂｐの機能性μＲＰＩプロモーター領域、６７２ｂｐのコートゞ配列および６７８ｂｐの３′非翻訳領域（転写終結配列としてだけではなく弱いＤＮＡ複製起点〔またはレプリコン〕として機能し、上り」配列と称されている）を含んでいる：プラスミ）’ＹＲｐ７はチュムパーおよびカーボン（１９８０）により記載されており、この１．４５ｋｂ腟ＲＩフラグメントをｐＢＲ３２２の上皿ＲＩ部位に工￥ユおよびアムピシリン耐性のための遺伝子が同じ向きで転写されるような方向に挿入せしめる事により構成されている；２−ｐＢＲ３２２配列（旦匹ＲＩ−Ｎ皿Ｉ、３３８９ｂｐ）は大腸菌（ｈ２．ｃｏｌｉ）甲で機能するＤＮＡ複製起点同様に大腸菌中でのアムビシリン耐性のだめの遺伝子も運ンテイル；３ブローチ（ｇ母菌属の分子生１梵工：生活環および遺伝形リングハーバ−、１９８１）により記載されておりほとんどの株のビール酵母菌に対し内因性である天然に存在するプラスミド、２ミクロン理のＢ型からの１．４５ｋｂＨ１ｎｃエエフラグメント。

Ｈｊ、ｎｃＩＩフラグメントはＤＮＡ複製の０強い”起尭（すなわち、酵母においてより高いプラスミドコピー数を与えるので＝１土よりも゛より強い”）を含み、有糸細胞分裂当りのプラスミド損失はより低い速度となる。この毒は寸だ部分的には、はとんどの酵母株で運搬されている内因性２−ベクロンブラスミドの存在の為でもちる。プラスミド９９Ｎ中でのこのベクターフラグメントの方向はこの機能に関しては重要な問題ではない；ターおよび１７アミノ酸シグナル−Ｓプチド（最初のメチオニンを含む）をコードする全てのＤＮＡ配列を含む；および６、ＫｐｎＩ一旦ｃｏＲエフラグメントはスペーサー領域として使用される。

このフラグメントの起源および琵さけブラスミｒ９９Ｎ′士たけその誘導体での使用にはＮ要な間四ではない。プラスミ）９９Ｎにおけるスペーサー領域は、ＰＨ０５構造配列からなる。

プラスミド９９Ｎは以下のごとく構成する。プラスミドＹＲｐ７をとＲＩで部分消化し、２つの旦四ＲＩ部位のただ１つのみを切断する。この消化による生成物のほとんどは５．８ｋｂ直線状ＹＲＰ７分子から成っている。この直線状分子の約半分は１方のＥｃｏＲＩ部位で切断されており、残りの半分は他の旦竺Ｒ工部位で切断されている。この直線状分子は、非切断環状分子およびまれに起る両方のＥｃｏＲＩ部位での切断により生じたより小さい直線状分子から、マニアチスら（１９８２）により記載されたごとくゲル電気泳動、吐いてのゲルからの溶出により分離する。

その後５′突出ＥｃｏＲＩ末端はＤＮＡポリ、メラーゼエ（タレツアー酵素）を用いてｄ、ＮＴＰａでふさぐ。（もしくｄ二、５′ハ二ＲＩ突出末端は最初に単 −釦特畳性の５′から３′へのエクソヌクシ・・アーゼにより除去できる。）とのようにして発生でせた十トｂ末端分子をＤＮＡＩＪガーゼで再結合するとぐ理化）、旦ヨＲＩ認識配列の１つが失われた事になる。刀すコに隣接した４副ＲＩ部位を残有する該当プラスミ）”（ＹＲｐ７’）は制限地図作ｆｆＫより同定する。次に、酵ｍ２ミクロンプラスミドからの１．４５ｋｂＨ１ｎｃＩＩフラグメントをＹＲｐ７’ＮｒｕＩ部位に結合せしめる。生じたプラスミド、ＹＲｐ７’ ＮをＥｃｏＲＩおよび担Ｈ■の両方で消化する。ゲルから単離される６、８７ｋｌ＋の大きなフラグメントがベクターフラグメントである。ビール酵母のＰＨ０ｓ遺伝子は、ｐ６０と呼ばれるペプチドに相当する、リン酸塩により抑制される主要な酸性フォスファターゼ（ＡＰａＢθ）をコードし、ボスチアン′ら（ヱ旧釡二、４５０４−４５０８（１９８０））およびクレーマーおよびアングーソン（ＰＮＡ８二、６５４１−６５４５（１９８０））により記載されているごとくクロモソーム２からの８ｋｂΔｃｏＲニゲツムＤＮＡフラグメント中に包含されている。ＰＨ０５フラグメントは８ｋｂＥｃｏＲＩＰＨ０５領域を運ぶプラスミド（例えば、アンダーンン、チルおよびり１／−マーにより記載されている１９８３））を一旦ａｍＨＩおよび４理工で消化し、ゲルから０．６ｋｂＢａｍＨＩ −ＫｐｎＩフラグメントを単離して調製される。

ＢａｍＨ工部位（−５３３）から先のＡＴＧトリプレットヌクレオチド寸での５ ′からγのＤＮＡ配列は転写の開始を可能にする中位（＋９４１）１））で始まり且惑工部位（＋４５００ｂｐ）で終了する且壓胆構造配列（旦ｃｏＲ工’Ｊンカー配列が付加されている）から成っている。このフラグメントをＰＨ０５フラグメントおよびベクターフラグメントと混合し、ＤＮＡリガーゼで環状プラスミドとなす。この生成物を大腸菌の形質転換に使用しアムビシリン耐性にする。この形質転換体のプールからプラスミ）”９９Ｎを同定し、プラス、？）”ＤＮＡを調製する。プラスミ）”９９ＮはＮＲＲＬに寄託番号１５７９０で寄託されている。

プラスミド９９Ｎは以下の１プラスミ）’９９Ｎ−アルファ“のところに記載される技術を用いて、最初の塩基対がＧで始まる外因性ＤＮＡ配列のためのクローニングビークル（例えばｐ９９Ｎ−アルファ）の構成に使用できる。もしくは、ｐ９９ＮにＭｘｕ工部位を挿入すると、最初の塩基対の同一性とは関係なく外因性ＤＮＡが発現できる。

プラスミド９９ＮＭｌｕ９９ＨのＰＨ０５シグナル配列の３′末端内へＭｌｕ工部位を挿入するために、以下の遺伝子工学工程が必要である。第１に、ＰＨ０５プロモーターおよびシグナル配列を含む９９Ｎの１．９５ｋｂＢａｍＨニーＥｅｏＲＩフラグメントをｐＢＲ３２２に挿入し、プラスミドｐＢＲＰｈｏを生じせしめる。その後、プラスミ１′□ｐＢＲＰｈ。

のｐＢＲ部分中の包工部位をＡｖａＩ−ｂ１エエフラグメントの除去により除いてｐＡＰＰを生じせしめる。ｐＡｐｐはこの時点で位への置換である。この置換を達成するためにはｐＡＰＰを工による消化に続いてベクターを閉じる。細菌形質転換体をＭｘｕ工部位の存在について検量する；そのようなプラスミドｐＡＰＰＭを単離する。

ｐＡＰＰＭを及凪工で消化し、ＢａｌＩ部位および及凪工突出部分を含む合成７ −ｍｅｒｅ（５’ＴＧＧＣＣＡＡ３’）および１１−ｍａｒｓ（５’ＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＡ３’）を連結する。これらのリンカ−のいくつかは２つのＭｌｕＩ突出部分の間に結合でき、これは次のような構造となる：（Ｚ央猥シグナル−Ｂａｘ・・・Ｍｌｕ−蜘壮・・・・・・蜘す−堕）。これらの構造物を互ａｘＩで消化し、ベクターを結合して閉じる。この事によりすべての不必要なリンカ−が除去され、差凹工部位をＰＨ０５シグナル中の、艷り、１部位の隣へ移動させ、このようにして所望の配置歳を得、それはＤＮＡ配列決定により証明される（ｐＰｈｏＭ）。

プラスミド−９９ＮおよびｐＰｈｏＭからの９９ＮＭｌｕの構成は以下のごとくして達成される：ｐＰｈｏＭの１．９５ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ工フラグメントを単離し、ＢａｍＨ工および旦Ｃ０ＲＩの両方で切断し、細菌の酸性フォスファターゼで処理した９９Ｎに結合させる。

細菌形質転換体はＭｌｕＩを持つプラスミドに関してスクリーニングする。そのようなプラスミド、９９ＮＭ１ｕ（図３に記載しである）はＫＬ離され、ＰＨ０ｓシグナルを異種タンパク宵と融合させるために使用できる。プラスミ）’９９ＮＭ１ｕはＮＲＲＬＫ寄託番号Ｂ１５７９２で供託されている。

このように９９ＮＭｌｕを竺ｘｕＩで消化した場合、４−塩基突出部分が得られ、それ（・よ正確にシグナル配夕１１のカル・ポキン・末端をコードする部位で経続する。このＭ］、ｕＩ突出部分はＤＮＡポリメラーゼエ（クレノー酵素）のラージフラグメントを用いてａＮＴＰ’Ｇで両方の部位をふさぐように修飾でき、それにより平滑末端の兄全ＰＨ０５シグナル配列がイ（）らハる。もしくは、この突出部分をヌクレアーゼＳ１で消化すると、最後の４つのヌクレオチドが消失した平滑末端Ｖ熱点シグナル・配列となる。

！Ｊ９ＮＭ］、ｕのこの領域はまた旦凹少ＩＩ（認識配列ＣＧＣＧ）でも切断でき、最後の２つのヌクレオチドが消失１−７だ平滑末端ＰＨ０ｓう／グナル配列全イｌる。

こねらの修飾により、制限消化または合成リンカ−の使用に↓り遺伝子工学的処理を受けた任意のゴード領域のわく内への以下の実施例はビール酵母菌におい′ でのプロモーター、翻訳開始部位およびＰＨ０５のシダナＪし配列の指令によるヒト絨毛性ゴナドトロピンのアルファザブユニット（アルファｈＣＧ）の提案された合成および分泌について記載している。アノトファ１１ＣＧおよび酵ａ酸性ホスファターゼの両方ともそのアミン末端にシグナルペプチドを含む＠駆−タン、２り質から誘導される分泌タンパク質である。

成熟アルプｙｈｃＧのコード配列の最初の卵ヌクレオチドは既知の制限酵素のどんな脇識配列も穐んでいない。それ故、アルファｈＣＧの成熟部分の任意のシグナル配列への融合には非常に長い合成りＮＡ’Ｊンカーの広範囲の使用を必要とするであろう。

この事はすべてしかし１つ甘だは２つの制限酵素認識部位のヌクレオチドを含む位置で、且つ成熟コード配列の開始点から下流に制限部位を作る事により打開できる。比較的短いおよび安価な合成りＮＡフックメントが９９ＮＭ１ｕの新しく作った制限部位および及ｒｕＴ、部位の間に挿入できる。

良好な方法においては、アルファｈＣＧの成熟型をコードスるＤＮＡフラグメントは、プラスミド９９ＮＭｌｕ中ＰＨ０５シグナルへの正しく読み取り枠調整された様式での融合を達成する事ができるように遺伝子工学的処理ができる。

完全前駆−アルファｈＣＧ分子をコードするアルファｈＣＧクローンはｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ工部位の間にクローン化しである。この挿入物の部分的制限地図および成熟アルファｈＣＧのためのコード配列の最初の３０ヌクレオチドを図５に示した。成熟アルファｂｃＧの最初のアミノ酸のコドンは矢印で示したごとく部番目の塩基から始する。９４番目の旦の見へのＯｆ換により、Ｐｅｔ工部位（ＣＴＧＣＡＧ）が生じ、合成りＮＡリンカ−の挿入に使用する事ができる。

エクソヌクレアーゼＢａ１３１をこのフラグメントのＢａｍＨＩｇ位から一部を切除するのに使用でき、約９０ｂｐが消化されるであろう。これらの消化を受けたフラグメントにン、ｔし、ご末端にＣを含む旦匹Ｒニリンカーを連結する。切除が正確に５’ＴＧＣＡＧ３’の配列で終了している分子のみが、Ｃの付加後に、９・２のる約２５０ｂｐ長のフラグメントをｐＢＲ３２２のＰｑｔＩ部で立にクローニングするｉ例より選択できる。そのようなフラグメントを含むプラスミドは二部Ｊで消化でき、合成１０ｍ＠ｒｓ（５’ＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣ３’）およびＩ８−ｍｅｒｓ（５’ＣＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡ３’）を連結する。これらのリンカ−は及凪工突出部分およびＰｓｔＩ突出部分で終了している、失われたアルファｈＣＧゴード配列を含んでいる。この連結混合物はＭｘｕＩで消化でき、フラグメントをｐＰｈｏＭの及」工部位にクローン化できる。アルファｈＣＧコード領域の３′フラグメントはこのプラスミ「に盈ｂａＩ一旦四ＲＩフラグメントとして挿入でき、成熟アルファｈｃＧゴード領域へ融合されたＰＨ０５プロモーターおよび旦匹臣ツ／グナルを含む完全ＢａｍＨＩ一旦ｃｎＲＩフラグメントはｐ９９ＮＭｌｕへ挿入できてｐ９９ＮＭ１ｕ−アルフ゛アを得、それは酵母の形質転換に使用できる。

グラスミ１９９Ｎ−アルフア別の方法においては、プラスミド９９Ｎは用チ臣シグナル配列がアルファｈＣＧの成熟型をコードするＤＮＡ配列に融合し九ノ・イブリッド遺伝子の構成にベクターとして使用され、図４に図示し７たブラスミｖ９９Ｎ−アルファを得る。、ＰＨ０５シグナル配列は最初の５１ヌクレオチド（完全な１７アミノ醒のシグナルペプチドをコードする）に付加的な１つのグアニン（Ｇ）残基を加ｊ−たもののみを含むように操作されているのでノ・イブ１１７）’遺伝子の、特異的合成がｒｉＪ能である。これは最初に罎ざ墜ＤＮＡを堕工幣素で消化し、３′突出鎖を発生せしめる裏により達成される。

牙、−）＜乞Ｔ４ＤＮＡ、−＋ゼ１）メラービの３’−５’エクソヌクレアーゼ：？１Ｆｔ、＋こより平滑末端分子を得る。成熟アＡ７アｈＣＧのコード領−々：・寸、ｐ９９ＮＭｌｕ−アルファの作製に記載した。場合と同様の方法で処理する。成熟アルファｈＣＧゴード領域にＧＡを付加して認識配列ＧＡＧＣＴＣの汝しい制限部泣山凪工を作る。これはＢａ１３１を使ってＢａｍＨＩ部ｆσから切除したアルファｈＣＧフラグメントを、修’ｊｌｓａｌ工部位を含む（それ酸末端にＧＡを含む）フラグメントに結合させることにより達成される。新しく作製した５ａｃＩ部位はその中にＡｘｕ工部位（ＡＧＣＴ）を含んでいる。

の最初のＧが消失したフラグメントを得る。これらのフラグメントと９９Ｎ中の修飾シグナルペプチドとの融合により、無傷のＰＨ０５プロモーター、翻訳開始都立および成熟アルファｈＣＧをコードする配列に♂′Ｌみ取り枠内！Ａ整されて融合した完全シグナル配列を含む９９Ｎ−アルファプラスミドが構成される。

プラスミ）’９９Ｎ−アルファはＮＲＲＬに寄託番号Ｂ１５７９１号で寄託されている。

タンノ々り質合成りローニングビークルはベッグス（、＊−ｆ−ヤー２７５：１０４−１０９Ｃ１９７８））により記ｉＳ！でれているごとき通常の技術により宿主酵母微生物の形１ｖ転換に使用する。

形質転換された酵母微生物はポットスタインおよびプービスレこより分約されているごとき（１酵母金用いる徂換えＤＮＡ研−、コールドスプリングハーノζ− ，ＮＹ、１９８２）通常の技術を用い標漁的な培養培地中で培養する。分泌された成熟ポリペプチドは囲りの培地から回収される。

プラスミド’９９Ｎ−アルファは突然変異体ｔｒｐｌ遺伝子（トリプトファンオークツトロフィー（要求性）を起こす）を運ぶビール酵母菌の休をＴｒｐ＋表現型（トリプトファンプロトトロフィー）に形質転換するのに使用した。プラスミド９９Ｎ−アルファは発現可能酵母ｔｒｐｌ遺伝子を運ぶのでトリプトファン非存在下でも増殖するように（トリプトファンプロトトロフィー）酵８を形質転換する。プラスミド’ＤＮＡによる酵母の形質転換に適した方法は例えばベッグスにより（１９７８）記載されている。

トリプトファンを欠いた合成増殖培地上、単一コロニー分離法により１つ甘たはそれ以上のＴｒｐ＋形質転換体を分離する。この培地は５Ｃ−ＴＲＰと称されており表１に記載されている。

表１ＳＣ−ＴＲＰＬＰ３ｏ（ＳＣ−ＴＲＰ）デキストロース２０、！ｉ’２０．９慌酸アンモニウム５．９５ｇ硫酸マグネシウム０．５ｇ０．５．９塩化ナトリウムｏ、ｔｇｏ、ｉｇ塩化カシカルシウム０．１ｇＯ，ＩＪビオチン、葉酸各々２μｙ各々２μｙホウ酸５００μｇ５００μｇ硫酸銅４０ｔＪ４０μｙヨウ化カリウム１００μｍ１００μｇイノシトール２ｍＪ２ｍ、９トレオニン１５０ｍＰ１５０ｍ、！？ロイシン、リシン各々６０ｍ、！ｉ’各々６０ｍ＆ＫＨ２ＰＯ４１，５，？３０ｍＮＫＧＩＯ１，５ｇ形質転換体株はトリプトファンを欠き、加η７６ＫＨ２ＰＯ４および１．５１／ｌＫＣｌを含む低リン酸合成液体増殖培地中で・インキュベートする。この培地はＬＰ３ｏ（ＳＣ−ＴＲＰ）と称され表１に記載されている。プラスミド９９Ｎ −アルファの発現を保有する細胞がこの培地中で増殖し、無機リン酸塩の細胞内ｍ度が低くなった時アルファｈＣＧを合成し始める。３０℃で２日間インキュベート後、はとんどすべて（９０％以上）抗原的に活性なアルファｈＣＧが培養培地に観察される。典型的な濃度はラジオイムノアッセイにより決定したところ０．２ＴＲ９／ｌまたはそれ以上である。

アルファｈＣＧのほとんどまたはすべてが培養培地内へ分泌されるので、酵母細胞を採取した細胞懸濁液から遠心分離、ｐ過その他のごとき任意のいくつかの常法により最初分離する。その後、細胞を含まない発酵ブロスは精製アルファｈＣＧを単離する為に計画された適当なタンパク質精製法で処理される。

以前に記載したごとく、プラスミド”９９ＮＭ１ｕ１ｉＰＨＯ５シグナル配列を任意の異種遺伝子またはｃＤＮＡへ結合せしめるのに使用する事ができ、任意のビール酵母醒株へ導入する事ができる。

その後、ｐ９９Ｎアルファで形質転換した酵母を用いるアルファｈＣＧの生産のために上で記載した技術を用いて、所望の異種タンパク質の生産に形質転換した酵母を使する事ができる。この系は細胞外液体へ分泌される異種タンパク質の収量を増加させることができる。

本明細書に記載した各々のプラスミド寄託物は以下の条件下に寄託された：（ａｌ米国特許および商標局の長官により決定さｈる者のみが特許出願が未定の間、３７ＣＦ″Ｒ１１４および３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１２２の下で、培養細胞に近つく（刊利全有する；および（ｂ）特許の付与によりそのようにして寄託された培養細胞の一般の利用へのすべての制限が変更せずに除去されるであろう！％ｆｃ保証する。

他の実施便様他の実施態様も以Ｆの請求の範囲に含１れる。発現された汁で１７、、Ｊ？プチドでの適切なジグプル切断部ｆｑ認識を達成する為には３つの末端フビノ醜は天然に存在する酵母シグナル配列のアミノ酸と同一であるべきである。無傷で未修飾なシグナル−ｔプチドの生産が望まハるが当業者ンま請求きね、た発明をごくわずか変更して使用する事が可能であろう。

同様（・て、所望のポリー！プチドのＮ末殉に少数の余分のアミノ酸を付けたものも含まハフ、またジグナルＤＮＡ配列の末端に関して制限酵素部位のいくつかのわずかな（３−６塩基対）移動も許容されるであろう。

発現および分泌できる他の受胎性ホルモンには卵胞刺激黄体化ホルモンが挙げられる。

ＩＧ１ＩＧ２ＩＧ３ＦＩＧ４丁続補、ｉＴ、ｉ！ｊ（方式〉 −１，９ｓ件の表示１”Ｃ丁／ＬＪＳ８εう１０１３１０２、イと明の名称酵母りＬｌ−ニングビークルＸ３、捕ＩＦをづる各！１１件との関係出願人住所氏名し七ント、ジエフリー・エフく外３３名）４、代理人住所東京都千代田区人手町二丁目２番１号新人手町ビル２０６号至５．補正命令の日付昭和６１年９月１６日（発送日）６．７＋（ｉ正の対像出願人の国籍を正ｈ１「【こ記載した所定の書面委任状及訳文クイブした明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内含国際調査報告Ｉｎ＋１１１１１１１４Ｑ自１＾Ｏ１＋ＩＩ（Ｉｌ１６ｆｉＮ！、、−／、＋＜９ｑ／ｆｉｌ’（ｌｎ

Claims

【特許請求の範囲】

１．酵母宿主において外因性ＤＮＡ配列の発現に影響する事ができるクローニングビークルであつて、読み取り枠内に転写の順に、酵母転写−制御配列、酵母シグナルペプチドをコードする酵母シグナル配列、およびヒト受胎性ホルモンまたはそれらのサブュニットをコードするＤＮＡから成る外因性ＤＮＡ配列を有する、前記クローニングビークル。
２．前記酵母シグナル配列および前記外因性ＤＮＡ配列が、間に余分なアミノ酸が入らずに所望のヒト受胎性ホルモンに隣接する完全な酵母シグナルペプチドからなる蛋白質を特徴とする請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
３．前記酵母転写制御配列が本質的に天然に存在するリン酸塩一抑制可能酵母酸性ホスフアターゼ遺伝子の転写一制御配列と同一である請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
４．前記酵母転写制御ＤＮＡ配列が本質的に酵母ＰＨＯ５遺伝子の転写制御配列と同一である請求の範囲第３項記載のクローニングビークル。
５．前記酵母転写制御配列が本質的にビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のクロモシーム２からの８ｋｂＥｃｏＲＩＰＨＯ５ゲノムＤＮＡフラグメントの０．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメント内に含まれているフラグメントと同一である請求の範囲第４項記載のクローニングビークル。
６．前記酵母シグナル配列が天然に存在するリン酸塩−抑制可能酵母酸性ホスフアターゼ遺伝子により発現されるシグナルペプチドと本質的に同一のペプチドをコードしている請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
７．前記酵母シグナルＤＮＡ配列がＰＨＯ５ゲノムフラグメントにより発現される完全シグナルペプチドと同一のシグナルペプチドをコードしている請求の範囲第６項記載のクローニングビークル。
８．シグナルペプチドのカルボキシ末端の３つのアミノ酸がＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａである請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
９．前記酵母シグナル配列が以下のシグナルペプチド：【配列があります】をコードしている請求の範囲第８項記載のクローニングビークル。
１０．酵母シグナル配列（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）が【配列があります】；または【配列があります】のどちらかである請求の範囲第９項記載のクローニングビークル。
１１．前記外因性ＤＮＡ配列が非分泌性タンパク質もしくはペプチドをコードしている請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
１２．前記外因性ＤＮＡ配列が分泌性タンパク質もしくはペプチドをコードしている請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
１３．前記外因性ＤＮＡ配列がアルフアｈＣＧの成熟型をコードしている請求の範囲第１項記載のクローニングビークル。
１４．前記クローニングビークルが９９Ｎ−アルフア（ＮＲＲＬＮｏＢ１５７９１）である請求の範囲１３項記載のクローニングビークル。