JPS61500729A - 抗腫瘍医薬組成物及びその製造法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍医薬組成物及びその製造法 技術分野 この発明は、抗腫瘍医薬組成物及びそれらの製造方法に関する。この発明のもう １つの目的は、ａ胞増殖￥ｃｒ！Ａ係する疾患の治療にさける８ｏｏよシも高く ない分子量を持つあるポリアミン誘導体類の使用次の一般式： で表わされる化合物は、文献において既知であシそして多くの異なりた産業分野 において用いられている。すなわち、たとえばＮ−［２−（２−（へ！タデセニ ル）−２−イミダゾリン−１−イル］−エチル〕−オレアミドＦｉ％Ｉリエボキ シドビテ為−メンのための添加剤としてイギリス特許第９２９３９７号から知ら れる。ジャーナルオツケξカルリサーチ（シノプス）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｔ　 Ｃｈｓｍｌｅａｌ　Ｒ＊ｓ＊ａｒｅｈ　（ｓｙｎｏｐｓ＠５））（１９８１）３ ：８４〜８５及びＤＩ−Ｏ８第２５４６１８０は、Ｎ−（２−（２−（８−ペプ タデセニル）　−４，５−ジヒドロ−ＩＥ［−イミダゾルー１−イル〕−エチル 〕−９−オクタデセンアミドの異なった立体異性体の反応及びＮｂ／Ｔ　ａ鉱物 の浮遊におけるそれらの使用を開示する。ゾルツェミスル・ケミストリー（Ｐｒ ｚｅｍｙｓｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　（４６）　８　：４９７〜４８１の論 文は、Ｎ、Ｍ−（エチレンビス（イミノエチレン）〕ビス（９，１１−オクタデ カジエンアミド）及び−（９，１１−オクタデカジェノエート）の（１：１）混 合物及び陽イオン性界面活性剤としてのそれらの使用を記載している。アメリカ 特許第３３３７４５９号によれば、Ｎ、Ｎ’　−（イミノビス（エチレンイミノ エチレン〕ビス（１０−オクタデセンアペド）は、脣剤として用いられる。アメ リカ特許１３１９３４５４ｕ、ペイントのための添加剤として１．１’−（イミ ノジエチレン）ビス〔２−（８−ｎ！タデセニル）−２−イミダシリンを記載す る。

しかしながら、従来技術においては前述の化合物のいずれの治療効果に関して、 まったく言及されていない。

過去１００年は、特に異常な化学の発展の結果、の発展は、好ましくない異常現 象をも起こし、そしてこれらの現象の１つが、腫瘍性疾患の急速な増加である。

現在、癌研究は、最っとも発展している研究領域の１つであシそして驚くべく財 政的及び知的供給を必要とする。基礎研究に加えて、ある特定タイプの腫瘍性疾 患の治療に関しては、偉人な成果が存在する。多くの場合、外科関与は、治療の 他の種類、たとえば、照射、化学治療法、等をしばしば伴う。既知方法及び特に 化学治療法は、それらが腫瘍の特定の型の分野に限定されているという共通の特 徴を持つ。腫瘍性細胞の一般的再生をもたらす一般方法は、今までのところ、見 出されていない。

科学の現状によれば、腫瘍性疾患は、ひじように初期の状態で検出された場合に は、治すことができる。初期段階は、認識するのがひじように難しいので、腫瘍 性疾患は、治療するのに最りとも難しい病気に属する。一般的に、対症治療が実 施されるが、しかし回復率はひじように乏しい。したがって、腫瘍性疾患の発生 を防ぎ、しかも同時に発達した疾患の患者に一般的で且つ適切な治療効果を与え る治療薬に関して強い必要性が存在する。

この発明の目的は、上記条件を満たす医薬組成物分提供することである。またこ の医薬組成物の製造方法を提供する。

さらにこの発明の目的は、前述の及び腫瘍性疾患の治療のための一般式〔■〕の 化合物の使用である。

この発明は、癌過程の開始理由が、細胞間の正しい情報及び／又は循環鎖におけ る不全のためであるという認識の上に置かれている。正常な器官においては、永 久的伝達が細胞間で起こる。その器官におの欠損の結果で゛あり−１−ごの場合 、細胞はお互い認識することができず、それらの連絡を失いそしてそれら自身の 内部情報によシ増加し始める。この増加は、悪性度の進行であシそして増殖を導 び〈０悪性過程により生じた増殖細胞は、破壊されるべきでなく、シかしこれら の悪性細胞友び／又は正常な細胞間の可能性ある連絡が再確立されるべきである ということが見出されている。腫瘍細胞の組織構造を健康な組織に再確立するた めの唯一の方法は、細胞間伝路を回復することである。

たぶん、細胞壁上に存在するタン・ぐり質外皮がその膜上にシールドを形成し、 従って、細胞間の”伝路チャンネル”を作用できなくする。この理論から出発す れば、この研究は、前記タンパク質外皮を崩壊する物質を見つけることに向けら れ、その結果この細胞間の伝路チャンネルは、回復し、そして腫瘍細胞はその分 離性を失う。

上記の効果は、前述の一般式（ｉの化合物によりて達成することができ、ここで 、 Ｒは、１つ又は複数の不飽和を含むことができる長い脂肪族炭化水素基であシ、 Ｒ１は、水素又は１つ又は複数の不飽和を含むことができる長い脂肪族アシル基 であり、 Ｘは、酸素であシそしてＹ＃：を水素であシ、又は−緒に取られる場合、Ｘ及び Ｙは、 −Ｎ　−ＣＨ２−ＣＨ２−の式の基を形成し、２け、１〜５の整数であシ、 ｑは、１〜４の整数である。

Ｘ及びＹが一緒になりて、基−Ｎ　−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成しすなわち、分子 間ジヒドロイミダゾ環が形成される場合、上記化合物は直鎖ポリマーの７ミノ化 合物、及びそれらの互変異体であることがわかる。

上記の長い脂肪族炭化水素基は好ましくは１２〜２０個の炭素原子及び場合によ っては少なくとも１つの二重結合を含む。開鎖化合物において、すなわちＸが酸 素の場合、長い脂肪族アシル基け、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸に 由来するのが好ましい。

すでに記載したように、一般式（１）の化合物は、当業界においては既知であり 、又はもし新規であれば、それらは既知の方法、たとえば次の反応：１、Ｒ−Ｃ ＯＯＨ＋　Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２→脂肪酸　 ポリアミン →　Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２＋　Ｒ２ ゜アミドポリアミン によって製造される。

もちろん、上の最終生成物とは異なる構造を持つ一般式（１３の化合物を、この 上で記載されたのと本質上同じルートによシ裂造することができる。

この発明の医薬製造において゛、一般式（１）の化合物のいずれか及び、それら の化合物のいくらかの又はすべてさえもの混合物が、活性成分として用いられ得 る。”活性成分”下で、前述の化合物の可能性ある立体異性体すべてをも意味す べきである。

水性媒体において、平衡が、開鎖の及び互変異体の環形成の間に存在するという ことが記載されるべきである。

この発明の医薬組成物は、このタイプの製剤化組成物のために良く知られている 方法によって、たとえば少なくとも１゛っの生理学的に許容できる担体と、一般 式（１）の１つ又は複数の化合物を混合することによって製造され得る。

この発明の医薬組成物は、経口的に又は好ましくは、静脈内に投与することがで き、さらに好ましい投与は、吸入法である。この目的のために、この発明の活性 化合物の蒸気、より多数のそれら、又は吸入性組成物に配合された上記のものの それが患者によって吸入される。

吸入法の場合、蒸気相は、式（Ｉ）の活性化合物の蒸気のみならず、これらの分 解組成物をも含んでいる。これらは、一般式、ＮＲＲ’Ｒ”及びＨ２Ｎ−［：（ ＣＲＲ’）ｙ−ＮＨ））、−ＨｌここでＲは水素、より長いアルキル又は−（Ｃ Ｈ２）ｎ−ＯＨであシＲ′及びＲ〃は水素及び低級アルキルであシ、そしてｎ、 ｘ及びｙけ整数である。

可能性ある分解生成物として、ホルムアルデヒドも記載しなければならない。

従って、この発明の医薬組成物は、活性成分として、式〔Ｉ〕の化合物及びそれ らの分解生成物を含んで成る。

それぞれこの発明の活性化合物及び医薬組成物は、腫瘍細胞及び正常な細胞が連 絡することを誘発し、その結果として、腫瘍細胞は、再びそれらの環境を認識し 、さらに増殖が停止しそして余分な、しかし。

もはや腫瘍性でない細胞を生゛物の異なった保ｉ！！機構の助けによって除去す ることによって免疫系が作用し始める。生物学的試験によれば、一般式（１）の 活性化合物の混合物は、細胞間伝路及び／又は循環チャンネルを再確立すること に特に活動的であること力；わかった。

この発明によれば、再生又は細胞間伝路及び／又は循環チャンネルをインヒポ及 びインビトロの両者で達成することができる。それらの目的のために、この発明 の活性化合物及び組成物、好ましくは前記混合物を、血流を通して、リン・！系 を通して、経口的に及び／又は吸入技法によって投与する。

一般式〔！〕の化合物及びそれらの混合物の抗腫瘍効果が、動物及び臨床実験、 兼びに組織培養物（白血病ビールス生産性形質転換細胞系）上でイン−ビトロに おいて試験された。形質転換されたそして悪性の増殖細胞系は、１０　〜ｌＯの 希釈のこの発明の化合物及び組成物によシ接触抑制され、一方弁悪性系は、それ らの増殖を抑制されていないとい５ことが見い出された。マウスに実施した試験 を通して、この化合物の腫瘍抑制量は、１００μ？Δ１体重よシも少ないという ことが証明された。ハンガリー特許出！！第７８７８４号に記載されている我々 の特殊診断方法によれば、腫瘍性状態から相当な再生が起ったということが臨床 実験の第１段階で確立され友。

前述の希釈においては、この発明の化合物は、非毒性であシ、動物実験における ＬＤ５ｏは、１５〜／ｋｔｐｏ、であシ、腫瘍に投与した場合、１７■、／　ｋ ｙである。組織培養における毒性は約５　Ｘ　１０’希釈である。

我々の生物学的実験は、この発明の組成物が抗腫瘍効果をもっているということ を示した。従って、これらの組成物は、腫瘍性疾患の治療に、並びに腫瘍性細胞 及び組織を再生するのに有益である。これらの医薬組成物は、治療において、そ れら自体で有用であるだけでなく、他の技法（外科手術のような）を完結するの にも用いられ得る。さらに、それらは他の治療の状態を完結し又は用意すること ができる。

！（ 説明部分に記載しているような一般的製造ルートに従って、次の化合物は調製さ れそして質量スペクトル分析法及びｍスペクトル分析法によって同定された（下 記の式において、リノールイル基を互によってラベルしそしてオレイルを９によ ってラベルする。） Ｃ、、Ｈ，１−Ｃｏ−Ｎ昧Ｈ２−ＣＨ２−Ｎ軒５ＣＯ−Ｃ１７Ｈ５ｓ　Ｍ”、ｉ 謔６７２Ｌ　Ｏ Ｃ，、Ｈ，−Ｃｏ−ＮＨ（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ＋３Ｃｏ−Ｃ１，Ｈ３３Ｍ　 、ｍ／Ｚ−６７４Ｃ、、Ｈ３，−Ｃｏ−ＮＨなＨ２−ＣＨ２−ＮＨ＋５ＨＭ＋： ｒｒｖ’ｚ−４０８Ｃ，７Ｈ５５−Ｃｏ　−Ｎ眸Ｈ２−ＣＨ２−ＮＨ＋３ＨＭ＋ ：　ｒｒＬ／’Ｚ−４１ＯＮＭＲ（’Ｈ，”Ｃ及び１５Ｎ）スペクトル分析は上 記構造を確認した。

上記化合物、並びにそれらの混合物（次のものにおいて：　ＣＤＭ　）　ｔ”、 次の生物学的配列において試験した： 次の問題を解くためにイン−ビトロ試験を実施したニ ーｉ性の形質転換イン−ビトロによる又はよらない細胞増殖に対するＣＤＭの効 果は何であるか。

まず、対数期（対数増殖期：実験タイプＡ）における細胞系について、その後、 平坦期（はとんど細胞増殖がない：実験タイプＢ）における細胞系について検討 を行なった； 一生物学的に有効な希釈範囲の決定。

投与量は濃度でなく希釈ユニットで表わされた；−ＣＤＭのイン−ビトロ細胞毒 性及びこの効果の可逆性の検討。

次の材料及び方法がこれらの実験に適用された：細胞系 正常な組織器官の細胞系：滑液起源のＭｅＣｏｙのヒト単層細胞系。

ＢＨＫ−Ｂ及びＢＨＫ−Ｔ　ｕｂ　ｉ　ｎ　ｇ　ｓ　ｎ種における新生ハムスタ ーの腎臓起源のＭｃＣｏｙのヒト単層細胞系。

成熟したハムスターの腎臓起源の）［ＡＫ単層細胞系。

ヒト胎児の肺起源のＭＲＣ−５単層細胞系。

腫瘍起源の細胞系＝７０〜８０ｓの類上皮タイプ細胞を含むヒト気管支筋起源の ＩＬＣ単層細胞系（またマウスにおけるインービゴで維持できる）。

ヒト頚部癌起源の細胞系のクローン、ＨｅＬａ−８３゜懸濁状に増殖する赤血琢 性白血病起源の細胞系、に５６２゜マウス骨髄性白血病起源の懸濁性クローン、 ＳＦ３゜マクスリン・を性白血病起源の懸濁性クローン、　Ｐ　−３８８゜マウ スリンパ性白血病起源の細胞系、Ｌ　−１２１０（それは腹水形でも保持でき− る）。

培養条件 １０％子牛脂児血清（Ｆｅ２　、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔ ｄ、）を含む最小必須培地（ＭＥＭ　）に細胞系を保持した。

細菌の感染を避けるために５０μｆｆ／ｆｎｌのゲンタマイシンを添加した。２ ５ｃＩｒ？のファルコンプラスチック細胞培養容器（ＮＵＮＣ、Ｇｒｅｉｎｅｒ 又はＣｏ５ｔａｒ　）中に１０ｍ１の体積でその培養を保持した。

単層培養物を、０．０５係のトリジンの添加と共に移し、一方懸濁培養物は、希 釈した。ＣＤＭ細胞培養物の実験のために２　ｃｍ”の２４個のウェルを含む複 数プレートを、１　ｍｌ培地／ウェルを添加して用いた。

５％の二酸化炭素を含む雰囲気で、３７℃で７２時間、この培養物を増殖せしめ た。相対湿度は７５〜８０係に維持した。対数期の細胞培養を、平坦期にありそ して接触抑制を示す培養物の１０倍の希釈によって達成した。単層培養物におい て、接触抑制の状態は、細胞コンフルエンスの微視的な出現の後の日に生じると 考えられた。これらの培養物をＢ−タイプ実験に用いた。

ＣＤＭの希釈 貯蔵溶液の千倍の希釈から始めて、ＣＤＭ　ｔ−ＭＥＭ（血清を含まない）中に 希釈した。渦ミキサーを用いて連続的に激しく混合することによって乳濁液の適 当に細かい分散度を達成した。培養物に添加する前に、与えられた希釈を注意し て再均質化した。

細胞の計数を、１１１＋ｒｋｅｒのホモサイトメーターによシ実施し、又はまた 細胞螢光法的測定を実施した場合、サイトフルオレグラフ（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ｏｇｒａｐｈ　）の値が、自動的に受け入れられた。

フロー−ミクロフルオロメトリック測定トリノシン処理の後、細胞を遠心分離し 、そして５０μ？のヨウ化！ロピジウムを含む水冷却の等張クエン酸三す）　Ｉ Ｊウム中で３０分間、染色した。４８８ｎｍのアルゴンイオンガスレーザーの助 けによシサイトフルオレグラフ（バイオフィジカル会社）を用いて測定を実施し た。ヨウ化−プロビジツム−ＤＮＡ複合体の螢光性を６００　ｎｍより上で検出 した。

内蔵電子示差識別器により、”二倍体”よシも少ないＤＮＡ含有量を有する細胞 測定のづいぶん前に死滅している可能性が非常に高いのでこれらの細胞を廃棄し た。

生存性の決定 トリプトシン処理の後、０．０５％（ｗ／ｖ　’）のトリ・母ンーブルー染剤を 含むＭＥＭ培地中に細胞を懸濁した。５分後、生きている（トリ・ぐンープルを 排除する）細胞及び死んだ細胞（青色になりている）の数を、光学顕微鏡によっ て測定した。

可逆性の決定 細胞培養物をＣＤＭによ＃）２４時間処理した。この時、並行サンプの半分を分 析し、一方の残りのサンプルを、ＣＤＭ不含の新鮮な培地中に再培養した。２４ 時間後、再培養を停止しそしてその細胞を分析のために取り出した。

まず、ＣＤＭを、対数期の細胞培養物に対して検討した。さらに研究のために最 適投与量範囲を、ＳＰ２細胞細胞対して選択し、ここでＣＤＭ　ｔ、広い濃度範 囲で適用した。

これらの経験を基礎として、さらにその上の研究において、５Ｘ１０’〜１０７ 倍の希釈範囲が用いられた。

増殖曲線の変法に従りて、この試験方法を次のようにして分類することができる ニ ー２４時間目までに培養物の細胞を殺したＣＤＭの５Ｘ１０　倍の希釈（Ｋ　− ｓ　６２　、　ｙｔＲｃ−５、ＢＨＫ−Ｂ　。

ＭｃＣｏｙ　、　ＨＡＫ　、　５Ｐ２）　；−実験の４８時間目までに培養物の 細胞を殺したＣＤＭの５×１０　倍の希釈（Ｐ　−３８８、Ｌ　−１２１０゜Ｂ ＨＫ　−Ｔｕｂ　）　ニ ー検討した希釈範囲で検出可能な毒性効果無しくＩ（ｅＬａ、ＬＬＣ）　−６る ＣＤＭの濃度さえもが対数期にある２つの後者の細胞系の増殖を刺激した。

接触抑制期にある培養物に対するＣＤＭの効果を２つの系列において検討した。

　ＣＤＭの効果が１０５倍以上の希釈においては、可逆的であシ、一方、１０　 倍以下の希釈では不可逆的であるようであることが、見出された。７時間培養の 後に記録された増殖反応曲線の一部は、連続的変化を示しく　ＢＨＫ−Ｂ　、　 ＢＨＫ−Ｔｕｂ、、　ＨＡＫ、Ｌ−１２１０）−一方、他は局部的な最小点を持 った（　Ｓ　Ｐ　−２ａ　ＭｃＣｏｙ　＃　ＬＬＣ、ＨｅＬａ　、　ＭＲＣ−５ ｊＰ−３８８）、局部的最小点のほとんどは、１０〜１０６倍の希釈の範囲内に あった。

５×１０〜１０　の希釈範囲で、４つの細胞系（ＬＬＣｒ　ＭｃＣｏｙ　＊　Ｈ ｅＬａ　、　ＢＨＫ−Ｔ’＋ｉｂ）に対して、生存性の研究を実施した。１０倍 又はよシ低い希釈において、ＣＤＭは１００％毒性をもたらした。イン−ビトロ のＬＤ５ｏ値は、１０’及び５　Ｘ　１０’倍の希釈の間に下がった。

その他の試験において、白血病ビールス生産性ＱＬ形質転換細胞系（Ｎａｇｙ、 に、：Ｃｈａｓｔｅｒ　ＢｅａｔｊｙＳｅｍｉｎａｒｓ＋　ロンドン、１９８３ ）７５ｆ、ＣＤＭのイン−ビトロの効果を研究するために選ばれた。

材料のアルカリ性質のため、ＣＤＭは、直接的ＫＦｉ適用されないが、しかしま ずジメチルサルフォキシド（ＤＭＳＯ，Ｒｅａｎａｌ　）中に希釈しそしてさら にその希釈が用いられた。

細胞培養 形質転換されたウズラの線維芽細胞の細胞系（ＱＬ）は増殖した腫瘍形成性のＭ 　Ｃ２９／Ｉ、ビールス亜系を絶え間なく産生ずる。

細胞を、Ｆａｌｃｏｎ　−Ｗプラスチック培養フラスコ中に保持しそして増殖せ しめた。１０％のトリプトーズーリン酸、５％の子牛胎児血清及び１％ニワ）　 ＩＪ血清によシ完全にされたＰａｒｋｅｒ　１９９組織培養培地を用いた。空気 中に５％の二酸化炭素を含む雰囲気中で、３７℃で細胞培養物を培養した。細胞 培養物は、普通１日おきにトリグシン処理によって移された。

細胞の計数 細胞培養物をトリグシン処理によって分散せしめ、そしてその細胞の総数をラボ −スカル（Ｌａｂｏｒｓｃａｌ）（Ｌａｂｏｒ　ＭＩＭ）電子細胞カウンター又 は少数の場合ではあるが、通常のＢｕｅｒｋｅｒ方法を用いて測定した。

生存性 細胞計数を、生きている細胞の比率に従って補正した。これを、）すｚ＃ンプル ー排除技法を用いて決定した。

００Ｍ処理の後、培養物’（１０’の細胞容器）に５０μＣｔ（０，２ｍ１）の 放射性３Ｈ−テミヂンヌクレオシド（チミヂン−６−３Ｈ、ケミポール、チェコ スロバキア）を添加することによｆｉ　ＤＮＡ合成速度を測定した。

選定された間隔で、細胞懸濁液を培養培地によシ洗浄しそして遠心分離（２００ ０ｒｐｍ　、　５分。

４℃）の後細胞を５チ氷冷却トリクロロ酢酸５　ｍｌで凝集せしめそしてミリポ ア濾紙上に集めた。このサンプルの放射能をパラカードトリカード（Ｐａｅｋａ ｒｄＴｒｉｃａｒｄ　）シンチレーション計数計を用いて測定した。

逆転写酵素（ＲＴ）検定 ＱＬ細胞の培養培地におけるＭ　Ｃ２９／Ｌビールスの存在及び力価を、ＲＮＡ 腫瘍ビールスに対してだけ特異的なＲＴ酵素活性によって決定した。まず、培養 培地を、遠心分離（１０００１，３０分、、＋４℃）により細胞残骸を除いて透 明にし、次にビールス画分を、超遠心分離（１０００００ｇ、９０分、、＋４℃ ）：（ＭＳＥ　６５スーツや一スピード、　Ｕ、に、）によって濃縮した。

沈殿物を、次の緩衝溶液：０．ＯＩＭのＴ’ｒｉｓ−塩酸（ｐＦ（７，５）、０ ．１　Ｍ　ノ塩化ナトリウム及びｏ、ｏｏＩＭのＥＤＴＡ中に再懸濁した。Ａｃ ｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉｏｇｙ（１９７８）２５，１４２に最初に記載されて いるようにしてこの反応を実施した。要約すれば：　ＴＫＤ緩衝液＋　ＭｎＣＬ ２Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びチミデンートリホスフェートを含む反応混合物を ビールスの存在中でポリ（ｒＡ　）（ｄＴ　）１２鋳型−プライマリイと共にイ ンキ−ベートした。この合成されたＤＮＡを、ＴＣＡによ！＋Ｆ紙ディスク上に 沈殿させ、それらの活性をシンチレーションカウンターによって測定した。

兄虜」ヒ艷邑 正常な、形質転換され、そして００Ｍ処理された細胞において細胞の骨格（細胞 骨格）を作り上げる活性線維の状態又は変化を、間接的免疫螢光法によっテ研究 した。細胞を、薄くて丸いカバーガラス上で増殖せしめ、そして抗アクチンウサ ギ血清と共に３７℃で４０分間インキュベートした。十分に洗浄した後、第２抗 体（フルオレセイン又はローダミン接合抗−ウサギャギ血清のいづれかによる） と共にインキュベートを続けた。第２抗体接合の後、サンプルを螢光顕微鏡によ シ紫外線中において検査した。

毒性の実験 １０’＃胞を含む２日経過のＱＬ線維芽細胞培養を、ＤＭＳＯ中に希釈した種々 の濃度のＣＤＭにより処理した。

この希釈した材料を、１ｍ１体積で容器に添加した。

４８時間後、細胞を数えそして生存性を測定した。

１０３ｅ　１０’　ａ及び１０５倍の希釈のＣＤＭは、高い毒性があり、なぜな らばそれらの溶液が生きているＱＬ細胞の数及び生存性を顎当減少させるからで あるということを、毒性実験が示した。有意ではな込けれども、１０６倍の希釈 さえも、細胞数の減少をもたらした。１０　又はより高い希釈においては、細胞 数又は生存性の減少は事実存在しないのでこれらの希釈は、ＱＬ細胞のためには 非毒性として考えることが急速に増殖している形質転換ＱＬ細胞の速度に基づい てＣＤＭの効果を研究した。未処理細胞は、２日目ごとに、それらの細胞数を２ 倍にした。

細胞増殖は、ＣＤＭの種々の濃度によってひじょうに影響を受けた。

１０７倍の希釈は、増殖の性質を変えづ、しかしながら対照と比較して同じ細胞 数を産生ずるのによシ長い時間を必要とした。１０　倍の希釈の効果は興銀ある 。細胞分裂は、ゆっ〈シ始まるが、その強さは、６日目まで一定であった。この 時から分裂の速度は上昇しそして８日目に、それは、前の希釈の値に近づいた。

１０　倍の希釈の効果は正反対であった。まずゆつくシした増殖が始まるがそれ は４日目で止まシそしてこの日から細胞数は、しだい忙減少した。

１０４倍希釈は、処理の２日目ですでにこの効果をも増殖性処理及び未処理細胞 中に、放射性ヌクレオシドーチミデンを取シ込むことによって、　ＤＮＡ合成の 強度を測定した。日増しに増加する取シ込みが、未処理細胞において見られた。

増加速度は、第５゜６日で、減少した。１０　倍希釈でチミデン合併の増加及び 減少の変動度が観察されたが、それにもかかわらずそれは、なお全体的にゆりく シとした増加を示した。１０　倍希釈は、ＱＬ細胞のＤＮＡ合成強度をおだやか に低下せしめ、一方１０　倍の希釈は、ひじょうに大きな低下を引き起こした。

逆転写酵素分析 ＤＮＡ合成及び細胞増殖の強度に対するＣＤＭの効果の研究に加えて、ＱＬ細胞 によって生成される腫瘍ビールスの増殖に対するこの化合物の影響を研究するこ とを希望した。指示された日に、サンダルを培養培地から取シそして腫瘍ビール スに特異的な逆転写酵素の酵素活性を決定した。１０’倍希釈のＣＤＭは未処理 細胞と比較して、ビールス濃度に比例する酵素活性を減少させるが、しかし、そ の値は、時間の関数として、増加傾向を示した。

１０　倍の希釈では、いくらかの初期増加はありたがしかしそれは６日目（第３ 回目の測定）に衰えそして測定値はひじよう忙減少したビールス濃度を示した。

ｌＯ倍の希釈は、６日目にビールスの増殖を完全に抑制し、そして８日目には酵 素活性が見られ上位細胞（５ｕｐｅｒｉｏｒ　ｃｅｌｌ　）の骨格は、細胞体質 （ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ　）である。これは細胞質におけるタンノンク質線 維の複雑な網状構造である。主成分は、アクチン線維である。それらの存在及び 変化を、正常のビールス形質転換された及びＣＤＭ処理された線維芽細胞におい て検討した。

正常な線維芽細胞において、それらは強く、組織化した束を形成し、これらのア クチン束を細胞質すべてにわたって観察することができる。オンコーナ（ｏｎｃ ｏｒｎａ　）ビールスによシ形質転換された細胞は、全く異なった形態的外観を 示す。これらの細胞においてアクチン線維は、線維芽的になシ、それらは結に位 置し、そして細胞質のすべての部分中に存在するか又は存在しないかである。

ＣＤＭ処理の後細胞は再び異なった形態的外観を持ちそして派生物を持った。先 に破壊された沈殿アクチン粒子は、線維に組織化されたが、線維の方向性はまだ 正常な細胞中に見つけられるほど表われなかった。よシ完全な実証のために、細 胞骨格のアクチン張厚線維を、フルオレセインの代わシにローダミンにより染色 し、そして基本的に類似のプロセスが証明された。

ＣＤＭの薬理効果を、Ｎａｍｅ　ｔｈ−Ｋｅ　ｌ　１　ｎｅ　ｒ　リンパ腫（Ｎ ＫＬ　）の１０倍希釈系を、接種されたスイス白マウスに対して試験した。マウ スのグループに、実験の始めにＮＫＬ及び同時にＣ０Ｍ材料の希釈物を接種した 。次にこの動物を、５つの追加出来事のために実験中にＣＤＭによシ処理した。

対照のために仕える動物は、始めに、ＮＫＬ材料の希釈を注射された。これらの 動物は、別な方法では、処理されなかった。

ＣＤＭ処理動物及び対照動物の平均体重を、実験中６回比較した。１６６日目Ｃ ＤＭ処理の動物の平均体重は、対照の体重よシも８〜２７％少なかりた。

１８８日目動物を殺しそして解剖した。希釈されていないＮＫＬ　（５千万の細 胞／動物）により接種されたマウスの場合、ＣＤＭは、腫瘍形成を抑制しなかっ た。５Ｘ１０，５Ｘ１０　及び５　Ｘ　１０’　又はよシ少ない細胞を、それぞ れ接種されたグループに対して、ＣＤＭは、２０チ、８０チ及び１００％の保護 をそれぞれに与えた。

国　ｗＡ　調　審　餌　牛 、１６１．１ａｒｈ−１１１．．．　ＰＣＴ／Ｈυ　８ａ１０００６２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．次の一般式〔Ｉ〕： ▲数式、化学式、表等があります▼〔Ｉ〕〔ここで、 Ｒは、１つ又は複数の不飽和を含むことができる長い脂肪族炭化水素基であり、 Ｒ１は、水素又は１つ又は複数の不飽和を含むことができる長い脂肪族アシル基 であり、 Ｘは、酸素でありそしてＹは水素であり、又は一緒の場合、Ｘ及びＹは、次の式 の基、 ＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、 ｚは１〜５であり、そして ｑは１〜４である〕の１つ又は複数の化合物を活性成分として含んで成る医薬組 成物。
2. ２．ＲがＣ１６〜Ｃ１８飽和又は不飽和の炭化水素基であり、Ｒ１が水素又はＣ １７〜Ｃ１９飽和又は不飽和の脂肪族アシルであり、ｚが１〜４でありそしてｑ が２である請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．Ｒが、ステアリン酸、オレイン酸又はリノール酸の脂肪族炭化水素基であり そしてＲ１が水素又はステアリル、オレイル又はリノレイル基である請求の範囲 第２項に記載の組成物。
4. ４．前記活性成分が一段式〔Ｉ〕の化合物の混合物である請求の範囲第１項〜第 ３項のいづれか１項に記載の組成物。
5. ５．抗腫瘍の医薬組成物の製造方法であって、請求の範囲第１項の一般式〔Ｉ〕 の化合物の１つ又は複数が、少なくとも１つの生理学的に許容できる担体と混合 することを特徴とする方法。
6. ６．次の一段式〔Ｉ〕、式中、Ｒはオレイン酸又はリノール酸の炭化水素基であ り、Ｒｌは水素、オレイル又はリノレイルであり、ｚは１〜４でありそしてｑは ２であり、Ｘは酸素でありそしてＹは水素であり又は一緒に取られる場合、Ｘ及 びＹは、式、＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２一の基を形成する化合物の少なくとも２つの 混合物が、少なくとも１つの生理学的に許容できる担体と混合することを特徴と する請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．腫瘍性疾患の治療において及び腫瘍性細胞及び組識の再生のために特許請求 の範囲第１項に記載の式〔Ｉ〕の化合物の使用。