JPS6135356A - 血液脂質脂肪酸の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床検査において血液脂質中の生理的に重要
な脂肪酸をガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣと記す
）により短時間に分析する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、血液脂質中の高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡ
と記す）と血栓、動脈硬化などの疾患との関係が明らか
にされ、生体試料についてのＰＵＦＡ分析が重要な問題
となってきた。ＰＵＦＡは、例えばエイコサトリエン酸
ではω−９、ω−６、ω−３のように、位置異性体が複
数存在する例がある。従って不飽和度の異なる他のＰＵ
ＦＡとのオーバーラツプ問題がある従来の充填カラム法
ＧＣや高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと
記す）では、精度および測定時間の長さの点で多数処理
が難しい。

〔発明が解決しようとする問題点〕

血液脂質中の脂肪酸の分析方法ｉ、従来充填カラムＧＣ
法、キャピラリーカラムＧＣ法、ＨＰＬＣ法が主な方法
であった。ＨＰＬＣ法は従来よく知られた方法であるが
〔島津科学器械ニュースＶｏ１．２４．　Ｎｏ、　３．
　Ｐ、９〜１３）、カルボン酸のＨＰＬＣ分析は感度の
点で十分でなかったため、高感度分析を目指したカルボ
ン酸分析用蛍光試薬、例えば９−アンスリルジアゾメタ
ンなどが開発されている。しかしながら、ＨＰＬＣ法は
蛍光試薬での誘導化、ＰＵＦＡ同士のクロマトグラム上
の重複、測定時間の長さなどから多数検体の処理には不
向である。

充填カラムＧＣ法においても、カラムの液相選択、測定
時間の長さなどを充分に検討すればＰＵＦＡの測定が可
能であるが、非常に長い測定時間を要し、昇温法により
ある程度短縮できるが、あまり短時間では分離能が著し
く低下する。

キャピラリーカラムＧＣ法によるＰＵＦＡの測定は多く
の報告があり（Ｊａｅｇｅｒ、■、、　Ｋｌｏｚ、　ｎ
、ＩＢｌｏｓ、　Ｇ、、　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄｓ　Ｒｅｓ
、、　１７．１８５（１９７６）、　Ｈ。

Ｈｅｃｋｅｒｓ、、　Ｆ、　Ｌ　Ｍｅｌｃｈｅｒ、　Ｕ
、　５ｃｈｌｏｅｄｅｒ、　Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、　１３６．３１１（１９７７）、
小沢昭夫ら９分析化学、丑、　１７４（１９８３）、其
、　８７（１９８２））、これらの方法は非常に優れた
分離能で、各ＰＵＦＡが完全分離され、一部では絶対値
の定量も行っており、４０分以上の測定では満足なデー
ターが得られている。しかしながらこの方法も分析に長
時間を要するため、多数検体処理には不向である。

最近、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析計）の
目覚しい進歩により、血液脂質中の脂肪酸、特にＰＵＦ
Ａを定量する試みがなされているが（Ｍ、　５ｕｚｕｋ
ｉ、　Ｍ、　ＮｉＮ１５ｈｉｚａ、　Ｔ、　Ｍｉｙａｔ
ａｋｅ、　Ｙ。

Ｋａｇａｗａ）　、このＧＣ−ＭＳ法では血液脂質中の
ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペン
タエン酸（ＥＰＡ）がｎｇ単位で検出できるが、絶対値
を定量するために各被検液に一定量添加する内部標準物
質としての８重水素化エイコサＡ− テトラエン酸の合成には非常に限定された環境と高度の
技術を要する。またマスフラグメントグラムにおいてＥ
ＰＡの保持時間が８分程度であり、ドコサヘキサエン酸
（ＤＨＡ）の流出にはさらに同程度の保持時間を有する
ので、測定時間として約２０分必要である。これらの点
から従来の測定時間のある程度の短縮は可能であるが、
特別な内部標準物質を用意しなくてはならないため、一
般的に応用することは難しい。

次にカラム長さ１０ｍ程度の短毛細管カラムを利用し、
飽和酸、モノエン酸、リルン酸などの脂肪酸を５分以内
で測定する方法が提案されているが（Ｒ，Ｐ、　Ｄ’Ａ
ｌｏｎｚｏ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｋｏｚａｒｅｋ、　Ｈ，Ｌ
Ｖｈａｒｔｏｎ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｉｌ　Ｃｈａｍ、
　Ｓｏｃ、、　５８．２１５（１９８１）、高木撤・板
橋豊、創立３０周年記念　油化学討論会・油化学研究発
表会　講演要旨集　９５　（１９８２））、これらの方
法では血液中で生体において重要な役割をはたすＰＵＦ
Ａの定性性や定量性について全く検討されていない。ま
た絶対値定量用の内部標準物質についても不明である。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明は上記の問題点を解決するためのもので、特定
のカラムに特定の液相をコーティングすることにより、
血液脂質中の微量脂肪酸を短時間で再現性よ＜ＧＣによ
り定性および定量分析することができる血液脂質中の微
量脂肪酸の分析方法を提案する。

本発明は、血液脂質中の微量脂肪酸をガスクロマトグラ
フィーにより定量する際に、マックレイノルズコンスタ
ントΣ、＝２２００〜２８００のガスクロマトグラフィ
ー用カラム液相をコーティングした直径０．３ｍｍ以下
で長さ１０ｍ以下のカラムを使用することを特徴とする
血液脂質脂肪酸の分析方法である。

血液脂質脂肪酸を分析するには、採取した血液を血漿、
血小板、赤血球ゴーストに分画し、それらの脂質を、リ
ン脂質、トリアジルグリセロール、コレステロールエス
テル、遊離脂肪酸に単離して各脂肪酸を分析する。さら
にリン脂質に関してはホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ｐｓ）、ホスファチ
ジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルコリン（ｐ
ｃ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、リゾＰＣ、カルシ
オリピン等に分画して各脂肪酸を分析することができる
。

次に被検液中の成分を分析するに当り、血液内に痕跡程
度しか存在しない脂肪酸、または被検液中に存在する脂
肪酸とクロマトグラム上で重複しない易揮発性の化学的
に安定な有機物を内部標準体として既知重量を添加する
。このような内部標準物質としては、トリコサン酸、ジ
オクチルフタレート、アジピン酸ジオクチル、マーガリ
ン酸等が使用できる。

上記の組成物をメチルエステル化剤にて脂肪酸はメチル
化し、炭化水素系溶剤で有機物の全量を抽出してＧＣ用
の試料とする。

ＧＣとしては、マックレイノルズコンスタント（液相選
択指数）Σ１＝２２００〜２８００のＧＣ用カラム液相
をコーティングした、直径０．３ｍｍ以下、長さ１０ｍ
以下のカラムを装着したものを使用し、これにインチグ
レーターを接続した装置を使用して分析を行う。カラム
の直径は理論的にはいくら細くてもよいが、一般的には
下限は０．０１關、好ましくは０．１ｍｍ程度である。

またカラムの長さも理論的にはいくら短くてもよいが、
一般的には下限は１ｍ、好ましくは５ｍである。

このようなカラムの内面に上記カラム液相をコーティン
グする。使用可能なカラム液相としては、２−ニトロテ
レフタル酸が結合したポリエチレングリコール、１，４
−ブタンジオールサクシネート、エチレングリコールア
ジペート、ポリエチレングリコール等があげられる。

ＧＣによる分析は一般のキャピラリーカラムＧＣと同様
に行い、キャリヤーガスにより前記試料をカラム内に展
開させる。キャリヤーガスの流速は従来法の４０〜８０
ｍＱ／ｍｉｎよりも速い速度とし、一般的には１５０−
２５０＋ｕｌ／ｍｉｎで、５分以内に分析を終る。

こうして得られたクロマトグラムより、内部標準物質と
リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸
、アラキドン酸、エイコサペンタＱ　　− エン酸、ドコサヘキサエン酸とのメチルエステル化物に
おける相対感度を測定し、その保持時間から定性分析を
行う。また内部標準物質の一定量に対して各酸の量を変
化させ４重量比と面積比の相関性測定し定量分析を行う
。

上記の分析により、各種のＰＵＦＡを５分以内に重複せ
ずに流出させることができ、絶対値測定に用いる内部標
準体とも重複しない。また保持時間１面積％ともに再現
性がよく、このため各脂肪酸を迅速に再現性よく定性分
析および定量分析することができる。こうして本発明で
は各分画脂質に内部標準体を添加するのみで、高感度で
迅速に脂肪酸の分析を行うことができ、短時間で大量の
検体を処理することができる。

従来法と本発明法の分析時間を比較すると、例えば、対
象者と投与者を各１０個選定し、６ケ月にわたり２０日
に一度採血して、血液を各部位に分画し、それらの脂質
成分を別々に抽出すると、２群×１０人×９回×３部位
×４脂質＝２１６０検体となる。従来法の平均分析時間
を４０分とす−〇　− ると、上記検体数の実測時間は１４４０時間であるが、
本発明法によれば、１８０時間となり、約１７８に短縮
される。

〔発明の効果〕

本発明によれば、特定のＧＣカラム液相をコーティング
した特定の大きさのカラムを使用してＧＣにより分析を
行うようにしたので、血液脂質中の微量脂肪酸を迅速、
高精度かつ再現性よく定性および定量分析することがで
き、これにより臨床検査において、大量の検体を短時間
に処理することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。

本実施例において測定対象としたＰＵＦＡの標準試料は
次のようにして準備した。リノール酸およびＤＨＡは日
本油脂株式会社製の市販品、アラキドン酸およびジホモ
−γ−リノレン酸は５ｅｒｄａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ製、ＥＰＡはマ
イワシ油脂肪酸から銀硅酸カラム法で単離したもの、ト
リコサン酸はシグマ社製のものを使用した。

血液からの脂質抽出に関して、検体の採取は２週間服薬
既往のない対象者を一夜絶食にした後の早朝空腹時に行
った。採血には血沈用３．８％クエン酸ナトリウム液を
あらかじめ注射器に吸引したものを用いた。採取した血
液からの血漿および血小板の分離は安永らの方法（安永
幸二部、日本臨＃　３７巻・夏季増刊号）に従った。脂
質の抽出はクロロホルム−メタノール系溶媒を用いるホ
ルヒ法で行った。赤血球膜からの脂質抽出は只野の方法
（只野寿太部、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　８゜１２０３、１９８０　　臨時増刊）に従った。

得られた脂質を各脂質成分に分画したり、分画したリン
脂質をさらに各リン脂質成分に分画する時は、プレコー
テッドプレートを用いたＴＬＣで展開した。各分画脂質
は、硫酸−ベンゼン−メタノール系でメチルエステル化
物とした。内部標準物質と各ＰＵＦＡの流出挙動は上記
方法でメチルエステル化したもので測定した。

分析に使用したＧＣは次の通りである。

使用力ラム：マックレイノルズコンスタントΣ７＝２３
１８の５％の２−二トロチレフタル酸が結合したポリエ
チレングリコール（カーボワックス２０Ｍ、液相名ＦＦ
ＡＰ）を超高純度石英カラム（内径０．２０ｍｍ、長さ
１０ｍ）の内壁にコーティングしたものを用意した。

使用ガスクロマトグラフィー二島津ＧＣｅＡ型にオール
ガラススプリッターを用いて短毛細管カラムを装着し、
スプリット比は微量ニードルバルブで１対２０から１対
１００に可変して用いた。その他、ＦＩＤ検出器、イン
チグレーター等は通常測定と同じである。

実施例１ 一定容量の血漿および一定個数の血小板に、内部標準物
質（ＩＳ）としてトリコサン酸、またＰＵＦＡとしてア
ラキドン酸（ＡＡ）、ＥＰＡ、ＤＭＡの各メチルエステ
ルを一定重量ずつ添加して各ピーク面積比を比較し、Ｐ
ＵＦＡの添加回収試験を行った。内部標準物質（トリコ
サン酸）と各ＰＵＦＡとの流出挙動を求めるために得ら
れたクロマトグラムは第１図に示す通りであり、各ＰＵ
ＦＡと内部標準物質の面積（カウント数）と保持時間の
再現性については第１表に示す通り非常に良好であった
。第１表の数値は検体数１２（ｎ＝１２）から求めた。

実施例２ 内部標準物質として使用するトリコサン酸と重複する血
液脂質中の脂肪酸がないことを確認するため、血漿、血
小板、赤血球脂質にトリコサン酸を添加して測定した。

いずれの試料も重複がなかった。例として血小板の例を
第２図に示す。

実施例３ 内部標準物質、即ちトリコサン酸の一定重量に対するア
ラキドン酸（ＡＡ）、ＥＰＡ、ＤＨＡの量を変化させて
得られたピーク面積比と重量比の間に直線性の相関があ
るか確認した。特に脂質総量の少ない血小板については
一定容量中の溶媒に一定個数、例えば１０９個の血小板
全脂質を溶解し、内部標準物質と各ＰＵＦＡを段階的に
添加した試料を調整した。結果を第３図に示す。

第３図かられかるように、血漿や赤血球の脂質にアラキ
ドン酸、ＥＰＡ、ＤＭＡを添加しその回収率を０．１２
５μＣ１０，２５μ区、０．５０μｇ、１．２５μｇ、
３．１２５μｇ、６．２５μｇ、１２．５μｇ、２５μ
ｇにて検討したところ、１．２５μｇ以下では内部標準
物質の絶対値も小さく、不純物の検出も多く、再現性の
良い値を得るには試料調整が非常に困難であった。しか
しながら添加量が増加するに従い回収率も９０〜１１０
％と安定し、変動係数も８％以下であった。

実施例４ 血漿について、次の通り脂質中のＰＵＦＡを分析した。

使用血漿：検体の採取は、対象者を一夜絶食にした後の
早期空腹時に行った。血沈用３．８％クエン酸ナトリウ
ム液をあらかじめ注射器に１ｍＱを吸引し、その注射器
に１０ｍＱ　の目盛まで採取し、静かに転倒し、抗凝固
剤とよく混和した。針をはずして静かにシリコン加工し
ているプラスチック遠沈管壁を伝わらせた。採血した血
液は卓上遠心機で１５０Ｏｒｐｍで６分処理した。多血
小板血漿の上層と赤血球を含んだ下層とに分け、この上
層を別の容器にシリコン塗布コマゴメピペットで移した
。下層部分を３００Ｏｒｐｍで２０分処理し、透明な乏
血小板血漿を作製した。脂質の抽出は５０ｆｉｌＱ共栓
付試験管に上記試料とクロロホルム１０ｍｆｆ、クロロ
ホルム：メタノール（２：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）　５　ｍ
Ωを加えて充分に攪拌し、−夜装置し脂質を抽出した。

脂質抽出液を脱脂濾紙で濾過し、５０＋ｎＱ　共栓付遠
沈管にとり、０．０４％塩化カルシウム溶液４ｍＱ　　
を加え充分に攪拌した。

さらに遠心後二相に分離した透明な上層をパスツールピ
ペットを用いて除去し下層のクロロホルム層はクロロホ
ルム：メタノール：水（３：４８：４７　ｖｏｌ／ｖｏ
ｌ／ｖｏｌ）を加え３回洗浄した。脂質抽出液はロータ
リーエバポレーターで溶媒を除去しながら試験管に移し
た。採取血漿量中の脂質量に合せて、血漿脂質の正常値
は０．５〜１．５μｇ／ｍΩ、トリコサン酸を試験管に
加えた。さらにベンゼン＝Ｓ水メタノール：濃硫酸（０
，５：　５．０　：０　、２　ｖｏｌ、／ｖｏｌ／ｖｏ
ｌ）を加えて水浴上で１時間反応させた。反応後１０ｗ
Ｑ、の水を加え、さらに３ｍＡのヘキサンを加えて振っ
てから上層のヘキサン層を集めた。さらに２回同様の操
作を行った後、ヘキサン層を無水硫酸ナトリウムで脱水
し、溶媒をある程度とばして測定用試料とした。

測定結果：血漿脂質中の各ＰＵＦＡ濃度はアラキドン酸
１３０〜１５０／ｌＺｇ／＋ｎＱ、ＥＰＡ５０−６０μ
ｇ／ｍＮ−ＤＨＡ７０〜８０ｚｚｇ／ｍＱ、ジホモ−γ
−リノレン酸１０〜４０μｇ／ｍＡ、リノール酸４００
〜８００μｇ／ｒｎＱであったが、個人差、性別、食習
慣によりかなり差があった。

以上の結果より、本発明によれば、血液脂質中のＰＵＦ
Ａが迅速定量できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ実施例１および２におい
て得られたクロマトグラム、第３図は実施例３の結果を
示すグラフである。 代理人　弁理士　柳　原　　　成 第１図 イ呆狩吟開（分） 第２図 做秤呼開（介） 第３図 ｔｔＪ乙　　Ｊ、ＰＵＦ％仰標平物質 手続補正書 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１５６９８３号 ２、発明の名称 血液脂質脂肪酸の分析方法 ３、補正をする者 代表者小川照次 ６、補正により増加する発明の数　　０７、補正の対象
　　明細書の発明の詳細な説明の欄８、補正の内容

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液脂質中の微量脂肪酸をガスクロマトグラフィ
   ーにより定量する際に、マックレイノルズコンスタント
   Σ＾５＿１＝２２００〜２８００のガスクロマトグラフ
   ィー用カラム液相をコーティングした直径０．３ｍｍ以
   下で長さ１０ｍ以下のカラムを使用することを特徴とす
   る血液脂質脂肪酸の分析方法。
2. （２）脂肪酸がリノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−
   γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸
   、ドコサヘキサエン酸である特許請求の範囲第１項記載
   の分析方法。
3. （３）分析用の試料が被検液中に存在する脂肪酸とクロ
   マトグラム上で重複しない易揮発性の化学的に安定な有
   機物を内部標準体として既知重量添加したものである特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の分析方法。
4. （４）分析用の試料がメチルエステル化剤にて脂肪酸は
   メチル化し、炭化水素系溶剤で有機物の全量を抽出した
   ものである特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれ
   かに記載の分析方法。