JPS61234784A - デオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送する方法 - Google Patents
デオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送する方法Info
- Publication number
- JPS61234784A JPS61234784A JP61006630A JP663086A JPS61234784A JP S61234784 A JPS61234784 A JP S61234784A JP 61006630 A JP61006630 A JP 61006630A JP 663086 A JP663086 A JP 663086A JP S61234784 A JPS61234784 A JP S61234784A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- bacterial
- deoxyribonucleic acid
- nrrl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 226
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 110
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 45
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 37
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 31
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 18
- 101100112724 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) ccsB gene Proteins 0.000 claims description 16
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 101100300704 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) queF gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N tetralin Chemical compound C1=CC=C2CCCCC2=C1 CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 14
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 14
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 14
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 14
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 10
- 101100407030 Arabidopsis thaliana PAO2 gene Proteins 0.000 description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 8
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241001464937 Neisseria perflava Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101100362469 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) rpsM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025342 Voltage-dependent N-type calcium channel subunit alpha-1B Human genes 0.000 description 1
- 101710088658 Voltage-dependent N-type calcium channel subunit alpha-1B Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- ZAIULUYKQLVQFH-UHFFFAOYSA-N n'-(2-aminophenyl)-n-phenylheptanediamide Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)CCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 ZAIULUYKQLVQFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、広め細菌宿主域を有する新しい小プラスミ
ド・リング（ｐｌａｓｍｉｄ ｒｉｎｇｓ）、およびデ
オキリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送す
る方法に関する。
ド・リング（ｐｌａｓｍｉｄ ｒｉｎｇｓ）、およびデ
オキリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送す
る方法に関する。
種々の化学薬品を創造するためにプラスミド組換え体の
遺伝的操作を含む先行技術の商業ベースによる研究は、
これまで宿主生物として大腸菌に集中してきた。その理
由は、その組換え体プラスミドが仲の宿主生物と和合で
きないためである。
遺伝的操作を含む先行技術の商業ベースによる研究は、
これまで宿主生物として大腸菌に集中してきた。その理
由は、その組換え体プラスミドが仲の宿主生物と和合で
きないためである。
しかしながら、大腸菌は、哺乳動物の腸道内におけるそ
の成長能と疾患をもたらすために、これらの目的に最適
の生物ではない。大腸菌の外に、広い細菌宿主域を有す
るプラスミドをもった宿主細菌を使用できることが極め
て７ましい。本発明は、特に哺乳動物の体温において生
存できない生物（細菌）の使用に関する。
の成長能と疾患をもたらすために、これらの目的に最適
の生物ではない。大腸菌の外に、広い細菌宿主域を有す
るプラスミドをもった宿主細菌を使用できることが極め
て７ましい。本発明は、特に哺乳動物の体温において生
存できない生物（細菌）の使用に関する。
以下は本発明に関して用いた語義である。
「細菌接合」とは、少なくとも２つの細菌宿主間の交配
と遺伝的伝達を意味し、その供与菌は「雄」、そして受
容菌は「雌」と呼ばれる。
と遺伝的伝達を意味し、その供与菌は「雄」、そして受
容菌は「雌」と呼ばれる。
「プラスミド集合体（又は集塊）」とは、２つのプラス
ミド・リング間の会合を意味する、こｑ場合、各プラス
ミドはその環状体としての構造を保ち、各環状体は各組
換え体の遺伝的操作のできるものである。
ミド・リング間の会合を意味する、こｑ場合、各プラス
ミドはその環状体としての構造を保ち、各環状体は各組
換え体の遺伝的操作のできるものである。
「輸送」とは、ＤＮＡが１つの細菌から別の細菌へ転移
されるプロセスに意味する。
されるプロセスに意味する。
「形質導入」とは、ＤＮＡプラスミドまたは断片が細菌
ウィルスによってインビボでの自然のプロセスで１つの
細菌から別の細菌へ移し入れられることを意味する。
ウィルスによってインビボでの自然のプロセスで１つの
細菌から別の細菌へ移し入れられることを意味する。
「形質転換」とは、インビトロでの細菌の全細胞から取
り除いたＤＮＡを宿主細菌へ移し入れることを意味する
。
り除いたＤＮＡを宿主細菌へ移し入れることを意味する
。
「転位（トランスポジション）」とは、遺伝物質がＤＮ
Ａ分子の１部分から他の部分、又は１つのＤＮＡ分子か
ら他のＤＮＡ分子へ移動することを意味する。
Ａ分子の１部分から他の部分、又は１つのＤＮＡ分子か
ら他のＤＮＡ分子へ移動することを意味する。
［トランスボゾン（ｚｒａｎｓｐｃｓｃｎ）Ｊとは、転
位によって移送された遺伝物質を意味する。
位によって移送された遺伝物質を意味する。
「ＤＮＡ源」または「ＤＮＡ断片」とは、真核細胞又は
原核細胞および／またはそれらのウィルスを含む寄生体
から誘導された染色体または染色体外の細胞要素からの
ＤＮＡを特徴する特許技術の状態は、米国特許第５．８
１３．５１６号；第１＋、ｃＤａ１１１３号；第１＋、
０８０，２６１号；第１４，０８２，６１３号および第
４．１９０．１１９５号に一般的に記載されている。こ
れらの特許には本発明に関連した先行技術の方法が記載
されている。
原核細胞および／またはそれらのウィルスを含む寄生体
から誘導された染色体または染色体外の細胞要素からの
ＤＮＡを特徴する特許技術の状態は、米国特許第５．８
１３．５１６号；第１＋、ｃＤａ１１１３号；第１＋、
０８０，２６１号；第１４，０８２，６１３号および第
４．１９０．１１９５号に一般的に記載されている。こ
れらの特許には本発明に関連した先行技術の方法が記載
されている。
ＤＮＡ分子自体の合成に必要な酵素と蛋白質の一連の群
の外に、インビボでのＤＮＡ分子の複製に必要な２つの
エレメントが同定されている。そｎらは、（ＩＩＤＮＡ
分子上の領域であってＤＮＡ複與の起源として同定され
、蛋白質によって認識されるものである、また（２）同
じＤＮＡ分子に与ら汎る前記蛋白質の遺伝子である。こ
の最小限の仕様を細菌細胞内で独自の自己増殖ができる
ＤＮＡ分子に仮定すると、前記２つの機能を妨げない限
りさらに別のＤＮＡ小片が含まれうる。事実、宿主細菌
種内に含まれ、宿生細菌種によって染色体外に保持され
ていることがわかっている前記ｆｉｌと（２）の組合せ
がプラスミドまたは染色体要素と呼ばれてきた（ Ｂａ
ｃｒ、ｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｓｖｉｅｗｓ、 ９．
ｐｐ。
の外に、インビボでのＤＮＡ分子の複製に必要な２つの
エレメントが同定されている。そｎらは、（ＩＩＤＮＡ
分子上の領域であってＤＮＡ複與の起源として同定され
、蛋白質によって認識されるものである、また（２）同
じＤＮＡ分子に与ら汎る前記蛋白質の遺伝子である。こ
の最小限の仕様を細菌細胞内で独自の自己増殖ができる
ＤＮＡ分子に仮定すると、前記２つの機能を妨げない限
りさらに別のＤＮＡ小片が含まれうる。事実、宿主細菌
種内に含まれ、宿生細菌種によって染色体外に保持され
ていることがわかっている前記ｆｉｌと（２）の組合せ
がプラスミドまたは染色体要素と呼ばれてきた（ Ｂａ
ｃｒ、ｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｓｖｉｅｗｓ、 ９．
ｐｐ。
５５２−５９０（１９７６）参照）。最近まで、微生物
遺伝学者は、細菌染色体のＤＮＡをプラスミドに組換え
るため、または同一の宿主細菌内に一緒に保持されたプ
ラスミド間の組換えをするために、宿主細菌細胞の組換
え機構を利用してインビボにおいてＤＮＡ断片を操作し
てきた。この方法は、種々の領域のより複雑なゲノムの
一部分を別の複勲ユニットへ転移することによってその
ゲノムの精製をさせた。しかしながら、この方法は、通
常別の源からの又は別の生物から大きな生物学的障壁を
越えて移送されたＤＮＡからなるプラスミド−雑種の生
成をさせない。
遺伝学者は、細菌染色体のＤＮＡをプラスミドに組換え
るため、または同一の宿主細菌内に一緒に保持されたプ
ラスミド間の組換えをするために、宿主細菌細胞の組換
え機構を利用してインビボにおいてＤＮＡ断片を操作し
てきた。この方法は、種々の領域のより複雑なゲノムの
一部分を別の複勲ユニットへ転移することによってその
ゲノムの精製をさせた。しかしながら、この方法は、通
常別の源からの又は別の生物から大きな生物学的障壁を
越えて移送されたＤＮＡからなるプラスミド−雑種の生
成をさせない。
しかしながら、最近、ＤＮＡの異種断片のインビボでの
操作および組換え技術によって雑種ＤＮＡ分子の生成が
可能になった。文献［”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ。
操作および組換え技術によって雑種ＤＮＡ分子の生成が
可能になった。文献［”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ。
Ｒ，Ｆ、Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｅ、Ｇ、Ｂａ５ｓｅｔｔ
、 ｐｐ、 ９−２０゜Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ ＹｏｒＫ（１９７？）］ から引用したインビト
ロ法の要約は次の通シである：［インビトロでの糺換え
体（ＤＮＡ）技術には、最終的に全ての源からのＤＮＡ
断片をレプリコン（プラスミド）へ挿入さすことになる
２、うの重要ガ技術的要素；およびそれらの複製要素と
しての回復がある。これら技術的要素は： １）目的のＤＮＡ分子の制限エンドヌクレアーゼによる
系統的切断（これら酵素の検討については、ロバーツ（
Ｒｏ ｂｅ ｒ、ｔ５ ）著のローニンク媒体（または
レプリコーン）への再結合； ５）組換え体ＤＮＡによる細胞の形質転換、および組換
え体プラスミドを含む細胞の選択；および ｕ）得られたＤＮＡの［クロン化（Ｃｘｏｎｅａ）ｊ断
片の同定および特性指摘。」 この発明は、上記要請の全て、特に第（２）項、すなわ
ち適当なりローニング運搬体（プラスミド）の必要条件
、および前記形質変換法の利用に寄与するプラスミド・
クローニング・ベクターの新しい性質に関するものであ
る。
、 ｐｐ、 ９−２０゜Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ ＹｏｒＫ（１９７？）］ から引用したインビト
ロ法の要約は次の通シである：［インビトロでの糺換え
体（ＤＮＡ）技術には、最終的に全ての源からのＤＮＡ
断片をレプリコン（プラスミド）へ挿入さすことになる
２、うの重要ガ技術的要素；およびそれらの複製要素と
しての回復がある。これら技術的要素は： １）目的のＤＮＡ分子の制限エンドヌクレアーゼによる
系統的切断（これら酵素の検討については、ロバーツ（
Ｒｏ ｂｅ ｒ、ｔ５ ）著のローニンク媒体（または
レプリコーン）への再結合； ５）組換え体ＤＮＡによる細胞の形質転換、および組換
え体プラスミドを含む細胞の選択；および ｕ）得られたＤＮＡの［クロン化（Ｃｘｏｎｅａ）ｊ断
片の同定および特性指摘。」 この発明は、上記要請の全て、特に第（２）項、すなわ
ち適当なりローニング運搬体（プラスミド）の必要条件
、および前記形質変換法の利用に寄与するプラスミド・
クローニング・ベクターの新しい性質に関するものであ
る。
分子ＤＮＡのクローニングに潜在的に有用なプラスミド
の生物学的な性質は、ヘリンスキイら（Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１
ｉｎｓｋｉ ａｚ ａｌ）によって次のように要Ｒ，Ｆ
、 Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｅ、Ｇ、 Ｂａ５ｓｅ
ｔｔ、 ｅｄｓ、。
の生物学的な性質は、ヘリンスキイら（Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１
ｉｎｓｋｉ ａｚ ａｌ）によって次のように要Ｒ，Ｆ
、 Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｅ、Ｇ、 Ｂａ５ｓｅ
ｔｔ、 ｅｄｓ、。
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｗａｒ ＮｅＷ Ｙｏｒｋ（１９７
７）を参照〕：［大腸菌における遺伝子のクローニング
に対するプラスミド要素の利用性が最初に論証されて以
来、種々のプラスミド要素が大腸菌および他の細菌にお
けるクローニング媒体として開発されてきた。これらの
新しいクローニング媒体はＤＮＡのクローニングに有利
な次のようなプラスミド特性をもっている： １）宿主細菌細胞内での安定維持、 ２）非自己伝達能。
７）を参照〕：［大腸菌における遺伝子のクローニング
に対するプラスミド要素の利用性が最初に論証されて以
来、種々のプラスミド要素が大腸菌および他の細菌にお
けるクローニング媒体として開発されてきた。これらの
新しいクローニング媒体はＤＮＡのクローニングに有利
な次のようなプラスミド特性をもっている： １）宿主細菌細胞内での安定維持、 ２）非自己伝達能。
３）遺伝的操作の容易性、
ｑ）分離の容易性、
５）寸法的に大きな範囲の異種ＤＮＡ七の結合能力およ
びその複〜能力、 ６）インビトロで生じた雑種プラスミドの細菌細胞への
導入の容易性。」 しかしながら、組換え体ＤＮＡの技術に有用なプラスミ
ドを最大限に利用するのに望ましいと考えられた特性に
関する前記仕様は広い細菌宿主域をもったクローニング
・プラスミドの高利用性を考慮していない。
びその複〜能力、 ６）インビトロで生じた雑種プラスミドの細菌細胞への
導入の容易性。」 しかしながら、組換え体ＤＮＡの技術に有用なプラスミ
ドを最大限に利用するのに望ましいと考えられた特性に
関する前記仕様は広い細菌宿主域をもったクローニング
・プラスミドの高利用性を考慮していない。
今までに記載された大部分の細菌プラスミドは、プラス
ミドが最初に分離された細珈に密接に関係した細菌種に
おいてのみ維持することができる。
ミドが最初に分離された細珈に密接に関係した細菌種に
おいてのみ維持することができる。
このために、特定プラスミドのＤＮＡの維持および重複
に関連した必要条件は一般に問題のプラスミドに特有な
ものである。しかし、この一般的な所見には例外があっ
た。例えば、オルセン（Ｏｌｓｅｎ。
に関連した必要条件は一般に問題のプラスミドに特有な
ものである。しかし、この一般的な所見には例外があっ
た。例えば、オルセン（Ｏｌｓｅｎ。
本願の発明者）とシップレイ（Ｓｈｉｐｌｅｙ）は、多
重の抗生物質抵抗を特定するプラスミド、Ｒ１ｇ２２（
後でＲＰＩと呼ぶようになった）が、有性接合によって
関係および無関係の細菌属を代表する種々の細菌種に転
移されること金示した［ Ｊｏｕｒｎａｌ７８０（１９
７３）を参照〕。菌株、緑膿菌１ｇ２２（これから後で
ＲＰＩが得られた）の起源はロウベリー（Ｌｏｗｂｕｒ
ｙ、 Ｅ、Ｊ、）らにより示された（Ｌａｎｃｅｔ ｉ
ｉ、 ｕ ＩＩ １３−１１５２ （１９６９）参照
）。
重の抗生物質抵抗を特定するプラスミド、Ｒ１ｇ２２（
後でＲＰＩと呼ぶようになった）が、有性接合によって
関係および無関係の細菌属を代表する種々の細菌種に転
移されること金示した［ Ｊｏｕｒｎａｌ７８０（１９
７３）を参照〕。菌株、緑膿菌１ｇ２２（これから後で
ＲＰＩが得られた）の起源はロウベリー（Ｌｏｗｂｕｒ
ｙ、 Ｅ、Ｊ、）らにより示された（Ｌａｎｃｅｔ ｉ
ｉ、 ｕ ＩＩ １３−１１５２ （１９６９）参照
）。
プラスミドＲＰＩの細菌宿主域は、腸内菌（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｚｅｒｉａｃｅａｅ）、 土壌腐生菌（Ｐｓｅ
ｕ−ａｏｍｏｎａｓ） 、ナイセリア・ベルフロ／’
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｐｅｒｆｌａｖａ）および光合成
菌ヲ含む。従って、プラスミドＲＰＩは、関係のない細
菌種間を自由に転移する広宿主域の細菌プラスミドの一
例である。
ｏｂａｃｚｅｒｉａｃｅａｅ）、 土壌腐生菌（Ｐｓｅ
ｕ−ａｏｍｏｎａｓ） 、ナイセリア・ベルフロ／’
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｐｅｒｆｌａｖａ）および光合成
菌ヲ含む。従って、プラスミドＲＰＩは、関係のない細
菌種間を自由に転移する広宿主域の細菌プラスミドの一
例である。
そのプラスミド・リングＲＰＩは比較的大きいものであ
る。この寸法が大きいこととプラスミド・リングの組成
が細菌の形質転換のプロセス全非効率的なものにする。
る。この寸法が大きいこととプラスミド・リングの組成
が細菌の形質転換のプロセス全非効率的なものにする。
特に形質転換によって細菌宿主から細菌宿主へと容易か
つ広く輸送できるクローニング媒体としての小さなプラ
スミド・リングおよびその組換え体を提供することは技
術的に着しい改良となる。それらのプラスミドが同定の
ために抗生物質抵抗性の単一表現型標識を含むならば、
それらプラスミドは特に有用なものとなる。また、小プ
ラスミド・リングの断片を他の遺伝子断片とインビボま
たはインビトロでの組換え方法全提供することも改良と
なる。
つ広く輸送できるクローニング媒体としての小さなプラ
スミド・リングおよびその組換え体を提供することは技
術的に着しい改良となる。それらのプラスミドが同定の
ために抗生物質抵抗性の単一表現型標識を含むならば、
それらプラスミドは特に有用なものとなる。また、小プ
ラスミド・リングの断片を他の遺伝子断片とインビボま
たはインビトロでの組換え方法全提供することも改良と
なる。
従って、本発明の目的はデオキシ核酸プラスミド全イン
ビボの細菌宿主に輸送する方法全提供することである。
ビボの細菌宿主に輸送する方法全提供することである。
さらに、組換え体のプラスミド・リング内で結合された
時にクローニング媒体の働をする小プラスミドから誘導
され、広い細菌宿主転移範囲を有する新しい組換え体プ
ラスミド・リングを提供することが本発明の目的である
。
時にクローニング媒体の働をする小プラスミドから誘導
され、広い細菌宿主転移範囲を有する新しい組換え体プ
ラスミド・リングを提供することが本発明の目的である
。
特に、宿主細菌において有用な化学薬品生成特性または
他の有用な特性を有する組換え体プラスミド・リングを
提供することが本発明の目的である。これらおよび他の
目的は、添付図面と共に以下の記載からさらに明白とな
るであろう。
他の有用な特性を有する組換え体プラスミド・リングを
提供することが本発明の目的である。これらおよび他の
目的は、添付図面と共に以下の記載からさらに明白とな
るであろう。
本発明は、細菌の接合、形質転換または形質導入の工程
を用いてデオキシリボ核酸プラスミド全インビボでの細
菌宿主へ輸送する方法において、第１プラスミド・リン
グを含み、該第１プラスミド・リングが最初プラスミド
Ｒｐｘｌ有するプラスミド集合体として誘導され、分子
の大きさが約２×１０ダルトン以下で、単独または第１
プラスミド・リングからの断片との複製に必須で分子の
大きさがＯ，ｇ ３ ｘ １０ダルトンの臨界、Ｂ、９
１１制限工ンドヌクレアーゼ消化断片を有し、組換え体
プラスミド・リングを形成するためにインビトロでの第
１プラスミドに連結された制限エンドヌクレアーゼ消化
断片またはインビボでの細菌によシ第１プラスミドに挿
入された自然発生断片である少なくとも１個の第２デオ
キシリボ核酸と共有結合され、前記プラスミドが緑膿菌
ＰＡＯＡＴＣＣ１５６９２によシ運搬可能であシ、広細
菌宿主塘を有し、該プラスミド自身は宿主細菌の細胞分
裂中にデオキシリボ核酸によってクローニングするとこ
ろのデオキシリボ核酸プラスミド・リングを輸送するこ
とからなることを特徴とする。
を用いてデオキシリボ核酸プラスミド全インビボでの細
菌宿主へ輸送する方法において、第１プラスミド・リン
グを含み、該第１プラスミド・リングが最初プラスミド
Ｒｐｘｌ有するプラスミド集合体として誘導され、分子
の大きさが約２×１０ダルトン以下で、単独または第１
プラスミド・リングからの断片との複製に必須で分子の
大きさがＯ，ｇ ３ ｘ １０ダルトンの臨界、Ｂ、９
１１制限工ンドヌクレアーゼ消化断片を有し、組換え体
プラスミド・リングを形成するためにインビトロでの第
１プラスミドに連結された制限エンドヌクレアーゼ消化
断片またはインビボでの細菌によシ第１プラスミドに挿
入された自然発生断片である少なくとも１個の第２デオ
キシリボ核酸と共有結合され、前記プラスミドが緑膿菌
ＰＡＯＡＴＣＣ１５６９２によシ運搬可能であシ、広細
菌宿主塘を有し、該プラスミド自身は宿主細菌の細胞分
裂中にデオキシリボ核酸によってクローニングするとこ
ろのデオキシリボ核酸プラスミド・リングを輸送するこ
とからなることを特徴とする。
細菌のプラスミド含量は、スラブ・アガロースゲルの電
気泳動法を採用し得られた電気フェログラムの写真を観
察することによシ便利かつ迅速に決定することができる
（例えば、Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄｏｌｓｅｎ、 Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
１３５゜Ｎ１１．ｐｐ、２２７−２５８（１９７ｇ）
を参照されたい）。かぐして、ＤＮＡは第１図に示すよ
うに次の如く電気泳動された：図のＡは緑膿菌ＮＲＲＬ
１２１２３から抽出したＤＮＡ；ＢはＲＰ １／ｐＲｏ
１６００ のＤＮＡ；ＣはｐＲＯ１６０１のＤＮＡ
；Ｄは大腸菌Ｖ５１７（サイズ標準として使用した多プ
ラスミドを含む菌株（Ｐｌａｓｍｉｄ、 １ ｐ ｐ
。
気泳動法を採用し得られた電気フェログラムの写真を観
察することによシ便利かつ迅速に決定することができる
（例えば、Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄｏｌｓｅｎ、 Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
１３５゜Ｎ１１．ｐｐ、２２７−２５８（１９７ｇ）
を参照されたい）。かぐして、ＤＮＡは第１図に示すよ
うに次の如く電気泳動された：図のＡは緑膿菌ＮＲＲＬ
１２１２３から抽出したＤＮＡ；ＢはＲＰ １／ｐＲｏ
１６００ のＤＮＡ；ＣはｐＲＯ１６０１のＤＮＡ
；Ｄは大腸菌Ｖ５１７（サイズ標準として使用した多プ
ラスミドを含む菌株（Ｐｌａｓｍｉｄ、 １ ｐ ｐ
。
＋４１７−１１２０（１９７８）参照）のＤＮＡ；Ｅは
ｐＲＯ１６１３のＤＮＡ；そしてＦはｐＲＯ１６１３、
ｐＲＯ１６１４のＤＮＡである。この方法は、適当な標
準体を併用することにより存在するプラスミドの分子の
大きさも決定することができる。
ｐＲＯ１６１３のＤＮＡ；そしてＦはｐＲＯ１６１３、
ｐＲＯ１６１４のＤＮＡである。この方法は、適当な標
準体を併用することにより存在するプラスミドの分子の
大きさも決定することができる。
プラスミドＲＰＩが細菌接合（又は有性接合）のプロセ
スによって１つの細菌から別の細菌へ伝達される時、そ
のプラスミドを新たに得た受容買は、普通、電気泳動図
では供与菌に存在するプラスミドと区別できないプラス
ミドを含む０第１図のＡ列には、伝達後に供与菌細菌個
体群または受容菌細胞個体群から抽出した時のプラスミ
ドＲＰ１の通常の様相（又は様子）が示されている。あ
る場合には別の結果が得られた。緑膿菌ＰＡＯ２５での
交雑実験においてプラスミドＲＰＩ’！ｉ受は取ったＡ
ＴＣＣ１５６９２（菌株ＰＡＯ２）の単一受容菌細胞か
ら誘導した培養体を分析した所、異なるプラスミド集合
体上生成していた。そのトランス接合個体は親のプラス
ミドのみならすかなシ小さな第２のプラスミドを示した
（第１図、Ｂ列参照）。親の大きさのプラスミドは第１
図Ｂ列の最上部に、異常に小さなプラスミドは下部に示
されている。この下部のプラスミドの大きさは、Ｄ列に
示す標準寸法と比較、計算した所３８×１０１６ダルト
ンのＲＰＩに対して２×１０ダルトンであった。従って
、この小プラスミドの出現は、一般に親プラスミドＲＰ
Ｉの受容菌への伝達中に生じたランダムの突然変異と考
えられる新規の出来事を示している。本発明者は、小プ
ラスミドｐＲＯ１６００およびＲＰＩ全有する集合体を
ＲＰ１／ｐＲＯ１６００と名付けた。
スによって１つの細菌から別の細菌へ伝達される時、そ
のプラスミドを新たに得た受容買は、普通、電気泳動図
では供与菌に存在するプラスミドと区別できないプラス
ミドを含む０第１図のＡ列には、伝達後に供与菌細菌個
体群または受容菌細胞個体群から抽出した時のプラスミ
ドＲＰ１の通常の様相（又は様子）が示されている。あ
る場合には別の結果が得られた。緑膿菌ＰＡＯ２５での
交雑実験においてプラスミドＲＰＩ’！ｉ受は取ったＡ
ＴＣＣ１５６９２（菌株ＰＡＯ２）の単一受容菌細胞か
ら誘導した培養体を分析した所、異なるプラスミド集合
体上生成していた。そのトランス接合個体は親のプラス
ミドのみならすかなシ小さな第２のプラスミドを示した
（第１図、Ｂ列参照）。親の大きさのプラスミドは第１
図Ｂ列の最上部に、異常に小さなプラスミドは下部に示
されている。この下部のプラスミドの大きさは、Ｄ列に
示す標準寸法と比較、計算した所３８×１０１６ダルト
ンのＲＰＩに対して２×１０ダルトンであった。従って
、この小プラスミドの出現は、一般に親プラスミドＲＰ
Ｉの受容菌への伝達中に生じたランダムの突然変異と考
えられる新規の出来事を示している。本発明者は、小プ
ラスミドｐＲＯ１６００およびＲＰＩ全有する集合体を
ＲＰ１／ｐＲＯ１６００と名付けた。
組換え体ＤＮＡの技術における小プラスミドの利用性は
、宿主細菌がもっていなかった独特な代謝特性用の遺伝
情報をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）する能力から一部由
来する。従って、プラスミドの存在又は不在は、遺伝的
操作後に間萌の代謝特性の存否に基いて決めることがで
きる。第１図のＢ列に示す細菌株を予備的に分析した所
、プラスミド１）’ＲＯ１６００の存在に関連した独特
な代謝特性（又は表現型形質）を示さなかった。従って
、本発明者は、ｐＲＯ１６００に区別の目安となる表現
型形質を加えて後の実験でその検出音する細菌の遺伝的
標準技法を適用し、それによって部分的に精象したＤＮ
Ａ溶液から受容菌株へ転換される能力を試験した。加え
た区別の目安となる表現型形質は、抗生物質カルペニシ
リンへの耐性用の遺伝情報をエンコードするＤＮＡの断
片であった。
、宿主細菌がもっていなかった独特な代謝特性用の遺伝
情報をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）する能力から一部由
来する。従って、プラスミドの存在又は不在は、遺伝的
操作後に間萌の代謝特性の存否に基いて決めることがで
きる。第１図のＢ列に示す細菌株を予備的に分析した所
、プラスミド１）’ＲＯ１６００の存在に関連した独特
な代謝特性（又は表現型形質）を示さなかった。従って
、本発明者は、ｐＲＯ１６００に区別の目安となる表現
型形質を加えて後の実験でその検出音する細菌の遺伝的
標準技法を適用し、それによって部分的に精象したＤＮ
Ａ溶液から受容菌株へ転換される能力を試験した。加え
た区別の目安となる表現型形質は、抗生物質カルペニシ
リンへの耐性用の遺伝情報をエンコードするＤＮＡの断
片であった。
従って、このＤＮＡ断片とプラスミドｐＲＯ１６００を
保有する細菌は全て、親のプラスミドを含ｉない細菌株
と異なりカルペニシリンの存在下で成長することになる
。
保有する細菌は全て、親のプラスミドを含ｉない細菌株
と異なりカルペニシリンの存在下で成長することになる
。
カルペニシリン耐性用の遺伝特性（又は形質）は、トラ
ンスポジションと呼ぶ遺伝的プロセスでプラスミドｐＲ
Ｏ１６００へ添加された。トランスポゾンと呼ぶ若干の
抗生物質耐性遺伝子は、ＤＮＡの断片上のある場所から
別の場所へ移動できる、或いはトランスポジションと呼
ぶ遺伝的なプロセスで細菌細胞内のあるＤＮＡ分子から
別のＤＮＡ分子へ移動できる（ Ｓ 、 Ｃ０ｈｅｎ、
”Ｔｒａｎｓ−ｐｏｓａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅ
ｌｅｍｅｎｔ、ｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ”、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２６３ 、 ｐｐ、
７５１−７３ｇ（１９７６）参照）。これらの遺伝的
エレメントは、細菌宿主の遺伝的組換え機構なしにこの
プロセスを果たす。第１図のＡ列に示すプラスミドＲＰ
Ｉは、カルペニシリンおよび関連抗生物質（ペニシリン
、アムビシリン）に対する耐性用遺伝情報をエンコード
するＴｎｌと呼ぶトランスポゾンを含む。トランスボゾ
ンＴｎＪは分子の大きさが３．２ ｘ １０ダルトンの
転置可能な遺伝的エレメントである。従って、Ｔｎｌに
よって転置されたＤＮＡは３．２ Ｘ １０ダルトンま
で大きさ全増すことになる。
ンスポジションと呼ぶ遺伝的プロセスでプラスミドｐＲ
Ｏ１６００へ添加された。トランスポゾンと呼ぶ若干の
抗生物質耐性遺伝子は、ＤＮＡの断片上のある場所から
別の場所へ移動できる、或いはトランスポジションと呼
ぶ遺伝的なプロセスで細菌細胞内のあるＤＮＡ分子から
別のＤＮＡ分子へ移動できる（ Ｓ 、 Ｃ０ｈｅｎ、
”Ｔｒａｎｓ−ｐｏｓａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅ
ｌｅｍｅｎｔ、ｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ”、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２６３ 、 ｐｐ、
７５１−７３ｇ（１９７６）参照）。これらの遺伝的
エレメントは、細菌宿主の遺伝的組換え機構なしにこの
プロセスを果たす。第１図のＡ列に示すプラスミドＲＰ
Ｉは、カルペニシリンおよび関連抗生物質（ペニシリン
、アムビシリン）に対する耐性用遺伝情報をエンコード
するＴｎｌと呼ぶトランスポゾンを含む。トランスボゾ
ンＴｎＪは分子の大きさが３．２ ｘ １０ダルトンの
転置可能な遺伝的エレメントである。従って、Ｔｎｌに
よって転置されたＤＮＡは３．２ Ｘ １０ダルトンま
で大きさ全増すことになる。
転位（トランスポジション）は、トランスポゾンを有す
る供与菌のＤＮＡ分子を含む細菌細胞の個体群において
不規則に生じる。従って、菌株緑膿菌ＲＰ １．”ｐｉ
’ｔｏ ｌ ６００の場合に、小比率の細菌細胞が転位
された異体のプラスミドを含むことが期待される。例え
ば、第１図のＢ列に示すように、培養における２、５の
細菌細胞は、電気法動因の下部に示す小ＤＮＡ分子より
１２Ｘ１０ダルトンまで大きいＤＮＡ分子を含んでいる
（そのプラスミドはｐＲＯ１６００となづけｆｃ）。し
かしながら、培養におけるこｎら細菌の比較的少数は第
１図に示すようにアガロース・ゲルでの検出を妨害する
。しかし、こｎらプラスミドｐＲＯ１６００の転置誘導
体は、細菌の形質転換と呼ぶ遺伝的技法を採用すること
によシ検出と分離をされる。この方法によって、供与菌
細胞から抽出されたＤＮＡはプラスミド金倉まない受容
菌細胞培養体へ付加される。次に、その混合体は、この
場合抗住物質のカルペニシリンを含む細菌学的媒質で成
長する。これらの条件下で、抗生物質カルペニシリン用
の遺伝情報をエンコードしている遺伝エレメントを得て
複製した細菌細胞のみが高密度便体群に成長する。この
実験が行なわれる時、２種類のカルペニシリン耐性細菌
株が期待される：即ち、供与菌親プラスミドＲＰＩの全
てを受は入れたものと、カルペニシリン耐性をエンコー
ドしているトランスボゾンＴｎＪと結合したｐＲＯ１６
００のみを受は入れたものである。前者の可能な細菌分
離体は、これらの細菌がカルペニシリンのみならずテト
ラサイクリンおよびカナマイシンに耐性があることによ
って区別することができる。しかし、後者の可能性の場
合に、これらの細菌分離体は、それらがプラスミドＲＰ
Ｉから細菌細胞内で同時に共に保持されたプラスミドｐ
ＲＯ１６００ヘジャンプしたＴｎＪだけを受は入れたか
ら、抗生物質カルペニシリンに対する耐性のみを示すで
あろう。そのような細菌株は前述のプロセスで得られた
、そしてそのＤＮＡは、そのプラスミドの抽出および電
気泳動稜のもの全第１図の０列に示す。このプラスミド
ｐＲＯ１６０１の電気泳動による移動度は、プラスミド
ｐ Ｒ０１６００よりも遅い（これはサイズが大きいこ
と表わす）。
る供与菌のＤＮＡ分子を含む細菌細胞の個体群において
不規則に生じる。従って、菌株緑膿菌ＲＰ １．”ｐｉ
’ｔｏ ｌ ６００の場合に、小比率の細菌細胞が転位
された異体のプラスミドを含むことが期待される。例え
ば、第１図のＢ列に示すように、培養における２、５の
細菌細胞は、電気法動因の下部に示す小ＤＮＡ分子より
１２Ｘ１０ダルトンまで大きいＤＮＡ分子を含んでいる
（そのプラスミドはｐＲＯ１６００となづけｆｃ）。し
かしながら、培養におけるこｎら細菌の比較的少数は第
１図に示すようにアガロース・ゲルでの検出を妨害する
。しかし、こｎらプラスミドｐＲＯ１６００の転置誘導
体は、細菌の形質転換と呼ぶ遺伝的技法を採用すること
によシ検出と分離をされる。この方法によって、供与菌
細胞から抽出されたＤＮＡはプラスミド金倉まない受容
菌細胞培養体へ付加される。次に、その混合体は、この
場合抗住物質のカルペニシリンを含む細菌学的媒質で成
長する。これらの条件下で、抗生物質カルペニシリン用
の遺伝情報をエンコードしている遺伝エレメントを得て
複製した細菌細胞のみが高密度便体群に成長する。この
実験が行なわれる時、２種類のカルペニシリン耐性細菌
株が期待される：即ち、供与菌親プラスミドＲＰＩの全
てを受は入れたものと、カルペニシリン耐性をエンコー
ドしているトランスボゾンＴｎＪと結合したｐＲＯ１６
００のみを受は入れたものである。前者の可能な細菌分
離体は、これらの細菌がカルペニシリンのみならずテト
ラサイクリンおよびカナマイシンに耐性があることによ
って区別することができる。しかし、後者の可能性の場
合に、これらの細菌分離体は、それらがプラスミドＲＰ
Ｉから細菌細胞内で同時に共に保持されたプラスミドｐ
ＲＯ１６００ヘジャンプしたＴｎＪだけを受は入れたか
ら、抗生物質カルペニシリンに対する耐性のみを示すで
あろう。そのような細菌株は前述のプロセスで得られた
、そしてそのＤＮＡは、そのプラスミドの抽出および電
気泳動稜のもの全第１図の０列に示す。このプラスミド
ｐＲＯ１６０１の電気泳動による移動度は、プラスミド
ｐ Ｒ０１６００よりも遅い（これはサイズが大きいこ
と表わす）。
第１図のＤ列に示す標準ＤＮＡを用いて計算すると、ｐ
ＲＯ１６０１がｐＲＯ１６００よりも分子の大きさで３
＋２ＸｌＯ大きいことになる。従って、この関係はＴｎ
ＪがｐＲＯ１６００へ付加されたこと、従って独特な代
謝特質（表功型標識）がｐＲＯ１６００へ付加されたこ
と示唆する（その検出は抗生物質カルペニシリンに対す
る耐性を試験することによって行なう）。
ＲＯ１６０１がｐＲＯ１６００よりも分子の大きさで３
＋２ＸｌＯ大きいことになる。従って、この関係はＴｎ
ＪがｐＲＯ１６００へ付加されたこと、従って独特な代
謝特質（表功型標識）がｐＲＯ１６００へ付加されたこ
と示唆する（その検出は抗生物質カルペニシリンに対す
る耐性を試験することによって行なう）。
ＤＮＡ分子はプリンおよびピリミジンと呼ぶ置換分子か
らなる線状分子である。その結合したプリン又はピリミ
ジンの正確な線状配列（シーフェンス）が注目のＤＮＡ
分子の領域全画定する。
らなる線状分子である。その結合したプリン又はピリミ
ジンの正確な線状配列（シーフェンス）が注目のＤＮＡ
分子の領域全画定する。
ＤＮＡ分子に類但した領域は、クラス■の制限エンドヌ
クレアーゼと呼ぶ領域におけるそれらの活性に特有な酵
素での分割（ｃｌｅａｖａｇｅ）によって識別すること
ができる（ Ｂ、Ａ１］ｅｔ、 ”Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｌ ｂｙ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ
ｌａｍｂｄａ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｎｕｃｉｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｐａｒａｉｎ−ｆ！ｕｅｎｚａｅ ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ Ｈｐａ Ｉ［’
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２．ｐｐ、３９７
２−３９７７（１９７２）参照）。認識シーフェンスと
呼ばれるＤＮＡ分子の特定領域（そ扛らは４０以上の特
定制限ニドヌクレアーゼによる分割用部位（又は座位）
の役目をする）は、別々に分布されるか、または別の生
物学的源からのＤＮＡが比較さｎる時には存在しない。
クレアーゼと呼ぶ領域におけるそれらの活性に特有な酵
素での分割（ｃｌｅａｖａｇｅ）によって識別すること
ができる（ Ｂ、Ａ１］ｅｔ、 ”Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｌ ｂｙ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ
ｌａｍｂｄａ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｎｕｃｉｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｐａｒａｉｎ−ｆ！ｕｅｎｚａｅ ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ Ｈｐａ Ｉ［’
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２．ｐｐ、３９７
２−３９７７（１９７２）参照）。認識シーフェンスと
呼ばれるＤＮＡ分子の特定領域（そ扛らは４０以上の特
定制限ニドヌクレアーゼによる分割用部位（又は座位）
の役目をする）は、別々に分布されるか、または別の生
物学的源からのＤＮＡが比較さｎる時には存在しない。
逆に言えば、関係又は同一のＤＮＡ分子は、制限エンド
ヌクレアーゼ消化およびスラブ・アガロース・ゲル電気
泳動法による分析後に同一セットの断片を生成する。従
って、新しいプラスミドは前述の消化後に生成すること
ができる。ＤＮＡ分子の大きさが小さく、制限エンドヌ
クレアーゼでの処理によシ生成した断片の数が少ないと
、これらの断片は、親分子に最初に存在した時と異なる
順序で不規則に連合することができる。この不規則な再
連合に続いて、それら断片は、再連合複合体が［） Ｎ
Ａ ＋）ガーゼと呼ぶ第２酵素で処理さ九る時に再び
共有結合ができ、補因子を必要とする。
ヌクレアーゼ消化およびスラブ・アガロース・ゲル電気
泳動法による分析後に同一セットの断片を生成する。従
って、新しいプラスミドは前述の消化後に生成すること
ができる。ＤＮＡ分子の大きさが小さく、制限エンドヌ
クレアーゼでの処理によシ生成した断片の数が少ないと
、これらの断片は、親分子に最初に存在した時と異なる
順序で不規則に連合することができる。この不規則な再
連合に続いて、それら断片は、再連合複合体が［） Ｎ
Ａ ＋）ガーゼと呼ぶ第２酵素で処理さ九る時に再び
共有結合ができ、補因子を必要とする。
従って、前述の方法はＤＮＡ分子の構造解析およびＤＮ
Ａシークエンスの新組合せ体の生成に適用できる。従っ
て、前述の方法によって、プラスミドの構造はＤＮＡの
必須でない領域の欠失或いは生物学的に関係のない源か
らのＤＮＡからなるＤＮＡ分子の生成によって変えるこ
とができる。
Ａシークエンスの新組合せ体の生成に適用できる。従っ
て、前述の方法によって、プラスミドの構造はＤＮＡの
必須でない領域の欠失或いは生物学的に関係のない源か
らのＤＮＡからなるＤＮＡ分子の生成によって変えるこ
とができる。
本発明は特に、プラスミドｐＲＯ１６０１、通常ＤＮＡ
組換え技術と呼ばれる前述の原理および手順を適用する
ことによる遺伝的クローニングおよび新規性に対する前
記プラスミドｐＲＯ１６０１の修飾および有用性に関す
る。このＤＮＡ組換え技術の主な特ｇｌは、既に要約さ
ｎている（Ｓ。
組換え技術と呼ばれる前述の原理および手順を適用する
ことによる遺伝的クローニングおよび新規性に対する前
記プラスミドｐＲＯ１６０１の修飾および有用性に関す
る。このＤＮＡ組換え技術の主な特ｇｌは、既に要約さ
ｎている（Ｓ。
Ｃｏｈｅｎ、 ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ、 Ｊｕｌｙ、 ｐｐ。
ｎ、 Ｊｕｌｙ、 ｐｐ。
２５−５５Ｃ１９７５）参照）。
上記通常の方法によるプラスミドｐＲＯ１６０１のＤＮ
Ａ’ｉ分析（制限エンドヌクレアーゼの地図作與）した
所、第２図のＡ部に示す構造となった。
Ａ’ｉ分析（制限エンドヌクレアーゼの地図作與）した
所、第２図のＡ部に示す構造となった。
この遺伝学的地図は、制限エン、ドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉ について４つの制限エンドヌクレアーゼ認識座位
（ｓ ｉ ｔｅｓ ）があることを示している。ｐＲＯ
１６０１を生成するためにｐＲＯ１６０１へ付加された
トランスポゾンｎ１は、５つの乙已工制限エンドヌクレ
アーゼの座位を含むことが知られている（Ｊ、 Ｇｒｉ
ｎｓｚｅｌ ｅｔ ａｌ、 Ｐｌａｓｍｉｄ、 １゜ｐ
ｐ うキーう７（１９７７）参照）。従ってＴｎｌに
よジ置換を受けた組換え体プラスミドのｐＲｏｌ ６０
０＠域は単一のＰｓｔＩ座位を含まなければならない。
Ｉ について４つの制限エンドヌクレアーゼ認識座位
（ｓ ｉ ｔｅｓ ）があることを示している。ｐＲＯ
１６０１を生成するためにｐＲＯ１６０１へ付加された
トランスポゾンｎ１は、５つの乙已工制限エンドヌクレ
アーゼの座位を含むことが知られている（Ｊ、 Ｇｒｉ
ｎｓｚｅｌ ｅｔ ａｌ、 Ｐｌａｓｍｉｄ、 １゜ｐ
ｐ うキーう７（１９７７）参照）。従ってＴｎｌに
よジ置換を受けた組換え体プラスミドのｐＲｏｌ ６０
０＠域は単一のＰｓｔＩ座位を含まなければならない。
また、 Ｔｎ １と連合したＰｓｔ工 断片の大きさは
前述のように評価されたから、ｐＲＯ１６００に狂特な
ＰｓｔＩ分割用の特定座位は同定することができる。こ
の座位は、遺伝地図作表用基準座位として選ばｎた。そ
して第２図のＡ部に示す図面の左側に現われている。紹
換え体プラスミドｐＲＯ１６０１の領域を表わす他の座
位（それらはＴｎ ｌの一部である）はｐＲＯ１６００
ＰｓｔＩの部位に関して並置されている。また、この遺
伝地図に示すように、制限エンドヌクレアーゼＢｉＩに
ついての特定認識部位がある。これらは、トランスボゾ
ンＴｎｌ（ｉ７ｐ ＲＯｌ ６００に挿入した点に関し
てｐＲＯ１６０１と異なる肛１−置換プラスミドｐＲＯ
１６００の他の変種を比較することによって決定された
。このために、約換え体ＤＮＡ技術に付随する通常の方
法を採用した。
前述のように評価されたから、ｐＲＯ１６００に狂特な
ＰｓｔＩ分割用の特定座位は同定することができる。こ
の座位は、遺伝地図作表用基準座位として選ばｎた。そ
して第２図のＡ部に示す図面の左側に現われている。紹
換え体プラスミドｐＲＯ１６０１の領域を表わす他の座
位（それらはＴｎ ｌの一部である）はｐＲＯ１６００
ＰｓｔＩの部位に関して並置されている。また、この遺
伝地図に示すように、制限エンドヌクレアーゼＢｉＩに
ついての特定認識部位がある。これらは、トランスボゾ
ンＴｎｌ（ｉ７ｐ ＲＯｌ ６００に挿入した点に関し
てｐＲＯ１６０１と異なる肛１−置換プラスミドｐＲＯ
１６００の他の変種を比較することによって決定された
。このために、約換え体ＤＮＡ技術に付随する通常の方
法を採用した。
第２図のパネルＡの１２１の所に引いたＰｓｔｌ制限エ
ンドヌクレアーゼの座位（これはトランスポゾンＴｎ
１の付加を反映する領域の部分として知られている）は
、カルペニシリンに対する耐性をエンコードする遺伝的
領域の中央にあるべきことが知らｎている。従って、こ
の点に過剰ＤＮＡの挿入はＤＮＡ配列の連続性を破壊し
、ＤＮＡのこの領域がカルペニシリン耐性をもった酵素
を特定する能力の喪失をもたらすことになる。ｐＲＯ１
６０１の分子クローニングへの有用性を示すために、Ｄ
ＮＡの断片をこの座位に挿入した。しかしながら、この
ＤＮＡ断片は抗生物質テトラサイクリンに対する耐性用
の遺伝情報を含んでいる。
ンドヌクレアーゼの座位（これはトランスポゾンＴｎ
１の付加を反映する領域の部分として知られている）は
、カルペニシリンに対する耐性をエンコードする遺伝的
領域の中央にあるべきことが知らｎている。従って、こ
の点に過剰ＤＮＡの挿入はＤＮＡ配列の連続性を破壊し
、ＤＮＡのこの領域がカルペニシリン耐性をもった酵素
を特定する能力の喪失をもたらすことになる。ｐＲＯ１
６０１の分子クローニングへの有用性を示すために、Ｄ
ＮＡの断片をこの座位に挿入した。しかしながら、この
ＤＮＡ断片は抗生物質テトラサイクリンに対する耐性用
の遺伝情報を含んでいる。
従って、この断片がこの座位でプラスミドｐＲＯ１６０
１へ組み込まｎ、連結されて閉鎖、円形ＤＮＡ構造を形
成し、受容菌に形質転換され、そしてテトラサイクリン
の存在下で成長できるように培養されると、挿入断片の
クローニングが生じるであろう。
１へ組み込まｎ、連結されて閉鎖、円形ＤＮＡ構造を形
成し、受容菌に形質転換され、そしてテトラサイクリン
の存在下で成長できるように培養されると、挿入断片の
クローニングが生じるであろう。
これらの実験用のＤＮＡ源には、さらにｐＢＲ３２２と
呼ぶ別のプラスミドがあった（Ｆ、Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ
ａｌ、”Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ＮｅＷ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ Ｍ＋ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐ
ｏｓｅｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ＠Ｇｅｎｅ、 ２
． ｐｐ＋９５−１１３（１９７７）参照）。現在まで
開発されたクローニング・プラスミドの代表的なもので
あるプラスミドｐＢＲ１２２は、原菌の大腸菌に密接に
関係しない細菌中に保存することができない。従って、
このプラスミドＤＮＡ？無関係の緑膿菌へ導入すると、
それは耐性、即ちカルペニシリンおよびテトラサイクリ
ンに対する耐性をエンコードする抗生物質の存在下で成
長する能力を授与することができない。一方、組換えに
よってプラスミドｐＢＲ５２２のＤＮＡがプラスミドｐ
ＲＯ１６０１のようなプラスミドの構造の一部分になる
と、組換え体プラスミドを含むｐＲｏ １６０１−ｐＢ
Ｒう２２雑種にその遺伝機能が授与されることになる。
呼ぶ別のプラスミドがあった（Ｆ、Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ
ａｌ、”Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ＮｅＷ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ Ｍ＋ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐ
ｏｓｅｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ＠Ｇｅｎｅ、 ２
． ｐｐ＋９５−１１３（１９７７）参照）。現在まで
開発されたクローニング・プラスミドの代表的なもので
あるプラスミドｐＢＲ１２２は、原菌の大腸菌に密接に
関係しない細菌中に保存することができない。従って、
このプラスミドＤＮＡ？無関係の緑膿菌へ導入すると、
それは耐性、即ちカルペニシリンおよびテトラサイクリ
ンに対する耐性をエンコードする抗生物質の存在下で成
長する能力を授与することができない。一方、組換えに
よってプラスミドｐＢＲ５２２のＤＮＡがプラスミドｐ
ＲＯ１６０１のようなプラスミドの構造の一部分になる
と、組換え体プラスミドを含むｐＲｏ １６０１−ｐＢ
Ｒう２２雑種にその遺伝機能が授与されることになる。
プラスミドｐＲＯ１６０１に類但したプラスミドｐＢＲ
３２２も抗生物質カルペニシリンに対する耐性を特定す
る遺伝子を含む。この遺伝子もカルペニシリン耐性と関
連したそのＤＮＡ０佃緘内に制限エンドヌクレアーゼＰ
ｓｔＩ用の座位を有する。
３２２も抗生物質カルペニシリンに対する耐性を特定す
る遺伝子を含む。この遺伝子もカルペニシリン耐性と関
連したそのＤＮＡ０佃緘内に制限エンドヌクレアーゼＰ
ｓｔＩ用の座位を有する。
プラスミドｐＲＯ１６９１のカルペニシリン耐性遺伝子
の部分がプラスミドｐＢＲ３２２からの類但遺伝子の部
分と接合できて、この場合１つの場所で接合した雑種分
子にカルペニシリン耐性の保存上もたらすという仮説を
試験するために、プラスミドｐＲｏ １６０１およびプ
ラスミドｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉで分割（又は切断）した。これによって、親の円
形構造から２つの線状分子（そｎらは不規則に会合でき
る）、即ちプラスミドｐＲＯ１６０１からの可能な４断
片の１つと、プラスミドｐＢＲ３２２がら誘導されたＤ
ＮＡの線状単一断片が得られた。
の部分がプラスミドｐＢＲ３２２からの類但遺伝子の部
分と接合できて、この場合１つの場所で接合した雑種分
子にカルペニシリン耐性の保存上もたらすという仮説を
試験するために、プラスミドｐＲｏ １６０１およびプ
ラスミドｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉで分割（又は切断）した。これによって、親の円
形構造から２つの線状分子（そｎらは不規則に会合でき
る）、即ちプラスミドｐＲＯ１６０１からの可能な４断
片の１つと、プラスミドｐＢＲ３２２がら誘導されたＤ
ＮＡの線状単一断片が得られた。
ＤＮＡ組換え技術、即ちプラスミドの分割、連結および
テトラサイクリンに対する抵抗性獲得用選択をも・つた
形質転換を行なうことによって２グル−プ（制限エンド
ヌクレアーゼで地図を作ることにより後で判定した）の
組換え体プラスミドが得られた。
テトラサイクリンに対する抵抗性獲得用選択をも・つた
形質転換を行なうことによって２グル−プ（制限エンド
ヌクレアーゼで地図を作ることにより後で判定した）の
組換え体プラスミドが得られた。
ｐＲＯ１６１３の決定構造は次の可能性から期待される
ものに一致する：第２図のパネルＡに示すＯとＬ２１の
間およびＬ２１と２．９５の間の距離を横切るプラスミ
ドｐＲＯ１６０１ＰｓｔＩ断片の再会合。しかしながら
、理論的に、これは得られたプラスミドｐＲＯ１６１３
について第２図のパネルＢに示すものではない２つのＰ
ｓｔＩの部位を有するプラスミドを生成する。従って、
他の系の先例に基いて、ｐＲＯ１６０１地図上の０と２
．９５におけるＤＮＡは、ＰｓｔＩの座位の欠失をさせ
るが細菌培養の成長および生殖中に細菌およびその子孫
細胞によってプラスミドの生存に必要な閉鎖リング構造
を再形成させる過程において、未知の要素によって変え
られたらしい。プラスミドｐＲＯ１６１３は、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔＩｉ生んだＤＮＡ断片のクローニ
ング用に潜在的に有用である（その存在は、代謝物質の
ＤＮＡクローンド断片内の体現によって確認できる。
ものに一致する：第２図のパネルＡに示すＯとＬ２１の
間およびＬ２１と２．９５の間の距離を横切るプラスミ
ドｐＲＯ１６０１ＰｓｔＩ断片の再会合。しかしながら
、理論的に、これは得られたプラスミドｐＲＯ１６１３
について第２図のパネルＢに示すものではない２つのＰ
ｓｔＩの部位を有するプラスミドを生成する。従って、
他の系の先例に基いて、ｐＲＯ１６０１地図上の０と２
．９５におけるＤＮＡは、ＰｓｔＩの座位の欠失をさせ
るが細菌培養の成長および生殖中に細菌およびその子孫
細胞によってプラスミドの生存に必要な閉鎖リング構造
を再形成させる過程において、未知の要素によって変え
られたらしい。プラスミドｐＲＯ１６１３は、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔＩｉ生んだＤＮＡ断片のクローニ
ング用に潜在的に有用である（その存在は、代謝物質の
ＤＮＡクローンド断片内の体現によって確認できる。
プラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４の決定構造
は、クローニング・ベクター・プラスミドｐＲＯ１６０
１の一部およびクローンド断片（この場合はプラスミド
ｐｓＲｓ２２）２含む雑種−糾換え体プラスミドに期待
される構造に一致している。さらに、この組換え体１）
ＲＯＬ６１１１の形成およびその緑膿菌への形質転換は
、今はカルペニシリン耐性およびテトラサイクリン耐性
である細菌の発生を伴う。従って、前記仮説を設けたよ
うに、カルペニシリン耐性遺伝子の部分はプラスミドｐ
ＲＯ１６０１から誘導され（Ｌ２１の所に示すＰＳｔＩ
の座位の左側の領域）、そしてカルペニシリン遺伝子の
部分は挿入したＤＮＡ断片（プラスミドｐＢＲ３２２の
部分であるから誘導（第２図のパネルＣに示すＬ２１の
右側の領域）されたことは明らかである。
は、クローニング・ベクター・プラスミドｐＲＯ１６０
１の一部およびクローンド断片（この場合はプラスミド
ｐｓＲｓ２２）２含む雑種−糾換え体プラスミドに期待
される構造に一致している。さらに、この組換え体１）
ＲＯＬ６１１１の形成およびその緑膿菌への形質転換は
、今はカルペニシリン耐性およびテトラサイクリン耐性
である細菌の発生を伴う。従って、前記仮説を設けたよ
うに、カルペニシリン耐性遺伝子の部分はプラスミドｐ
ＲＯ１６０１から誘導され（Ｌ２１の所に示すＰＳｔＩ
の座位の左側の領域）、そしてカルペニシリン遺伝子の
部分は挿入したＤＮＡ断片（プラスミドｐＢＲ３２２の
部分であるから誘導（第２図のパネルＣに示すＬ２１の
右側の領域）されたことは明らかである。
従って、この結果は無関係のＤＮＡ（プラスミドｐＢＲ
５２２）のクローニング用にプラスミドｐＲＯ１６０１
が有用であることを示している。
５２２）のクローニング用にプラスミドｐＲＯ１６０１
が有用であることを示している。
また、この結果は大きさは小さいが親のプラスミドＤＮ
Ａ分子ｐＲＯ１６０１よシも高有用性である関連の派生
プラスミドの誘導を示す。 ２宿主細菌による維持に
必要なプラスミドｐＲＯ１６０１の重要な特徴に関する
別の情報もこれらの実験によシ提供される、即ち第２図
のペネルＡ、ＢおよびＣでα０５〜０．８８の地図単位
（０，８３メガダルトンの距離がある）領域が図示した
全てのプラスミドに共通している。従って、これはプラ
スミドｐＲＯ１６００に最初に存在するプラスミドＤＮ
Ａの領域であってプラスミド・クローニング・ベクター
およびその可能な誘導体の複製および維持に必須なもの
である。０．０５および０．８ｇ地図単位における制限
エンドヌクレアーゼ酵素の座位によって画定されるこの
領域は本発明の重要な実施態様である。
Ａ分子ｐＲＯ１６０１よシも高有用性である関連の派生
プラスミドの誘導を示す。 ２宿主細菌による維持に
必要なプラスミドｐＲＯ１６０１の重要な特徴に関する
別の情報もこれらの実験によシ提供される、即ち第２図
のペネルＡ、ＢおよびＣでα０５〜０．８８の地図単位
（０，８３メガダルトンの距離がある）領域が図示した
全てのプラスミドに共通している。従って、これはプラ
スミドｐＲＯ１６００に最初に存在するプラスミドＤＮ
Ａの領域であってプラスミド・クローニング・ベクター
およびその可能な誘導体の複製および維持に必須なもの
である。０．０５および０．８ｇ地図単位における制限
エンドヌクレアーゼ酵素の座位によって画定されるこの
領域は本発明の重要な実施態様である。
以上の外に、本発明の開発において記載されたプラスミ
ドの制限エンドヌクレアーゼ消化分析によって、ＲＰｌ
から独立してプラスミドｐＲＯ１６００の遺伝地図の推
論をすることができる。
ドの制限エンドヌクレアーゼ消化分析によって、ＲＰｌ
から独立してプラスミドｐＲＯ１６００の遺伝地図の推
論をすることができる。
その制限エンドヌクレアーゼ消化地図を第２図のパネル
Ｄに示す。
Ｄに示す。
本発明は特に、制限エンドヌクレアーゼでの染色体分割
により得られた染色体ＤＮＡ断片を広宿主域のレプリケ
ータ−・プラスミドへ添加することからなる方法に関す
る。このプラスミドと染色体ＤＮＡ断片の混和体は次に
リガーゼによる処理および組換えＤＮＡの適当な細菌宿
主への形質転換を受ける。
により得られた染色体ＤＮＡ断片を広宿主域のレプリケ
ータ−・プラスミドへ添加することからなる方法に関す
る。このプラスミドと染色体ＤＮＡ断片の混和体は次に
リガーゼによる処理および組換えＤＮＡの適当な細菌宿
主への形質転換を受ける。
この系列のクローニング実験用ＤＮＡ源はプラスミドｐ
ＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４と緑膿菌株ＰＡＯ染色体
であった。これら実験の目的は、細菌細胞の生合成活性
に寄与する特定の代謝機能を組み込んだ染色体上の遺伝
的場所に対応する染色体ＤＮＡ断片をクローニングする
ためのｐＲＯ１６１１ｔの有用性を示すことであった。
ＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４と緑膿菌株ＰＡＯ染色体
であった。これら実験の目的は、細菌細胞の生合成活性
に寄与する特定の代謝機能を組み込んだ染色体上の遺伝
的場所に対応する染色体ＤＮＡ断片をクローニングする
ためのｐＲＯ１６１１ｔの有用性を示すことであった。
このために、菌株ＰＡＯ２５６と呼ぶ緑膿菌の突然変異
体を形質転換−クローニング受容菌として使用した（
Ｄ、Ｈａａｓ ａｎｄＢ、 ＨＯ１１０Ｗａ７１ ＭＯ
ｌｅＣｕｌａｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ １ｕｌ＋ ： ２５１ （１９７６）参照）。残
菌の緑膿菌株ＰＡＯ１ｃ （ＡＴＣＣ１５６９２）と異
なり、菌株ＰＡ○２３６は突然変異したが、細胞合成と
成長を維持するための成長媒質にアミノ酸のＬ−インロ
イシン、Ｌ−バリンおよびＬ−メチオンの添加を要した
。従って、これらのアミノ酸栄養の要求は、これら化合
物の合成と関係した染色体ＤＮＡ断片を含む組換え体ク
ローンの選択を許す：適当なりローノドＤＮＡ断片全受
入した細菌はアミノ酸がない時に成長能力を得る。また
、この原理を適用することから、組換え体プラスミド（
この場合はｐＲＯ１６１Ｂにクローニングまたは染色体
ＤＮＡ断片を加えたもの）がプラスミドｐＲＯ１６１１
４の分子よシも大きくなるという結果になる（これは分
子のクローニング・プロセスにおいて付加ＤＮＡの獲得
を表わす）。広細菌宿主域のレプリケータ−・プラスミ
ドｐＲＯ１６１３にクローニングされたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＤＮＡの中に、抗生物質テトラサイクリンに
対する耐性を特定する遺伝情報が含まれる。
体を形質転換−クローニング受容菌として使用した（
Ｄ、Ｈａａｓ ａｎｄＢ、 ＨＯ１１０Ｗａ７１ ＭＯ
ｌｅＣｕｌａｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ １ｕｌ＋ ： ２５１ （１９７６）参照）。残
菌の緑膿菌株ＰＡＯ１ｃ （ＡＴＣＣ１５６９２）と異
なり、菌株ＰＡ○２３６は突然変異したが、細胞合成と
成長を維持するための成長媒質にアミノ酸のＬ−インロ
イシン、Ｌ−バリンおよびＬ−メチオンの添加を要した
。従って、これらのアミノ酸栄養の要求は、これら化合
物の合成と関係した染色体ＤＮＡ断片を含む組換え体ク
ローンの選択を許す：適当なりローノドＤＮＡ断片全受
入した細菌はアミノ酸がない時に成長能力を得る。また
、この原理を適用することから、組換え体プラスミド（
この場合はｐＲＯ１６１Ｂにクローニングまたは染色体
ＤＮＡ断片を加えたもの）がプラスミドｐＲＯ１６１１
４の分子よシも大きくなるという結果になる（これは分
子のクローニング・プロセスにおいて付加ＤＮＡの獲得
を表わす）。広細菌宿主域のレプリケータ−・プラスミ
ドｐＲＯ１６１３にクローニングされたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＤＮＡの中に、抗生物質テトラサイクリンに
対する耐性を特定する遺伝情報が含まれる。
クローニングされた断片のこの領域内には、制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨ１用の認識座位もある。
ヌクレアーゼＢａｍＨ１用の認識座位もある。
従って、この関係から、クローニングされたＤＮＡ断片
のインビトロでの挿入によるこのテトラサイクリン耐性
遺伝子の連続性の中断はこの遺伝子により特定さｎたテ
トラサイクリン耐性を無効にするという結果になる。さ
らに、クローニングされたＤＮＡ断片の選択が特定代謝
特質の獲得に基〈ならば、適当な組換体プラスミドを受
入した細菌は間助の特定代謝特質に対応する代謝産物が
なくて成長するであろう。そのような菌株は前述の方法
で得られた、そして七ｎらのプラスミド抽出後の七ｎら
のＤＮＡ全第３図に示す。第５図において、Ｂ列は大き
さの基準として用いた基準のＤＮＡを含んでいる。０列
はプラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４を示し、
Ａ列はプラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４のＤ
ＮＡ断片が今やアミノ酸のイソロイシンとＬ−バリンが
なくて菌株ＰＡＯ２３６Ｑ成長さすｐ Ｒ０１６１５と
呼ぶプラスミドを示し、Ｄ列はプラスミドｐＦｌ。
のインビトロでの挿入によるこのテトラサイクリン耐性
遺伝子の連続性の中断はこの遺伝子により特定さｎたテ
トラサイクリン耐性を無効にするという結果になる。さ
らに、クローニングされたＤＮＡ断片の選択が特定代謝
特質の獲得に基〈ならば、適当な組換体プラスミドを受
入した細菌は間助の特定代謝特質に対応する代謝産物が
なくて成長するであろう。そのような菌株は前述の方法
で得られた、そして七ｎらのプラスミド抽出後の七ｎら
のＤＮＡ全第３図に示す。第５図において、Ｂ列は大き
さの基準として用いた基準のＤＮＡを含んでいる。０列
はプラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４を示し、
Ａ列はプラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４のＤ
ＮＡ断片が今やアミノ酸のイソロイシンとＬ−バリンが
なくて菌株ＰＡＯ２３６Ｑ成長さすｐ Ｒ０１６１５と
呼ぶプラスミドを示し、Ｄ列はプラスミドｐＦｌ。
１６１３、ｐＲＯ１６１４のクローニングされ７’ＣＤ
ＮＡ断片が今やアミノ酸のＬ−メチオニンがなくて菌株
ＰＡＯ２３６を成長さすｐＲＯ１６１６と呼ぶプラスミ
ドを示す。Ａ列とＤ列に示す組換え体プラスミドがｐＲ
Ｏ１６１１Ｌよシ大きいことは明らかである。
ＮＡ断片が今やアミノ酸のＬ−メチオニンがなくて菌株
ＰＡＯ２３６を成長さすｐＲＯ１６１６と呼ぶプラスミ
ドを示す。Ａ列とＤ列に示す組換え体プラスミドがｐＲ
Ｏ１６１１Ｌよシ大きいことは明らかである。
これは、組換え体ＤＮＡ技術の適用により異種のＤＮＡ
断片の獲得に関連した期待される関係である。
断片の獲得に関連した期待される関係である。
特定の説明
り工程
遺伝的クローニング・プラスミドを人工的、化学的に誘
導した非伝達性プラスミドの形にする特定の方法および
ＤＮＡの代表的断片の遺伝的クローニングへの利用は次
の通りである： （１）遺伝的転移実験に続いて、先祖のプラスミドＲＰ
Ｉの存在についてのルーチン分析中に突然変異プラスミ
ドの新規性および潜在的有用性の認−識（ｐＲＯ１６０
０の発生）； （２）特に不規則なプラスミドとして観察さｎる小プラ
スミドに抗生物質カルペニシリン耐性用の識別可能な表
現型特質の付加（プラスミドｐＲＯ１６０１の産生）； （３）制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドｐＲ
ｏ １６０１の物理的遺伝子地図の作製；（ＩＬＩ
プラスミドｐＲＯ１６０１のサイズ縮少（プラスミドｐ
ＲＯ１６１５の産生）、プラスミドｐＢＲ３２２のプラ
スミドｐＲＯ１６０１への遺伝的クローニング（プラス
ミドｐＲＯ１６１１４の産生）；および （５１ＤＮＡ組換え技術を用いて、Ｌ−インロイシンお
よびＬ−バリンまたはＬ−メチオニンのない時に菌株Ｐ
ＡＯ２３６による成長と関連した細菌染色体ＤＮＡの遺
伝的クローニング。
導した非伝達性プラスミドの形にする特定の方法および
ＤＮＡの代表的断片の遺伝的クローニングへの利用は次
の通りである： （１）遺伝的転移実験に続いて、先祖のプラスミドＲＰ
Ｉの存在についてのルーチン分析中に突然変異プラスミ
ドの新規性および潜在的有用性の認−識（ｐＲＯ１６０
０の発生）； （２）特に不規則なプラスミドとして観察さｎる小プラ
スミドに抗生物質カルペニシリン耐性用の識別可能な表
現型特質の付加（プラスミドｐＲＯ１６０１の産生）； （３）制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドｐＲ
ｏ １６０１の物理的遺伝子地図の作製；（ＩＬＩ
プラスミドｐＲＯ１６０１のサイズ縮少（プラスミドｐ
ＲＯ１６１５の産生）、プラスミドｐＢＲ３２２のプラ
スミドｐＲＯ１６０１への遺伝的クローニング（プラス
ミドｐＲＯ１６１１４の産生）；および （５１ＤＮＡ組換え技術を用いて、Ｌ−インロイシンお
よびＬ−バリンまたはＬ−メチオニンのない時に菌株Ｐ
ＡＯ２３６による成長と関連した細菌染色体ＤＮＡの遺
伝的クローニング。
乙 使用菌株
遺伝的クローニング用プラスミドの発生および確認に用
いた細菌株およびそれらの顕著な特色は次の通りである
： （１） 緑膿菌ＰＡＯ２：この菌株は緑膿菌１ｃ（Ａ
Ｔ ＣＣＮα１５６９２）の突然変異体であシ、その成
長および維持にアミノ酸のセリンを必要とする。
いた細菌株およびそれらの顕著な特色は次の通りである
： （１） 緑膿菌ＰＡＯ２：この菌株は緑膿菌１ｃ（Ａ
Ｔ ＣＣＮα１５６９２）の突然変異体であシ、その成
長および維持にアミノ酸のセリンを必要とする。
（２）緑膿菌ＰＡＯ２（ＲＰＩ）：この菌株は前記ＰＡ
Ｏ２（ＲＰ １ ） ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１２３から細
菌接合のプロセスでプラスミドＲＰＩの付加により前記
菌株ＰＡＯ２から誘導された。
Ｏ２（ＲＰ １ ） ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１２３から細
菌接合のプロセスでプラスミドＲＰＩの付加により前記
菌株ＰＡＯ２から誘導された。
（３） シュードモナス・プチダＰＰＯｌ ５１ ：
この菌株はシュードモナス・プチダＡ、３．１２（ＡＴ
ＣＣＮｃＬ１２６５３）の突然変異体であり、その成長
および維持にアミノ酸のヒスチジンを必要とした。
この菌株はシュードモナス・プチダＡ、３．１２（ＡＴ
ＣＣＮｃＬ１２６５３）の突然変異体であり、その成長
および維持にアミノ酸のヒスチジンを必要とした。
体）螢光菌ＰＦ’０１１１１：この分離体は自然界から
分離さｎた野生型菌株から誘導された。この菌株のクロ
ーンは５２℃以上の温度でその成長と増殖が不能になっ
た。従って、この生理学的特性が細菌の成長を効果的に
抑制する、従ってそのプラスミドは哺乳動物環境全排除
する。螢光菌ＰＦ’０１ヰ１は成長および維持にアミノ
酸のヒスチジンを必要とする野生型菌株の突然変異体で
ある。
分離さｎた野生型菌株から誘導された。この菌株のクロ
ーンは５２℃以上の温度でその成長と増殖が不能になっ
た。従って、この生理学的特性が細菌の成長を効果的に
抑制する、従ってそのプラスミドは哺乳動物環境全排除
する。螢光菌ＰＦ’０１ヰ１は成長および維持にアミノ
酸のヒスチジンを必要とする野生型菌株の突然変異体で
ある。
（５）大腸菌ＥＤＩＩ！６５１１：この菌株は大腸菌に
１２の誘導された、そしてその成長と維持にアミノ酸の
メチオニンを必要とする。この菌株も突然変異したもの
でＤＮＡ’ｉ制限或いは修飾しない。
１２の誘導された、そしてその成長と維持にアミノ酸の
メチオニンを必要とする。この菌株も突然変異したもの
でＤＮＡ’ｉ制限或いは修飾しない。
（６） アゾトバクタ−・パイネランデイＡＶＭ１０
０ ：これは自然界から分離された菌株である。
０ ：これは自然界から分離された菌株である。
（７）肺炎桿菌ＫＰＯ１００：これは自然界から分離さ
れた菌株である。
れた菌株である。
Ｎ８１ 大腸菌ＰＡＯ２５６：この菌株は緑膿菌１ｃ
（ＡＴＣＣＮ１１５６９２）の突然変異体であり、突然
変異にはインロイシン、バリン、メチオニン、その他の
アミノ酸を必要とした。
（ＡＴＣＣＮ１１５６９２）の突然変異体であり、突然
変異にはインロイシン、バリン、メチオニン、その他の
アミノ酸を必要とした。
前記培養菌は全てミシガン大学医学部の微生物学科の培
養菌集積所に保管されていて、適性な受容菌に自由に利
用できる。そのような培養菌は他の貯蔵所からも入手す
ることができる。
養菌集積所に保管されていて、適性な受容菌に自由に利
用できる。そのような培養菌は他の貯蔵所からも入手す
ることができる。
工材料
前記細菌株の日常的な維持および増殖に使用さｎた細菌
学的媒質は次の成分を含有した：バクトートリプトン
５１バクトーイースト・エキス Ｎ７
５．９デキストロース ＩＪＦＫＮｏ
、 Ｉ１１蒸留水
１０００ｍ固体媒質を使用した時は、滅菌
前にバクト・アガール（１５ｇ）を添加した。媒質は１
２１℃の温度で１５分間オートクレーブで処理すること
により滅菌さ九た。滅菌処理後、前記媒質に抗生物質を
添加して５０℃に冷却した。プラスミドＤＮＡが受容菌
に添加され、抗生物質耐性を特定するプラスミドの取込
みおよび維持のための選択が行なわれた。カルペニシリ
ンには０．５ ｍｇ ／ ｒｕｇ、テトラサイクリンに
は大腸菌ＰＡＯ２ｉ除いて０．０２５１１９／Ｍであっ
た。この菌株に、テトラサイクリンをｏ、 ０５ ｍｙ
／ｍｌ （媒質）添加した。
学的媒質は次の成分を含有した：バクトートリプトン
５１バクトーイースト・エキス Ｎ７
５．９デキストロース ＩＪＦＫＮｏ
、 Ｉ１１蒸留水
１０００ｍ固体媒質を使用した時は、滅菌
前にバクト・アガール（１５ｇ）を添加した。媒質は１
２１℃の温度で１５分間オートクレーブで処理すること
により滅菌さ九た。滅菌処理後、前記媒質に抗生物質を
添加して５０℃に冷却した。プラスミドＤＮＡが受容菌
に添加され、抗生物質耐性を特定するプラスミドの取込
みおよび維持のための選択が行なわれた。カルペニシリ
ンには０．５ ｍｇ ／ ｒｕｇ、テトラサイクリンに
は大腸菌ＰＡＯ２ｉ除いて０．０２５１１９／Ｍであっ
た。この菌株に、テトラサイクリンをｏ、 ０５ ｍｙ
／ｍｌ （媒質）添加した。
４、温度
シュードモナス・プチダ又は螢光菌を利用する実験は２
５℃で行ない、他の実験は全て５７℃で行なった。
５℃で行ない、他の実験は全て５７℃で行なった。
これはプラスミドｐＲｏ１６００に選択遺伝標識の付加
実験（プラスミドｐＲＯ１６０１の生成）である。
実験（プラスミドｐＲＯ１６０１の生成）である。
この実験には、緑膿菌ＰＡ○２（ＲＰＩ）または緑膿菌
（ＲＰ １／ｐＲｏ ｌ ６００ ）から誘導され、部
分的に精製されたＤＮＡ懸濁液が緑膿菌ＰＡＯ２の成長
培養菌に添加された。細菌の形質転換の周知プロセスに
伴う実験操作に続いて、混和物を抗生物質カルペニシリ
ンを含んだ固体媒質の表面に置いた。これを３７℃で２
１１時間培養した、そして細菌群体の数を計数した。代
表的な実験結果を第１表に示す。カルペニシリンの存在
下で成長できるように選んだこｎらの群体は、さらに抗
生物質のテトラサイクリン又はカナマイシンを含む栄養
培地で増殖させた。
（ＲＰ １／ｐＲｏ ｌ ６００ ）から誘導され、部
分的に精製されたＤＮＡ懸濁液が緑膿菌ＰＡＯ２の成長
培養菌に添加された。細菌の形質転換の周知プロセスに
伴う実験操作に続いて、混和物を抗生物質カルペニシリ
ンを含んだ固体媒質の表面に置いた。これを３７℃で２
１１時間培養した、そして細菌群体の数を計数した。代
表的な実験結果を第１表に示す。カルペニシリンの存在
下で成長できるように選んだこｎらの群体は、さらに抗
生物質のテトラサイクリン又はカナマイシンを含む栄養
培地で増殖させた。
第１表に示す結果は、緑膿菌ＰＡＯ２（ＲＰＩ／ｐＲＯ
１６００）のＤＮ八へ濁液から得た形質転換体の８％だ
けがカルペニシリン耐性を獲得して、テトラサイクリン
又はカナマイシン耐性は獲得できなかったことを示す。
１６００）のＤＮ八へ濁液から得た形質転換体の８％だ
けがカルペニシリン耐性を獲得して、テトラサイクリン
又はカナマイシン耐性は獲得できなかったことを示す。
従って、この結果は、前記技術的背景の検討の所で示唆
したように、Ｔｎ １トランスポゾン全もったｐＲＯ１
６００が形質転換されたことを示唆する。一方、緑膿菌
ＰＡＯ２（ＲＰＩ）のＤＮＡ懸濁液を使用して誘導され
た形質転換体は、この菌株が潜在的トランスポゾン受容
菌プラスミドとしてプラスミドＩ）ＲＯ１６００を含ま
ないから、カルペニシリンのみに対する耐性をもった形
質転換体全生成しなかった。
したように、Ｔｎ １トランスポゾン全もったｐＲＯ１
６００が形質転換されたことを示唆する。一方、緑膿菌
ＰＡＯ２（ＲＰＩ）のＤＮＡ懸濁液を使用して誘導され
た形質転換体は、この菌株が潜在的トランスポゾン受容
菌プラスミドとしてプラスミドＩ）ＲＯ１６００を含ま
ないから、カルペニシリンのみに対する耐性をもった形
質転換体全生成しなかった。
実 施 例 ２
この実験はプラスミドｐＲＯ１６０１のサイズ減縮（プ
ラスミドｐＲＯ１６１５の生成）およびｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡのプラスミド１）ＲＯ１６０１へのクローニング（
プラスミドｐＲＯ１６１１４の生成）である。
ラスミドｐＲＯ１６１５の生成）およびｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡのプラスミド１）ＲＯ１６０１へのクローニング（
プラスミドｐＲＯ１６１１４の生成）である。
この実験には、第２表に示す部分的に精動したＤＮＡ溶
液を表記群累で処理した。形質転換体は前もってプラス
ミドを受は入れなかった緑膿菌ＰＡＯ２の細胞を使用し
て選択さ扛た。表記のように処理された種々のＤＮＡ標
本との混合の結果として細菌により獲得された抗生物質
耐性は表の右欄に示す。
液を表記群累で処理した。形質転換体は前もってプラス
ミドを受は入れなかった緑膿菌ＰＡＯ２の細胞を使用し
て選択さ扛た。表記のように処理された種々のＤＮＡ標
本との混合の結果として細菌により獲得された抗生物質
耐性は表の右欄に示す。
上記実験から、プラスミドｐＢＲ３２２はそｎ自身で形
質転換できなかったことが注目される。
質転換できなかったことが注目される。
従って、プラスミドｐＲＯ１６０１にクローニングされ
た時そのテトラサイクリン耐性の表瑠は、中介体プラス
ミドｐＲＯ１６０１によって提供さｎた重要な機能との
共同によるその維持を表わす。
た時そのテトラサイクリン耐性の表瑠は、中介体プラス
ミドｐＲＯ１６０１によって提供さｎた重要な機能との
共同によるその維持を表わす。
こｎは、ｐＲＯ１６００から誘導されたプラスミドにつ
いて広細菌宿主域の実証実験である。
いて広細菌宿主域の実証実験である。
異なる生態的地位および生理学的性質の細菌にＤＮＡ組
換え技術を用いてクローニングの実験を行なう、のに本
発明の有用性に関してプラスミドｐＲＯ１６００（７）
誘導体（ｐＲＯ１６１３、ｐＲｏ １６１りの有用性を
示すために、形質転換−受容菌として緑膿菌ＰＡＯ２以
外の細菌を用いて細菌の形質転換の研究上行なった。代
表的な実験結果を第５表に示す。ＤＮＡの生成および抽
出の方法は前記ハンセンおよびオルセンの引例に記載さ
ｎている。
換え技術を用いてクローニングの実験を行なう、のに本
発明の有用性に関してプラスミドｐＲＯ１６００（７）
誘導体（ｐＲＯ１６１３、ｐＲｏ １６１りの有用性を
示すために、形質転換−受容菌として緑膿菌ＰＡＯ２以
外の細菌を用いて細菌の形質転換の研究上行なった。代
表的な実験結果を第５表に示す。ＤＮＡの生成および抽
出の方法は前記ハンセンおよびオルセンの引例に記載さ
ｎている。
この研究のために、０，０２５ＪＩ７緩衝溶液に懸濁し
た約α５μｓのＤＮＡが約１×１０受容菌細胞（０，２
１ｎｌの体積）に添加さ几た。その溶液はレーデルブル
グら、（Ｄ、Ｅ、Ｌｅｄｅｒｂｕｒｇ ａｎｄ Ｓ、Ｎ
、Ｃｏｈｅｎ。
た約α５μｓのＤＮＡが約１×１０受容菌細胞（０，２
１ｎｌの体積）に添加さ几た。その溶液はレーデルブル
グら、（Ｄ、Ｅ、Ｌｅｄｅｒｂｕｒｇ ａｎｄ Ｓ、Ｎ
、Ｃｏｈｅｎ。
Ｊ、Ｂａｃｔ、Ｖｏｌ、 １１９． ｐｐ １０７２〜
１０７１１（１９７Ｊ）。
１０７１１（１９７Ｊ）。
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ５ａｌｎｎｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｎｉｕｍｂ’ｙ ｐｌａｓｍｉｄ
Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ’）の
方法で０℃と１１５℃の間をサイクル加熱された。この
混和体は、細菌形質転換の周知方法に伴う実験操作に続
いて抗生物質を含んで固体媒質の表面に置いた。これを
５７℃の温度で４ｇ時間培養して細菌群体の数を計数し
た。こｎらの実験結果を第５表に示す。
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｎｉｕｍｂ’ｙ ｐｌａｓｍｉｄ
Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ’）の
方法で０℃と１１５℃の間をサイクル加熱された。この
混和体は、細菌形質転換の周知方法に伴う実験操作に続
いて抗生物質を含んで固体媒質の表面に置いた。これを
５７℃の温度で４ｇ時間培養して細菌群体の数を計数し
た。こｎらの実験結果を第５表に示す。
第５表に示した実験は、プラスミドｐＲｏ １６０ 。
から誘導さｎたプラスミドの広宿王域の特ｇ１を明示し
ている。使用した菌株での形質転換効率の変動は、多分
問題の菌株に最適でない形質転換プロセスを採用したこ
とに関連していると思われる。
ている。使用した菌株での形質転換効率の変動は、多分
問題の菌株に最適でない形質転換プロセスを採用したこ
とに関連していると思われる。
従って、これらの結果の定量的解釈は、形質転換効率の
低い細菌での遺伝的クローニング実験用にプラスミドｐ
Ｒｏ ｌ ６００−誘導体の有用性を決、して限定する
ものではない。これらの場合に、問題の細菌株について
の細菌形質転換プロセスにおける改良は、将来において
これらの菌株を用いて形質転換自体の効率を高めるべき
である。
低い細菌での遺伝的クローニング実験用にプラスミドｐ
Ｒｏ ｌ ６００−誘導体の有用性を決、して限定する
ものではない。これらの場合に、問題の細菌株について
の細菌形質転換プロセスにおける改良は、将来において
これらの菌株を用いて形質転換自体の効率を高めるべき
である。
本例は、組換え体プラスミドｐＲＯｌ ６１ ｕｆ使用
して緑膿菌から染色体ＤＮＡの分子クローニングを実証
するものである。
して緑膿菌から染色体ＤＮＡの分子クローニングを実証
するものである。
細菌の染色体遺伝子のクローニングにＤＮＡ組換え技術
を使用してクローニング実験を行なうのに本発明の有用
性に関して誘導プラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６
１４の効用を示すべく、アミノ酸のＬ−イソロイシン、
Ｌ−バリンおよびＬ−メチオニンの生合成と関連した細
菌遺伝子の選択（又は淘汰）および分離のためにクロー
ニング実験を行なった。
を使用してクローニング実験を行なうのに本発明の有用
性に関して誘導プラスミドｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６
１４の効用を示すべく、アミノ酸のＬ−イソロイシン、
Ｌ−バリンおよびＬ−メチオニンの生合成と関連した細
菌遺伝子の選択（又は淘汰）および分離のためにクロー
ニング実験を行なった。
染色体およびプラスミドＤＮＡの生成方法は前記ハンセ
ンとオルセンの引例に記載されている。
ンとオルセンの引例に記載されている。
この実験には、ＰＡＯｌｃから抽出した染色体ＤＮＡ又
はプラスミドｐＲＯ１６１１４ＤＮＡ約０５μＩが０．
０２５ ｍｌの緩衝液に懸濁され、制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨｌで消化され友。次にそれぞれの溶液を混
合し、酵素Ｔ４リガーゼおよび共同因子で処理した。こ
の混合体は、細菌の形質転換法に伴う実験操作に続いて
、アミノ酸のＬ−インロイシンとＬ−バリンの場合、お
よび別のアミノ酸のＬ−メチオニンの場合を除いて緑膿
菌による成長に必要な栄養素を補給された固体培地の表
面に置かれた。前記選択培地の各々に細菌成長の単一群
体が現わｎた（１０個の受容菌に１個の頻度）。これら
の組換え体ＤＮＡプラスミドが形質転換の受容菌から抽
出される時、得られたＤＮＡはさらに別の受容菌への形
質転換によるテスト時に高形質転換頻度を示す。アミノ
酸の生合成獲得の頻度はこｎら実験におけるカルペニシ
リン耐性獲得の頻度に対応する。次に、こｎらの解体は
プラスミドＤＮＡの生成のために精鯛、成長さｎる。
はプラスミドｐＲＯ１６１１４ＤＮＡ約０５μＩが０．
０２５ ｍｌの緩衝液に懸濁され、制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨｌで消化され友。次にそれぞれの溶液を混
合し、酵素Ｔ４リガーゼおよび共同因子で処理した。こ
の混合体は、細菌の形質転換法に伴う実験操作に続いて
、アミノ酸のＬ−インロイシンとＬ−バリンの場合、お
よび別のアミノ酸のＬ−メチオニンの場合を除いて緑膿
菌による成長に必要な栄養素を補給された固体培地の表
面に置かれた。前記選択培地の各々に細菌成長の単一群
体が現わｎた（１０個の受容菌に１個の頻度）。これら
の組換え体ＤＮＡプラスミドが形質転換の受容菌から抽
出される時、得られたＤＮＡはさらに別の受容菌への形
質転換によるテスト時に高形質転換頻度を示す。アミノ
酸の生合成獲得の頻度はこｎら実験におけるカルペニシ
リン耐性獲得の頻度に対応する。次に、こｎらの解体は
プラスミドＤＮＡの生成のために精鯛、成長さｎる。
第５図は緑膿菌ＰＡ０２５６からのプラスミドＤＮＡに
ついてのスラブ・アガロース・ゲル電気泳動写真の一部
を示す。細菌細胞は栄養のブイヨン媒質で成長させ、プ
ラスミドＤＮＡＦｉ第１図に関して記載したように抽出
そして処理さｆ′した。電気泳動させ；１ＤＮＡの試料
は次の通りである二ＡはＬ−インロイシン又はＬ−バリ
ンなしに成長できる形質転換体クローンから抽出したＤ
ＮＡ（ｐＲＯ１６１５）；Ｂは大腸菌ｖ５１７からのＤ
ＮＡであって、大きさの標準として使用した菌株を含む
多重プラスミド；Ｃは緑膿ＷＰＡＯ２（ｐＲＯ１６１３
、ｐＲＯ１６１４）からのＤＮＡ；ＤはＬ−メチオニン
なしに成長できる形質転換クローンから抽出したＤＮＡ
（ｐＲＯ１６１６）。これら組換え体プラスミドの算定
した分子の大きさはＡ列のプラスミドが１ＬＬ×１０ダ
ルトン、そしてＤ列のプラスミドがｌｏ、 ｕ ｘ １
ｆダルトンである。
ついてのスラブ・アガロース・ゲル電気泳動写真の一部
を示す。細菌細胞は栄養のブイヨン媒質で成長させ、プ
ラスミドＤＮＡＦｉ第１図に関して記載したように抽出
そして処理さｆ′した。電気泳動させ；１ＤＮＡの試料
は次の通りである二ＡはＬ−インロイシン又はＬ−バリ
ンなしに成長できる形質転換体クローンから抽出したＤ
ＮＡ（ｐＲＯ１６１５）；Ｂは大腸菌ｖ５１７からのＤ
ＮＡであって、大きさの標準として使用した菌株を含む
多重プラスミド；Ｃは緑膿ＷＰＡＯ２（ｐＲＯ１６１３
、ｐＲＯ１６１４）からのＤＮＡ；ＤはＬ−メチオニン
なしに成長できる形質転換クローンから抽出したＤＮＡ
（ｐＲＯ１６１６）。これら組換え体プラスミドの算定
した分子の大きさはＡ列のプラスミドが１ＬＬ×１０ダ
ルトン、そしてＤ列のプラスミドがｌｏ、 ｕ ｘ １
ｆダルトンである。
インロイシンおよびバリン生成合の組換え体クローン（
Ａ列）又はメチオニン生合成（Ｄ列）はプラスミドｐＲ
Ｏ１６１３、ｐＲＯ１６１４クローニング・ベクター（
Ｃ列）よシ明らかに大きい。この関係は、ＤＮＡの組換
え技術を用いて問題のアミノ酸の生成合を導く染色体Ｄ
ＮＡの獲得を表わしている。
Ａ列）又はメチオニン生合成（Ｄ列）はプラスミドｐＲ
Ｏ１６１３、ｐＲＯ１６１４クローニング・ベクター（
Ｃ列）よシ明らかに大きい。この関係は、ＤＮＡの組換
え技術を用いて問題のアミノ酸の生成合を導く染色体Ｄ
ＮＡの獲得を表わしている。
その組換え体プラスミドは予想通シヵルペニシリン耐性
を保持した。
を保持した。
本発明の新規プラスミドおよびＲＰＩは、国際寄託当局
であるノーザン・リージョナル研究所（Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）に寄託さｎている、そして次の国際受託番
号で請求することによシ自由に入手できる。また、そｎ
らプラスミドは内国参照番号で請求することによってミ
シガン大学からも入手することができる：ＲＰＩ
Ｂ−１２１２３ｐＲ）ＲＰＶ、４６０
０ Ｂ−１２１２ｕｐＲＯ１６０１Ｂ−
１２１２５ ｐＲｏ １６１３ Ｂ−１２１２６１）
ＲＯ１６１１４Ｂ −１２１２７ ｐＲＯ１６１５Ｂ−１２１ｕ９ ｐＲｏ １６１６ Ｂ −１２１ｎ ８
以上記載した実験の外に、本発明の範囲内において多く
の実験があシうることは明らがである。
であるノーザン・リージョナル研究所（Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）に寄託さｎている、そして次の国際受託番
号で請求することによシ自由に入手できる。また、そｎ
らプラスミドは内国参照番号で請求することによってミ
シガン大学からも入手することができる：ＲＰＩ
Ｂ−１２１２３ｐＲ）ＲＰＶ、４６０
０ Ｂ−１２１２ｕｐＲＯ１６０１Ｂ−
１２１２５ ｐＲｏ １６１３ Ｂ−１２１２６１）
ＲＯ１６１１４Ｂ −１２１２７ ｐＲＯ１６１５Ｂ−１２１ｕ９ ｐＲｏ １６１６ Ｂ −１２１ｎ ８
以上記載した実験の外に、本発明の範囲内において多く
の実験があシうることは明らがである。
第１図はスラブ・アガロース・ゲル電気泳動図形であっ
て、（Ａ）は先行技術のＲＰＩ；（ＤＪは電気泳動の大
きさ基準となる大腸菌Ｖ５１７；（Ｂ）のＲＰ１／ｐＲ
Ｏ１６００；および（Ｃ，Ｅ、およびＦ）は本発明のプ
ラスミドについてのものである。 第２図は、本発明の望ましいプラスミド（特にｐＲＯ１
６０１，ｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６
１４およびｐＲＯ１６００）についての制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩおよびＢＩＩＩ Ｉの遺伝地図（メガ
ダルトンで表わす）ｙ＆：示す。かっこ内の数値は制限
エンドヌクレアーゼ断片の分子の大きさくメガダルトン
で表わす）を示す。水平の実線の上下に示す数値は、プ
ラスミドｐＲＯ１６００に存在する単一のＰａｔＩ制限
エンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ分割位置で画定されるゼロ
点からの制限エンドヌクレアーゼ認識位置（メガダルト
ンで表わす）の地図距離である。 第５図はスラブ・アガロース・ゲル電気泳動図形を示し
、［Ｃ１は１１）ＲＯ１６１ヰ；Ｂは先行技術による大
腸菌Ｖ ５１７カらのＤＮＡ；（Ａ）および（Ｄｉはそ
ｎぞｎｐＲＯ１６１１Ｊの組換え修飾の結果として、Ｌ
−インロイシン又はＬ−バリンおよびＬ−メチオニンな
しに成長できる形質転換体クロンがらのＤＮＡ（１）Ｒ
Ｏ１６１５）、およびＤＮＡ（＋）ＲＯ１６１［））に
ついての図形である。 図面のｉうを広−（内容に変更なし） ＦＩ Ｇ、Ｉ ＦＩＧ、３ 手 続 補 正 書（方式） ％式％ １、事件の表示 デオキシリポ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸
送する方法３、補正する者 事件との関係 特許出願人 ４、代愈人
て、（Ａ）は先行技術のＲＰＩ；（ＤＪは電気泳動の大
きさ基準となる大腸菌Ｖ５１７；（Ｂ）のＲＰ１／ｐＲ
Ｏ１６００；および（Ｃ，Ｅ、およびＦ）は本発明のプ
ラスミドについてのものである。 第２図は、本発明の望ましいプラスミド（特にｐＲＯ１
６０１，ｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６
１４およびｐＲＯ１６００）についての制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩおよびＢＩＩＩ Ｉの遺伝地図（メガ
ダルトンで表わす）ｙ＆：示す。かっこ内の数値は制限
エンドヌクレアーゼ断片の分子の大きさくメガダルトン
で表わす）を示す。水平の実線の上下に示す数値は、プ
ラスミドｐＲＯ１６００に存在する単一のＰａｔＩ制限
エンドヌクレアーゼ−ＤＮＡ分割位置で画定されるゼロ
点からの制限エンドヌクレアーゼ認識位置（メガダルト
ンで表わす）の地図距離である。 第５図はスラブ・アガロース・ゲル電気泳動図形を示し
、［Ｃ１は１１）ＲＯ１６１ヰ；Ｂは先行技術による大
腸菌Ｖ ５１７カらのＤＮＡ；（Ａ）および（Ｄｉはそ
ｎぞｎｐＲＯ１６１１Ｊの組換え修飾の結果として、Ｌ
−インロイシン又はＬ−バリンおよびＬ−メチオニンな
しに成長できる形質転換体クロンがらのＤＮＡ（１）Ｒ
Ｏ１６１５）、およびＤＮＡ（＋）ＲＯ１６１［））に
ついての図形である。 図面のｉうを広−（内容に変更なし） ＦＩ Ｇ、Ｉ ＦＩＧ、３ 手 続 補 正 書（方式） ％式％ １、事件の表示 デオキシリポ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸
送する方法３、補正する者 事件との関係 特許出願人 ４、代愈人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細菌の接合、形質転換または形質導入のプロセスを
利用してデオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌
宿主に輸送する方法において、 （ａ）緑膿菌ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１２４、ＮＲＲＬ−Ｂ
−１２１２５、ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１２６、ＮＲＲＬ−
Ｂ−１２１２７、ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１４９およびＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１２１４８にそれぞれ担われたｐＲＯ１６０
０、ｐＲＯ１６０１、ｐＲＯ１６１３、ｐＲＯ１６１４
、ｐＲＯ１６１５およびｐＲＯ１６１６から選んだクロ
ーニング媒体としての第１のプラスミドと、（ｂ）第１
のプラスミドと第２のデオキシリボ核酸源のエンドヌク
レアーゼのエンドヌクレアーゼ分割によつて産生された
第１のプラスミドの組換えプラスミド・リング誘導体か
ら選んだデオキシリボ核酸プラスミド・リングを線状の
デオキシリボ核酸断片内に輸送し、該断片の連結反応を
させて、組換えプラスミドを形成させることからなり、
前記プラスミド・リングは緑膿菌ＰＡＯ ＡＴＣＣ １
５６９２ によつて担い運ばれることができると共に、
広細菌宿主域を有し、プラスミド自身は宿主細菌の細胞
分裂中にデオキシリボ核酸の複製によつてクローンを発
生し、クローニング媒体からのデオキシリボ核酸が細胞
分裂中の組換えプラスミドの複製を制御することを特徴
とするデオキシリボ核酸をインビボの細菌宿主に輸送す
る方法。 ２、前記組換えプラスミド・リングである第２のＤＮＡ
部分と結合された第１のプラスミド・リング部分が、宿
主細菌に所定の抗生物質耐性を与える表現型標識を有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法
。 ３、前記抗生物質耐性が抗生物質カルペニシリンに対す
るものであつて、前記プラスミドがｐＲＯ１６０１であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法
。 ４、プラスミドｐＲＯ１６０１が緑膿菌ＮＲＲＬ−Ｂ−
１２１２５に担い運ばれることを特徴とする特許請求の
範囲第３項に記載の方法。 ５、前記耐性が抗生物質カルペニシリンおよびテトラン
リンに対するものであつて、前記プラスミドがｐＲＯ１
６１４であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の方法。 ６、前記プラスミドが緑膿菌ＮＲＲＬ−Ｂ−１２１２７
に担い運ばれることを特徴とする特許請求の範囲第５項
に記載の方法。 ７、前記プラスミドがｐＲＯ１６１３であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US147563 | 1980-05-08 | ||
| US06/147,563 US4374200A (en) | 1980-05-08 | 1980-05-08 | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61234784A true JPS61234784A (ja) | 1986-10-20 |
| JPH0158949B2 JPH0158949B2 (ja) | 1989-12-14 |
Family
ID=22522070
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13943180A Granted JPS572299A (en) | 1980-05-08 | 1980-10-07 | Wide range host plasmid ring as cloning vector |
| JP61006630A Granted JPS61234784A (ja) | 1980-05-08 | 1986-01-17 | デオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送する方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13943180A Granted JPS572299A (en) | 1980-05-08 | 1980-10-07 | Wide range host plasmid ring as cloning vector |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4374200A (ja) |
| EP (1) | EP0039743A3 (ja) |
| JP (2) | JPS572299A (ja) |
| AU (1) | AU538600B2 (ja) |
| CA (1) | CA1150169A (ja) |
| DE (1) | DE39743T1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508823A (en) * | 1980-05-08 | 1985-04-02 | Microlife Technics, Inc. | Gene splicing method and products produced therefrom |
| US4508824A (en) * | 1980-05-08 | 1985-04-02 | Microlife Technics, Inc. | Pseudomonas degradation of hydrocarbons |
| US4508827A (en) * | 1980-05-08 | 1985-04-02 | Microlife Technics, Inc. | Molecular cloning vectors for use in gram-negative bacteria |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| US4654307A (en) * | 1983-02-17 | 1987-03-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code |
| US4567141A (en) * | 1983-04-25 | 1986-01-28 | Microlife Technics, Inc. | Plasmid vectors including Tn904 |
| US4593003A (en) * | 1983-05-19 | 1986-06-03 | Microlife Technics, Inc. | Bacterial method and compositions for isoprenoid degradation |
| ZA859400B (en) | 1984-12-10 | 1986-10-29 | Monsanto Co | Insertion of the bacillus thuringiensis crystal protein gene into plant-colonizing microorganisms and their use |
| US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
| AU590558B2 (en) * | 1985-04-30 | 1989-11-09 | Monsanto Company | Plant-colonizing microorganisms containing the toxin gene of b. thuringiensis as a chromosomal insertion |
| JPS63104406U (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-06 | ||
| JPH0519092Y2 (ja) * | 1987-03-06 | 1993-05-20 | ||
| WO2008136790A1 (en) | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Merial Limited | Dna plasmids having improved expression and stability |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
-
1980
- 1980-05-08 US US06/147,563 patent/US4374200A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-06-18 AU AU59374/80A patent/AU538600B2/en not_active Ceased
- 1980-06-27 DE DE198080103658T patent/DE39743T1/de active Pending
- 1980-06-27 EP EP80103658A patent/EP0039743A3/en not_active Withdrawn
- 1980-06-30 CA CA000355182A patent/CA1150169A/en not_active Expired
- 1980-10-07 JP JP13943180A patent/JPS572299A/ja active Granted
-
1986
- 1986-01-17 JP JP61006630A patent/JPS61234784A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0039743A3 (en) | 1982-10-27 |
| CA1150169A (en) | 1983-07-19 |
| AU5937480A (en) | 1981-11-12 |
| US4374200A (en) | 1983-02-15 |
| DE39743T1 (de) | 1983-02-03 |
| JPH0158949B2 (ja) | 1989-12-14 |
| JPS572299A (en) | 1982-01-07 |
| AU538600B2 (en) | 1984-08-23 |
| EP0039743A2 (en) | 1981-11-18 |
| JPS6359677B2 (ja) | 1988-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Olsen et al. | Development of broad-host-range vectors and gene banks: self-cloning of the Pseudomonas aeruginosa PAO chromosome | |
| Donohue et al. | [22] Genetic techniques in rhodospirillaceae | |
| JPH0691827B2 (ja) | 新規ベクタ−プラスミド | |
| US4626504A (en) | DNA transfer vector for gram-negative bacteria | |
| JPS61234784A (ja) | デオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送する方法 | |
| US4680264A (en) | Class II mobilizable gram-negative plasmid | |
| EP0057976B1 (en) | a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| US4338400A (en) | Co-integrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| US4649119A (en) | Cloning systems for corynebacterium | |
| US4340674A (en) | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| Duncan et al. | Transformation of Bacillus subtilis and Escherichia coli by a hybrid plasmid pCD1 | |
| Katsu et al. | Transposition of the carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamase gene | |
| US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| EP0091723A2 (en) | Vector system | |
| US4418194A (en) | DNA Fragments for forming plasmids | |
| Foster et al. | Genetic Analysis of Deletions of R1001 that are Both Transfer-deficient and Tetracycline-sensitive | |
| US4401761A (en) | Process for stabilizing plasmids by deletion of DNA | |
| US4686184A (en) | Gene transfer vector | |
| US5049501A (en) | Production method for PvuI restriction endonuclease | |
| JPS60156388A (ja) | Ｄνａおよびその用途 | |
| EP0035914A2 (en) | Plasmid vectors, plasmids and their preparation, and cloning processes using them | |
| CA1177420A (en) | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| JP2518051B2 (ja) | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 | |
| US4567141A (en) | Plasmid vectors including Tn904 | |
| Smith et al. | R-plasmid-mediated chromosome mobilization in Bordetella pertussis |