JPS61218600A - 卵胞刺激ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は卵胞刺激ホルモンの測定法、測定試薬、これに
好適なモノクロナール抗体、その取得法及びハイブリド
ーマ細胞系に関る、。

従来の技術 体液、例えば尿、血清及び同様に血漿中の卵胞刺激ホル
モン（ＦＳＨ）の測定は、主として、視床下部、下垂体
及び性腺の内分泌状態を評価る、ために使用される。こ
の試験は、特に性腺機能低下、子育症等の鑑別診断に役
立つ。更に、このＦＳＨ−測定は、妊娠の誘導の際の排
卵時点の測定のために使用される。

これらのすべての場合に、血清値は生理学的範囲内に存
在る、。更に、血清中のＦＳＨの濃度も、このホルモン
の生物学的作用に関る、情報を得るための目的だけにも
測定される。従って、実質的に、自然のホルモンの血清
濃度の認識は診断上重要である。

血清中のヒ）　ＦＢ）ｉの生理学的濃度は次の範囲内に
ある： 男　性　　　　　　　　　　＜１５ｍＩＵ屓閉経期前の
婦人（周期）　　１０ｍＩル欝排卵ぎ−り時の婦人　　
　２［）＝３０　ｍＩＵ／ａｕ閉経期後の婦人　　　　
　３０−８０　ｍＩＵ層ＦＳＨの測定のためには、特に
抗原としてのこのホルモンがこれに対応る、抗体１種以
上を用いて測定される免疫学的試験法が好適である。

このポリペプチド−ホルモンを用いる抗体取得は、すべ
てのポリペプチド−ホルモンは免疫性が悪いので、困難
と結びついている。ＦＳＨと他の糖蛋白質ホルモン例え
ば黄体形成ホルン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ８
Ｈ）又はヒト絨毛性ゴナドトロぎン（ｈＣＧ）との間の
ホルモン学に基づき、これらホルモンの１種に対る、特
異抗体を得ることは非常に困難である。これら糖蛋白質
−ホルモンに対応る、抗体は、通例、多かれ少なかれ他
の糖蛋白質−ホルモンとの交叉反応を有る、。

特異的にＦＳＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとの
交叉反応をしないモノクロナール抗体は、従来は知られ
ていない。従って、現在までのところでは、他の糖蛋白
質ホルモンを多かれ少なかれ共に検出る、ことなしにＦ
ＳＨ’ｉ免疫学的に測定る、ことは可能ではない。

発明が解決し゛ようとる、問題点 本発明の課題は、それ金柑いて、他のｍｆｒ白質−ホル
モンの存在でもＦＳＨを特異的に測定る、ことのできる
新規の免疫学的方法及び試薬金得ることであった。

問題点を解決る、ための手段 この課題は、本発明による免疫学的方法及び試薬で解決
される。

従って、本発明の目的は、特異的にＦＳＨに対応してい
て、他の糖蛋白質−ホルモンとは３％より少な（交叉反
応る、モノクロナール抗体少なくとも１ａ金用いる卵胞
刺激ホルモンの免疫学的測定法並びにこれに好適な試薬
である。

免疫学的測定法としては、原則的には、すベオ ての慣用のイムノアッセイ例えばラジ声イムノアッセイ
、酵素−イムノアッセイ、螢光−イムノ−アッセイ等が
好適である。更に、全体的な変法例えば競争的イムノア
ッセイ、サンドイツ可 チー法等も使用２能である。標識付けのためには、それ
ぞれの測定法に慣用の手段が好適である。従って、ラジ
オ−イムノアッセイの場合には、ラジオアイソトープ例
えば１２５Ｊが標識付けのために使用される。酵素−イ
ムノアッセイのためには、このために通例使用されるす
べての酵素、例えはペルオキシダーゼ又はβ−ガラクト
シダーゼが好適である。螢光−イムノアッセイのために
は、慣用の発光団がマーカーとして使用可能である。こ
れら種々の試験法及び変法の詳細は当業者にとって公知
である。ＦＳＨの種々の抗原決定因に対応していて、そ
のうちの少なくとも１種が他の糖蛋白質−ホルモンとは
３％よシ少なく交叉反応る、、少なくとも２種の本発明
によるモノクロナール抗体を使用る、試験変法が有利で
ある。

ＦＳＨの測定のためには、測定すべき抗ｉｔ−担体結合
され、標識付けられた抗体と接触させるサンドイッチ−
法が特に好適であると立証された。このような測定法の
ために、例えば本発明による特異的なモノクロナール抗
体を固定相に結合させることができる。これを、第１の
インキュベーション工程で、測定すべきＦＳＨ及び一般
に他の糖蛋白質ホルモンを含有る、試料と共にインキュ
ベートる、。この際、特異的抗体により選択的にＦＳＨ
が結合される。慣用の洗浄工程の後に、この標識された
抗体と共にインキュベートる、。これは、必ずしも特異
的にＦＳＨに対応している必要はなく、他の糖蛋白質ホ
ルモンと交叉反応してもよい。

この方法は、非特異的に担体結合る、抗体を用いても実
施できる。しかしながら、標識された抗体として、本発
明による特異的にＦＳＨに対応している抗体を使用る、
ことが必要である。

このサンドインチ法の変法は、同様に、ＦＳＨの測定の
ために好適である。例えは、差当り、標識されていない
可溶性抗体で、かつ標識された抗体で、可溶性サンドイ
ッチ−複合体を形成る、ことができる。これを、引続き
、標識されていない可溶性抗体のＥｃ、一部に対応して
いる担体結合抗体を用いて不溶性にる、。この変法では
、少なくともａｍされていない可溶性抗体が本発明の抗
体であるべきである。この際、標識された抗体を過剰に
使用る、のが有利である。

本発明の′Ｍ喪性は、この免疫学的方法のために、特異
的にＦＳＨに対応していて、従ってＦＳＨの特異的測定
を可能とる、モノクロナール抗体を提供る、ことが意想
外に達成されたことにある。

従って、本発明のもう１つの目的は、他の糖蛋白質−ホ
ルモンとの交叉反応性が３１より小さいＦＳＨに対る、
モノクロナール抗体である。

本発明によるモノクロナール抗体を得るために、実験動
物例えばマウスｔ−Ｆ８Ｈで免疫化る、。

この免疫化のために、この免疫原管例えはアジュパンス
と組合せて常法で付与る、。アジュバンスとしては、水
酸化アルミニウムを百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）又はフロイントの（Ｆｒｅｕｎ
ｄｓｃｈｅｍ　）アジュバンスと共に使用る、のが有利
である。免疫化は、有利に、数ケ月にわ九９．４〜６週
間隔での少なくとも４回の免疫化により行なう（腹膜内
注射）。

このように免疫化した動物から、Ｂ−リンパ球を得、こ
れを永久骨髄腫細胞系と融合させる。

この−合は、ケーラー（Ｋ♂ｈ１ｅｒ　）及びミルスタ
イン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）の公知方法〔ネイチュア（
Ｎａｔｕｒｅ　）、２５６．１９７５．４９５〜４９７
頁〕で行なう。この除虫じたノーイブリッド細胞の１次
培養物を常法で、例えは、市販の細胞ツルター（ｚｅｌ
ｘｓｏｒｔｅｒ　）の使用下に、又は限定稀釈によりク
ローン化る、。それぞれ、適当な試験法で例えは酵素−
イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ−法）で、ＬＨに対して陽
性にかつ他のｍ蛋白質−ホルモンとは陰性にもしくは僅
かにのみ反応る、培養物を更に加工る、。こうして、本
発明によるモノクロナール抗体を産生ずる多数のハイブ
リドーマ−細胞系が得られる。

公知方法で、この細胞系を培養し、これにより産生され
たモノクロナール抗体を単離る、ことができる。

この方法で得られる細胞系の例は次のとおりである： クローン２９３　（ＮＣＡＣＣ８ａ１２２００２　）ク
ローン１６３　（ＮＣＡＣＣ８４１２２００６）及びク
ローン３８１　（ＮＣＡＣＣ８５０２２２０５）。

これらの細胞系は、それぞれの番号で寄託機関ＮＣＡＣ
Ｃ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ａｎｉｍａｌ：　Ｃｅ１１Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に寄託
されている。

このように得られたモノクロナール抗体は、ＦＳＨに対
して非常に高い親和性（１０９〜１０１１ｔ１モルの親
和性定数）ｔ−有し、他の糖蛋白質ホルモンとは３％よ
り少なく交叉反応る、ことで優れている。特に有利なモ
ノクロナール抗体は、他のｓｆｆ白質−ホルモン例えば
ｈＣＧ、　ＬＨ及びＴＳＨに対る、１％より少ない特に
有利に０．１％より少ない交叉反応性を有る、。この親
和性及び他のホルモンとの交叉反応性の測定のために、
当業者に公知の慣用法が提供される。

本発明によるモノクロナール抗体は、試料例えば血清又
は血漿中でこのホルモンＦ８Ｈ他の糖蛋白質−ホルモン
の存在で％異的に測定る、ために極めて好適である。こ
の測定法のために、モノクロナール抗体そのもの又はそ
れからの相応る、免疫学的特性を有る、フラグメント例
えはＦａｂ−フラグメント全便用る、ことができる。

従って、「モノクロナール抗体」の概念で、完全抗体も
フラグメントも理解される。

実施例 次の実施例につき、本発明を詳説る、：例　　１ ＦＳＨに対る、モノクロナール抗体の敗得生後８〜１２
週のＢａ１ｂ／ｃ−マウス會、水酸化アルミニウム及び
百日咳菌に吸着された１１１Ｆ８Ｈ（イムネツクス社（
Ｆｉｒｍａ　Ｉｍｍｕｎｅｘ　）　）１００μＩで腹膜
内で免疫化させる。６週後に４週間間隔で更に３回免疫
化させく。この際、各々、水酸化アルミニウム及び百日
咳菌に吸着されたＦＳＨ５０μＩｉを腹膜内に施与る、
。

最後の免疫化の後約４ケ月に融合させる。この融合の３
日及び４日前に、それぞれ１回、ＦＳＨ１００μ、９　
／　ＰＨ１（燐酸塩緩衝溶液）により腹膜内もしくは静
脈内で免疫化る、。

融合のために、エンツイメ／ロジイ　（Ｅｎｚｙ−ｍｏ
ｘｏｇｙ　）　７３　（１９８１）　３頁中のガルフレ
法（Ｇａ１ｆｒ６　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）によシ、免
疫化されたマウスの脾臓細胞１０８を骨髄７ｍ（Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ−ＣＨＩ、８３７５）２
Ｘ１０’と混合し、引続き１０分間遠心分離る、（６０
０ｇ１４℃）。細胞をもう一度Ｂｕｓ　（−平衡塩類溶
液：　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　ｓｏ’１ｕｔｉｏ
ｎ　）で洗浄し、４００ｇで遠心る、。上置みｔ除去る
、。細胞沈殿物に５０％ＰＥＧ−溶液（分子量４０００
、Ｍｅｒｃｋ　）　１　ｔｄ　ｋ加える。その後、室温
で、牛胎児血清（ＦＫ８　）不含のＲＰＭＩ　１６４０
−媒体（ＲＰＭＩ　−ＲｏｓｅｗｅｌＩＰａｒｋｅｒ　
Ｍｅｍｏｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）５ｄｔ引続きも５
１度１０　ｅｌｋ　ＦＫ８含有ＲＰＭ１１６４〇−媒体
５−を徐々に滴加し、媒体で５［］ｍＭまで光友し、４
００＃で１０分間遠心分離る、。沈殿した細胞ｔ−１０
％ＦＫｓ含有ＲＰＭ１１６４〇−媒体中に入れる。牌Ｍ
細胞各　２×１０５ｔ−２４−穴（ｗ６１１　）−細胞
培養プレート（ヌンク社：　Ｆｉｒｍａ　Ｎｕｎｃ　）
上に播種る、。各培養液に、脾臓細胞１×１０ｂ又は腹
膜滲出液細胞５Ｘ１０’ｔ”栄養細胞として添加る、。

次の日に、ヒボキサンチン−アゾセリン−選択媒体（ヒ
ボキサンチン１００　ｍＭ、アゾセリン１μｇ／―）を
添加る、。

約７〜１０日後に、既に多くのクローンが認められる。

１次培養液の上置みを例２に記載のＥＩＪＳＡ法で試験
る、。抗原特異性抗体を含有す°る１次項４に液を螢光
活性化細胞ツルターを用いて％−穴−細胞培養プレート
（ヌンク社）上で更にクローン化る、。栄養細胞として
、腹膜−参出液一細ｊｌｌＩＸ１０’又は脾臓細胞２　
Ｘ　１０４を培養液％−穴−細胞培養プレート当シに使
用る、。

こうして、双方のハイブリドーマ−細胞系クローン２９
３、クローン１６３及びクローン３８１ｔ−単離る、こ
とができ、これらは寄託機ｒＪＡＮＣＡＣＣ（Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に次の寄託査号で寄託
されている： ＮＣＡＣＣ８４１２２００１（−クローン２９３）ＮＣ
ＡＣＣ８４２２００６（−クローン１６３）及びＮＣＡ
ＣＣ８５０２２０５（−クローン３８１）。

腹水を得るために、ハイブリッド細胞５Ｘ１０’を予め
プリスタン（Ｐｒ１ｓｔａｎ　）　０．５　ｔｕで１〜
２回前処理されたマウスの腹膜内に注射る、。その１〜
３週間後に、このマウスから腹水液を得ることができる
。これから常法で抗体を単離る、ことができる。このモ
ノクロナール抗体は特異的にＦＳＨに対応していて、他
の糖蛋白質−ホルモンとは交叉反応しないかもしくは僅
かに反応る、だけである。これらを以後、ＭＡＫ　２９
５（クローン２％の）、ＭＡＫ１６３（りは−ン１６３
）のもしくはＭＡＫ　３８１　（クローン３８１の）と
称る、。

これらのモノクロナール抗体は、サブ群ＩｇＧ１／Ｋに
輌る、。これらの親和性は１０’ｔ／ｍｏ１である。親
和性の測定のために、同族抗原との競争曲線會スカツチ
ャード法（８ｃａｔｃｈａｒｄ：　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、
　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　５１．１９４９．６６０頁参
照）で測定し、評価る、。このために必要な測定は例２
と同様に実施る、。

例　　２ ＦＳＨに対る、抗体のスクリーニング試験免疫化された
マウスの血清又はハイブリッド細胞の培養液上置み又は
腹水中のＦＢ）１に対る、抗体の存在及び特異性を知る
ために、試験原理としてＥＩＪＳＡ−法を用い、マイク
ロ滴定プレートにＦＳＨ１μ９／被櫟緩衝液−（０，２
Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ｐ）１９．３〜
９．５）を６７℃で１夜重層る、。０．９　％塩化ナト
リウム溶液及び１チアルデミン溶液で１０分間後処理る
、。引続き、０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄る、。

引続き６７℃で１時間、試料１００μｔと共にインキュ
ベートし、改めて０．９　％塩化ナトリウム溶液で洗浄
る、。更に、シャ７（５ｃｈａｆ　）−抗−マウス−Ｉ
ｇ（）−ペルオキシダーゼ−コンシュ？”　　）　Ｉ　
ＤＯ〜１５０ｍＵ／ｍＡと共にインキュベートる、（６
７℃、１時間）。

０．９チ塩化す）　ＩＪウムでの新たな洗浄工程の後に
、ペルオキシダーゼ活性を常法で測定る、（例えはＡＢ
ＴＳを用い、室温で３０分、４０５ｎｍでの吸光度差Δ
ｍｇ　ｆ絖む）。

このＥＬｘＳＡ−試験は次のようにしても実施できる： マイクロ滴定プレートにまずシャ７−抗−マクス−ｘｇ
ａを重層る、（２０〜３０μｇ／被覆緩衝液−１３７℃
で１時間〜１夜）。その後、前記のように更に処理し、
試料溶液を添加し、改めて洗浄る、。引続き、ＦＳＨ−
ペルオキシダーゼ−コンシュデート２５０ｍＵ／−と共
にインキュベートる、（１時間、３７℃）。これを改め
て洗浄し、ペルオキシダーゼ−活性を例えばＡＢＴＳに
より測定る、。

例　　３ 他の糖蛋白質との交叉反応の測定 例２の記載と同様に操作る、。差当シ、ＦＳＨの反応性
全測定る、。次いで、それぞれのモノクロナール抗体に
、それぞれ、交叉反応を試験る、抗！　（ｈＣＧ、　Ｔ
ＳＨ，ＦＳＨ）を上昇性濃度で縫加る、。引続き、この
交叉反応全次式で計算る、： Ｃ（交叉反応抗原） Ｃ＝最大信号の５０俤に達る、ために必要である抗原の
＃度 次の第１表にＭＡＫ　２９３、ＭＡＫ　１６５及びＭＡ
Ｋ　５　Ｂ　１に関る、測定値ｔ−まとめる。

例　　４ エビトーゾ特異性（Ｅｐｉｔｏｐｓｐｅｚｉｆｉｔａｔ
　）の測！ マイクロ滴定プレートに、０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ
９，６）中のマウス−抗体のＦｃｙ−領域に対る、シャ
ツ（８ｃｈａｆ　）−抗体１０μｇ／ｄｔ−％３７℃で
２時間又は４℃で１夜重膚る、。その後、ＰＢ８／ツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０　（０，１’１ｋ　）（ｐ
Ｈ７，３５）で洗浄る、。引続き、インキュベーション
緩衝液（ＰＥＡ、牛血清アルブミン（Ｒ８Ａ　）　０．
１％、ツイーン２０　０．１チ）中のモノクロナール抗
体（ＭＡＫ　１　、濃度１０μｙ／ａ　）　１００μを
七加え、６７℃で２時間インキエベートる、。

ＦＳＨ−ペルオキシダーゼ−コンシュデート（１００ｍ
Ｕ／ｓｕ）′ｔ−溶液中の第２のモノクロナール抗体（
ＭＡＸ　２　）　１０μｇ７ｘｉと共に４℃で１夜予備
インキユベートる、。

ＭＡＫ　１　ｋ　有る、プレートのこのインキュベーシ
ョンの後に、過剰のＭＡＫ　１　ｋ　ＰＨ１−ツイーン
２０で除去る、。このプレートに、更にＰＨ１−Ｒ８Ａ
中の１チマクスー正常血清ｔ−３０分間室温で後重層る
、。予備インキエベートされたＭＡＫ２　／　ＦＳＨ−
ペルオキシダーゼ−複合体１００μｔをプレート上に加
え、３７℃で２時間インキエペートる、。結合したペル
オキシダーゼ−活性を基質としてのＡＢＴ８で可視にる
、。測定した色強度は、ＭＡＫｌに結合したＭＡＫ　２
　／　ＦＳＨ−ベルオキシダーゼーコンジエ？−）に正
比例る、。

種々のモノクロナール抗体で得られた測定結果上次にま
とめる。結合した活性を非競争的に結付したＦＳＨ−ペ
ルオキシダーゼ−活性を百分率で示す。

得うれた結果は、モノクロナール抗体ＭＡＫ３８１が、
双方の抗体ＭＡＫ　２９３及びＭＡＫ　１６りと捻異な
る抗原Ｆ１３Ｈのエピトープに対する、モノクロナール
抗体であることを示している。

例　　５ Ｆ８Ｈの測定 Ａ）試薬溶液の製造 １ン　基質緩衝液： 燐酸ナトリウム緩衝液（Ｐｋ１７．４　）　１５ｍＭ塩
化ナトリウム　　　　　　　　１５ｍＭＥＤＴＡ　　　
　　　　　　　　　　　　５ｍＭ牛血清アルデミン（ｐ
）１７．４）　　　０．２％０−ニトロフェニルガラク
トシド５！ｌｌＩＭ２）処方　１−溶液 処方１として、本発明によるモノクロナールマウス−抗
−Ｆ８Ｈ−抗体を使用る、。この抗体を含弔る、腹水液
に硫酸アンモニウムを１．８Ｍまで加える。沈殿を１５
騙燐酸ナトリウム（ｐ）１７．０）及び５３　ｍＭ塩化
ナトリウムの緩衝液中に入れる。こうして得た溶液をＤ
ＥＡＥ−セルロース上から通過させる◎６）処方６−溶
液 処方３として、同様であるが、処方１とは異なる抗原決
定因ｔ−認識る、本発明のモノクロナールマウス−抗−
Ｆ８Ｈ−抗体を使用る、。

この抗体を含有る、腹水液ｔ−２）の記載と同様に精製
る、。完全抗体を公知方法で切断してＦａｂ−７ラグメ
ントを得る。得られたＦａｂ−７ラグメントとβ−ガラ
クトシダーゼとｔ。

Ｒ，Ｒ，ボルタ−（Ｆｏｒｔｅｒ　）によるビオケミカ
ル　ジャーナル（阻ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　７３、（
１９５９）１１９頁の方法で結合させる。

４）活性化された処方２−溶液 シャ７−抗−マウス−ｇｃｒ−抗血清に硫酸アンモニウ
ムを１．８Ｍまで加える。沈殿を１５ｍＭ硫酸ナトリウ
ムＣＰ）１７．０）及び５０蜆塩化ナトリウムからの緩
衝液中に入れる。

こうして得た溶液ｔ−ＤＥＡＲ−セルロース上に通過さ
せる。

Ｂン　試薬担持材の製造 １）試薬担持材１ １継当り 燐酸ナトリウム（ｐ）１７．３．３７℃）１００Ｐｐ塩
化マグネシウム　　　　　　　　　’ｌｔｙ＋塩化ナト
リウム　　　　　　　　　０．９　％牛血清アルブミン
　　　　　　　　０．５　％マウスからの抗−Ｆ８Ｈ−
モノ クロナール抗体（処方１−浴 液）　　　　　　　　　　　　　　５μ＆、７ｍ抗−Ｆ
８Ｈ−抗体−（マウス）− ７ａｂ−フラグメント−β−ガラ クトシダーゼーコンシュデート （処方６−＃！液）　　　　　　　　　１００ｍＵ會含
１る、溶液４０μｔ’ｋｓ市販のポリエステル紙よりな
るフリース上に滴加る、。引続き、室温で乾燥させる。

このフリースをその使用まで４”Ｃ及び相対湿度２０％
に保持る、。

２）試薬担持材２ セルロースフリース上に公知のブロムシアン油性化法（
西ドイツ％計出願公開第１７６８５１２号明細を）で、
マウス−抗体のＥｃ７一部に対る、シャツ−抗体（活性
化された処方２−溶液）を固定させ、この際、繊維材料
１ｙ当シ抗体１０μＩＩｔ−固定のために提供る、。洗
浄により、結合しなかった抗体を除き、フリースヲ室温
で温和に乾燥させる。こうして得た７リースの貯蔵は試
薬担持材１と同様に行なう。

この双方の試薬担持材１及び２會用いる測定は、西ドイ
ツ特許出ｍ第３４２５００８．５号明細１・に記載の分
析測定実施用装ｆｊ！、を用いて行なう。これは、それ
ぞれ特定の１試薬で含浸された吸収性担持物質含有る、
多数の試薬領域と連結していて、挿入素子ｔローター上
に固定る、除に、−緒になって内部半径から外部半径方
向に通じる試料液体搬送路を形成る、少なくと合 も１個の混合弁室と混Ｚ室金有る、試料装入室及び更に
少なくとももう１つの液体収容室及びこの呈から測足室
に通じ、試料液体搬送路と少なくとも部分市に同じ搬送
路會弔る、成形体よりなる自動遠心分離分析装置川ロー
ター挿入索子を明らかにしている。ここで、試料液体搬
送路は、試料装入室（Ｐ）から吸着性材料の充填された
緩衝液含有室（ａ）、室ＣＣ）及び室（ａ）と（Ｃ）の
間に配置された第１弁室（ＶＫｌ）’を経て、第２弁室
（’Ｖ’に２）に至り、かつここから室（ｄ）及び収集
室（ＡＫ）　ｉ経て測定室（Ｋ）に至る。もう１つの液
体を収容る、ために、ポンプ室として１ＩＩ４１！ｔさ
れた基質室（ｐＫ）　ｔ−伽えておシ、これ線、配量室
（ＤＫ）及び毛ａｖ（ｋａｐ）よシなる配量装置及び溢
流室（ｕｋ）を経て第２弁室と連結している。第１図は
この使用ローター挿入素子を図示している。ここで、試
薬担持材１をこの使い捨て部品の区分Ｃに配置し、試薬
担持材２を区分ｄに配置る、。この際、試料４０μｍ　
？　、上縁の開口部から直接、区分ａにピペット装入る
、。この試料は稀釈されていない。基＊浴液２７０μｔ
２室ｐＫ中にピペット装入る、。高回転数が静止状態と
父換る、過当なプログラムによシ、試料及び基質溶液は
分離マトリックス及びキュベツトの方向に送られる。

この際、プログラムの経過で処方１及び６は試料液によ
り区分Ｃから溶離され、引続きこの均質混合物が反応る
、。生じた複合体が区分ｄで処方２と納会される。区分
Ｃからｄへの試料の移動は非常に抑時間内に行なわれる
。

基’Ｊ［溶液は、配量室ＤＫ金通って少部分に分けられ
、その最初のものは、過剰の非複合コンシュ？−）の洗
浄のために使用される。

複合体形成を介してｄで納会したβ−ガラクトシダーゼ
活性は、試料中に含有されるＦＳＨ量に比例る、。この
活性線、基質が５分間の反応で着色生成物に変換される
のに光分な、更なる＝’ｔｔｔｔで測定される。生じる
色はキュベツト中、４１　Ｌｌ　ｎｍで測定される。

既知ＦＳＨ含１ｔｔ−；ｗる、検量血清で、第２図の検
量曲線が得られ、これは、ＦＳＨＯ〜４ｎｇ／ｄの範囲
（Ｆ８Ｈ６８／４０に関る、第１工即−規珈で標準化）
ｔ−把握し、血清又ａ血漿中の光分に敏感なＦＳＨ測定
を可能にる、。この検量曲線を用いて、体液例えは血清
又は血漿中の未知ＦＳＨ含ｙを測定る、ことができる。

例　　６ サンドイッチ−原理によるＦＳＨの測定被扱緩暫液（０
，２Ｍ炭酸す）　ＩＪクム／重炭酸ナトリウムｐ）１９
．４）中に本発明によるＦＳＨに対る、モノクロナール
抗体を５０μ＆／ｍの濃度で含有る、溶液１００μｔ′
（！−マイクロ滴定プレートの各々の凹所に入れ、室温
で１時間インキュベートる、。引続き、インキュベーシ
ョン緩衝液（牛血清アルブミン１％、ＮａＣＬ　Ｏ，９
％）を後Ｍ層し、室温で３０分間インキュベートる、。

洗浄緩衝液（ＮａＣｔＯ，９％、ライ−７２００，１％
）で洗浄後に、各凹所に測定すべきＪ’ｆ’ＳＨを含羽
る、試料１００μを金入れ、室温で３０分間インキュベ
ートる、。洗浄緩衝液での再度洗浄の後に、ペルオキシ
ダーゼ（活性１００ｍＵ　／　ｘｉ　）とＦＳＨと嫁異
なるエビトーゾに対応る、本＠明によるもう１つのモノ
クロナール抗体とからのコンシュデート１００μｔを１
１層し、室温で１時間インキュベートる、。

このコンシュデートの製造のために、オランダガラシ（
Ｍｅｅｒｒｅｔｔｉｃｈ　）−ペルオキシダーゼ（Ｅ、
Ｃ，１，１１，１，７）　′ｔ−使用る、。このコンシ
ュデートは過沃素酸塩での酸化及び引続く水素化ホウ素
を用いる還元によ、９、Ｐ、に、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ
　）による処方（Ｍ、Ｂ、ウィルソン（ＷｉｌｇＯｎ　
）及びＰ、に、ナカネのＷ、クナツゾ（Ｋｎａｐｐ　）
　ＩＡ行、イムノフルオレッセンス・アンド・リレイテ
ツド・ステイニング・テクニクス（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ
ｏｒｅａｃｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　８ｔａ
ｉｎ−１ｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｃｓ　）　、１９７，８、
エルスゲイア／ノース・ホーランド・ビオメディカル・
プレス（ｇｌｓｅｖｔｅｒ　／　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ａ
ｎｄ　、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｒｅｓｓ　）　２
１５〜２２４頁〕に応じて製造る、。

洗浄緩衝液を用いる洗浄の後に、ＡＢＴ８−棒ｆｌ＆溶
液１００μｔｔｍ層し、１時間の呈色反応後に、４０５
　ｎｍでの吸光度？　ＥＬＩ８Ａ−リーダー（ダイナチ
ック：　Ｄｙｎａｔｅｃ　）で測定る、。

検量曲線を得るために、前記の方法で、試料の代りに、
Ｆ１３Ｈを種々の限定された濃度で含弔る、溶液を用い
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施る、自動遠心分離分析装置
用ローター挿入素子の略示図であり、第２図は既知のＦ
ＳＨ−含分の血清の検量曲線である。 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対応し、他の糖蛋白
   質ホルモンとは３％より少なく交叉反応するモノクロナ
   ール抗体少なくとも１種を使用することを特徴とする、
   卵胞刺激ホルモンの免疫学的測定法。 ２、ＦＳＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは１％
   より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも
   １種を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、そのうちの少なくとも１種は他の糖蛋白質と３％よ
   り少なく交叉反応する、ＦＳＨに対応するモノクロナー
   ル抗体少なくとも２種を使用する、特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の方法。 ４、ＦＳＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは３％
   より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも
   １種を含有することを特徴とする、卵胞刺激ホルモン測
   定用試薬。 ５、ＦＳＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは１％
   より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも
   １種を含有する、特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６、そのうちの少なくとも１種が他の糖蛋白質−ホルモ
   ンと３％より少なく交叉反応する、ＦＳＨに対応するモ
   ノクロナール抗体少なくとも２種を含有する、特許請求
   の範囲第４項又は第５項記載の試薬。 ７、他の糖蛋白質−ホルモンとは３％より少なく交叉反
   応することを特徴とする、卵胞刺激ホルモンに対応する
   モノクロナール抗体。 ８、１％より低いＬＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧとの交叉反応性
   を有する、特許請求の範囲第７項記載のモノクロナール
   抗体。 ９、他の糖蛋白質−ホルモンとは３％より少なく交叉反
   応する卵胞刺激ホルモンに対応するモノクロナール抗体
   を得るために、過当な動物をＦＳＨで免疫化し、この免
   疫化された動物の脾臓からＢ−リンパ球を得、これを骨
   髄腫細胞と融合させ、生じたバイブリドーマ細胞をクロ
   ーン化し、特異的にＦＳＨに対応する抗体を産生するク
   ローンを選択し、これにより形成された抗体を取得する
   ことを特徴とする、モノクロナール抗体の取得法。 １０、ＦＳＨに対応していて、他の糖蛋白質とは３％よ
   り少なく交叉反応するモノクロナール抗体を産生するハ
   イブリドーマ細胞系。