JPS61218599A - 黄体形成ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は黄体形成ホルモンの測定法、測定試薬、これに
好適なモノクロナール抗体、その取得法及びハイブリド
ーマ細胞系に関る、。

従来の技術 体液、例えば尿、血清及び血漿中の黄体形成ホルモン（
ＬＨ）の測定は、主として、視床下部、下垂体及び性腺
の内分泌状態を評価る、ために使用される。この試験は
、特に性腺機能低下、子育症等の鑑別診断に役立つ。更
に、このＬＨ−測定は、妊娠の誘導の際の排卵時点の測
定のために使用される。

これらのすべての場合に、血清値は生理学的範囲内に存
在る、。更に、血清中のＬＨの濃度も、このホルモンの
生物学的作用に関る、情報を得るための目的だけでも測
定される。従って、実質的に、自然のホルモンの血清濃
度の認識は診断上重要である。

血清中のヒトＬＨの生理学的濃度は次の範囲内にある： 男性　　　　　　　　　４〜２４ｍｌ　Ｕ／ｍＡ’閉経
期前閉経人前周期）　　　１０〜２０ｍ１Ｕ／ｍｌ排卵
ピーク時の婦人　　　　８０〜１００ｍ１Ｕ／ｍｌ閉経
期後の婦人　　　　　　８０〜１５０ｍ１Ｕ／ｍ／！Ｌ
Ｈの測定のためには、特に抗原としてのこのホルモンが
これに対応る、抗体１種以上を用いて測定される免疫学
的試験法が好適である。

このポリペブチＰホルモンを用いる抗体取得は、すべて
のポリペプチド−ホルモンは免疫性が悪いので、困難と
結びついている。ＬＨと他の糖蛋白質ホルモン例えば卵
胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）又はヒト絨毛性ザナＰトロピン（ｈＣＧ　）との間
のホルモン学に基づき、これらホルモンの１種に対る、
特異抗体を得ることは非常に困難である。これら糖蛋白
質ホルモンに対応る、抗体は、通例、多かれ少なかれ他
の糖蛋白質−ホルモンとの交叉反応を有る、。

クリ二カ・ケミ力・アクｐ　（Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｅ
ｍ−ｉｃａ　Ａｃｔａ　）　１３３　（１９８３）、２
６３〜２７４頁には、ＴＳＨ及びｈＣＧと１０％かっＦ
ＳＨと３％交叉反応る、、ＬＨに対る、モノクロナール
抗体が記載されている。英国特許（ＧＢ−Ａ）第２１１
１２０１号明細書からは、同様に、ＬＨに対る、モノク
ロナール抗体が知られている。

しかしながら、これは、同様にｈＣＧと反応る、。特異
的にＬＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとの交叉反
応をしないモノクロチー／＋４ｊｔ体は、従来は知られ
ていない。従って、現在までのところでは、他の糖蛋白
質ホルモンを多かれ少なかれ共に検出る、ことなしにＬ
Ｈを免疫学的に測定る、ことは可能ではない。

発明が解決しようとる、問題点 本発明の課題は、それを用いて、他の糖蛋白質−ホルモ
ンの存在でもＬＨを特異的に測定る、ことのできる新規
の免疫学的方法及び試薬を得ることであった。

問題点を解決る、ための手段 この課題は、本発明による免疫学的方法及び試薬で解決
される。

従って、本発明の目的は、特異的にＬＨに対応していて
、他の糖蛋白質ホルモンとは３％より少なく交叉反応る
、モノクロナール抗体少なくとも１種を用いる黄体形成
ホルモンの免疫学的測定法並びにこれに好適な試薬であ
る。

免疫学的測定法としては、原則的には、すべ法等も使用
可能である。標識付けのためには、それぞれの測定法に
慣用の手段が好適である。

従って、ラジオイム（アッセイの場合には、ラジオアイ
ソトープ例えば１２５Ｊが標識付けのために使用される
。酵素−イム×アッセイのためには、このために通例使
用されるすべての酵素、例工ばペルオキシダーゼ又はβ
−ガラクトシダーゼが好適である。螢光−イムにアッセ
イのためには、慣用の発光団がマーカーとして使用可能
である。これら種々の試験法及び変法の詳細は当業者に
とって公知である。ＬＨの種々の抗原決定因に対応して
いて、そのうちの少なくとも１種が他の糖蛋白質−ホル
モンとは３％より少なく交叉反応る、、少なくとも２種
の本発明によるモノクロナール抗体を使用る、試験変法
が有利である。

ＬＨの測定のためには、測定すべき抗原を担体結合され
、標識付けされた抗体と接触させるサンドインチ法が特
に好適であると立証された。

このような測定法のために、例えば本発明による特異的
なモノクロナール抗体を固定相に結合させることができ
る。これを、第１のインキュ（−ション工程で、測定す
べきＬＨ及び一般に他の糖蛋白質ホルモンを含有る、試
料と共にインキュベートる、。この際、特異的抗体によ
り選択的にＬＨが結合される。慣用の洗浄工程の後に、
この標識された抗体と共にインキュシートる、。これは
、必ずしも特異的にＬＨに対応している必要はなく、他
の糖蛋白質ホルモンと交叉反応してもよい。

この方法は、非特異的に担体結合る、抗体を用いても実
施できる、しかしながら、標識された抗体として、本発
明による特異的にＬＨに対応している抗体を使用る、こ
とが必要である。

このサンドインチ法の変法は、同様に、ＬＨの測定のた
めに好適である。例えば、差当り、標識されていない可
溶性抗体で、かつ標識された抗体で、可溶性サンＰイツ
チー複合体を形成る、ことができる。これを、引続き、
標識されていない可溶性抗体のＥｃｒ一部に対応してい
る担体結合抗体を用いて不溶性にる、。この変法では、
少なくとも標識されていない可溶性抗体が本発明の抗体
であるべきである。この際標識された抗体を過剰に使用
る、のが有利である。

本発明の重要性は、この免疫学的方法のために、特異的
にＬＨに対応していて、従ってＬＨの特異的測定を可能
とる、モノクロナール抗体を提供る、ことが意想外に達
成されたことにある。

従って、本発明のもう１つの目的は、他の糖蛋白質ホル
モンとの交叉反応性が３％より小さいＬＨに対る、モノ
クロナール抗体である。

本発明によるモノクロナール抗体を得るために、実験動
物例えばマウスをＬＨで免疫化る、。

免疫化のために、この免疫原を例えばアジュ／々ンスと
組合せて常法で付与る、。アジュノ々ンスとしては、水
酸化アルミニウムを百日咳菌（日−ｏｒｄｅｔｅｌｌａ
　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）又は７０イｙｌＦの（Ｆ−ｒ
ｅｕｎｄｓｃｈｅｍ　）アジュノ々ンスと共に使用る、
のが有利である。免疫化は、有利に、数ケ月にわたり、
４〜６週間隔での少なくとも４回の免疫化により行なう
（腹膜内注射）。

このように免疫化した動物から、Ｂ−９７７９球を得、
これを永久骨髄腫細胞系と融合させる。

この融合は、ケーラー（にａｈｌｅｒ　）及びミルスタ
イン（Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ　）　ノ公知方法〔ネイチュ
ア（Ｎ−ａｔｕｒｅ　）、２５６．１９７５．４９５〜
４９７頁　〕で行なう。この除虫じたハイブリツＰ細胞
の１次培養物を常法で、例えば、市販の細胞ツルター（
Ｚｅｌ　１ｓｏｒｔｅｒ　）の使用下に、又は限定稀釈
によりクローン化る、。それぞれ、適当な試験法で例え
ば酵素イムにアッセイ（ＥＬＩＳＡ−法）で、ＬＨに対
して陽性にかつ他の糖蛋白質ホルモンとは陰性にもしく
は僅かにのみ反応る、培養物な更に加工る、。こうして
、本発明によるモノクロナール抗体を産生ずる多数のノ
・イブリＰ−マ細胞系が得られる。公知方法で、この細
胞系を培養し、これにより産生されたモノクロナール抗
体を単離る、ことができる。

この方法で得られる細胞系の例は次のとおりである： りａ−ｙ３６９　（ＮＣＡＣＣ８４１２２００１）　及
びクローン７９９　（ＮＣＡＣＣ８４１２２００５）。

これらの細胞系は、それぞれの番号で寄託機関ＮＣＡＣ
Ｃ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
　ＡｎｉｍａｌＣｅｌ　ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）　Ｖ
Ｃ寄託さレテσ・る。

このように得られたモノクロナール抗体は、ＬＨに対し
て非常に高い親和性（１０〜１０　１１モルの親和性定
数）を有し、他の糖蛋白質ホルモンとは３％より少なく
交叉反応る、ことで優れて（・る。特に有利なモノクロ
ナール抗体は、他の糖蛋白質ホルモン例えばｈＣＧ、Ｆ
ＳＨ及びＴＳＨに対る、１％より少ない、特に有利に０
、１％より少ない交叉反応性を有る、。この親和性及び
他のホルモンとの交叉反応性の測定のために、当業者に
公知の慣用法が提供される。

本発明によるモノクロナール抗体は、試料例ゑば血清又
は血漿中でこのホルモｙＬＨを他の糖蛋白質ホルモンの
存在で特異的に測定る、ために極めて好適である。この
測定法のために、モノクロナール抗体そのもの又はそれ
からの相応る、免疫学的特性を有る、フラグメント例え
ばＦａｂ−フラグメントを使用る、ことができる、従っ
て、陣ノクロナール抗体」の概念で、完全抗体もフラグ
メントも理解される。

実施例 次の実施例につき、本発明を詳説る、：例Ｉ ＬＨに対スるモノクロナール抗体の取得生後８〜１２週
のＢａ１ｂ／ｃ−マウスを、水酸化アルミニウム及び百
日咳菌に吸着されたｈＬＨ［イ、ムネツクス社（Ｆｉｒ
ｍａ　Ｉｍｍｕｎｅｘ　）　）　１００μｔで腹膜内で
免疫化させる。６週後に４週間間隔で更に３回免疫化さ
せる。この際、各々、水酸化アルミニウム及び百日咳菌
に吸着されたＬＨ５０μｆを腹膜内に施与る、。

最後の免疫化の後約４ケ月に融合させる。この融合の３
日及び４日前に、それぞれ１回、ＬＨ１００μｆ／ＰＢ
Ｓ（燐酸塩緩衝溶液）により腹膜内もしくは静脈内で免
疫化る、。

融合のために、エンツイメ／ｃ１シイ（Ｅｎｚｙ−ｍｏ
ｌｏｇｙ　）　７３　（ＩＧ）８１）　３頁中のガルフ
レ法（Ｇａｌｆｒｅ　、　Ｍｅｔｉｏｄｓ　）　Ｋ　ヨ
リ、免疫化サレタマウスの膵臓細胞１０８を骨髄腫（Ｐ
３Ｘ６３Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５　
）２ｘｌＯ７と混合し、引続き１０分間遠心分離る、（
３０ｏｆ、４℃）。

細胞をもう一度５ＳＳ（＝平衡塩類溶液：　ｂａ−１ａ
ｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）で洗浄し、
４００Ｆで遠心る、。上澄みを除去る、。細胞沈殿物に
５０％ＰＥＧ−溶液（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ　）
　ｌ　ｍｌを加える。その後、室温で、牛胎児血清（Ｆ
ＫＳ）不含（７）ＲＰＭＩ　１６４０−媒体（ＲＰＭ　
ｌ　＝Ｒｏｓｅｗ−ｅｌ　Ｉ　Ｐａｒｋｅｒ　Ｍｅｍｏ
ｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）　５　ｍｌを、引続きも
う１度ｌＯ％ＦＫＳ含有ＲＰＭ１１６４０−媒体５−を
徐々に滴加し、媒体で５０ｍ１まで充たし、４００２で
１ｏ分間遠心分離る、。沈殿した細胞を１０％ＦＫＳ含
有ＲＰＭ１１６４０−媒体中に入れる。膵臓細胞各２×
１０５を２４−六一細胞培養プレート（ヌンク社：　Ｆ
ｉｒｍａ　Ｎｕｎｃ　）上に播種る、。各培養液に、膵
臓細胞１×１０５又は腹膜滲出液細胞５　Ｘ　１０’を
栄養細胞として添加る、。次の日に、ヒポキサンチン−
アザセリン−選択媒体（ヒポキサンチンｌｏｏｒｎＭ。

アザセリン１μｐ／ｍ）を添加る、。

約７〜１０日後に、既に多くのクローンが認められる。

１次培養液の上澄みを例２に記載のＥＬＩＳＡ法で試験
る、。抗原特異性抗体を含有る、１次培養液を螢光活性
化細胞ソールターを用いて９６−六−細胞培養プレート
（ヌンクネＤ上で更にクローン化る、。栄養細胞として
、腹膜−滲出液−細胞Ｉ　Ｘ　１０’又は膵臓細胞２Ｘ
ｌＯ’を培養液９６−穴−細胞培養プレート当りに使用
る、。

こうして、双方のハイブリドーマー細胞系クローン３６
９及びクローン７９９を単離る、ことができ、これらは
、寄託機関ＮＣＡＣＣ（Ｎａ−ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌ　
１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌ　ｌ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒ−ｅｓ　）に次の寄託番号で寄託されている
：ＮＣＡＣＣ８４１２２００１（＝りｏ　−：／３６９
）ＮＣＡＣＣ８４２２００５（＝り０−７７９９）。

腹水を得るために〜ハイブリッド細胞５ＸＩＯ’ｆａ：
予メフリスｐ　ン（Ｐｒ１ｓｔａｎ　）　０．５ｍ／で
１〜２回前処理されたマウスの腹膜内に注射る、。その
１〜３週間後に１このマウスから腹水液を得ることがで
きる。これから常法で抗体を単離る、ことができる。こ
のモノクロナール抗体は特異的にＬＨに対応していて、
他の糖蛋白質−ホルモンとは交叉反応しないかもしくは
僅かに反応る、だけである。これらを以後、ＭＡＫ　３
６９（クローン３６９の）もしくはＭＡＫ　７９９　（
クローン７９９の）と称る、。

双方のモノクロナール抗体は、サブ群１　ｇＧｌ　／Ｋ
に属る、。これらは次の親和性を有る、：ＭＡＫ　　３
６Ｑ＝７．９ｘｌＯ１０ｚ／ｍｏｌ。

Ｍ　Ａ　Ｋ　　７９９　＝９．５　×１０”　Ｌ／ｍｏ
　ｌ　＊親和性の測定のために、同族抗原との競争曲線
をスカツチャーＰ法（５ｃａｔｃｈａｒｄ　：　Ａｎｍ
。

Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　５１．１９４９．６
６０頁参照）で測定し、評価る、。このために必要な測
定は例２と同様に実施る、。

例２ ＬＨに対る、抗体のスクリーニング試験免疫化されたマ
ウスの血清又はハイブリッｒ細胞の培養液上澄み又は腹
水中のＬＨに対る、抗体の存在及び特異性を知るために
、試験原理としてＥＬＩＳＡ−法を用い、マイクロ滴定
プレートにＬＨｌμｆ／被覆緩衝液１１１７（０，２Ｍ
炭炭酸ナトリウム型炭酸ナトリウム、ｐＨ９，３〜９．
５）を３７℃で１夜重層る、。０．９％塩化ナトリウム
溶液及び１％アルブミン溶液で１０分間後処理る、。

引続き、０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄る、。

引続き３７℃で１時間試料１００μｔと共にインキュベ
ートシ、改めて０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄る、
。更に、シャツ（５ｃｈａｆ　）−抗一マウスー１ｇＧ
−ベルオキシダーゼーコンジュゲー）１００〜１５０　
ｍｕ　／ｍｌと共にインキュベートる、（３７℃、１時
間）。０．９％塩化ナトリウムでの新たな洗浄工程の後
に、ペルオキシダーゼ活性を常法で測定る、（例えばＡ
ＢＴＳを用い、室温で３０分％４０５ｎｍでの吸光度差
ΔｍＥを読む）。

このＥＬＩＳＡ−試験は次のようにしても実施できる： マイクロ滴定プレートにまずシャツ−抗−マウス−１ｇ
Ｇを重層る、（２０〜３０μｆ／被覆緩衝液ｍ１ｓ３’
ｒ℃で１時間〜１夜）。その後、前記のように更に処理
し、試料溶液を添加し、改めて洗浄る、。引続き、ＬＨ
−ペルオキシダーゼ−コンジュゲート２５０…Ｕ／ｍ／
と共にインキュベートる、（゛１時間、３７℃）。これ
を改めて洗浄し、ペルオキシダーゼ−活性を例えばＡＢ
ＴＳにより測定る、。

例３ 他の糖蛋白質との交叉反応の測定 例２の記載と同様に操作る、。差当り、ＬＨの反応性を
測定る、。次いで、それぞれのモノクロナール抗体に、
それぞれ、交叉反応を試験る、抗原（ｈＣＧ　、ＴＳＨ
Ｓ　ＦＳＨ）を上昇性濃度で添加る、。引続き、この交
叉反応を次式で計算る、： Ｃ＝最大信号の５０％に達る、ために必要である抗原の
濃度 次の第１表にＭＡに３６９及びＭＡＫ　７９９に関る、
測定値をまとめる。

例４ エピトープ特異性（Ｅｐｉｔｏｐｓｐｅｚｉｆｉｔｉｔ
　）の測定 マイクロ滴定プレートを、０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ
９，６）中のマウス−抗体のＦｃγ−領域に対る、シー
ｗ　−ｙ　（５ｃｈａｆ　）−抗体１０ｐｆ／ｒｒｔｌ
で３７℃で２時間又は４℃で１夜被覆る、。その後、Ｐ
ＢＳ　／ツイーン　（Ｔｗｅｅｎ　）　２０　（０，１
％　）　（ｐＨ７，３５）で洗浄る、。引続き、インキ
ュベーション緩衝液（ＰＢＳ、牛血清アルブミン（Ｒ３
Ａ　）０．１％、ツイーン２００．１％）中のモノクロ
ナール抗体（ＭＡＫ　１、濃度１０μｆ／ｌｆｆ７り１
００μｔを加え、３７℃で２時間インキュベートる、。

ＬＨ−ペルオキシダーゼ−コンジュゲート（１００ｍＵ
／ｍＪ）を溶液中の第２のモノクロナール抗体（ＭＡＫ
２　）　１０　ｔｔｆ／ｍｌ　ト共に４Ｃで１夜予備イ
ンキユベートる、。

ＭＡＫ　１を有る、プレートのこのインキュベーション
の後に過剰のＭＡＫ　１をＰＢＳ−ツイーン２０で除去
る、。このプレートにＰＢＳ　−ＲＳＡ中の１％マウス
−正常血清を３０分間室温で後重層る、。予備インキュ
ベートされたＭＡＫ２／ＬＨ−ペルオキシダーゼ−複合
体１００μｔをプレート上に加え、３７℃で２時間イン
キュベートる、。結合したペルオキシダーゼ−活性を基
質としてのＡＢＴＳで可視にる、。測定した色強度は、
ＭＡＫ　１に結合したＭＡＫ２／ＬＨ−ペルオキシダー
ゼ−コンジュゲートに正比例る、。ＭＡＫ　ｌとしての
ＭＡＫ　７９９及びＭＡＫ２としてのＭＡＫ　３６９に
関して、結合活性は、非競争ＬＨ−ＰＯＤ−活性の３４
％である。

結果は、双方のモノクロナール抗体が抗原ＬＨの種々の
エピトープに対応していることを示している。

例５ ＬＨの測定 Ａ）試薬溶液の製造 １）基質緩衝液： 燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（７，４）　　１５ｍＭ塩
化ナトリウム　　　　　　　　　１５ｍ１ＶＩＥＤＴＡ
　　　　　　　　　　　　　　　５ｍＭ牛血清アルブミ
７　（ｐＨ７，４）　　　　０．２％０−ニトロフェニ
ルガラクトシｒ　　　５ｍＭ２）処方１−溶液 処方ｌとして、本発明によるモノクロナールマウス−抗
−ｈＬＨ−抗体を使用る、。この抗体を含有る、腹水液
に硫酸アンモニウムを１．８Ｍまで加える。沈殿を１５
ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）及び５０ｍＭ塩化ナ
トリウムの緩衝液中に入れる。こうして得た溶液をＤＥ
ＡＥ−セルロース上から通過させる。

３）処方３−溶液 処方３として、同様であるが、処方１とは異なる抗原決
定図を認識る、本発明のモノクロナールマウス−抗−ｈ
ＬＨ−抗体を使用る、。この抗体を含有る、腹水液を　
２）の記載と同様に精製る、。完全抗体を公知方法で切
断してＦａｂ−フラグメントを得る。得られたＦａｂ−
フラグメントとβ−ガラクトンダ／ぜとヲ５Ｒ−Ｒ−ｆ
　ルタ（ＰＯｒ　ｔｅｒ　）によるビオ）ｙ　ミカルａ
シャーｆ−ル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ−）　７３（１９５
９）１１９頁の方法で結合させる。

４）活性化された処方２−溶液 シャツ−抗−マウスーＥｃγ−抗血清に硫酸アンモニウ
ムを１．８Ｍまで加える。沈殿を１５ｍＭ硫酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，０）及びａｏｍＭ塩化ナトリウムからの緩
衝液中に入れる。こうしテ得た溶液をＤＥＡＥ−セルロ
ース上に通過させる。

Ｂ）試薬担持材の製造 １）試薬担持材１ １　ｒｎｌ当り 燐厳ナト　リウム（ｐＨ７，３，３７℃）１００μモル
塩化マクネシウム　　　　　　　　２μモル塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　　０．９％牛血清アルブミン　　
　　　　　　０．５％マウスからの抗−ｈＬＨ−モノク
ロナール抗体（処方１−溶液）　　　　　　　５μｆ／
ｍｌ抗−ｈＬＨ−抗体−（マウス）　−Ｆａｂ　−フラ
グメント−β−ガラクトシダーゼ−コンジュゲート（処
方３−溶液）　　　　　１００ｍｕを含有る、溶液４０
μｔを市販のポリエステル紙よりなるフリース上に滴加
る、。引続き、室温で乾燥させる、このフリースをその
使用まで４℃及び相対湿度２０％に保持る、。

２）試薬担持材２ セルロースフリース上に公知のブロムシアン活性化法（
西ドイツ特許出願公開第１７６８５１２号明細書）で、
マウス−抗体のＥｃγ一部に対る、シャツ−抗体（活性
化された処方２−溶液）を固定させ、この際、繊維材料
１２当り抗体１０μ２を固定のために提供る、。洗浄に
より、結合しなかった抗体を除き、フリースを室温で温
和に乾燥させる。こうして得たフリースの貯蔵は試薬担
持材１と同様に行なう。

この双方の試薬担持材１及び２を用いる測定は、西Ｐイ
ツ特許出願第３４２５００８．５号明細書に記載の分析
測定実施用装置を用いて行なう。これは、それぞれ特定
の１試薬で含浸された吸収性担持物質を有る、多数の試
薬領域と連結していて、挿入素子をローター上に固定る
、際に、−緒になって内部半径から外部半径方向び更に
少なくとももう１つの液体収容室及びこの室から測定室
に通じ、試料液体搬送路と少なくとも部分的に同じ搬送
路を有る、成形体よりなる自動遠心分離分析装置用ロー
ター挿入素子を明らかにしている。ここで、試料液体搬
送路は、試料装入室（Ｐ）から吸着性材料の充填された
緩衝液含有室（ａ）、室（Ｃ）及び室（ａ）と（ｃ）の
間に配置された第１弁室（ＶＫＩ　）を経て、第２弁室
（ＶＫ２　）に至り、かつここから室（ｄｉ及び収集室
（ＡＫ　）を経て測定室（Ｋ）に至る。

もう１つの液体を収容る、ために、ポンプ室として構成
された基質室（ＰＫ　）を備でおり、これは、配量室（
ＤＫ　）及び毛細管（Ｋａｐ　）よりなる配量装置及び
溢流室（ｕＫ　）を経て第２弁室と連結している。第１
図はこの使用ローター挿入素子を図示している。ここで
、試薬担持材１をこの使い捨て部品の区分Ｃに配置し、
試薬担持材２を区分ｄに配置る、。この際、試料４０μ
Ｌを、上縁の開口部から直接、区分ａにピペット装入る
、。この試料は稀釈されていない。基質溶液２７０μｔ
を室ｐＫ中にピペット装入る、。

高回転数が静止状態と交換る、適当なプログラムにより
、試料及び基質溶液は分離マトリックス及びキュベツト
の方向に送られる。

この際、プログラムの経過で処方１及び３は試料液によ
り区分Ｃかも溶離され、引続き均質混合物が反応される
。生じた複合体が区分ｄで処方２と結合される。区分Ｃ
からｄへの試料の移動は非常に短時間内に行なわれる。

基質溶液は、配量室ＤＫを通って少部分に分けられ、そ
の最初のものは、過剰の非複合コンジュゲートの洗浄の
ために使用される。

複合体形成を介してｄで結合したβ−ガラクトシダーゼ
活性は、試料中に含有されるｈＬＨ量に比例る、。この
活性は、基質が５分間の反応で着色生成物に変換される
のに充分な更なる基質量で測定される。生じる色はキュ
ベツト中、４１０ｎｍで測定される。

既知ＬＨ−含量を有る、検量血清で、第２図の検量曲線
が得られ、これは、ｈＬＨＱ〜２５ｍｕ／ｍ１（Ｄ範囲
（ｈＬＨ６８／４０に関る、第１ＩＲＰ−規準で標準化
）を把握し、血清又は血漿中の充分に敏感なｈＬＨ測定
を可能にる、。

この検量曲線を用いて、体液例えば血清又は血漿中の未
知ｈＬＨ含量を測定る、ことができる。

１１ｃＧ　１００ＩＵ／ｍＪ（１，ＩＲＰ−ＷＨＯ（７
）１．６］際関連製剤）を有して貯蔵された標準の再現
率は９６〜１０４％である。

例６ サンドイッチ−原理によるＬＨの測定 被覆緩衝液（０，２Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウ
ムｐＨ９，４）中に本発明によるＬＨに対る、モノクロ
ナール抗体を５０μｙ／ｒｎｌの濃度で含有る、溶液１
００μｔをマイクロ　滴定プレートの各々の凹所に入れ
、室温で１時間インキュベートる、。引続き、インキュ
ベーション緩衝液（牛血清アルブミン１％、Ｎａ（ＪＯ
，９％）を後重層し、室温で３０分間インキュベートる
、。洗浄緩衝液（Ｎａｃｚｏ、９％、ツイー／２００．
１％）で洗浄後に、各凹所に測定すべきＬＨを含有る、
試料１００μｔを入れ、室温で３０分間インキュベート
る、。洗浄緩衝液での再度洗浄の後に、ペルオキシダー
ゼ（活性１００ｍＵ／ｍ／）とＬＨとは異なるエピトー
プに対応る、本発明によるもう１つのモノクロナール抗
体とからのコンジュゲートｌｏＯμｔを重層し、室温で
１時間インキュベートる、。

このコンジュゲートの製造のために、オランダガシ（Ｍ
ｅｅｒｒｅｔｔｉｃｈ　）ヘルオ＊　Ｖ　！　−セ（ε
。

Ｃ０１，１１，１，７）を使用る、。このコンジュゲー
トは過沃素酸塩での酸化及び引続く水素化ホウ素を用い
る還元により、Ｐ、に、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ　）によ
る処方［：　Ｍ、Ｂ、ウィル７７　（Ｗｉｌｓｏｎ　）
及び・ステイニング−テクニクス（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ
ｏｒｅ−ｓｃｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔ
ａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｃｓ　）　％１．９７８、
エルスウイア／ノース・ホーランＰ・ビオメゾイカ／ｌ
／−プｖ　ス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　／　ＮｏｒｔｈＨｏ
ｌｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　
）　　２１５〜２２４頁〕に応じて製造る、。

洗浄緩衝液を用いる洗浄の後に、ＡＢＴＳ−標呈 単溶液１００μｔを重層し、１時間の景色反応後に、４
０５ｎｍでの吸光度をＥＬ　Ｉ　ＳＡ−リーダー（グイ
ナテツク：　Ｄｙｎａｔｅｃ　）で測定る、。

検量曲線を得るために、前記の方法で１試料の代りに、
ＬＨを種々の限定された濃度で含有る、溶液を用いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施る、自動遠心分離分析装置
用ローター挿入素子の略示図であり、第２図は既知ＬＨ
−含分の血清の検量曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、黄体形成ホルモン（ＬＨ）を測定するために、ＬＨ
   に対応し、他の糖蛋白質ホルモンとは３％より少なく交
   叉反応するモノクロナーール抗体少なくとも１種を使用
   することを特徴とする、黄体形成ホルモンの免疫学的測
   定法。 ２、ＬＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは１％よ
   り少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも１
   種を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、そのうちの少なくとも１種は他の糖蛋白質−ホルモ
   ンとは３％より少なく交叉反応するＬＨに対応するモノ
   クロナール抗体少なくとも２種を使用する、特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、ＬＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは３％よ
   り少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも１
   種を含有することを特徴とする、黄体形成ホルモン測定
   用試薬。 ５、ＬＨに対応し、他の糖蛋白質−ホルモンとは１％よ
   り少なく交叉反応するモノクロナール抗体少なくとも１
   種を含有する、特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６、そのうちの少なくとも１種が３％より少ない他の糖
   蛋白質−ホルモンと交叉反応する少なくとも２種のＬＨ
   に対応するモノクロナール抗体を含有する、特許請求の
   範囲第４項又は第５項記載の試薬。 ７、他の糖蛋白質−ホルモンと３％より少なく交叉反応
   することを特徴とする、黄体形成ホルモンに対応するモ
   ノクロナール抗体。 ８、他の糖蛋白質−ホルモンと１％より少なく交叉反応
   する、特許請求の範囲第７項記載のモノクロナール抗体
   。 ９、他の糖蛋白質−ホルモンと３％より少なく交叉反応
   する、黄体形成ホルモンに対応するモノクロナール抗体
   を取得するため、適当な動物をＬＨで免疫化させ、この
   免疫化された動物の膵臓からＢ−リンパ球を得、これを
   骨髄腫細胞と融合させ、生じたハイブリドーマ細胞をク
   ローン化し、特異的にＬＨに対応する抗体を産生するク
   ローンを選択し、これにより形成された抗体を取得する
   ことを特徴とするモノクロナール抗体の取得法。 １０、ＬＨに対応して、他の糖蛋白質−ホルモンと３％
   より少なく交叉反応するモノクロナール抗体を産生する
   ハイブリドーマ細胞系。