JPS61215330A - セラペプタ−ゼの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗炎症剤などとして有用なセラペプターゼ（
５ｅｒｒａｐｅｐｔａｓｅ、国際一般的名称）の精製法
（−関する。

従来の技術 抗炎症剤などとして有用なセラペプターゼとしては、た
とえばセラチア属菌が産生する１０テアーゼ（特公昭４
１−１０９８１号公報、米国特許第８，６９１，０１４
号公報参照）が挙げら几る。

セラペプターゼの精製法としては、塩類の添加（二よる
塩析法、水溶性有機溶媒の添加（ユよる分画沈澱法、各
種イオン交換吸着体によるクロマトグラフィー法等の精
製法が従来より知らｔている。

しかしながら、こ几らはいず几も塩類、有機溶媒等の多
量の原料を要すること、微細な沈澱物の採取に多大の労
力と時間を要すること、またイオン交換基を有するセフ
ァデックスなどを用いた精製法ではクロマトグラフィー
分離性などの点で優几た面があるが、カラム操作を行う
場合十分な流速が得られず、工業的方法としては問題が
ある等の欠点を有している。

また近年、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体で
あるハイポーラスポリマー系の非極性吸着剤を用いる精
製法が、ある種の酵素（二ついて提案さねている（特開
昭５２−１５８８４号公報参照）。しかし、この吸着剤
は、吸着溶出時の収率が悪く、またセラペプターゼはこ
几らの吸着剤に殆んど吸着されないという欠点を荷下る
。

従来のセラペプターゼの精製法によっては、上記した如
く、種々の欠点を有しており、そのため、比活性の高い
セラペプターゼを得ることは困難であった。

上記した事情に鑑み、本発明者らは、より効率的なセラ
ペプターゼの精製法を確立すべく種々研究を重ねたとこ
ろ、アクリル酸エステル系の非イオン性吸着樹脂がセラ
ペプターゼに対して強い吸着力を有すること、さらに、
吸着時に水溶性塩類を共存させると該吸着樹脂への吸着
力が著しく増強さねること、さらに驚くべきことには、
セラペプターゼが吸着された該吸着樹脂よりのセラペプ
ターゼの溶出に際し、その溶出力を弱めると推定された
水溶性塩類を溶出剤中に共存させることにより逆に溶出
収率が飛躍的に向上するという全く思いもかけぬ事実を
見い出し、こ肚らの新知見（−基づいてさらに研究した
結果本発明を完成した。

本発明は、セラペフ′ターゼを含有下る溶液をアクリル
酸エステル系の非イオン性吸着樹脂に接触させてセラペ
プターゼを吸着させ、次いで、吸着さｎたセラペプター
ゼを溶出剤で溶出させることを特徴とするセラペフ“タ
ーゼの精製法である。

セラペフ′ターゼを含有する溶液としては、たとえば特
公昭４１−１．０９８１号公報、米国特許第３．６９１
，０１４号公報などに記載のセラチア属に属しセラペプ
ターゼを生産する能力を有する微生物を培地に培養して
得らｎた培養液または該培養液を菌体分離、塩析、溶媒
分画あるいは膜分離等の方法（−より一部精製された粗
酵素を含有する水溶液などが挙げられる。

該セラチア属に属しセラペプターゼを生産する能力を有
する微生物としては、たとえばセラチア・エスピー８１
５株が挙げられ、該セラチア・エスピーＥｉｓ株は、ジ
・アメリカン・タイプ・カルテヤー−コレツｉ／　ヨン
（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　’ｌ’ｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅｔｉｏｎ　）（米国）に西暦１９６
７年５月１５８ｉ二受託番号ＡＴＣＣ２１０７４として
寄託され、該コレクションのカタログ・オブ・ストレイ
ンズ　Ｔ　第１５版１９８２年（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　Ｃａｔａｌ　−ｏｇｕｅ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ　（
ｐｉｆｔｅｅｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ１９８２）−二掲
載されている。

セラペプターゼを含有する溶液（二おけるセラペプター
ゼの濃度としては、通常の水溶液状態であれば特（二問
題なく適用可能である。好ましくは１０％以下、０．０
１％以上であ几ば適用容易である。該溶液のｐＨは、セ
ラペプターゼの安定ｐＨ範囲であるｐＨ約４ないし９が
好ましい。

本発明で用いらするアクリル酸エステル系非イオン性吸
着樹脂としては、アクリル酸もしくはメタクリル酸等の
アルキル置換アクリル酸のアルキルエステルの重合物で
、巨大網状構造を有する多孔性の非イオン性吸着樹脂が
挙げろ几、またアルキルエステル部の一部にスルホキサ
イド等が含まｎでいてもよく、更Ｃニエステル結合の他
に一部アクリル酸アミド結合等を有しているものが含ま
れているもの、また上記アクリル酸エステル系の組成が
約５０％以上であれば、たとえばアクリロニトリル等と
の共重合物でもよい。

またこれらの樹脂の中でも非極性のものよりは、極性を
もったものがより好ましく使用できる。

アクリル酸エステルのみからなる吸着樹脂の具体例とし
ては、例えばダイヤイオンＨＰ−４ＭＧ。

１４Ｐ−２ＭＧ、ＨＰ−８ＭＧ（三菱化成工業株式会社
製：商品名）、アンバーライトＸＡＤ−７，ＸＡＤ−８
（米国ロームアンドへ−ス社製：商品名）等が挙げられ
る。

本発明で用いら几る吸着剤樹脂は第−表に示されるよう
に表面積が約１００〜５００％２７ｆｌ＊細孔容積が約
０．３〜１．２ｍｌ／９の特性値！持っているものが好
ましい。

第−表　吸着樹脂の物性 表面積　細孔容・積 （シフ）　　Ｃｍ１７ｇ） ダイヤイオン　　ＨＰ−ＩＭＧ　　　８００　　　０．
９ダイヤイオン　　ＨＰ−２ＭＧ　　　５００　　　１
．２ダイヤイオン　　ＨＰ−ａＭＧ　　　５００　　　
０．６アンバーライト　ＸＡＤ−７４５００゜３アンバ
ーライト　ＸＡＤ−８１４００，７また、アクリル酸エ
ステルのアルキルエステル部の一部にスルホキサイドが
含まｎている吸着樹脂の例としては、たとえばアンバー
ライトＸＡＤ−９（米国ロームアンドハース社製）が挙
げら几る。

本発明方法における吸着は、通常行なわｎる操作、たと
えばカラム法、パッチ法など、（二よって行なわれる。

該吸着（−おいては、セラペプターゼ含有溶液は、その
まま吸着剤に接触させてもよいし、水溶性塩類を共存さ
せて吸着剤に接触させてもよい。水溶性塩類を共存させ
る方が、吸着能が向上する。

該水溶性塩類としては、アンモニウムイオンあるいは金
属イオン等の陽イオンと各種無機酸あるいは有機酸等の
陰イオンよりなる比較的水溶性の高い塩類が挙げられ、
なかでも陽イオンとしてはアンモニウムイオン、ナトリ
ウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属イオン、マ
グネシウム。

カルシウム等のアルカリ土類金属イオン、亜鉛・コバル
ト等の金属イオンよりなる水溶性塩類がより好ましい。

また陰イオンとしては硫酸イオン。

リン酸イオン、クロルイオン、硝酸イオン等の無機酸イ
オン、酢酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン等の
有機酸イオンよりなる水溶性塩類がより好ましく用いら
ｎる。

該水溶性塩の具体例としては、たとえば硫酸塩（例、ナ
トリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウ
ム塩等）、クロライド（例、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム。

塩化カルシウム、塩化コバルト等）、酢酸塩（例、ナト
リウム塩、アンモニウム塩、亜鉛塩等）、リン酸塩（例
、ナトリウム塩、カリウム塩等）、硝酸塩（例、ナトリ
ウム塩等）、酒石酸塩（例、ナトリウム塩等）、クエン
酸塩（例、ナトリウム塩等）などが挙げられる。

セラペプターゼを含有する溶液に共存させてもよい水溶
性塩類の使用量は、該溶液に対し約５ないし２０％（Ｗ
／Ｖ　）である。

本発明方法（＝おける吸着操作においては、温度は約０
〜３０℃で、さら（二好ましくは約０〜１０℃で行なわ
ｎる。

該吸着操作としては吸着樹脂を充填したカラムにセラペ
プターゼを含有する該溶液を、たとえばＳＶ＝約０．０
５〜２０（充填吸着樹脂量の約０．０５〜２０倍／時間
の流速）で通液し吸着させるカラム法、また該溶液中に
吸着樹脂を投入し攪拌しながらセラペプターゼを該吸着
樹脂（二吸着させるパッチ法等のいずれの方法でも良い
。

本発明方法における溶出は、セラペプターゼが吸着され
た樹脂を、たとえば含水有機溶媒で処理することにより
行なわ几る。該有機溶媒としては、たとえば低級アルコ
ール類（例、メタノール、エタノール。１０パノール、
インプロパツール、フタノール、インブタノール等）、
ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン等）、エ
ステル類（例、酢酸メチル。酢酸エチル等）、エーテル
類（例、ジオキサン等）などが挙げら八る。

該溶出の際（二は、溶出剤である含水有機溶媒に、さら
に水溶性塩類を含有せしめてもよい。水溶性塩類を含有
せしめると、溶出効率が向上する。該水溶性塩類として
は、前記した吸着時に共存せしめてもよい水溶性塩類と
同様のものが挙げら肚る。

該水溶性塩類の使用量は、含水有機溶媒の量（二対し約
０，５〜１０％（Ｗ／Ｖ）である。本発明方法における
溶出操作は、温度約０〜３０℃、さらに好ましくは約Ｏ
〜１０℃で行なわれる。該溶出操作は、前記吸着操作Ｃ
二準じたカラム法あるいはパッチ法等いずれの方法を用
いてもよい。

また本発明の精製法を従来の塩析法、溶媒分画法、クロ
マトグラフィー法、更（二は膜分離法等と組み合わせて
行うことももちろん可能である。

本発明のセラペプターゼ精製法の特徴的利点としては、
吸着容量が非常１：大きいこと、溶出収率が良いこと、
夾雑物の多い粗酵素液に直接応用できること、分画能力
が高く酵素比活性を大巾（二高めることができること、
工業的スケールでカラムクロマトグラフィーを行う場合
に早い流速が確保できること、吸着・溶出と言う簡単な
操作なので労力が大いに節減できること等があげられる
。したがって、本発明方法は、セラペプターゼを工業的
に生産する場合のその精製法として、頁別に利用するこ
とができる。

実施例 以下の実施例および実施例（二より、本発明をさらに具
体的（ユ説明する。なお以下の操作は丁べて約１０℃の
条件下で行わルたものである。

実験例１ セラペプターゼ含有水溶液５００ｍＪ（セラペプターゼ
活性５０８０　ＰＵ／ｍ１．但しＰＵについては特公昭
４１−１０１９８号公報参照）を１００ｍｊの吸着樹脂
を充填したカラムに流速１Ｇ　０ｆｆｌｌ？／Ｈで通液
し溶液中のセラペプターゼを吸着させた時の各樹脂の吸
着容量はｆＪｒ１２表の通りであった。

上記より、スチレンとジビニルベンゼンの共重合物を母
体とする吸着剤樹脂は、セラペプターゼを殆んど吸着し
ないが、アクリル酸エステル系吸着樹脂を用いた場合に
はセラペプターゼは効率良く吸着されることがわかる。

実験例２ 実験例１と同様のセラペプターゼ含有水溶液Ｃ二硫酸ア
ンモニウムを添加した溶液を吸着樹脂アンバーライ）Ｘ
ＡＤ−８に通液させ、５％破過点を求めた時の硫酸アン
モニウム添加濃度とアンバーライ）ＸＡＤ−８への吸着
力の関係について測定した。その結果を第３表（二本す
。

第３表（二本したように５〜２０％の硫酸アンモニウム
を添加すること（二よって大巾に吸着能が向上すること
がわかる。

実験例ａ 実験例２と同様の方法で、吸着樹脂としてダイヤイオン
ＨＰ−ＩＭＧを用い、水溶性塩類の共存（塩類を１０％
ｗ／ｖとなるよう（二添加）によるセラペプターゼの吸
着能を調べた。結果を第４表（ニ（塩類が無添加の場合
の吸着能を１として表わした。） 第４表で示されたように、水溶性塩類を添加することに
よりいずれの塩類でも無添加の場合に比しセラペプター
ゼの吸着能が大幅に向上することがわかる。

実験例４ 実験例１と同様のセラペプターゼ含有水溶液５００ｍ１
に硫酸アンモニウム５１を加え溶解しタッチ、７ンバー
５イ）ＸＡＤ−８１００１Ｍを充填したカラムに通液し
、セラペプターゼを吸着させた。次にｌＯ％硫酸アンモ
ニクム水１５０ｍＡ！で洗浄したのち、４０％メタノー
ル水に硫酸アンモニウムを０〜１０％濃度となるように
添加した溶出剤で溶出した時のセラペプターゼの溶出収
率な調べた。結果を第５表に示す。

上記第５表から、硫酸アンモニウム濃度０．５〜ｌＯ％
の４０％メタノール水で溶出した時に溶出収率が著しく
向上することが分かる。

実施例１ セラペプターゼ生産菌セラチア・エスピーＥｔｓ（５ｅ
ｒｒａｔｉａ　ｓｐ　Ｅ、、　ＡＴＣＣ２１０７４）を
アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
ト　リ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ　−ｍｉｓｔｒｙ）　　
３４，１１０〜８１８（１９７０）を二記載の方法と同
様の方法で培養して得た培養液を遠心分離し上澄液５１
を得た（セラペプターゼ活性４８００　ＰＵ／ｍｌ）。

この上澄液に硫酸アンモニウム７５０１を添加して溶解
した。この液をダイヤイオンＨＰ　−ＩＭＧ　５００　
Ｉｌ＋／を充填したカラムに１０００１ｒｒｌ／Ｈの流
速で通液しセラペプターゼを吸着させた。吸着終了後１
５％硫酸アンモニウム水５００ｍ１で洗浄し、次（二４
％硫酸アンモニウム・５０％メタノール水を５００　Ｍ
ｌ／Ｈの流速でカラムＣ：流しセラペプターゼを溶出し
た。

活性フラクションを集めて精製セラペプターゼ液７５０
ｍ１（８１５００ＰＵ／ｍ）を得た。酵素比活性は、遠
心上澄液に比ベア倍上っていた。

実施例２ 実施例１と同様にして得た遠心上澄液１５１に硫酸ナト
リウム’１５０１１を添加溶解した。この液をアンバー
ライ）ＸＡＤ−８４，２１を充填したカラム（二４１／
Ｈの流速で通液し、次に５％硫酸ナトリウム水を通液し
、夾雑不純物を除いた後、０．５％硫酸ナトリウム・４
５％メタノール水を２１７Ｈの流速で通液し吸着したセ
ラペプターゼを溶出し活性フラクシヨンを集め精製セラ
ペプターゼ溶液５．９１　（９７６０ＰＵ／ｍｌ）　ｆ
得た。

この液をポリスルフォン系の限外濾過膜ＰＭ−１０（米
国ロミコン社製）に循環流入させ５０　ＯＮまで濃縮し
た（１０℃１．５　ｋｇ／ｃｍ　　循環流速９０Ｊ／Ｈ
，膜面積０．１ｆｉ”）。濃縮液に水５００ゴを加え再
び限外ｒ過濃縮を行なった。同様の操作を５回繰り返し
精製濃縮液５００ｍ１を得た。この液に乳糖１ｓｇを添
加溶解した後凍結乾燥を行い、精製セラペプターゼ粉末
１９．１．９（２４００ＰＵ／η）を得た。この精製粉
末の酵素比活性は、遠心上澄液に比べ１５倍向上してい
た。

実施例３ 実施例１と同様の方法で得た遠心上澄液８１＋＝硫酸ア
ンモニウム６００ｇを溶解しダイヤイオンＨＰ−２ＭＧ
　　８０ｏｍｙ！を充填したカラムに３００ｍＡ／Ｈの
流速で通液しセラペプターゼを吸着させた。

次に１５％硫酸アンモニウム水で洗浄後１０％塩化ナト
リウム・４５％エタノール水で溶出し精製セラペプター
ゼ液６７０１ｒＬｇを得た。（１６４００ＰＵ／ｍｅ）
。

実施例４ 実施例】においてダイヤイオンＨＰ−ＩＭＧに吸着した
セラペプターゼを、溶出剤として４％硫酸アンモニクム
・５０％メタノール水のかわりに０５％酢酸アンモニウ
ム・４０％アセトン水を用いて溶出し精製酵素液１．６
１を得た（　１２７５０ＰＵ／ｍｌ　）。酵素比活性は
遠心上澄液に比ベア倍向上していた。

発明の効果 本発明の精製法においては、吸着剤としてアクリル酸エ
ステル系非イオン性吸着樹脂を用いたこと（二より、セ
ラペプターゼの吸着能を飛躍的に向上させることができ
る。さらＣ：ここ【二おいて、樹脂（＝接触させるセラ
ペプターゼ含有溶液あるいは溶出操作時に用いる溶出液
に水溶性塩類を共存させること（二よりセラペプターゼ
の吸着あるいは溶出をそれぞれ飛躍的に向上させること
ができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）セラペプターゼを含有する溶液をアクリル酸エス
   テル系非イオン性吸着樹脂に接触させてセラペプターゼ
   を吸着させ、次いで、吸着されたセラペプターゼを溶出
   剤で溶出させることを特徴とするセラペプターゼの精製
   法。
2. （２）セラペプターゼを含有する溶液に水溶性塩類を共
   存させて樹脂に接触させる特許請求の範囲第１項記載の
   精製法。
3. （３）水溶性塩類を溶解した溶出剤を用いる特許請求の
   範囲第１項記載の精製法。