JPS6121240B2 - - Google Patents
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Description
グルカゴンは動物の糖代謝に極めて重要な働き
をするホルモンであるが、その血中濃度の測定は
従つて臨床上、極めて重要である。本発明は、本
ホルモン、特に膵臓由来のグルカゴンの血中濃度
の測定に有用な、ラジオイムノアツセイ用、ヨー
ド化されたグルカゴンフラグメントおよびその原
料ペプチドに関するものである。
グルカゴンには、化学構造上、類似していると
いわれる膵グルカゴン
と、腸管グルカゴンが存在し、血糖値に影響する
ものは主として膵グルカゴンとされている。従つ
て、臨床的に必要な測定値は主として膵由来のグ
ルカゴンの血中濃度である。
ところで、血中に存在する微量のホルモンを定
量するためには、現在ラジオイムノアツセイ法が
広く用いられているが、そのためには、125又
は131で、ヨード化されたホルモンが必要であ
る。しかし、グルカゴンの場合、ヨード化して得
られるヨードグルカゴンは、腸グルカゴンに対す
る抗体との反応性は良いが、膵グルカゴンに対す
る抗体との反応性は極めて悪いのが一般的であ
り、従つて、膵グルカゴンのみを選択的に測定す
ることは難かしいことは良く知られている所であ
る。
本発明者らは、膵グルカゴンに特異的な抗体と
の反応性の高い、ヨードラベル化合物の製造を目
的として種々検討した結果、式
（R1およびR2は、それぞれＨまたは放射性ヨ
ー素、R3はNH2を有しまたは有しない炭素数４ま
でのアルカン残基、R4は膵グルカゴンの19位ま
での１−５個の部分ペプチド鎖、R5はMetをそれ
ぞれ示す。）のペプチドが膵グルカゴンあるい
は膵グルカゴン特異的に反応する抗体とそれぞれ
特異的に反応しうること。そして式
（R′1およびR′2の一方が放射性ヨー素で他方が
Ｈであるか、あるいは両方が放射性ヨー素、R3
はNH2を有しまたは有しない炭素数４までのアル
カン残基、R4は膵グルカゴンの19位までの１−
５個の部分ペプチド鎖、R5はMetをそれぞれ示
す。）のペプチド′が膵グルカゴン測定ラジオイ
ムノアツセイ用診断剤として有効に使用しうるこ
と等の予期せざる新知見を得、これらの新知見に
基づきさらに種々研究した結果、本発明を完成し
た。
すなわち、本発明はペプチドおよびペプチド
′を含有する膵グルカゴン測定ラジオイムノア
ツセイ用診断剤である。
R1，R′1，R′2で表わされる放射性ヨー素として
は、125，131があげられる。
R3の炭素数４までのアルカン残基としては、
たとえば−CH2−，−CH2CH2−，−CH2CH2−
CH2−，−CH2CH2CH2CH2−などがあげられ、そ
れらは適宜NH2を有していてもよい。ペプチド
のＮ末端がチロシル基の場合、それはｌ体、ｄ体
あるいはラセミ体のいずれであつてもよい。
R4は、膵グルカゴンの19位までの１−５個の
部分ペプチド鎖で、
を示す。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。
Arg：アルギニン
Trp：トリプトフアン
Asn：アスパラギン
Asp：アスパラギン酸
Thr：スレオニン
Ser：セリン
Glu：グルタミン酸
Gln：グルタミン
Ala：アラニン
Val：バリン
Met：メチオニン
Met（Ｏ）：メチオニンスルフオキシド
Leu：ロイシン
Nle：ノルロイシン
Phe：フエニルアラニン
Ｚ：カルボベンゾキシ
Boc：ｔ−ブチルオキシカルボニル
OBut：ｔ−ブチルエステル
OBzl：ベンジルエステル
ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドエステル
MBS：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル
HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド
DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド
DCU：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルウレア
DMF：Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド
NMP：Ｎ−メチル−２−ピロリド
TFA：トリフルオロ酢酸
THF：テトラヒドロフラン
TEA：トリエチルアミン
DCHA：ジシクロヘキシルアミン
CMC：カルボキシメチルセルロース
Hpa：ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸
Hpp：ｐ−ヒドロキシフエニルプロピオン酸
本発明のペプチドは、ペプチド合成の常套手
段で製造しうる。固相合成法、液相合成法のいず
れによつてもよいが、液相合成法が有利な場合が
多い。そのようなペプチド合成の手段は、たとえ
ば“The Peptides”、第１巻（1966），Schr¨ｏder
and Lubke著、Academic Prese，New York，
U.S.A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸
善株式会社（1975年）に記載されており、たとえ
ばアジド法、クロライド法、酸無水物法、混酸無
水物法、DCC法、活性エステル法、ウツドワー
ド試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール
法、酸化還元法、DCC／アデイテイブ（例、
HONB，HOBt，HOSu）法などがあげられる。
本発明の化合物は、そのペプチド結合の任意
の位置で２分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、
他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を
有する原料をペプチド合成の常套手段で縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その
保護基を常套手段で脱離させることにより製造し
うる。ペプチド′は、R1＝R2＝Ｈのペプチド
をそれ自体常套手段で放射性ヨー素でヨー素化し
て有利に製造しうる場合が多い。
ペプチドを製造する反応工程で、Aspは通常
保護しておくのが望ましい場合が多く、最終工程
としてはペプチドの構成アミノ酸残基の少くと
も一つが保護された保護ペプチドから保護基す
べて脱離することにより製造しうる場合もあり、
あるいは最終工程で
Glucagon is a hormone that plays an extremely important role in sugar metabolism in animals, and measurement of its blood concentration is therefore extremely important clinically. The present invention relates to an iodinated glucagon fragment and its raw material peptide for radioimmunoassay, which is useful for measuring the blood concentration of this hormone, particularly glucagon derived from the pancreas. Glucagon is said to have a similar chemical structure to pancreatic glucagon. In addition, there is intestinal glucagon, and pancreatic glucagon is said to mainly affect blood sugar levels. Therefore, the clinically necessary measurement value is mainly the blood concentration of glucagon derived from the pancreas. By the way, the radioimmunoassay method is currently widely used to quantify trace amounts of hormones present in the blood, but for this purpose, hormones iodinated with 125 or 131 are required. However, in the case of glucagon, iodoglucagon obtained by iodination has good reactivity with antibodies against intestinal glucagon, but generally has extremely poor reactivity with antibodies against pancreatic glucagon. It is well known that it is difficult to selectively measure only the As a result of various studies aimed at producing an iodolabel compound with high reactivity with antibodies specific to pancreatic glucagon, the present inventors found that the formula (R 1 and R 2 are H or radioactive iodine, respectively, R 3 is an alkane residue with up to 4 carbon atoms with or without NH 2 , and R 4 is a residue of 1 to 5 carbon atoms up to position 19 of pancreatic glucagon. The peptides of the partial peptide chains (R 5 represents Met) can react specifically with pancreatic glucagon or an antibody that specifically reacts with pancreatic glucagon. and the expression (One of R′ 1 and R′ 2 is radioactive iodine and the other is H, or both are radioactive iodine and R 3
is an alkane residue having up to 4 carbon atoms with or without NH 2 , R 4 is a 1- to 19th position of pancreatic glucagon
Five partial peptide chains, R 5 each represent Met. We have obtained unexpected new findings such as the fact that the peptide ' of ) can be effectively used as a diagnostic agent for radioimmunoassay for measuring pancreatic glucagon, and as a result of further various studies based on these new findings, we have completed the present invention. That is, the present invention is a diagnostic agent for pancreatic glucagon measurement radioimmunoassay containing a peptide and a peptide'. Examples of radioactive iodine represented by R 1 , R′ 1 , and R′ 2 include 125 and 131 . As an alkane residue with R 3 having up to 4 carbon atoms,
For example, −CH 2 −, −CH 2 CH 2 −, −CH 2 CH 2 −
Examples include CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2- , and they may contain NH2 as appropriate . When the N-terminus of the peptide is a tyrosyl group, it may be in the l-, d-, or racemic form. R4 is a 1-5 partial peptide chain up to position 19 of pancreatic glucagon, shows. In this specification, when amino acids, peptides, protective groups, active groups, etc. are indicated by abbreviations,
They are IUPAC-IUB Commission on
The abbreviations are based on Biological Nomenclature or common abbreviations in the field, examples of which are listed below. Furthermore, when an amino acid or the like can have optical isomers, the L-isomer is indicated unless otherwise specified. Arg: Arginine Trp: Tryptophan Asn: Asparagine Asp: Aspartic acid Thr: Threonine Ser: Serine Glu: Glutamic acid Gln: Glutamine Ala: Alanine Val: Valine Met: Methionine Met (O): Methionine sulfoxide Leu: Leucine Nle: Norleucine Phe : Phenylalanine Z: Carbobenzoxy Boc: t-Butyloxycarbonyl OBu t : t-Butyl ester OBzl: Benzyl ester ONB: N-hydroxy-5-norbornene-
2,3-dicarboximide ester MBS: p-methoxybenzenesulfonyl HONB: N-hydroxy-5-norbornene-
2,3-dicarboximide DCC: N,N'-dicyclohexylcarbodiimide DCU: N,N'-dicyclohexylurea DMF: N,N'-dimethylformamide NMP: N-methyl-2-pyrrolide TFA: Trifluoroacetic acid THF: Tetrahydrofuran TEA: Triethylamine DCHA: Dicyclohexylamine CMC: Carboxymethyl cellulose Hpa: p-hydroxyphenyl acetic acid Hpp: p-hydroxyphenylpropionic acid The peptide of the present invention can be produced by conventional methods of peptide synthesis. Either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used, but the liquid phase synthesis method is often advantageous. Such means of peptide synthesis are described, for example, in “The Peptides”, Volume 1 (1966), Schr¨oder
and Lubke, Academic Prese, New York,
USA or "Peptide Synthesis", written by Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd. (1975), such as the azide method, chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, Woodward reagent Method using K, carbodiimidazole method, redox method, DCC/additive (e.g.
Examples include the HONB, HOBt, HOSu) method. The compound of the present invention comprises a raw material having a reactive carboxyl group corresponding to one of two types of fragments bisected at any position of the peptide bond;
When a raw material having a reactive amino group corresponding to the other fragment is condensed using a conventional method for peptide synthesis, and the resulting condensate has a protecting group, it can be produced by removing the protecting group using a conventional method. Peptides' can often advantageously be prepared by iodinating peptides with R 1 =R 2 =H per se in conventional manner with radioactive iodine. In the reaction process for producing peptides, it is often desirable to protect Asp, and the final step is to remove all protecting groups from the protected peptide, in which at least one of the constituent amino acid residues of the peptide is protected. In some cases, it can be manufactured by
Or in the final process
【式】で表わされる基を残
余ペプチドフラグメントに常套手段で導入するこ
とにより製造しうる場合もある。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護お
よび保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に
関与する官能基の活性化などもまた公知のものあ
るいは手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカ
ルボベンゾキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、
ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキ
シカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオ
ロアセチル、フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフ
エニルスルフエニル、ジフエニルホスフイノチオ
イルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基
としては、たとえばアルキルエステル（例、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチルなど
のエステル基）、ベンジルエステル基、ｐ−ニト
ロベンジルエステル基、ｐ−メトキシベンジルエ
ステル基、ｐ−クロルベンジルエステル基、ベン
ズヒドリルエステル基、カルボベンゾキシヒドラ
ジド基、ｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド
基、トリチルヒドラジド基などがあげられる。
アルギニンのグアニジノ基の保護基としては、
たとえばニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベン
ゼンスルホニル基、カルボベンゾキシ、イソボル
ニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカル
ボニル等が例示される。また、そのグアニジノ基
は、酸（例、ベンゼンスルホン酸、トルエンスル
ホン酸、塩酸、硫酸など）塩の形で保護してもよ
い。
スレオニンの水酸基は、たとえばエステル化ま
たはエーテル化によつて保護することができる。
このエステル化に適する基としてはたとえばアセ
チル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル
基、などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニ
ル基、エチルオキシカルボニル基などの炭酸から
誘導される基などがあげられる。またエーテル化
に適する基としては、たとえばベンジル基、テト
ラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
しかしながらスレオニンの水酸基は必ずしも保護
する必要はない。メチオニンはスルホキサイドの
形で保護しておいてもよい。原料のカルボキシル
基の活性化されたものとしては、たとえば対応す
る酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロ
ロフエノール、ｐ−ニトロフエノール、Ｎ−ハイ
ドロキシサクシンイミド、Ｎ−ハイドロキシベン
ズトリアゾール、Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボ
ルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどとのエ
ステル）などがあげられる。ペプタイド結合形成
反応は脱水剤（例、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、カルボジイミダゾール等のカルボジイミド
試薬）の存在下に実施しうる場合がある。
本ペプタイド縮合反応は溶媒の存在下に行うこ
とができる。溶媒としては、ペプタイド縮合反応
に使用しうることが知られているものから適宜選
択されうる。たとえば無水または含水のジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、ピリジ
ン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロルメタ
ン、テトラハイドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メ
チルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物な
どがあげられる。
反応温度はペプチド結合形成反応に使用されう
ることが知られている範囲から適宜選択され、通
常約−40℃−約60℃、好ましくは約−20℃−約０
℃の範囲から適宜選択される。
本縮合反応終了後、生成物が保護基を有してい
る場合、それは常法により離脱できる。かかる常
法としては、たとえば還元的方法（例、パラジウ
ム黒等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア
中金属ナトリウムによる還元）、アシドリシス
（例、トリフルオロ酢酸、フツ化水素、メタンス
ルホン酸等の強酸によるアシドリシス）などがあ
げられる。
上記のようにして製造されたペプチドは反応
終了混合物から、ペプチドの分離手段、抽出、分
配、カラムクロマトグラフイーなどにより採取で
きる。
この様にして得られた本発明のペプチド
（R1＝R2＝Ｈ）のヨードラベル化は、公知のクロ
ラミンＴ法〔W.M.Hunter and F.C.
Greenwood，Nature，194，495（1962）〕によつ
て実施しうる。ヨード化の反応条件を適宜設定す
ることによりR′1およびR′2のいずれか一方が放射
性ヨー素で他方がＨのペプチド′，R′1および
R′2の両方共放射性ヨー素の化合物′あるいはそ
れらモノおよびジヨー素体の任意の割合の混合物
を製造き、それらはいずれも目的とするラジオイ
ムノアツセイに適宜使用しうる。ヨード化された
ペプチドは、セフアデツクス等に用いるゲルろ過
カラムクロマトグラフイーにより、無機ヨードと
分離したのち凍結し、場合によりさらに乾燥し
て、粉末を得てもよい。この様にして得られたヨ
ード化されたペプチド′は、膵グルカゴンに特
異的な抗体と極めて良く反応し、グルカゴンと同
じ強さの反応性を有する。
本発明のペプチドは、種々の特徴を有する
が、その例を次にあげる。
(1) 本発明のペプチドは、種々の抗源から生ず
る膵グルカゴン抗体と特異的に効率よく反応す
る。
(2) 本発明のペプチド′は、血液中の膵グルカ
ゴンをそれ自体公知のラジオイムノアツセイ法
で正確に測定しうる場合に有用である。
以下の実施例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、メルク社製シリカゲルプレート60F254又
は、フナコシ薬品社製セルロースプレート、アビ
セルSFを用い、下記の展開溶媒を用いた。
Rf1：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5
Rf2：クロロホルム：メタノール；水＝７：３：
0.5
Rf3：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24
実施例 １
(1) Boc−Asn−Thr−OBzlの製法
Boc−Thr−OBzl 112ｇをTFA300mlに溶か
し、室温で20分間振り混ぜた後、濃塩酸30mlを加
え、溶液を減圧濃縮する。残留物がTHF1に溶
かし、氷冷し、TEA50mlを加えて中和する。こ
れにBoc−Asn−OH76.7ｇ，HONB64.5ｇ，
DCC74.3ｇを加えて15時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去した後、溶媒を減圧で留去し、残留
物を酢酸エチル１に溶かす。これを10％クエン
酸水（300ml×３）、飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３）、水（300ml×３）で順序洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去
した後、酸留物にエーテル１を加えて、粉末と
して、ろ取した後、アセトニトリルより再結晶す
る。収量105.1ｇ（75.2％）m.p165−166℃〔α〕
２３ Ｄ−13.9゜（ｃ＝0.9，DMF中），Rf10.51，
C20H29C7N3としての元素分析計算値：C56.72；
H6.90；N9.92，実験値：C57.01；H6.89；N9.94
(2) Boc−Met（Ｃ）−Asn−Thr−OBzlの製造
Boc−Asn−Thr−OBzl50.0ｇにTFA170mlを
加えて室温で30分間振り混ぜた後、濃縮したエー
テル500mlを加えて粉末してろ取し乾燥する。こ
れをTHF400mlに溶かし、氷冷しTFA20mlを加え
た後、Boc−Met（Ｏ）−ONB（Boc−Met（Ｏ）・
OH31.3ｇHONB23.3ｇをTHF200mlに溶解し、氷
冷し、DCC26.8ｇを加えて、４時間かき混ぜて調
製する。）を加え、15時間かき混ぜる。溶媒を減
圧で留去したのち、残留物に酢酸エチル（200
ml）、エーテル（200ml）を加え、粉末としてろ取
し、アセトニトリルより再沈澱する。収量48.5ｇ
（72.2％）、m.p.145−147℃〔α〕２３ Ｄ−6.5゜（ｃ
＝
1.1，DMF中）、Rf10.19，C25H38O9N4Sとしての
元素分析計算値：C52.62；H6.71；N9.82；
S5.62、実験値：C52.44；H6.73；N9.60；S5.15
(3) Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製法
Boc−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl15.0ｇに
TFA45mlを加え、室温で45分間振り混ぜた後、
濃縮し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取
し、乾燥する。これをDMF50mlに溶解し、氷冷
し、TEA5.7mlを加え、これにBoc−Leu−ONB
（Boc−Leu−OH6.69ｇ、HONB5.70ｇ、DCC6.56
ｇより調製）を加えて、15時間かき混ぜる。溶剤
を減圧で留去した後、残留物に酢酸エチル200ml
を加えて、粉末としてろ取し、アセトニトリル−
酢酸エチルより再沈澱する。収量15.0ｇ（83.4
％），m.p.134−136℃，〔α〕２４ Ｄ−15.1゜（ｃ＝
1.0，DMF中），Rfl0.25，C31H49O10N5Sとしての
元素分析計算値：C54.45；H7.22；N10.24；
S4.69、実験値：C54.62；H7.60；N9.89；S3.95
(4) Ｚ−Gln−Trp−OBzlの製造
Ｈ−Trp−OBzl・パラトルエンスルホン酸塩
50.0ｇをTHF500mlに溶かし、氷冷し、TEA15.4
ml，Ｚ−Gln−GH28.0ｇ，HONB19.7ｇ，
DCC22.7ｇを加えて、15時間かき混ぜる。析出し
たDCUをろ去した後、濃縮し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶かす。これを飽和炭酸水素ナトリ
ウム水（150ml×２），10％クエン酸水（150ml×
２）、水（150ml×２）で順次洗浄する。溶媒を減
圧で留去した後、残留物をTHF300mlに溶かし、
不溶物をろ去する。これを濃縮した後、エーテル
500mlを加えて、粉末としてろ取し、アセトニト
リルより再結晶する。収量46.1ｇ（82.8％），
〔α〕２３ Ｄ＋5.80（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.60，
C31H32O6N4としての元素分析計算値：C66.89；
H5.80；N10.07，実験値：C66.79；H5.71；
N10.20
(5) Ｚ−Val−Gln−Tro−OHの製造
Ｚ−Gln−Trp−OBzl 50.0ｇをメタノール700
mlに溶かし、５時間接触還元（触媒：パラジウム
黒）すると、結晶が析出するので、これをろ取す
る。これをDMF300mlに懸濁し、TEA13mlを加
えて溶かし、触媒をろ去する。これにＺ−Val−
ONB37.0ｇを加えて、10時間かき混ぜた後、IN
−塩酸100mlを加えて中和し、さらに水500mlを加
えて、粉末としてろ取する。これをメタノールで
十分洗浄する。収量43.0ｇ（84.7％），m.p.246−
247℃〔α〕２３ Ｄ＋12.4゜（ｃ＝0.9，DMF中），
Rf10.14，C29H35O7N5としての元素分析計算値：
C61：58；H6.24；N12.38、実験値：C61，86；
H6.30；N12.36
(6) Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OHの製造
Ｚ−Val−Gln−Trp−OH5.1ｇを酢酸100mlに
溶かし、３時間接触還元したのち触媒をろ去し、
濃縮する。これをDMF200mlに懸濁し、これに
TEA2ml，Ｚ−Phe−OH2.70より調製したＺ−
Phe−ONBを加えて、７時間かき混ぜる。溶媒を
減圧で留去し、残留物に酢酸水を加えてゲルとし
てろ取する。これをメタノールより再沈澱する。
収量5.50g（84.5％），m.p.240℃〔α〕２４ Ｄ＋4.1゜
（ｃ＝1.0，DMF中）、Rf10.15，C38H44O8N6・1/2
H2Oとしての元素分析計算値：C63.23；H6.28；
N11.64、実験値：C63.11；H6.29；N11.80
(7) Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OHの製造
Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OH8.5ｇを、
DMF150ml、酢酸50mlの混液に溶かし、５時間接
触還元する。触媒をろ去した後、濃縮し、残留物
にメタノール100mlを加えて結晶としてろ取す
る。これを、DMF200mlに懸濁し、TEA3.0ml、
Boc−Asp（OBzl）−ONB（Boc−Asp（OBzl）−
OH3.9ｇ，HONB2.4ｇ，DCC2.7ｇより調製）を
加えて、10時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物に酢酸水を加えて、ゲルとしてろ
取し、DMF、水より再沈澱する。収量6.3ｇ
（58.1％），m.p.191−192℃（分解），〔α〕２４ Ｄ−
6.2
゜（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.11C46H57O11N7・3/
２H2Oとしての元素分析計算値：C60.64；
H6.63；N10.76、実験値：C60.30；H6.48；
N11.34
(8) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−OHの製造
Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OH6.0ｇに、TFA50mlを窒素気流中加え、10分
間ふり混ぜた後、濃縮しエーテルを加えて粉末と
してろ取する。これをDMF100mlに溶かし、
TEA2.0mlを加え、Boc−Gln−ONB（Boc−Gln
−CH1.76ｇ，HONB1.34ｇ，DCC1.54ｇから調
製）を加えて、15時間かき混ぜる。これに酢酸水
を加えて、粉末として、ろ取したのち、アセトニ
トリル、水より再沈澱する。収量5.50ｇ（82.6
％），m.p.210−212℃（分解）、〔α〕２４ Ｄ−10.1゜
（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.09，C51H65O13N9とし
ての元素分析計算値：C60.52；H6.47；N12.46、
実験値：C60.19；H6.37；N12..23
(9) Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OButの製造
Ｚ−Ala−OBut31.0ｇをメタノール300mlに溶
かし、５時間接触還元した後、触媒をろ去し、濃
縮する。一方、Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA53.0ｇを酢酸エチル500mlに懸濁し、10％
クエン酸200mlを加えて、よく振り混ぜた後、水
洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。これを
THF500mlに溶かし、これに、先に調製したＨ−
Ala−OButを加えHONB14.9ｇを加えて氷冷し、
DCC17.1ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、濃縮した後、酢酸エチル500mlに
溶かし、10％クエン酸水（200ml×３）、飽和炭酸
水素ナトリウム水（200ml×３）、水（200ml×
３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
溶媒を減圧で留去したのち、残留物にエーテル
300mlを加えて粉末として、ろ取する。収量44.5
ｇ（66.8％），m.p.125−127℃，〔α〕２５ Ｄ−6.00（
ｃ
＝1.0，DMF中），Rf10.62，C28H39O8N5Sとして
の元素分析計算値：C55.52；H6.49；N11.56；
S5.27、実験値：C55.71；H6.49；N11.81；S5.29
(10) Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OBut
の製造
Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OBut43ｇをメタノー
ル500mlに溶かし、５時間還元したのち、濃縮す
る。残留物をDMF200mlに溶かし、Ｚ−Arg
（MBS）−OH（Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA49.7ｇより調製）、HONB140ｇを加え、標
冷し、DCC16.1ｇを加えて15時間かき混ぜる。析
出したDCUをろ去した後、濃縮し、残留物をク
ロロホルム500mlに溶かす。これを10％クエン酸
水（300ml×３）、飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３）、水（300ml×３）の順に洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去し
たのち、メタノール300mlを加えて、結晶として
ろ取し、メタノールより再結晶する。収量52.4ｇ
（79.2％），m.p.116−118℃，〔α〕２５ Ｄ−8.8゜（
ｃ＝
1.0，DMF中），Rf10.42，C41H57O12N9S2・2H2O
としての元素分析計算値：C50.86；H6.35；
N13.02；S6.62、実験値：C51.05；H6.08；
N13.11；S6.62
(11) Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OButの製造
Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−
OBut30.0ｇをDMF80ml、メタノール300mlの混液
に溶かし、７時間接触還元する。触媒をろ去し、
メタノールを減圧で留去したのち、これにBoc−
Ser−OH7.3ｇ，HONB6.3ｇを加え、氷冷し、
DCC7.3ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、溶媒を減圧で留去し、残留物を
クロロホルム500mlに溶かす。これを飽和炭酸水
素ナトリウム（300ml×２）、水（300ml×２）で
洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減
圧で留去しのち、クロロホルム30mlにとかしシリ
カゲルのカラム（400ｇ）につける。クロロホル
ム：メタノール：酢酸（９：0.7：0.35）の溶媒
で展開し、800mlから２までの画分を集めて濃
縮し、エーテルを加えて粉末とする。収量25.5ｇ
（79.0％），m.p.85−88℃，〔α〕２６ Ｄ−20.9゜（ｃ
＝
1.0、メタノール中）、Rf10.33，
C41H64O14N10S2・H2Oとしての元素分析計算値：
C49.09；H6.63；N13.96；S6.39，実験値：
C48.96；H6.55；N13.70；S5.84
(12) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−
Arg（MBS）−Ala−OHの製造
Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−
OBut10.5ｇにTFA50mlを加え、室温で60分振り
混ぜた後、濃縮し、エーテル300mlを加えて粉末
としてろ取する。これをDMF50mlに溶かし、
TEA4.1ml，Boc−Asp（OBzl）・ONB（Boc−
Asp（OBzl）・OH3.40ｇ，HONB1.97ｇ，
DCC2.27gより調製）を加えて15時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧留去したのち、残留物に酢酸水を
加えて、粉末として、ろ取し乾燥する。これをア
セトニトリル・エーテルより再沈澱する。収量
6.0ｇ（51.5％），m.p.126−130℃，〔α〕２４ Ｄ＋3.5
゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.17，C48H67O17N11S2・
2H2Oとしての元素分析計算値：C49.26；
H6.12；N13.17；S5.48，実験値：C49.62；
H5.84；N13.00；S5.03
(13) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln
−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製造
Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl3.25g
にTFA25mlを加え、室温で15分間ふり混ぜた
後、濃縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉
末として、ろ取し、乾燥する。これをNMP10ml
に溶かし、TEA2ml加えてよく振り混ぜたのち、
エーテル100mlを加え、粉末として再びろ取す
る。これをDMF100mlに溶かし、さらにBoc−
Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OH4.80ｇ，HONB2.70ｇを加えて溶かしたの
ち、氷冷し、DCC1.55ｇを加えて58時間かき混ぜ
ると反応液がゲル状になる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物を含水アセトニトリルで十分に洗
浄する。収量5.75ｇ（76.8％），m.p.234℃（分
解）〔α〕２６ Ｄ−15.8゜（ｃ＝0.4、酢酸中）、
Rf20.63，C77H104O20N14Sとしての元素分析計算
値：C58.61；H6.64；N12.43；S2.03，実験値：
C59.13；H6.96；N12.40；S1.70
(14) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−
Arg（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr
−OBzlの製造
Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl520ｇ
にアニソール１mlを加え、さらに窒素気流中、
TFA35mlを加えて、室温で15分間かき混ぜ、濃
縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉末とし
てろ取する。これをNMP20mlにとかし、
TEA2.77mlを加えて十分に振り混ぜたのち、エ
ーテル200mlを加えて、粉末としてろ取する。こ
れをLMF150mlに溶かし、Boc−Asp（OBzl）−
Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OH3.66
ｇ，HONB2.36ｇを加え、氷、食塩で−10℃に冷
却し、DCC1.02ｇを加える。反応液を０℃で10時
間、室温で24時間かき混ぜたのち、析出した
DCUをろ去し、溶媒を減圧で留去する。残留物
に水50mlを加えて粉末としてろ取したのち、含水
アセトニトリルで十分に洗浄する。収量5.3ｇ
（61.1％），m.p.237℃（分解），〔α〕２６ Ｄ−7.1゜
（ｃ
＝0.9、酢酸中）Rf20.63，C120H161O34N25S3・
2H2Oとしての元素分析計算値：C54.82；
H6.32；N13.32；S3.57；実験値：C54.47；
H6.16；N13.07；S3.47
(15) Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）
−Asn−Thr−OHの製造
Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−
Gin−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl400mgにアニソール0.25mlを加え、これにメ
タンスルホン酸５mlを加えて、室温で60分振り混
ぜた後、エーテル100mlを加えて油状物を沈澱さ
せる。エーテルを傾斜法で除いたのち、残留物を
水10mlにとかし、アンバーライトIRA−410（酢
酸型）カラム（１×10cm）を通し、溶出液（液量
50ml）を氷冷し、3Nアンモニア水10mlを加えて
０℃で30分間かき混ぜたのち、凍結乾燥する。こ
れを水30mlにとかし、CMCのカラム（22×18
cm）に付し、水（500ml）から0.2M酢酸アンモニ
ア水（500ml）までの線型勾配法で溶出し、150ml
から195mlまでの画分を集めて凍結乾燥する。収
量150mg。次にこれを水20mlに溶かし、アンバー
ライトXAD−２のカラム（1.6×５cm）に付し、
水（200ml）から80％エタノール（200ml）までの
線型勾配法で溶出し、180mlから225mlまでの画分
を集め、エタノールを留去したのち、凍結乾燥す
る。収量115mg，〔α〕２４ Ｄ−33.6゜（ｃ＝0.6；50％
酢酸水中），Rf30.54（アビセス）、アミノ酸分析
（４％チオグリコール酸5.7N−塩酸加水分解）；
Arg2.03（２）；Trp0.87（１）；Asp3.03
（３）；Thr0.97（１）；Ser0.73（１）；Glu2.13
（２）；Ala1.00（１）；Val1.03（１）；Met1.00
（１）；Leu1.03（１）；Phe1.03（１）；（ペプ
チド含量85.7％）
(16) Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr−OH（glucagon（15−29））の製造
Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Alar−Gln−Asp
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn
−Thr−OH225mgを５％チオグリコール酸水20ml
に溶かし、50℃で20時間放置するとゲルが析出す
る。水を減圧で留去したのち、残留物を50％酢酸
５mlに溶かし、セフアデツクスＧ−25のカラム
（23×118cm）に付す。50％酢酸水で溶出し、180
mlから240mlまでの画分を集めて凍結乾燥する。
収量220mg，〔α〕２４ Ｄ−30.0゜（ｃ＝0.3，50％酢酸
水中），Rf30.59（アビセル）、アミノ酸分析（４
％チオグリコール酸、5.7N−塩酸加水分解）；
Arg2.15(2)；Trp0.91(1)；Asp3.13(3)；Thr0.99
(1)；Ser0.87(1)；Glu2.20(2)；Ala1.05(1)；Val0.96
(1)；Met1.00(1)；Leu1.07(1)；Phe1.07(1)；ペプチ
ド含量79.3％
(17) Hpa−ONBの製造
ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸（Hpa）1.52ｇを
THF20mlにとかし、氷冷しこれにHONB1.97ｇ，
DCC2.27gを加えて４時間かき混ぜたのち室温に
もどし、さらに15時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去したのち、溶媒を減圧で留去し、残
留物に石油ベンジンを加えて結晶としてろ取す
る。これを酢酸エチル、石油ベンジンより再結晶
する。収量2.50ｇ（79.9％）mp137−138℃，
C17H15O5Nとしての元素分析計算値：C65.17；
H4.82；N4.47，実験値：C65.32；H4.91；
N4.75。
(18) Hpa−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr−OHの製造
Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−
Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−
OH110mgをDMF5ml、水１mlの混液にとかし、こ
れにHPa−ONB30mgを加えて、15時間かき混ぜ
るとゲルが析出するので、溶媒を減圧で留去し、
残留物を50％酢酸５mlにとかしたのち、セフアデ
ツクスＧ−25のカラム（2.3×118cm）に付し、50
％酢酸で溶出する。170mlから270mlまでの画分を
集めて凍結乾燥する。収量105mg，〔α〕２４ Ｄ＋2.6゜
（ｃ＝0.55、酢酸中）、Rf30.64（アビセル）、アミ
ノ酸分析値：Arg2.46(2)；Trp1.02(1)；Asp3.31
(3)；Thr0.90(1)；Ser0.79(1)；Glu2.16(2)；Ala0.91
(1)；Val1.00(1)；Met1.02(1)；Leu0.9(1)；Phe0.81
(1)；ペプチド含量74％。
実施例 ２
Hpp−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−
Thr−OHの製造
ｐ−ヒドロキシフエニルプロピオン酸（Hpp）
15mgをDMF1mlにとかし、氷冷し、これに
HONB20mg，DCC23mgを加えて15時間かきまぜ
る。
一方、Ｈ Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln
−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr−OH 110mgをDMF5ml、水１mlの混液に
とかし、これに先に調製したHpp−ONBのDMF
溶液を加えて、15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で
留去したのち、残留物を50％酢酸５mlにとかした
のち、セフアデツクスＧ−25のカラム（2.3×118
cm）に付す。50％酢酸で溶出し、180mlから285ml
までの画分を集めて、凍結乾燥する。収量100
ｍ，〔α〕２４ Ｄ＋3.0゜（ｃ＝0.50、酢酸中）、Rf30.
65
（アビセル）、アミノ酸分析値：Arg2.20(2)；
Trp0.95(1)；Asp3.25(3)；Thr1.00(1)；Ser0.82
(1)；Glu2.26(2)；Ala1.02(1)；Val1.00(1)；Met1.02
(1)；Leu0.99(1)；Phe；1.05(1)、ペプチド含量76.0
％
実施例 ３
Ｈ−Tyr−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr−OHの製造
Boc−ThyOH30mgをDMF1mlにとかし、氷冷
し、これにHONB20mg．DCC23mgを加えて、15
時間かき混ぜる。一方Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg
−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu
−Met−Asn−Thr−OH110mgを、DMF5ml、水
１mlの混液にとかし、これに先に調製したBoc−
Tyr−ONBのDMF溶液円加えて15時間かき混ぜ
る。溶液を減圧で留去したのち、残留物にトリフ
ルオロ酢酸２mlを加えて、室温で10分間ふり混ぜ
たのち、減圧で留去する。残留物を、５％酢酸５
mlにとかし、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通す。溶出液を濃縮
したのち、セフアデツクスＧ−25のカラム（2.3
−118cm）に付し、50％酢酸で溶出する。185mlか
ら280mlまでの画分を集めて、凍結乾燥する。収
量93mg，〔α〕２６ Ｄ−35.0゜（ｃ＝0.3，50％酢酸
中），Rf30.61（アビセル）、アミノ酸分析値：
Arg2.33(2)；Trp0.93(1)；Asp3.34(3)；Thr0.95
(1)；Ser0.83(1)；Glu2.17(2)；Ala1.00(1)；Val1.05
(1)；Met1.00(1)；Leu0.93(1)；Tyr0.97(1)；
Phe1.03(1)；ペプチド含量75％
実施例 ４
(1) Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OHの
製造
Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−AlaOBut3.0
ｇをTFA20mlにとかし、室温で40分間振り混ぜ
たのち減圧で留去する。残留物にエーテル50mlを
加えて粉末としてろ取し、乾燥する。これをシリ
カゲルカラムクロマトグラフイー（シリカゲル40
ｇ、展開溶媒クロロホルム：メタノール：酢酸＝
９：１：0.5）にて精製し、得られた油状物にエ
ーテルを加えて粉末としてろ取する。収量2.1ｇ
（73.0％）mp112−115℃〔α〕２１ Ｄ−2.5゜（ｃ＝1.1
％，DMF中），C37H49O12N9S2・H2Oとしての元
素分析計算値：C49.71；H5.75；N14.10；
S7.17、実験値：C49.87；H5.87；N13.96；S6.76
(2) Ｈ−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OHの製造
Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl800mg
にアニソール0.2mlを加え、窒素気流中、TFA10
mlを加えて、室温で10分間振り混ぜたのち、
TFAを減圧で留去し、残留物にエーテルを加え
て粉末として、ろ取する。これをNMP5mlにとか
し、TEAを加えて中和したのち、エーテルを加
えて粉末とし、ろ取する。これをDMF10mlにと
かし、Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−
OH440mgを加えて、水−食塩で冷却する。これ
にHONB180mg，DCC160mgを加えて、24時間か
き混ぜたのち、溶媒を減圧で留去し、残留物に酢
酸エチル50mlを加えて、粉末としてろ取する。こ
れを含水アセトニトリルで洗浄する。収量680
mg。このうち、500mgをとり、アニソール0.2ml、
メタンスルホン酸５mlを加えて室温で１時間振り
混ぜた後、エーテル100mlを加えて沈澱させる。
エーテルを傾斜法にて除いたのち、残留物を水10
mlにとかし、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通したのち、0.5N
アンモニア処理を０゜，30分間行ない、凍結乾燥
する。これを水50mlにとかし、CMCのカラム
（2.4×15cm）に付す。水（500ml）から、0.2M酢
酸アンモニア水（500ml）までの線型勾配法で溶
出し、215mlから305mlまでの画分を集めて凍結乾
燥する。収量50mg，〔α〕２１ Ｄ−48.2゜（ｃ＝0.5％
，
0.1N塩酸中），Rf30.53（アビセル）
(3) Ｈ−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製
造
Ｈ−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−OH30mgを５
％チオグリコール酸−50％酢酸水３mlにとかし、
45℃で24時間還元する。その後反応液を、セフア
デツクスＧ−25のカラム（2.4×122cm）に付し、
30％酢酸水で溶出し、180mlから250mlまでの溶出
液を集めて凍結乾燥する。収量29mg。〔α〕２１ Ｄ−
41.9゜（ｃ＝0.4％，0.1N塩酸中）。Rf30.55（アビ
セル），アミノ酸分析：Trp0.69(1)；Arg2.25(2)；
Asp2.13(2)；Thr0・97(1)；Glu2.16(2)；Ala1.00
(1)；Val1.01(1)；Met0.97(1)；Leu1.01(1)；Phe1.05
(1)；ペプチド含量78％
(4) Hpa−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OH
の製造
Ｈ−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−The−OH20mgを
DMF2ml、水0.5mlの混液にとかし、これに、Hpa
−ONB7mgを加えて、15時間かき混ぜる。反応液
をセフアデツクスＧ−25のカラム（2.3×118cm）
に付し、50％酢酸で溶出する。170mlから210mlま
での画分を集め凍結乾燥する。収量18mg。
Rf30.61（アビセル）。アミノ酸分析：Trp0.75
(1)；Arg2.16(2)；Asp2.23(2)；Thr1.02(1)；
Glu2.00(2)；Ala1.02(1)；Val1.00(1)；Met0.98(1)；
Leu1.1(1)；Phe1.03(1)；ペプチド含量76％
実施例 ５
(1) Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OHの製造
Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OBut1.3ｇをTFA10ml
にとかし室温で40分間振り混ぜたのち、減圧で留
去する。残留物にエーテル50mlを加えて粉末とし
て、ろ取する。これをシリカゲルカラムクロマト
グラフイー（シリカゲル20ｇ、展開溶媒、クロロ
ホルム：メタノール：酢酸＝９：１：0.5）で精
製し、得られた油状物に、エーテルを加えて粉末
としてろ取する。収量0.90ｇ（76.2％）mp68−
70℃〔α〕２１ Ｄ＋3.4゜（ｃ＝0.8％，DMF中），
C24H31O8N5Sとしての元素分析計算値；C52.45；
H5.69；N12.74；S5.83，実験値：C52.05；
H5.94；N12.53；S5.61。
(2) Ｈ Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln
−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OHの製
造
Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl450mg
を、実施例４と同様に、TFA処理したのち、
DMF10mlにとかす。これにZArg（MBS）−Ala−
OH160mgを加え、氷−食塩で冷却したのち
HONB104mg，DCC90mgを加えて24時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧で留去したのち、酢酸エチルを加
えて、粉末としてろ取し、含水アセトニトリルで
洗浄する。収量460mg。このうち、350mgをとりア
ニソール0.20ml、メタンスルホン酸を加えて室温
で１時間振り混ぜる。これにエーテル100mlを加
えて油状物を沈澱させたのち、エーテル層を傾斜
法にて除去する。残留物を水20mlにとかし
Amberlite IRA−410（酢酸型）のカラム（１×
10cm）でイオン交換したのち、0.5Nアンモニア
水で０゜，30分間処理し、凍結乾燥する。これに
30％酢酸４mlを加えたのち、セフアデツクスLH
−20のカラム（3.4×57cm）に付し、30％酢酸で
溶出する。200mlから250mlまでの画分を取り、凍
結乾燥する。収量40mg，〔α〕２１ Ｄ−42.1゜（ｃ＝0.
4
％，0.1N塩酸中），Rf30.59（アビセル）。
(3) Ｈ−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln
−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製造
Ｈ−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OH25mgを５
％チオグリコール酸−50％酢酸水2.5mlにとか
し、45゜で24時間還元したのち反応液をセフアデ
ツクスLH−20のカラム（3.4×57cm）に付す。30
％酢酸水で溶出し、200mlから240mlまでの画分を
集めて、凍結乾燥する。収量20mg。Rf30.62（ア
ビセル）、アミノ酸分析：Trp0.74(1)；Arg1.13
(1)；Asp2.03(2)；Thr0.95(1)；Glu2.03(2)；
Ala1.00(1)；Val0.98(1)；Met0.93(1)；Leu0.99(1)；
Phe0.98(1)，ペプチド含量79％
(4) Hpa−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製造
Ｈ−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OH 15mgのDMF2
ml、水0.5mlの混液にとかし、これにHpa−ONB7
mgを加えて15時間かき混ぜる。反応液をセフアデ
ツクスＧ−25のカラム（2.3×118cm）に付し、50
％酢酸で溶出する。175mlから205mlまでの画分を
集めて凍結乾燥する。収量13mg。Rf30.68（アビ
セル）、アミノ酸分析：Trp0.72(1)；Arg1.13(1)；
Asp2.15(2)；Thr1.00(1)；Glu2.15(2)；Ala1.02
(1)；Val1.00(1)；Met0.95(1)；Leu0.98(1)；Phe0.98
(1)；ペプチド含量76％
実施例 ６
(1) Ｈ−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp
−Leu−Met（Ｏ）−Asn−ThrOHの製造
Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl800mg
を実施例４と同様に、TFA処理したのち、
DMF10mlにとかし、これにＺ−Ala−ONB
（ZAla−OH120mg，HONB100mg，DCC110mgより
調製）を加えて、24時間かき混ぜる。溶媒を減圧
で留去したのち、酢酸エチルを加えて、粉末とし
てろ取する。収量760mg。このうちの500mgをと
り、アニソール0.5ml、メタンスルホン酸５mlを
加えて室温で１時間振り混ぜる。これにエーテル
100mlを加えて油状物を沈澱させたのち、エーテ
ル層を傾斜法にて除去する。残留物を50％酢酸水
30mlにとかし、Amberlite IRA 410（酢酸型）の
カラム（１×10cm）でイオン交換し、凍結乾燥す
る。これを水10mlに懸濁し、0.5Nアンモニア水
で０゜，30分間処理し、凍結乾燥する。これを50
％酢酸５mlにとかし、セフアデツクスLH−20の
カラム（3.4×57cm）に付し、50％酢酸で溶出す
る。215mlから265mlまでの画分を集めて凍結乾燥
する。収量55mg，Rf30.68（アビセル）
(2) Ｈ−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp
−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製造
Ｈ−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−
Leu−Met（０）−Asn−Thr−OH30mgの５％チ
オグリコール酸−50％酢酸水3.0mlにとかし、45
゜で24時間還元したのち反応液をセフアデツクス
LH−20のカラム（3.4×57cm）に付し、50％酢酸
で溶出する。235mlから280mlまでの画分を集め
て、凍結乾燥する。収量23mg。Rf30.72（アビセ
ル）。アミノ酸分析：Trp0.76(1)；Asp2.15(2)；
Thr0.93(1)；Glu2.15(2)；Ala0.97(1)；Val1.00(1)；
Met0.92(1)；Leu1.02(1)；Phe1.02(1)。ペプチド含
量82％
(3) Hpa−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製造
Ｈ−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−
Leu−Met−Asn−Thr−OH20mgをDMF2ml，水
0.5mlの混液にとかし、TEA0.1mlを加え、これに
HPa−ONB9mgを加えて、15時間かき混ぜる。反
応液を、セフアデツクスＧ−25のカラム（2.3×
118cm）に付し、50％酢酸で溶出する。160mlから
185mlまでの画分を集めて凍結乾燥する。収量18
mg。Rf30.79（アビセル）、アミノ酸分析：
Trp0.73(1)；Asp2.05(2)；Thr0.94(1)；Glu2.13
(2)；Ala1.00(1)；Val0.97(1)；Met0.9(1)；Leu0.99
(1)；Phe1.00(1)；ペプチド含量81％
前記実施例１と同様にして、R1＝R2＝Ｈ，R3
＝CH2，R4＝Asp−Ser−Arg−Arg−Alaおよび
R5＝Nleのペプチドを製造しうる。
実施例 ７
ペプチド′（R′1，R′2の一方又は両方が131
，R3はCH2，R4はAsp−Ser−Arg−Arg−
Ala，R5はMetを示す）の製造
1.2mCiのNa131に、0.25Mリン酸緩衝液（PH
7.5）20μを加え、1.5μｇのHpa−グルカゴン
15−29を、リン酸緩衝液５μにとかしたものを
加える。これに、クロラミンT20μｇを、リン酸
緩衝液20μにとかしたものを加え、室温で５秒
から30秒間振り混ぜたのち、直ちにメタ重亜硫酸
ナトリウム120μを、リン酸緩衝液50μにと
かしたものを加え、反応を停止する。これに、ヨ
ー化カリウム溶液（10mg／ml）0.1mlを加え、セ
フアデツクスＧ−25（１×20cm）に付す。0.05M
ペロナール緩衝液（PH8.6）で溶出し、11.5mlか
ら14mlまでを集める。
このようにして得られた画分の総放射能をガン
マシンチレーシヨンカウンターで測定したところ
310μCi（放射化学収率26％）であり、またTLC
−RIスキヤナー（Aloka Thin layer
chromatogram scanner Model TRM−18，プレ
ート；セルロース（アビセル）展開溶液；ｎ−ブ
タノール；ピリジン；酢酸；水＝30：20：６：
24）により測定したRf値は0.64であつた。
このようにして得られた本発明のペプチド″
と膵グルカゴンに特異的な抗体（Ｇ−21A，Ｇ−
42）との反応性を図１に示す。（K.Shimaand P.
P Foa，Clin，Clim，Acta，22，511（1968）。
Ｇ−21Aは、グルカゴンを用いて作製した膵グ
ルカゴンに特異的な抗体であり、Ｇ−42は、グル
カゴン15−29を用いて作製した膵グルカゴンに特
異的な抗体であるが、いるれの抗体に対しても本
発明のペプチド′は、ヨードグルカゴンと同じ
反応性を示す。以上の結果より、本発明のペプチ
ド′は、ヨードグルカゴンの代りに十分使用可
能である。
実施例 ８
ペプチド′，R′，R′2の一方又は両方が125
，R3はCH2，R4はAsp−SerArg−Arg−
Ala，R5はMetを示す）の製造
0.5mciのNa125に、0.4Mリン酸緩衝液（PH
7.3）25μを加え、2.5μｇのHpa−グルカゴン
（15−29）を、上記リン酸緩衝液10μにとかし
たものを加える。これに3.6μｇのクロラミンＴ
を、0.04Mリン酸緩衝液（PH74）10μに溶かし
た液を加えて、室温で60秒間振り混ぜた後、これ
に、48μｇのメタ重亜硫酸ナトリウムを、0.04M
リン酸緩衝液20μに溶かした液を加える。反応
液に、さらに１％ヨー化ナトリウム溶液50μ、
2M−トリス溶液５μ，トリス−塩酸緩衝液
（0.1Mトリス、0.1M塩化ナトリウム、0.05％BSA
水溶液、PH8.6）500μを加え、QAEセフアデ
ツクスA25のカラム（１×10cm）に付す。
上記トリス塩酸緩衝液で溶出し、33−54mlの画
分を集める。このようにして得られた画分の総放
射能は100μCi（放射化学収率20％）であり、
TLC−RIスキヤナー（Aloka Thin layer
chromatogram scanner Model TRM−18プレー
ト；セルロース（（アビセル）、展開溶媒；ｎ−ブ
タノール：ピリジン：酢酸：水＝30：20：６：
24）により測定したRf値は0.64であつた。またか
くして得られるペプチド′は実施例７で得られ
るペプチド′と同様に膵グルカゴン特異抗体と
反応する。In some cases, it can be produced by conventionally introducing a group represented by the formula into the remaining peptide fragment. Protection of functional groups that should not participate in the reaction of raw materials, protective groups, removal of the protective groups, activation of functional groups that participate in the reaction, etc. can also be appropriately selected from known methods or methods. Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include carbobenzoxy, t-butyloxycarbonyl,
t-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, 2-chloro-benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthalyl, formyl, o-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosph Examples include wild boar oil. Examples of protective groups for carboxyl groups include alkyl esters (eg, ester groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl, and t-butyl), benzyl ester groups, p-nitrobenzyl ester groups, p-methoxybenzyl ester groups, and p-methoxybenzyl ester groups. -chlorobenzyl ester group, benzhydryl ester group, carbobenzoxyhydrazide group, t-butyloxycarbonylhydrazide group, tritylhydrazide group, etc. As a protecting group for the guanidino group of arginine,
Examples include nitro group, tosyl group, p-methoxybenzenesulfonyl group, carbobenzoxy, isobornyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, and the like. The guanidino group may also be protected in the form of an acid (eg, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, etc.) salt. The hydroxyl group of threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
Examples of groups suitable for this esterification include lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethyloxycarbonyl groups. Further, examples of groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydropyranyl group, and t-butyl group.
However, the hydroxyl group of threonine does not necessarily need to be protected. Methionine may be protected in the form of sulfoxide. Examples of raw materials with activated carboxyl groups include corresponding acid anhydrides, azides, active esters (pentachlorophenol, p-nitrophenol, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenztriazole, N-hydroxy- Examples include esters with 5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc. The peptide bond forming reaction may be carried out in the presence of a dehydrating agent (eg, a carbodiimide reagent such as dicyclohexylcarbodiimide, carbodiimidazole, etc.). This peptide condensation reaction can be carried out in the presence of a solvent. The solvent may be appropriately selected from those known to be usable in peptide condensation reactions. Examples include anhydrous or water-containing dimethylformamide, dimethylsulfoxide, pyridine, chloroform, dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, N-methylpyrrolidone, or a suitable mixture thereof. The reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for peptide bond forming reactions, usually about -40°C to about 60°C, preferably about -20°C to about 0°C.
It is appropriately selected from the range of °C. After the completion of the condensation reaction, if the product has a protecting group, it can be removed by a conventional method. Such conventional methods include, for example, reductive methods (e.g. hydrogenation using catalysts such as palladium black, reduction with metallic sodium in liquid ammonia), acidolysis (e.g. strong acids such as trifluoroacetic acid, hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, etc.). acidolysis). The peptide produced as described above can be collected from the reaction mixture by peptide separation means, extraction, distribution, column chromatography, etc. Iodolabeling of the peptide of the present invention (R 1 =R 2 =H) thus obtained was performed using the known chloramine T method [WMHunter and FC
Greenwood, Nature, 194 , 495 (1962)]. By appropriately setting the reaction conditions for iodination , peptides ′, R′ 1 and
Compounds in which both R' 2 are radioactive iodines or mixtures of their mono- and di-iodine forms in arbitrary proportions can be prepared, and any of them can be suitably used in the desired radioimmunoassay. The iodinated peptide may be separated from inorganic iodine by gel filtration column chromatography used in Sephadex, frozen, and optionally further dried to obtain a powder. The iodinated peptide' thus obtained reacts extremely well with antibodies specific for pancreatic glucagon, and has the same reactivity as glucagon. The peptide of the present invention has various characteristics, examples of which are listed below. (1) The peptide of the present invention reacts specifically and efficiently with pancreatic glucagon antibodies generated from various antigen sources. (2) The peptide' of the present invention is useful when pancreatic glucagon in blood can be accurately measured by a known radioimmunoassay method. In the following examples, thin layer chromatography was carried out using a silica gel plate 60F 254 manufactured by Merck, or a cellulose plate or Avicel SF manufactured by Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., and the following developing solvent was used. Rf 1 : Chloroform: Methanol: Acetic acid = 9:
1:0.5 Rf 2 :chloroform:methanol;water=7:3:
0.5 Rf 3 :n-butanol:pyridine:acetic acid:water=
30:20:6:24 Example 1 (1) Production method of Boc-Asn-Thr-OBzl Dissolve 112 g of Boc-Thr-OBzl in 300 ml of TFA, shake for 20 minutes at room temperature, then add 30 ml of concentrated hydrochloric acid and dissolve the solution. Concentrate under reduced pressure. Dissolve the residue in 1 THF, cool on ice, and neutralize by adding 50 ml of TEA. To this, Boc-Asn-OH76.7g, HONB64.5g,
Add 74.3g of DCC and stir for 15 hours. precipitated
After filtering off the DCU, the solvent is distilled off under reduced pressure and the residue is dissolved in 1 part of ethyl acetate. This is sequentially washed with 10% citric acid water (300 ml x 3), saturated sodium bicarbonate water (300 ml x 3), and water (300 ml x 3), and dried over anhydrous sodium sulfate. After the solvent was distilled off under reduced pressure, ether 1 was added to the acid distillate, the powder was collected by filtration, and then recrystallized from acetonitrile. Yield 105.1g (75.2%) m.p165-166℃ [α]
23 D -13.9° (c=0.9, in DMF), Rf 1 0.51,
Elemental analysis calculation value as C 20 H 29 C 7 N 3 : C56.72;
H6.90; N9.92, Experimental value: C57.01; H6.89; N9.94 (2) Production of Boc-Met(C)-Asn-Thr-OBzl 50.0 g of Boc-Asn-Thr-OBzl and 170 ml of TFA After shaking at room temperature for 30 minutes, add 500 ml of concentrated ether to powder, filter, and dry. Dissolve this in 400ml of THF, cool on ice, add 20ml of TFA, and then add Boc-Met(O)-ONB (Boc-Met(O)・
Dissolve 31.3 g of OH and 23.3 g of HONB in 200 ml of THF, cool on ice, add 26.8 g of DCC, and stir for 4 hours to prepare. ) and stir for 15 hours. After distilling off the solvent under reduced pressure, ethyl acetate (200
ml) and ether (200 ml), filtered as a powder, and reprecipitated from acetonitrile. Yield 48.5g
(72.2%), mp145-147℃ [α] 23D -6.5゜(c
=
1.1, in DMF), Rf 1 0.19, elemental analysis calculation as C 25 H 38 O 9 N 4 S: C52.62; H6.71; N9.82;
S5.62, experimental value: C52.44; H6.73; N9.60; S5.15 (3) Production method of Boc-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl Boc-Met(O)-Asn- Thr-OBzl15.0g
After adding 45 ml of TFA and shaking at room temperature for 45 minutes,
Concentrate, add 100 ml of ether, filter to obtain a powder, and dry. Dissolve this in 50ml of DMF, cool on ice, add 5.7ml of TEA, and add Boc-Leu-ONB.
(Boc-Leu-OH6.69g, HONB5.70g, DCC6.56
(prepared from g) and stir for 15 hours. After distilling off the solvent under reduced pressure, add 200ml of ethyl acetate to the residue.
was added, filtered as a powder, and washed with acetonitrile.
Reprecipitate from ethyl acetate. Yield 15.0g (83.4
%), mp134-136℃, [α] 24 D -15.1゜(c=
1.0, in DMF), Rfl0.25, elemental analysis calculation as C 31 H 49 O 10 N 5 S: C54.45; H7.22; N10.24;
S4.69, experimental value: C54.62; H7.60; N9.89; S3.95 (4) Production of Z-Gln-Trp-OBzl H-Trp-OBzl/paratoluenesulfonate
Dissolve 50.0g in THF500ml, cool on ice, TEA15.4
ml, Z-Gln-GH28.0g, HONB19.7g,
Add 22.7g of DCC and stir for 15 hours. After filtering off the precipitated DCU, it is concentrated and the residue is dissolved in 300 ml of ethyl acetate. This was mixed with saturated sodium bicarbonate water (150ml x 2) and 10% citric acid water (150ml x 2).
2) Wash sequentially with water (150ml x 2). After distilling off the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in 300 ml of THF.
Insoluble matter is filtered off. After concentrating this, ether
Add 500ml, filter it as a powder, and recrystallize it from acetonitrile. Yield 46.1g (82.8%),
[α] 23 D +5.80 (c=1.0, in DMF), Rf 1 0.60,
Elemental analysis calculated value as C 31 H 32 O 6 N 4 : C66.89;
H5.80; N10.07, experimental value: C66.79; H5.71;
N10.20 (5) Production of Z-Val-Gln-Tro-OH Add 50.0 g of Z-Gln-Trp-OBzl to 700 g of methanol
ml and subjected to catalytic reduction (catalyst: palladium black) for 5 hours to precipitate crystals, which are collected by filtration. This is suspended in 300 ml of DMF, 13 ml of TEA is added and dissolved, and the catalyst is filtered off. Z-Val- to this
After adding ONB37.0g and stirring for 10 hours, IN
- Add 100 ml of hydrochloric acid to neutralize, then add 500 ml of water and filter as a powder. Wash this thoroughly with methanol. Yield 43.0g (84.7%), mp246−
247℃〔α〕 23 D +12.4゜(c=0.9, in DMF),
Elemental analysis calculation as Rf 1 0.14, C 29 H 35 O 7 N 5 :
C61: 58; H6.24; N12.38, experimental value: C61, 86;
H6.30; N12.36 (6) Production of Z-Phe-Val-Gln-Trp-OH Dissolve 5.1 g of Z-Val-Gln-Trp-OH in 100 ml of acetic acid, perform catalytic reduction for 3 hours, and then remove the catalyst by filtration. death,
Concentrate. Suspend this in 200ml of DMF and add
Z- prepared from TEA2ml, Z-Phe-OH2.70
Add Phe-ONB and stir for 7 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, and aqueous acetic acid was added to the residue to form a gel, which was collected by filtration. This is reprecipitated from methanol.
Yield 5.50g (84.5%), mp 240℃ [α] 24 D +4.1゜ (c = 1.0, in DMF), Rf 1 0.15, C 38 H 44 O 8 N 6・1/2
Elemental analysis calculation as H 2 O: C63.23; H6.28;
N11.64, experimental value: C63.11; H6.29; N11.80 (7) Boc−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln−Trp−
Production of OH Z-Phe-Val-Gln-Trp-OH8.5g,
Dissolve in a mixture of 150 ml of DMF and 50 ml of acetic acid and perform catalytic reduction for 5 hours. After filtering off the catalyst, concentrate, add 100 ml of methanol to the residue, and collect by filtration as crystals. Suspend this in 200ml of DMF, add 3.0ml of TEA,
Boc−Asp(OBzl)−ONB(Boc−Asp(OBzl)−
(prepared from 3.9 g of OH, 2.4 g of HONB, and 2.7 g of DCC) and stir for 10 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, aqueous acetic acid was added to the residue, the gel was collected by filtration, and reprecipitated from DMF and water. Yield 6.3g
(58.1%), mp191-192℃ (decomposition), [α] 24 D −
6.2
゜(c=1.1, in DMF), Rf 1 0.11C 46 H 57 O 11 N 7・3/
Elemental analysis calculation value as 2H 2 O: C60.64;
H6.63; N10.76, experimental value: C60.30; H6.48;
N11.34 (8) Boc−Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln−
Production of Trp-OH Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-
Add 50 ml of TFA to 6.0 g of OH in a nitrogen stream, shake for 10 minutes, concentrate, add ether, and filter to obtain a powder. Dissolve this in 100ml of DMF,
Add 2.0ml of TEA and add Boc-Gln-ONB (Boc-Gln
- prepared from 1.76 g of CH, 1.34 g of HONB, and 1.54 g of DCC) and stirred for 15 hours. Aqueous acetic acid is added to this, the powder is collected by filtration, and then reprecipitated from acetonitrile and water. Yield 5.50g (82.6
%), mp210-212℃ (decomposed), [α] 24 D -10.1゜ (c=1.1, in DMF), Rf 1 0.09, elemental analysis calculated value as C 51 H 65 O 13 N 9 : C60.52 ;H6.47;N12.46,
Experimental value: C60.19; H6.37; N12..23 (9) Production of Z-Arg(MBS)-Ala-OBut 31.0 g of Z-Ala-OBut was dissolved in 300 ml of methanol, and after catalytic reduction for 5 hours, Filter off the catalyst and concentrate. On the other hand, Z−Arg(MBS)−OH・
Suspend 53.0g of DCHA in 500ml of ethyl acetate, 10%
Add 200ml of citric acid, shake well, wash with water, and dry with anhydrous sodium sulfate. this
Dissolve in 500 ml of THF and add the previously prepared H-
Add Ala-OBut, add 14.9g of HONB, cool on ice,
Add 17.1g of DCC and stir for 10 hours. precipitated
After removing DCU by filtration and concentrating, it was dissolved in 500 ml of ethyl acetate, followed by 10% citric acid water (200 ml x 3), saturated sodium bicarbonate water (200 ml x 3), and water (200 ml x 3).
3) and dry with anhydrous sodium sulfate.
After distilling off the solvent under reduced pressure, ether was added to the residue.
Add 300ml to make a powder and filter it. Yield 44.5
g (66.8%), mp125-127℃, [α] 25 D -6.00 (
c.
= 1.0, in DMF), Rf 1 0.62, elemental analysis calculation as C 28 H 39 O 8 N 5 S: C55.52; H6.49; N11.56;
S5.27, experimental value: C55.71; H6.49; N11.81; S5.29 (10) Z−Arg(MBS)−Arg(MBS)−Ala−OBut
Production of Z-Arg(MBS)-Ala-OBut 43g was dissolved in 500ml of methanol, reduced for 5 hours, and then concentrated. Dissolve the residue in 200ml of DMF and add Z-Arg
(MBS)-OH(Z-Arg(MBS)-OH・
Add 140 g of HONB (prepared from 49.7 g of DCHA) and 140 g of HONB, cool, add 16.1 g of DCC, and stir for 15 hours. After filtering off the precipitated DCU, concentrate and dissolve the residue in 500 ml of chloroform. This is washed with 10% citric acid water (300 ml x 3), saturated sodium bicarbonate water (300 ml x 3) and water (300 ml x 3) in this order, and dried over magnesium sulfate. After distilling off the solvent under reduced pressure, 300 ml of methanol is added and the crystals are collected by filtration and recrystallized from methanol. Yield 52.4g
(79.2%), mp116-118℃, [α] 25D - 8.8゜(
c=
1.0, in DMF), Rf 1 0.42, C 41 H 57 O 12 N 9 S 2・2H 2 O
Elemental analysis calculation value as: C50.86; H6.35;
N13.02; S6.62, experimental value: C51.05; H6.08;
N13.11; S6.62 (11) Boc−Ser−Arg(MBS)−Arg(MBS)−Ala
−Manufacture of OBut Z−Arg(MBS)−Arg(MBS)−Ala−
Dissolve 30.0 g of OBut in a mixture of 80 ml of DMF and 300 ml of methanol, and perform catalytic reduction for 7 hours. Filter off the catalyst;
After methanol was distilled off under reduced pressure, Boc-
Add 7.3 g of Ser-OH and 6.3 g of HONB, cool on ice,
Add 7.3g of DCC and stir for 10 hours. precipitated
The DCU is filtered off, the solvent is distilled off under reduced pressure and the residue is dissolved in 500 ml of chloroform. This is washed with saturated sodium bicarbonate (300 ml x 2) and water (300 ml x 2), and dried over magnesium sulfate. After distilling off the solvent under reduced pressure, dissolve in 30 ml of chloroform and apply to a silica gel column (400 g). Develop with a solvent of chloroform:methanol:acetic acid (9:0.7:0.35), collect and concentrate fractions 2 from 800 ml, and add ether to make a powder. Yield 25.5g
(79.0%), mp85-88℃, [α] 26D - 20.9゜(c
=
1.0 in methanol), Rf 1 0.33,
Elemental analysis calculation values as C 41 H 64 O 14 N 10 S 2・H 2 O:
C49.09; H6.63; N13.96; S6.39, experimental value:
C48.96; H6.55; N13.70; S5.84 (12) Boc−Asp(OBzl)−Ser−Arg(MBS)−
Production of Arg(MBS)-Ala-OH Boc-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-
Add 50 ml of TFA to 10.5 g of OBut, shake and mix at room temperature for 60 minutes, concentrate, add 300 ml of ether, and collect by filtration as a powder. Dissolve this in 50ml of DMF,
TEA4.1ml, Boc−Asp(OBzl)・ONB(Boc−
Asp (OBzl)・OH3.40g, HONB1.97g,
Add DCC (prepared from 2.27g) and stir for 15 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, aqueous acetic acid is added to the residue, and the powder is collected by filtration and dried. This is reprecipitated from acetonitrile ether. yield
6.0g (51.5%), mp126-130℃, [α] 24D +3.5
゜(c=1.0, in DMF), Rf 1 0.17, C 48 H 67 O 17 N 11 S 2・
Elemental analysis calculation as 2H 2 O: C49.26;
H6.12; N13.17; S5.48, experimental value: C49.62;
H5.84; N13.00; S5.03 (13) Boc−Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln
-Production of Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl Boc-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl3.25g
Add 25 ml of TFA to the solution, shake for 15 minutes at room temperature, concentrate, add 100 ml of ether to the residue, make a powder, filter, and dry. Add this to 10ml of NMP
After adding 2ml of TEA and shaking well,
Add 100 ml of ether and filter again as a powder. Dissolve this in 100ml of DMF and add Boc-
Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln−Trp−
After adding 4.80 g of OH and 2.70 g of HONB and dissolving them, cool on ice, add 1.55 g of DCC and stir for 58 hours, and the reaction solution becomes gel-like. After the solvent is distilled off under reduced pressure, the residue is thoroughly washed with aqueous acetonitrile. Yield 5.75g (76.8%), mp 234℃ (decomposition) [α] 26 D -15.8゜ (c = 0.4, in acetic acid),
Rf 2 0.63, Elemental analysis calculated value as C 77 H 104 O 20 N 14 S: C58.61; H6.64; N12.43; S2.03, experimental value:
C59.13; H6.96; N12.40; S1.70 (14) Boc−Asp(OBzl)−Ser−Arg(MBS)−
Arg(MBS)−Ala−Gln−Asp(OBzl)−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met(O)−Asn−Thr
−Production of OBzl Boc−Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln−
Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl520g
Add 1 ml of anisole to the solution, and add 1 ml of anisole to the solution.
Add 35 ml of TFA, stir at room temperature for 15 minutes, concentrate, add 100 ml of ether to the residue, and filter as a powder. Dissolve this in 20ml of NMP,
Add 2.77 ml of TEA and shake thoroughly, then add 200 ml of ether and filter as a powder. Dissolve this in 150ml of LMF, Boc−Asp(OBzl)−
Ser−Arg(MBS)−Arg(MBS)−Ala−OH3.66
Add 2.36 g of HONB, cool to -10°C with ice and salt, and add 1.02 g of DCC. After stirring the reaction solution at 0°C for 10 hours and at room temperature for 24 hours, precipitation occurred.
The DCU is filtered off and the solvent is distilled off under reduced pressure. Add 50 ml of water to the residue, filter it as a powder, and wash thoroughly with aqueous acetonitrile. Yield 5.3g
(61.1%), mp237℃ (decomposition), [α] 26 D -7.1゜(c
= 0.9, in acetic acid) Rf 2 0.63, C 120 H 161 O 34 N 25 S 3・
Elemental analysis calculation value as 2H 2 O: C54.82;
H6.32; N13.32; S3.57; Experimental value: C54.47;
H6.16; N13.07; S3.47 (15) H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-
asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met(O)
-Production of Asn-Thr-OH Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg
(MBS) −Ala−Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−
Gin−Trp−Leu−Met(O)−Asn−Thr−
Add 0.25 ml of anisole to 400 mg of OBzl, add 5 ml of methanesulfonic acid, shake and mix at room temperature for 60 minutes, and then add 100 ml of ether to precipitate an oily substance. After removing the ether by decanting, the residue was dissolved in 10 ml of water, passed through an Amberlite IRA-410 (acetic acid form) column (1 x 10 cm), and the eluate (volume
50 ml) on ice, add 10 ml of 3N ammonia water, stir at 0°C for 30 minutes, and freeze-dry. Dissolve this in 30 ml of water and use a CMC column (22 x 18
cm) and eluted with a linear gradient method from water (500 ml) to 0.2 M ammonium acetate (500 ml), and 150 ml
Fractions from up to 195 ml were collected and lyophilized. Yield 150mg. Next, this was dissolved in 20 ml of water and applied to an Amberlite XAD-2 column (1.6 x 5 cm).
Elute with a linear gradient method from water (200 ml) to 80% ethanol (200 ml), collect fractions from 180 ml to 225 ml, distill off the ethanol, and freeze-dry. Yield 115 mg, [α] 24 D -33.6° (c = 0.6; 50%
(in acetic acid water), Rf 3 0.54 (Abysses), amino acid analysis (4% thioglycolic acid 5.7N-hydrochloric acid hydrolysis);
Arg2.03 (2); Trp0.87 (1); Asp3.03
(3); Thr0.97 (1); Ser0.73 (1); Glu2.13
(2);Ala1.00(1);Val1.03(1);Met1.00
(1); Leu1.03 (1); Phe1.03 (1); (peptide content 85.7%) (16) H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
Production of -Thr-OH (glucagon (15-29)) H-Asp-Ser-Arg-Arg-Alar-Gln-Asp
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met(O)−Asn
-Thr-OH225mg in 5% thioglycolic acid water 20ml
When dissolved in water and left at 50°C for 20 hours, a gel will precipitate. After water was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in 5 ml of 50% acetic acid and applied to a Sephadex G-25 column (23 x 118 cm). Elute with 50% acetic acid water, 180
Fractions from ml to 240 ml are collected and lyophilized.
Yield 220 mg, [α] 24 D -30.0° (c = 0.3, in 50% acetic acid water), Rf 3 0.59 (Avicel), amino acid analysis (4
% thioglycolic acid, 5.7N-hydrochloric acid hydrolysis);
Arg2.15(2); Trp0.91(1); Asp3.13(3); Thr0.99
(1); Ser0.87(1); Glu2.20(2); Ala1.05(1); Val0.96
(1); Met1.00(1); Leu1.07(1); Phe1.07(1); Peptide content 79.3% (17) Production of Hpa-ONB 1.52 g of p-hydroxyphenylacetic acid (Hpa)
Dissolve in 20ml of THF, cool on ice, add 1.97g of HONB,
Add 2.27g of DCC and stir for 4 hours, then return to room temperature and stir for an additional 15 hours. precipitated
After DCU is filtered off, the solvent is distilled off under reduced pressure, petroleum benzine is added to the residue, and the crystals are collected by filtration. This is recrystallized from ethyl acetate and petroleum benzine. Yield 2.50g (79.9%) mp137-138℃,
Elemental analysis calculated value as C 17 H 15 O 5 N: C65.17;
H4.82; N4.47, experimental value: C65.32; H4.91;
N4.75. (18) Hpa−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
-Production of Thr-OH H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-
Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−
Dissolve 110 mg of OH in a mixture of 5 ml of DMF and 1 ml of water, add 30 mg of HPa-ONB to this, and stir for 15 hours. A gel will precipitate, so the solvent will be distilled off under reduced pressure.
After dissolving the residue in 5 ml of 50% acetic acid, it was applied to a Sephadex G-25 column (2.3 x 118 cm) and
Elute with % acetic acid. Fractions from 170 ml to 270 ml are collected and lyophilized. Yield 105 mg, [α] 24 D +2.6° (c = 0.55, in acetic acid), Rf 3 0.64 (Avicel), amino acid analysis values: Arg2.46(2); Trp1.02(1); Asp3.31
(3); Thr0.90(1); Ser0.79(1); Glu2.16(2); Ala0.91
(1); Val1.00(1); Met1.02(1); Leu0.9(1); Phe0.81
(1); Peptide content 74%. Example 2 Hpp-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−
Production of Thr-OH p-hydroxyphenylpropionic acid (Hpp)
Dissolve 15mg in 1ml of DMF, cool on ice, and add to this.
Add 20mg of HONB and 23mg of DCC and stir for 15 hours. On the other hand, H Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln
−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
Dissolve 110 mg of -Thr-OH in a mixture of 5 ml of DMF and 1 ml of water, and add the DMF of Hpp-ONB prepared earlier.
Add the solution and stir for 15 hours. After the solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in 5 ml of 50% acetic acid, and then transferred to a Sephadex G-25 column (2.3 x 118
cm). Elute with 50% acetic acid, 180ml to 285ml
Collect the fractions and lyophilize. Yield 100
m, [α] 24 D +3.0° (c=0.50, in acetic acid), Rf 3 0.
65
(Avicel), amino acid analysis value: Arg2.20(2);
Trp0.95(1);Asp3.25(3);Thr1.00(1);Ser0.82
(1); Glu2.26(2); Ala1.02(1); Val1.00(1); Met1.02
(1); Leu0.99(1); Phe; 1.05(1), peptide content 76.0
% Example 3 H-Tyr-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
-Production of -Thr-OH Dissolve 30 mg of Boc-ThyOH in 1 ml of DMF, cool on ice, and add 20 mg of HONB. Add 23mg of DCC, 15
Stir for an hour. On the other hand, H-Asp-Ser-Arg-Arg
−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu
-Met-Asn-Thr-OH (110 mg) was dissolved in a mixture of DMF (5 ml) and water (1 ml), and added to the previously prepared Boc-
Add DMF solution of Tyr-ONB and stir for 15 hours. After the solution was distilled off under reduced pressure, 2 ml of trifluoroacetic acid was added to the residue, shaken at room temperature for 10 minutes, and then distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in 5% acetic acid.
ml and pass through an Amberlite IRA-410 (acetic acid type) column (1 x 10 cm). After concentrating the eluate, it was applied to a Sephadex G-25 column (2.3
−118 cm) and elute with 50% acetic acid. Fractions from 185 ml to 280 ml are collected and lyophilized. Yield 93 mg, [α] 26 D -35.0° (c = 0.3, in 50% acetic acid), Rf 3 0.61 (Avicel), amino acid analysis value:
Arg2.33(2); Trp0.93(1); Asp3.34(3); Thr0.95
(1); Ser0.83(1); Glu2.17(2); Ala1.00(1); Val1.05
(1);Met1.00(1);Leu0.93(1);Tyr0.97(1);
Phe1.03(1); Peptide content 75% Example 4 (1) Production of Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OH Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-AlaOBut3.0
Dissolve g in 20 ml of TFA, shake for 40 minutes at room temperature, and then evaporate under reduced pressure. Add 50 ml of ether to the residue, filter it as a powder, and dry. This was subjected to silica gel column chromatography (silica gel 40
g, developing solvent chloroform: methanol: acetic acid =
9:1:0.5), ether is added to the obtained oil, and the powder is collected by filtration. Yield 2.1g
(73.0%) mp112−115℃〔α〕 21 D −2.5゜(c=1.1
%, in DMF), elemental analysis calculation as C37H49O12N9S2・H2O : C49.71 ; H5.75 ; N14.10;
S7.17, experimental value: C49.87; H5.87; N13.96; S6.76 (2) H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val
−Gln−Trp−Leu−Met(O)−Asn−Thr−
Production of OH Boc−Gln−Asp(OBzl)−Phe−Val−Gln−
Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl800mg
Add 0.2 ml of anisole to the solution and add TFA10 in a nitrogen stream.
ml and shake for 10 minutes at room temperature.
TFA is distilled off under reduced pressure, and ether is added to the residue to form a powder, which is collected by filtration. Dissolve this in 5 ml of NMP, add TEA to neutralize it, add ether to make a powder, and filter it. Dissolve this in 10ml of DMF, Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-
Add 440 mg of OH and cool with water-salt. Add 180 mg of HONB and 160 mg of DCC to this, stir for 24 hours, then distill off the solvent under reduced pressure, add 50 ml of ethyl acetate to the residue, and filter it as a powder. This is washed with aqueous acetonitrile. Yield 680
mg. Of this, take 500mg, anisole 0.2ml,
Add 5 ml of methanesulfonic acid and shake for 1 hour at room temperature, then add 100 ml of ether to precipitate.
After removing the ether using the decanting method, the residue was diluted with 10% water.
After passing through a column (1 x 10 cm) of Amberlite IRA-410 (acetic acid type), 0.5N
Perform ammonia treatment at 0° for 30 minutes and freeze-dry. Dissolve this in 50 ml of water and apply to a CMC column (2.4 x 15 cm). Elute with a linear gradient method from water (500 ml) to 0.2 M aqueous ammonium acetate (500 ml), collect fractions from 215 ml to 305 ml, and lyophilize. Yield 50 mg, [α] 21 D -48.2° (c = 0.5%
，
(in 0.1N hydrochloric acid), Rf 3 0.53 (Avicel) (3) H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val
-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH production H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-
Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-OH 30mg 5
% thioglycolic acid - Dissolve in 3 ml of 50% acetic acid,
Reduce at 45°C for 24 hours. Thereafter, the reaction solution was applied to a Sephadex G-25 column (2.4 x 122 cm),
Elute with 30% acetic acid water, collect the eluate from 180 ml to 250 ml, and freeze-dry. Yield 29mg. [α] 21 D −
41.9° (c=0.4%, in 0.1N hydrochloric acid). Rf 3 0.55 (Avicel), amino acid analysis: Trp0.69(1); Arg2.25(2);
Asp2.13(2); Thr0・97(1); Glu2.16(2); Ala1.00
(1); Val1.01(1); Met0.97(1); Leu1.01(1); Phe1.05
(1); Peptide content 78% (4) Hpa−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OH
Production of H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−The−OH20mg
Dissolve in a mixture of 2 ml of DMF and 0.5 ml of water, add Hpa
- Add 7 mg of ONB and stir for 15 hours. Transfer the reaction solution to a Sephadex G-25 column (2.3 x 118 cm)
and eluted with 50% acetic acid. Fractions from 170 ml to 210 ml are collected and lyophilized. Yield 18mg.
Rf 3 0.61 (Avicel). Amino acid analysis: Trp0.75
(1);Arg2.16(2);Asp2.23(2);Thr1.02(1);
Glu2.00(2);Ala1.02(1);Val1.00(1);Met0.98(1);
Leu1.1(1); Phe1.03(1); Peptide content 76% Example 5 (1) Production of Z-Arg(MBS)-Ala-OH 1.3g of Z-Arg(MBS)-Ala-OBut in 10ml of TFA
Dissolve and shake at room temperature for 40 minutes, then evaporate under reduced pressure. Add 50 ml of ether to the residue to make a powder, and filter it. This is purified by silica gel column chromatography (20 g of silica gel, developing solvent, chloroform:methanol:acetic acid = 9:1:0.5), and ether is added to the resulting oil, which is filtered as a powder. Yield 0.90g (76.2%) mp68−
70℃〔α〕 21 D +3.4゜(c=0.8%, in DMF),
Elemental analysis calculation value as C 24 H 31 O 8 N 5 S; C52.45;
H5.69; N12.74; S5.83, experimental value: C52.05;
H5.94; N12.53; S5.61. (2) H Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln
-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OH production Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl450mg
was treated with TFA in the same manner as in Example 4, and then
Dissolve in 10ml of DMF. ZArg (MBS) −Ala−
After adding 160 mg of OH and cooling with ice and salt,
Add 104mg of HONB and 90mg of DCC and stir for 24 hours. After the solvent was distilled off under reduced pressure, ethyl acetate was added and the powder was collected by filtration and washed with aqueous acetonitrile. Yield 460mg. Take 350 mg of this, add 0.20 ml of anisole and methanesulfonic acid, and shake and mix at room temperature for 1 hour. After adding 100 ml of ether to precipitate an oily substance, the ether layer is removed by a decanting method. Dissolve the residue in 20ml of water.
Amberlite IRA-410 (acetic acid form) column (1x
After ion exchange with 10cm), treat with 0.5N ammonia water at 0° for 30 minutes, and freeze-dry. to this
After adding 4 ml of 30% acetic acid,
-20 column (3.4 x 57 cm) and elute with 30% acetic acid. Take fractions from 200 ml to 250 ml and lyophilize. Yield 40 mg, [α] 21 D -42.1° (c=0.
Four
% in 0.1N hydrochloric acid), Rf 3 0.59 (Avicel). (3) H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln
-Production of Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-
Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OH25mg 5
Dissolve in 2.5 ml of % thioglycolic acid-50% acetic acid water, reduce at 45° for 24 hours, and apply the reaction solution to a Sephadex LH-20 column (3.4 x 57 cm). 30
Elute with % acetic acid water, collect fractions from 200 ml to 240 ml, and lyophilize. Yield 20mg. Rf 3 0.62 (Avicel), amino acid analysis: Trp0.74(1); Arg1.13
(1);Asp2.03(2);Thr0.95(1);Glu2.03(2);
Ala1.00(1); Val0.98(1); Met0.93(1); Leu0.99(1);
Phe0.98(1), peptide content 79% (4) Hpa−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Production of Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-
Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OH 15mg DMF2
ml and 0.5ml of water, and add Hpa-ONB7 to this.
Add mg and stir for 15 hours. The reaction solution was applied to a Sephadex G-25 column (2.3 x 118 cm), and 50
Elute with % acetic acid. Fractions from 175 ml to 205 ml are collected and lyophilized. Yield 13mg. Rf 3 0.68 (Avicel), amino acid analysis: Trp0.72(1); Arg1.13(1);
Asp2.15(2); Thr1.00(1); Glu2.15(2); Ala1.02
(1); Val1.00(1); Met0.95(1); Leu0.98(1); Phe0.98
(1); Peptide content 76% Example 6 (1) H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp
-Leu-Met(O)-Asn-ThrOH production Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl800mg
After being treated with TFA in the same manner as in Example 4,
Mix with 10ml of DMF and add Z-Ala-ONB to this.
(prepared from ZAla-OH 120 mg, HONB 100 mg, DCC 110 mg) and stir for 24 hours. After the solvent is distilled off under reduced pressure, ethyl acetate is added and the powder is collected by filtration. Yield 760mg. Take 500 mg of this, add 0.5 ml of anisole and 5 ml of methanesulfonic acid, and shake and mix at room temperature for 1 hour. ether to this
After adding 100 ml to precipitate the oil, the ether layer is removed by decanting. Dilute the residue with 50% acetic acid water
Dissolve to 30 ml, perform ion exchange using an Amberlite IRA 410 (acetic acid type) column (1 x 10 cm), and freeze-dry. This is suspended in 10 ml of water, treated with 0.5N ammonia water at 0° for 30 minutes, and freeze-dried. 50 of this
Dissolve in 5 ml of 50% acetic acid, apply to Sephadex LH-20 column (3.4 x 57 cm), and elute with 50% acetic acid. Fractions from 215 ml to 265 ml are collected and lyophilized. Yield 55 mg, Rf 3 0.68 (Avicel) (2) H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp
-Leu-Met-Asn-Thr-OH production H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-
Dissolve 30 mg of Leu-Met(0)-Asn-Thr-OH in 3.0 ml of 5% thioglycolic acid-50% acetic acid,
After 24 hours of reduction at
Apply to LH-20 column (3.4 x 57 cm) and elute with 50% acetic acid. Fractions from 235 ml to 280 ml are collected and lyophilized. Yield 23mg. Rf 3 0.72 (Avicel). Amino acid analysis: Trp0.76(1); Asp2.15(2);
Thr0.93(1); Glu2.15(2); Ala0.97(1); Val1.00(1);
Met0.92(1); Leu1.02(1); Phe1.02(1). Peptide content 82% (3) Hpa−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−
Production of Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-
Leu−Met−Asn−Thr−OH20mg in DMF2ml, water
Dissolve 0.5ml of the mixture, add 0.1ml of TEA, and add to this.
Add 9 mg of HPa-ONB and stir for 15 hours. The reaction solution was transferred to a Sephadex G-25 column (2.3×
118cm) and elute with 50% acetic acid. From 160ml
Fractions up to 185 ml are collected and lyophilized. Yield 18
mg. Rf 3 0.79 (Avicel), amino acid analysis:
Trp0.73(1); Asp2.05(2); Thr0.94(1); Glu2.13
(2);Ala1.00(1);Val0.97(1);Met0.9(1);Leu0.99
(1); Phe1.00(1); Peptide content 81% In the same manner as in Example 1, R 1 = R 2 = H, R 3
= CH 2 , R 4 = Asp-Ser-Arg-Arg-Ala and
Peptides with R 5 =Nle can be produced. Example 7 Peptide′ (one or both of R′ 1 and R′ 2 is 131
, R 3 is CH 2 , R 4 is Asp−Ser−Arg−Arg−
Production of 1.2 mCi of Na 131 in 0.25 M phosphate buffer (PH
7.5) Add 20μ and 1.5μg Hpa-glucagon
Add 15-29 dissolved in 5μ of phosphate buffer. Add 20μg of chloramine T dissolved in 20μ of phosphate buffer, shake for 5 to 30 seconds at room temperature, and immediately add 120μ of sodium metabisulfite dissolved in 50μ of phosphate buffer. , stop the reaction. To this was added 0.1 ml of potassium iodide solution (10 mg/ml), and the mixture was applied to Sephadex G-25 (1 x 20 cm). 0.05M
Elute with Peronal buffer (PH8.6) and collect 11.5 ml to 14 ml. The total radioactivity of the fraction thus obtained was measured using a gamma scintillation counter.
310 μCi (26% radiochemical yield) and also TLC
−RI Scanner (Aloka Thin layer)
chromatogram scanner Model TRM-18, plate; cellulose (avicel) developing solution; n-butanol; pyridine; acetic acid; water = 30:20:6:
The Rf value measured by 24) was 0.64. The peptide of the present invention thus obtained
and pancreatic glucagon-specific antibodies (G-21A, G-
Figure 1 shows the reactivity with 42). (K. Shimaand P.
P Foa, Clin, Clim, Acta, 22 , 511 (1968). G-21A is a pancreatic glucagon-specific antibody prepared using glucagon, and G-42 is a pancreatic glucagon-specific antibody prepared using glucagon 15-29. The peptide' of the present invention also shows the same reactivity as iodoglucagon. From the above results, the peptide' of the present invention can be fully used in place of iodoglucagon. Example 8 One or both of peptide ′, R′, R′ 2 is 125
, R 3 is CH 2 , R 4 is Asp−SerArg−Arg−
Production of 0.5 mci Na 125 and 0.4 M phosphate buffer (PH
7.3) Add 25μg of Hpa-glucagon (15-29) dissolved in 10μ of the above phosphate buffer. This includes 3.6 μg of chloramine T.
was dissolved in 10μ of 0.04M phosphate buffer (PH74), shaken for 60 seconds at room temperature, and 48μg of sodium metabisulfite was added to 0.04M.
Add a solution dissolved in 20μ of phosphate buffer. Add 50μ of 1% sodium iodide solution to the reaction solution.
2M Tris solution 5μ, Tris-HCl buffer (0.1M Tris, 0.1M sodium chloride, 0.05% BSA
Add 500μ of aqueous solution, pH 8.6) and apply to QAE Sephadex A25 column (1 x 10cm). Elute with the above Tris-HCl buffer and collect 33-54 ml fractions. The total radioactivity of the fraction thus obtained was 100 μCi (20% radiochemical yield);
TLC-RI Scanner (Aloka Thin layer)
chromatogram scanner Model TRM-18 plate; Cellulose ((Avicel), developing solvent; n-butanol: pyridine: acetic acid: water = 30:20:6:
The Rf value measured by 24) was 0.64. Furthermore, the peptide' thus obtained reacts with the pancreatic glucagon-specific antibody similarly to the peptide' obtained in Example 7.
図面は、本発明のペプチド′と、膵グルカゴ
ンに特異的な抗体との反応性を示す。
The figure shows the reactivity of the peptide' of the invention with antibodies specific for pancreatic glucagon.
Claims (1)
ー素、R3はNH2を有しまたは有しない炭素数４ま
でのアルカン残基、R4は膵グルカゴンの19位ま
での１−５個の部分ペプチド鎖、R5はMetをそれ
ぞれ示す。） ２ 式 （R′およびR′2の一方が放射性ヨー素で他方が
Ｈであるか、または両方が放射性ヨー素、R3は
NH2を有しまたは有しない炭素数４までのアルカ
ン残基、R4は膵グルカゴンの19位までの１−５
個の部分ペプチド鎖、R5はMetをそれぞれ示
す。）のペプチドを含有する膵グルカゴン測定ラ
ジオイムノアツセイ用診断剤。[Claims] Peptide of primary formula (R 1 and R 2 are H or radioactive iodine, respectively, R 3 is an alkane residue with up to 4 carbon atoms with or without NH 2 , and R 4 is a residue of 1 to 5 carbon atoms up to position 19 of pancreatic glucagon. Partial peptide chain, R 5 represents Met.) 2 Formula (One of R′ and R′ 2 is radioactive iodine and the other is H, or both are radioactive iodine and R 3 is
Alkane residue with or without NH 2 up to 4 carbon atoms, R 4 is 1-5 up to position 19 of pancreatic glucagon
R 5 represents Met. ) diagnostic agent for radioimmunoassay for measuring pancreatic glucagon.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11424277A JPS5446776A (en) | 1977-09-21 | 1977-09-21 | Novel peptide |
| US05/924,553 US4206199A (en) | 1977-07-22 | 1978-07-14 | Novel glucagon fragment and its derivatives |
| DE2858718A DE2858718C2 (en) | 1977-07-22 | 1978-07-21 | |
| DE19782832090 DE2832090A1 (en) | 1977-07-22 | 1978-07-21 | GLUCAGON FRAGMENT AND ITS DERIVATIVES |
| GB7830677A GB2002387B (en) | 1977-07-22 | 1978-07-21 | Glucagon fragment and derivatives thereof |
| FR7821686A FR2398051A1 (en) | 1977-07-22 | 1978-07-21 | NEW FRAGMENT OF GLUCAGON AND ITS DERIVATIVES |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11424277A JPS5446776A (en) | 1977-09-21 | 1977-09-21 | Novel peptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5446776A JPS5446776A (en) | 1979-04-12 |
| JPS6121240B2 true JPS6121240B2 (en) | 1986-05-26 |
Family
ID=14632826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11424277A Granted JPS5446776A (en) | 1977-07-22 | 1977-09-21 | Novel peptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5446776A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02208707A (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-20 | Rinnai Corp | Temperature controller of hot-water supply device |
| JPH07305890A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Method and apparatus for controlling temperature of hot supply water |
| JPH07305891A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Method and apparatus for controlling temperature of hot supply water |
| JPH07305892A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Temperature controller for hot supply water |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5735551A (en) * | 1980-08-08 | 1982-02-26 | Daiichi Rajio Isotope Kenkyusho:Kk | Preparation of undecapeptide |
-
1977
- 1977-09-21 JP JP11424277A patent/JPS5446776A/en active Granted
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02208707A (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-20 | Rinnai Corp | Temperature controller of hot-water supply device |
| JPH07305890A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Method and apparatus for controlling temperature of hot supply water |
| JPH07305891A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Method and apparatus for controlling temperature of hot supply water |
| JPH07305892A (en) * | 1995-05-15 | 1995-11-21 | Takagi Ind Co Ltd | Temperature controller for hot supply water |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5446776A (en) | 1979-04-12 |
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