JPS61202142A - 吸光度を用いた分析方法および分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、吸光度を用いた定量分析方法及び定量分析装
置に関するものである。さらに詳細には、本発明は被検
液中における分析対象物質の濃度が高い領域においても
精度よく安定に分析することができる定量分析方法及び
そのための装置を提供するものである。特に血液、胆液
等の体液や、尿等の排泄物の中に含まれる種々の成分、
たとえばホルモン、ビタミン、酵素、その他の生体成分
。

薬物などの分析に適した簡便な定石分析方法及び装置を
提供するものである。

［従来技術］ これまでの光を用いた定量分析において、目的物質を含
んだ被検液の透過光を測定し吸光度を求めることが通常
用いられている。この場合、被検液に対する入射光の強
度をＩｏ、透過光の強度を１、濃度をＣ９光路長を文、
εを定数とすると、吸光度Ｅは次式で表わすことができ
、濃度Ｃに比例することが知られている。

Ｅ−リＯ（＋（１０／Ｔ）−εＣ用 しかしながらこの比例関係が成立するのは、被検液中の
目的物質の濃度が比較的低く、透過光の強度Ｉが入射光
の強度ＩＯに比較して小さくなり過ぎないような範囲に
限られている。この範囲以上に目的物質の濃度が高くな
った場合には、上記の比例関係が成立しないばかりか、
その′ａ痘の差による吸光度の差が非常に小さくなるた
めに精度よく定量分析を行なうことが出来ない。このた
めの方策として、被検液の希釈法が用いられているが、
この方法では操作が煩雑であるという大きな欠点があっ
た。

［発明の目的］ 本発明は、吸光度を用いた分析方法における上記の欠点
を解決することを目的とするものである。

即ち被検液中において高濃度に含まれる物質を精度よく
安定して且つ極めて簡単に分析することが可能な分析方
法及び分析装置を提供することを目的としている。

［発明の構成］ 本発明者は、かかる目的を達成すべく鋭意研究した結果
、目的物質の高濃度領域における透過光の強度の極端な
低下を防止することが非常に有効であることを見い出し
、それを極めて簡単な操作で行ない得る方策として以下
の如き本発明に到達した。

即ち本発明は、被検液に光束を照射しその透過光の特定
波長に関する吸光度を測定することによって該被検液中
の特定物質の濃度を測定する分析方法において、該被検
液中の該特定物質の濃度領域に対応して該特定波長の変
更及び／又は該被検液中での透過光路長の変更を行なう
ことを特徴とする号光度を用いた分析方法；及び被検液
に光束を照射する手段、その透過光を受け特定波長に関
する吸光度を測定する手段を有した該被検液中の特定物
質の分析装置において、該被検液中の該特定物質の濃度
に対応して該特定波長を・変更する手段及び／又は該濃
度に対応して該被検物中での透過光路長を変更する手段
を具備したことを特徴とする吸光度を用いた分析装置を
提供するものである。

以下に本発明のさらに詳細な説明を行なう。

本発明に言う透過光を用いた定量分析方法の測定原理は
、被検液の吸収スペクトルが被検液中の特定物質の濃度
に応じて変化することに立脚したもので、該特定物質に
よって適当な特定波長を選択し、その波長における該透
過光の吸光度の変化を光電的に測定し、さらに該特定物
質の吸光特性等から得られる濃度対吸光度の相関関係に
より濃度単位に変換し表示するものである。

本発明はこの吸光度を用いた定量分析において、被検液
中の分析対象である特定物質の濃度に応じて、特定波長
の変更及び／又は被検液中での透過光路長の変更を行な
うことを特徴とするものである。

この特定波長を変更する形式としては特に限定されるも
のではないが、該特定物質の′ａ度の広い範囲にわたっ
て吸光度が精度よく安定に測定でき且つ測定操作及び測
定装置が簡便なものとして以下に示す形式が好ましい。

即ち被検液中の該特定物質の濃度範囲を複数領域に分割
し、その各々の領域に対応して別々の特定波長を用いる
ことが望ましい。特定波長としては、各々の濃度範囲に
おける該特定物質の吸光度特性からその濃度変化により
吸光度が出来るだけ大きく変化し得る波長を選択するの
がｊ；い。特に該特定物質の高濃度領域では、低濃度領
域と同様の特定波長を用いたのでは吸光度が大きくなり
過ぎて測定不能となることから、それよりも吸光度が小
さく且つ濃度変化による吸光度変化の大きい特定波長を
選択すべきである。通常は、該濃度範囲を２領域に分割
し、それに対応した２種の波長を用いることが、操作等
が簡便で好ましい。

また本発明の被検液中での透過光路長を変更する形式と
しては特に限定されるものではないが、該被検液中の透
過光路部の一部にスペーサーを設けることにより透過光
路長を減少せしめる方式が好ましい。かかるスペーサー
としては、その吸光度が小さくてそれを挿入することに
よる分析精度への影響の小さいものが好ましく、その好
ましい材質としてはガラス、石英などの無機物質、ポリ
スチレン、メチルメタアクリレートなどの有機高分子物
質等が挙げられ、内部に空間を有していてもよい。透過
光路長を変更する手段としてのスペーサーを２個以上用
いてもよいが、操作性や装置の簡便さから１個のスペー
サーを用いることでそ一７＝ の効果が充分得られる。

また透過光路長を変える他の方法としては測定されるセ
ルの形状を変えることにより光路長を変えることも考え
られる。たとえば被検液のはいる同一セルにおいてその
上部の内径又は奥行を大きくし、下部の内径又は奥行を
小さくする方法が考えられる。即ち第２図に例示するよ
うな測定セルを用いて、まず光を上部の内径の太い部分
２０に当てて、得られる透過光があらかじめ決められた
強さより強い場合は、下部の内径の細い部分２１に光を
当てる。

また本発明において上記した特定波長の変更と透過光路
長の変更の両方を併用してもよいが、通常はいずれか一
方を用いることが好ましい。特に特定波長の変更方式が
操作性が良好であって好ましい態様である。

本発明に言う被検液としては、場合によっては乳化物や
懸濁物等の固体を少量含むものであってもよいが、固体
を含まない均一な溶液状態にあるものが好ましい。尚被
検液はガラス等の無機物質−Ω　− や有機高分子物質などで出来た測定セルに入れた状態で
分析に供される。かかる被検液の溶媒には分析対象物質
を溶解するのに適したものが用いられるが特に限定され
ない。

本発明における分析対象である特定物質としては特に限
定されるものではないが、本発明に特に適した該特定物
質としては、ペプチドホルモン。

非ペプチドホルモン、その他のホルモン、酵素。

ビールス、特異抗原、血清蛋白成分、ビタミン。

薬物、その伯が挙げられる。

即ちペプチドホルモンとしては、たとえばインシュリン
、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、カル
シトニン、■リス口ポエチン、セクレチン、コレシスト
キニン、ガストリン、アンギオテンシン■、パップレシ
ン、オキシトシン。

メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳ）−１）、ＴＳＨ分泌促進ホル
モン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン
（ＬＨ）、ＬＨ分泌促進ホルモン（ＬＨＲＨ）、絨毛性
ゴナドトロピン（ＨｃＧ）。

卵胞刺戟ホルモン等が挙げられる。非ペプチドホルモン
としては、たとえばステロイドホルモン類のグルココル
チコイド、アルドステロン、テストステロン、エストリ
オール、エストラジオール。

プロゲステロン等が挙げられる。またその他のホルモン
としては、たとえば甲状線ホルモン（サイロキシン、ト
リヨードサイロニン、リバーストリヨードサイロニン）
、コルチゾール、アドレナリン、ノルアドレナリン、メ
ラトニン、アセチルコリン等が挙げられる。さらに酵素
としては、たとえばＣ１エステラーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ。

ペプシノーゲン、トリプシン、カイネース等；特異抗原
としては、たとえばα−フェトプロティン。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等；血清蛋白成分としてはたと
えばサイロキシン結合グロブリン、β２ミクログロブリ
ン、Ｉ（ＩＧ、ｒｇｖ、Ｉｔ）Ａ。

１０Ｄ、Ｉ（ＩＥ等；薬物としては、たとえばジフェニ
ルヒダントイン、フエノバルビタール、メフォバルビタ
ール、カルバマゼピン、パルプロ酸。

プリミドン、エトサクシミド、メトサクシミド。

メフエニトイン、フェンサクシミド、グルテチミド、ク
ロナゼパム、クロルジアゼポキサイド、二トラゼパム、
アンフェタミン、イミプラミン、アミトリブチリン、プ
ロトリブチリン、フェノチアジン、メブロバメート、コ
カイン等；ビタミンとしては、たとえばビタミンＡ（レ
チノール）、ビタミンＢ＋　　（サイアミン）、ビタミ
ンＢ２　　（リボフラビン）、ビタミンＢ６　　（ピリ
ドキサールリン酸）、ビタミンＢ１２．ビタミンＣ（ア
スコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ（α−トコフ
ェロール）１葉酸、二］チン酸、パントテン酸、ビオチ
ン等：その伯たとえばリウマチ因子、トＩＢｓ抗原、Ｈ
Ｂｓ抗体、ミオシン等が挙げられる。

これまでの吸光度を用いた分析法においては、かかる被
検液中に含まれる特定物質をたとえばある濃度基準で表
わした１０〜１０００の濃度の範囲で測定したい場合、
この濃度範囲がある特定波長へで吸光度即ちＯ，Ｄ、　
　（Ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）が約０．１から
５．０の程度の値を示すことがある。この場合ふつう光
度計の性質上、Ｏ，Ｄ、が約２．０以上の吸光度は誤差
が大きすぎるため、測定のためにこの範囲の吸光度が用
いられることはない。そこで本発明の分析法では、特定
波長をたとえばＢにかえることによりたとえばＱ、ｌ’
）、５．０をＯ２０，１，０に下げることが可能であり
、そうすることにより、波長Ａで測定できなかった高濃
度領域たとえば２００〜１０００にお（）る測定が可能
になる。

ただしこの場合低濃度域（１０〜２００）を波長Ｂで測
定することは感度・精度ともに悪くなり好ましくない。

この様に低濃度域は波長Ａで測定し高濃痩域は別の波長
Ｂで測定するようにすれば、１０〜１０００の広い範囲
にわたり同じ被検液調製で精度よく測定が可能である。

さらに本発明に言う吸光度を用いた定量分析装置は、以
上に述べた如き定量分析を行ないうるちのであって、被
検液中の分析対象物質の濃度に対応して吸光度を測定す
る特定波長を変更する手段及び／又は被検液中の透過光
路長を変更する手段を具備することを特徴としている。

かかる特定波長の変更手段としては、２種以上、好まし
くは２種の特定された波長の中から選択し、例えば切替
えスイッチ等で簡単に切替えて使用できる形式のものが
好ましい。また透路長を変更する手段としてスペーサー
を用いた場合には、そのスペーサーの出し入れ操作を手
動式あるいはモーター等で自動的に行なってもよい。

さらに該分析装置は、測定された吸光度を被検液中の特
定物質濃度に変換するための手段を具備するものである
。かかる濃度変換手段としては、例えば吸光度と濃度の
相関関係を表わしたもの、即ち検量線を、近似式等の数
式変換あるいはパターン認識等の図形変換などを用いた
演算方式を記憶し得る機能を有したものが、実用上非常
に有効である。尚この演算方式は更新して記憶できるこ
とが望ましい。

以下、実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１ （１）試料の調製 ヒト絨毛ゴナドトロピン（以下１１ＣＧと略す）の国際
標準品であるＷ　ＨＯ２ｎｄ　　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　　５ｔａｎｄａｒｄ　ｆｏｒ　）ＩｃＧ　（
５３００国際単位（ＩＵ）／アンプル）を０．０１　Ｍ
リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳと略す）　　［Ｎａ　Ｃ
９８，５ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４０，２６６ｇ、　Ｋ２　Ｈ
ＰＯ４１，４０１ｇを蒸留水に溶かして１Ｊｌ！とした
］　　ｐＨ’７．２の５．３ｍに溶解して１０００ＩＵ
／ｄのＨＣＧ原液を作った。これを上記ＰＢＳで適宜希
釈して、１０．２５．５０．　１００．　２００゜４０
０、　６００．　９００Ｔｌ’Ｌ　Ｉ　Ｕ　／　ｄの溶
液を調製し試料とした。

（２１ｍ素免疫定量法（Ｅ　ｎｚｙＩＩｌｅ　ｌ　１ｍ
ｕｎｏ　Ａ　５ｓａｙ）の実施 下記の構成成分より成るＨＯＧ定量用キッドにより酵素
免疫定量法を実施した。

■　抗体結合スティック：　（ＧＣＧ−ベータザブユニ
ットに対する抗体の結合したプラスチック棒■　酵素抗
体結合物：ＨＣＧ−ベータサブユニットに対する抗体の
結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ　　
Ｒａｄｄｉｓｈ　　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　）■　基質
液；　　０．０３％過酸化水素溶液■　発色液；テトラ
メチラベンジシン溶液即ち１２Ｘ　７５．ガラス試験管
に試料０．５ｍｉ！と酵素抗体結合物 ■　０．５戒を加えよく混合した。ここに抗体結合ステ
ィックを入れ２５℃の水浴中で１５分間インキュベーシ
ョンした。この１５分間のインキュベーション中に、別
の１２Ｘ　７５ｍガラス試験管に基質液■　０．７−と
発色液　■　０．３ｄを加えよく混合した。１５分間経
過後スティックを取り出し水道水でよく洗い、このステ
ィックを先に調製した基質液と発色液の混合液中に入れ
て、２５℃の水浴中で１０分間インキュベーションした
。１０分間経過後スティックを捨て、試験管中の液の吸
光度を測定した。（３）吸光度の測定 発色した試験管中の液の吸光度を光路長１０ＩｌｌＩ１
１のキュベツトを用い、波長６６０ｔｖで測定した結果
を表１に示す。使用した分光光度翳１は日本分光社製分
光光度計ＵＶＩＤＥＣ５０５型である。

同じ液を本発明の分析装置の１実施態様である第１図に
示した装置により以下の要領で測定した。

まず発色した液のはいった試験管を試験管挿入口５に入
れてスイッチ１を押す。すると光ｍ３から波長６６０ｎ
ｎ＋の光が手で試験管中の液に当たり、透過した光が検
出器７に当たる。ここで電気信号に変換され、これが演
算装置９の中に記憶されている検量線に従って被検液中
の濃度に変換され、得られた結果を濃度表示部９に表示
する。ただし得られた濃度が５ｍ１Ｕ／ｄより低い場合
は「５イカ」と表示され、１５０ｍ　Ｉ　Ｌｌ　／−を
越える場合は「１５０イジヨウ」と表示される。

「１５０イジヨウ」と表示された場合は試験管を試験管
挿入口５より取出し試験管挿入口６に入れる。スイッチ
２を押すことにより光８！４から波長５６０ｎｍの光が
出て試験管に当たり、透過した光が検出器８に当たる。

ここで電気信号に変換され、これが演算装置９の中に記
憶されている別の検量線に従って被検液中の濃度に変換
される。こうして得られた濃度が濃度表示部１０に表示
される。得られた結果を表２に示す。

（以下余白） 表２ 以上の結果から明らかな様に波長６６０ｎｍにおいては
５〜１５０７＋’Ｌ　Ｉ　Ｕ　／ｄの範囲のｌ−１０Ｇ
が測定できるが、１５０７＋’Ｌ　Ｉ　Ｕ　／ｄ以上は
吸光度が高すぎるため測定不可能である。しかし波長５
ｅｏｉｖを採用することにより　ｉｏｏ〜１ｏｏｏｍ　
Ｉｕ　／Ｉｄの濃度が精度よく測定できる。

実施例２ （１）　　ヒト応対形成ホルモン（以下ＬＨと略す）の
国際標準品であるＷ　ｌ−１０Ｉ　ｓｔ　　Ｉ　ｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　　Ｐ　ｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ｌ　Ｈ（７７国際単位（ＩＵ
）／アンプル）を実施例１に記載のＰＢＳ　７．７ｍに
溶解して１０ＩＵ／ｍ１のＨＣＧ原液を作った。これを
ＰＢＳで適宜希釈して、５　、１０．２５゜５０、　１
００．　２００．　４００ｍ　Ｉ　Ｕ　／　ｕｄｌの溶
液を調製し試料とした。

（２）酵素免疫定量法（Ｅ　ｎｚｙｍｅ　Ｉ　ｍ１ｕｎ
ｏ　Ａ　５ｓａｙ。

Ｅ　ＩＡ）の実施 下記の構成成分より成るＬＨ定定量用フッ１〜より酵素
免疫定量法を実施した。

■　抗体結合スティック；ＬＨに対する抗体の結合した
プラスチック棒 ■　酵素抗体結合物；ＬＨに対する抗体の結合した西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ｌｌｏｒｓｅＲａｄｄｉｓｈ
　　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　、トＩＲＰと略ず）■　基
質液：　　０．０３％過酸化水素溶液■　発色液；テト
ラメチルベンジジン溶液定量は実施例１に記載の方法と
全く同様にして行なった。

（３）吸光度の測定 発色した試験管中の液の吸光度を光路長１０ｍｍのキュ
ベツトを用い、波長６６０ｎｍで測定した結果を表３に
示す。使用した分光光度計は日本分光社製分光光度計Ｕ
ＶＩＤＥＣ５０５型である。

同じ液を図１に示した装置（ただしこの場合演算装置は
Ｌ　Ｈ用に作成したものを使用）で測定した結果を表４
に示す。

（以下余白） 表４ 以上の結果から明らかな様に、波長ｅｅｏｎｍにおイテ
ハ５〜１５０ｍ１Ｕ／＃ｌｉ！の範囲のＬＨが測定でき
るが、１５０ｍ　Ｉ　ＬＪ　／　ｒｄ以上は吸光度が高
すぎるため測定不可能である。しかし波長５６０ｎｍを
採用することにより　１００〜５００ｍ　Ｉ　Ｌｌ　／
１ｕｆｔの濃度が精度よく測定できる。

実施例３ （１）試料の調製 実施例１と同様に行なった。

（２）酵素免疫定損法の実施 基質液ど発色液を入れる試験管は第２図に示したものを
使用した以外は実施例１の場合と同様に行なった。

（３）吸光度の測定 第２図に示した試験管中で発色した液を本発明の分析装
置の１実施態様である第３図の測定装置で測定した。

すなわち発色した液のはいった試験管を試験管挿入口１
４に入れスイッチ１１を押す。すると光源１３からの光
が試験管の内径の太い部分に当たり透過光が検出器１５
に当たり電気信号に変換される。これが演算装置１６で
ｉｌｌ痘に変換され得られた濃度が８Ｉ麿表示部１７に
表示される。濃度が５ＴＩＬＩＵ／ｍｉ！より低い場合
は「５イカ」と表示され、１５０７１ｉＬ　ＩＵ／ｄよ
り高い場合は「１５０イジ」つ」と表示される。　　「
１５０イジヨウ」と表示された場合はスイッチ１２を押
す。すると試験管挿入口４の中の試験管を支えている部
分が少し上昇し、試験管の内径の細い部分が光路にはい
る。次に光源１３から光が出て前記した順序に従い、濃
度が濃度表示部１７に表示される。

こうして得られた結果を表５に示す。

（以下余白） 表５ ［発明の効果］ 本発明は、被検液中における分析対象物質の濃度が高い
領域においても精度よく安定に且つ極めて簡単な操作に
より分析することが可能な吸光度による定量分析方法及
び定量分析装置を提供する。

特に、分析対象物質に対する吸収係数の高い波長及び低
い波長を用いることにより、又は測定用試験管の中にス
ペーサーを入れたり、又は試験管の形状を工夫して光路
長を容易に変換することにより、広範囲の濃度の物質を
精度よく測定する方法及びその装置を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図に本発明に係る透過型分析装置の１実施態様のブ
ロック図を示す。 第２図は本発明に適した測定セルの１実施態様である試
験管の断面図であり、上部は肉厚が薄く従って内径が大
きく、下部は肉厚になっているため内径が小ざい。 第３図は、第２図の試験管を用いて測定する場合の本発
明における測定装置の１実施態様である。 第１図 第２図 第３図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検液に光束を照射しその透過光の特定波長に関
   する吸光度を測定することによって該被検液中の特定物
   質の濃度を測定する分析方法において、該被検液中の該
   特定物質の濃度に対応して該特定波長の変更及び／又は
   該被検液中での透過光路長の変更を行なうことを特徴と
   する吸光度を用いた分析方法。
2. （２）該透過光路長の変更が、該被検液中の透過光路部
   の一部にスペーサーを挿入すること及び該スペーサーを
   該一部から取り出すことによるものである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. （３）該被検液中の特定物質の濃度範囲を複数領域に分
   割し、その領域に対応して該変更を行なう特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。
4. （４）該領域分割を２分割で行ない、２種の特定波長を
   用いる特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）被検液に光束を照射する手段、その透過光を受け
   特定波長に関する吸光度を測定する手段を有した該被検
   液中の特定物質の分析装置において、該被検液中の該特
   定物質の濃度に対応して該特定波長を変更する手段及び
   ／又は該濃度に対応して該被検物中での透過光路長を変
   更する手段を具備したことを特徴とする吸光度を用いた
   分析装置。
6. （６）測定された該吸光度を該被検液中の特定物質の濃
   度に変換するための手段を具備した特許請求の範囲第５
   項記載の装置。
7. （７）該変換手段が、変換用の演算方法を記憶し得る機
   能を有したものである特許請求の範囲第６項記載の装置
   。