JPS61143325A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明は酵素誘導体に、特に血栓症疾病の治療に使用す
るための酵素誘導体に関する。

従来の技術 欧州特許第０．００９．８７９号は血栓症治療用の有用
な治療剤である生体内線維素溶解性酵素の誘導体を開示
している。これらの誘導体は偽−次加水分解速度が１Ｏ
−６秒−１，、、ＩＱ−３秒−１の範囲であるような加
水分解により除去可能な基により酵素の活性触媒部位が
遮断されていることを特徴とする。

発明が解決しようとする問題点 本発明に２いてこれらの酵素が除去可能な遮断基により
互いに結合されうろことが見出された。

〔発明の構既〕

問題を解決するための手段 本発明によれば、除去可能な遮断基によりその活性中心
を介して互いに結合された複数個の線維素溶解性酵素か
らなる結合体（ｃｏｎｊ　ｕｇａｔｅ　）が提供される
。

作用・効果 本明細書中にて「線維素溶解性酵素（ｆｉｂｒｉｎ−ｏ
ｌｙｔｉａ　ｅｎｚｙｍｅ　）　Ｊという語は欧州特許
第０．００９．８７９号（米国特許第４，２８５，９３
２号）中にて定義されたように生体内繊維素溶解活性を
示すいかなる酵素も意味する。従ってこの語は線維素の
直接蛋白質分解により機能するこれら酵素（例えばプラ
スミン）％プラスミノゲンの活性化により機能するもの
（例えばヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＦＡ
Ｉ％ウロキナーゼ（高及び低分子量形態両者）及びスト
レプトキナーゼ及びプラスミンの錯体を包含する。この
語はまた間接経路により線維素浴解性系と相互作用でき
るこれら酵素（例えばヒト活性化蛋白質Ｃ）も包含する
。このような酵素は補乳類の尿、血液′または組織から
得ることができ、あるいは異種宿主菌が酵素を特定する
遺伝子を表現する場合のような組換型ＤＮＡ法により得
ることができる。この語はま九下紀のものも包含する。

（ａ）　　欧州特許公告出願ｖｉｃｏｘｓ’５ｓｒｒｔ
号中に開示されているような線維素溶解活性ノーイブリ
ッド蛋白質。

伽）　欧州特許公告出願第０１５２７３８号中に開示さ
れているような線維素溶解活性の因となる酵素における
触媒部位が、可逆性結合基によシそれに結合しているそ
れ自体繊維素溶解性酵素であるヒト蛋白質によシ速断さ
れている繊維素溶解性蛋白質の誘導体、及び （ｃ）　　欧州特許公告出願第０１５２７３８号中に開
示されているような蛋白質結合体。

「除去可能な遮断基（ｒｅｍｏｖａ　ｂｌｅ　ｂｌｏｃ
ｋｉｎｇｇｒｏｕｐ　）　Ｊという表現はこれがヒト血
液のような生理的条件下で除去されるように酵素に可逆
的に結合されている基を意味する。

好適には、遮断基は偽−次加水分解速度定数が等張水性
媒体中でｐＨ７及び３７℃にて１０−秒′″１から１０
−３秒″″１の範囲であるような速度で加水分解により
各酵素から除去可能である。各結合に好ましい速度定数
はＩ　Ｘ　１０°Ｓ〜８　Ｘ　１０’″４秒−１の範囲
である。速度定数の測定に適し几媒体は水中に０．０５
Ｍ燐酸ナトリウム／　０．１　Ｍ塩化ナトリウム７０．
０１容量憾トウイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０洗剤から
なる緩衝液系である。

好適な除去可能な基の例には下記構造（１）で表わされ
る基がある。

Ｌ（−Ｂ−Ａ−Ｘ−）ｎ　　　　　（１）〔式中、ｎ拡
２〜６の整数であり。

Ｌはｎ価の結節基（ｎｏｄａｌ　ｇｒｏｕｐ　）であり
。

各Ｂは独立して線状親水性結合基であり、各人は独立し
て酸素、硫黄及び窒素から選択されｔ少なくとも１個の
へテロ原子を含有し、窒素が０１−アルキルによ、り置
換されていてもよい橋かけ基であり、そして 各Ｘは独立して式−Ｒ−Ｃ−Ｃ式中、Ｒは芳香族または
不飽和非芳香族官能である）で表わされるアシル基であ
る、。〕 本明細書中で使用したように「結節基（ｎｏｄａｌｇｒ
ｏｕｐ　）　Ｊという表現は多官能性結合基を意味する
Ｏ 好ましくはｎは２〜４の整数を示す。

ｎが２であるときの好適な結節基りの例には結合、メチ
レンもしくはエチレン（−ａ（ｓ　−ＣＦ（ｔ　−）の
ようなポリメチレン基、酸素、硫黄、ジチオ（−８−８
−）、−８−Ｒ”　　−Ｃ式中Ｒ１はチオール反応性電
子吸引性基から誘導される）％モノ置換窒素、すなわち
−ＮＨ−のようなイミノ誘導体。

及びヒドラジン誘導体が含まれる。

基Ｒ１の例には基Ｌ： す を与えるスクシンイミド及びメチレンケトが含まれる。

ｎが３であるときの好適な基りの例には非置換窒素１式
−ｏ−ｐ−ｏ−で表わされるホスホトリエ〇− ステル、 のような３価フェノキシまたはベンゼントリカルボン酸
基が含まれる。

４価の結節基りの例にはトリメチルアンモニウム、炭素
及び４価フェノキシ単位が含まれる。

基Ｂの例は６−アミノヘキシルのようなω−置換ｃ雪−
ｃｔｅ　　γルカン類、カルボニル基を末端基としてい
てもよいポリエチレングリコールまたはポリプロピレン
グリコールのような線状ポリマー。

ポリグリシン、ポリアラニンまたはポリサル；シンであ
る。線状基は誘導体の分析を促進するためまたは結節基
りと反応するためのジスルフィド結合またはα、β−ジ
ヒドロキシ官能のような開裂可能な部分を含有していて
もよい〇 好ましくは、Ｂは線状親水性ポリマー、例えばカルボニ
ル基を末端基としてよいポリエチレングリコールまたは
ポリプロピレングリコールのようなポリアルキリデング
リコールまたはポリアラニン及びポリサルコシンのよう
なポリアミノ酸である。

構造（１）を有し式中ｎが２である基において。

部分Ｌ（−Ｂ−）、は従ってそれ自身Ｂについて上記し
たような線状残水性ポリマーであってもよりことが理解
されよう。

線状親水性ポリマーが例えばポリアミノ酸のように対称
ではないとき、全体としての遮断基は結節基に関して非
対称であることも理解されよう。

式（１）で表わされる遮断基において、好ましくは全て
の基Ｂは同じものである。

好ましくは線状親水性結合基の長さは酵素に結合し九部
分Ｘのカルボニル基間の距離が少なくと４３０Ａである
ものであろう。部分Ｉ、（−Ｂ）、がポリエチレングリ
コールである場合、ポリマーは好ましくは７〜５０個の
エチレンオキシ単位を含有するＯ 好適な基Ａは得られるアシル酵素を充分安定化させるこ
とにより偽−次加水分解速度定数が上記Ｌｌ範囲に、好
マシくはｌＸｌ０−’　〜８Ｘ１０−’秒−１の範囲に
なるようＫするものである。

Ａの例には式（ＩＩ） −（Ｃ）ｍ−Ｄ−Ｅ　　　　　（ｆｆ）（式中、ＣはＢ
に結合するのに適した官能基１例えばＲ２が水素または
０１〜６アルキルであるときのＮＲ”、Ｓ　　またはＯ
であり。

Ｄは化学結合または好適には鎖中に８個以下の炭素原子
を有する炭化水素鎖であり、 Ｅは電子吸引性基、例えばＲ８が水素またはＣ１〜、ア
ルキルであるときのＮＲ”　、　Ｓまたは０であり。

ｍはｌであるか、またはＥがＢＫ結合するのに適してい
ると蔭はｍは代りに・０であってもよい）で表わされる
部分が含まれる。

従って、Ａの例には −Ｏ−−３−−ＮＴ〔（ＣＨ，）、ＮＨ−−ＮＨ−−Ｎ
Ｈ−ＮＨ−−８（ＣＨｔ）ｓＮト−Ｎ−Ｒ４ ４Ｒ４ −０−ＮＨ−−ＮＨ（ＣＨｚ’１ｚＮＨ−（式中％　Ｒ
４は６〜６アルキル基である）が含まれる。

Ｒとして好適な芳香族基には置換されていてもよいフェ
ニルまたはナフチルが含まれる。好適な基Ｘの例には２
または４位置換されていてもよいベンゾイル基及び２ま
たは３位愉換されていてもよいアクリロイルが含まれる
。

好適な基Ｘには欧州特許第０．００９．８７９号（米国
特許第４，２８５，９３２号）中に記載された遮断基か
ら誘導されたこれらの基が含まれる。かくして、好まし
い基は上記の欧州特許中に記載されたように置換されて
いてもよい、そして更に基Ａにより置換されたベンゾイ
ルま几はアクリロイル基１例えば置換さねていてもよい
、そして更に基Ａにより２または４位で置換され友ベン
ゾイル基及び置換されていてもよい、そして更に基ＡＫ
より２または３位でｔ換されたアクリロイル基である。

Ｘにとって存在可能な置換基は好適にはアミノのような
電子放装置＊Ｍである。

基−Ａ−Ｘ−の好ましい例は２−または４−オキシ−、
ヒドラジノ−、アミノ−またはω−アミノアルキルアミ
ノ安息香ｅ誘導体である。

上記した結合体の生理条件下の加水分解は末変性形勅の
酵素ｆｆｆ＋の再生を持たらす。

本発明の結合体は２種以上の酵素を含有できる。

この種の結合体における異なる酵素を組合せることによ
り、その活性を操作しかつ変性させることが可能である
。

かくして、二量体のアシループラズミンのようなホモ結
合体またはプラスミン−ｔ−ＦＡのよ５１ｋへテロ結合
体が製造できる。しかしながら、生理的線維素溶解系の
成分は血栓の線維素母体上の様様な部位で様々な程度相
互反応することが知られている。また、繊維素溶解性成
分の生理的清速速度が著しく異なり、プラスミノゲンで
は循環系からゆり〈）清掃される一方、他方ではｔ−Ｆ
Ａ及びｕ−ＦＡは速かに清掃されることも知られている
。

血栓溶解剤の望ましい特徴は遅い生理学的清掃及びＩＩ
Ｉ＃素への高い親和性であり、なぜならばこれらの性質
か一緒になって血栓への蛋白質分解活性素〔例えば（ア
シル−）プラスミン〕に結合しているものである。得ら
れる結合体は元のプラスミノゲン活性化因子よりゆっく
り清掃される。

他の好ましいへ・テロ結合体は繊維素への親和性がこの
ような親和性をほとんどないしまったく有さない酵素（
例えばｕ−ＰＡ）Ｋ：与えられるかまたは固有繊維素親
和性を有する酵素を結合することＫより増加され、かく
して繊維素母体との多価相互反応を可能にするものであ
る。

本発明によれ＃−ｊ１種以上の線維素溶解性酵素を同時
または順次多官能性了シル化剤と反応させることからな
る上記した酵素結合体（ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｉｕ−ｇ
ａｔｅ）の製造方法もまた提供される。

更に本発明によれば、酵素を多官能性アシル化剤で処理
することからなる上記した酵素結合体の製造方法が提供
される。

本明細書で使用し友ように、「多官能性アシル化剤（ｐ
ｏｌｙｆｕｎｃＨｏｎａｌムｃｙｌａｔｉｎｇ　ａｇｅ
ｎｔ　）　Ｊという表現は複数個の反応性アシル化性部
分を有する上記の式（１）で表わされるもののような除
去可能な適断基を含む薬剤を意味する０ 好ましい実施態様において、結合体辻１種以上の線維素
溶屏性酵素を式（ＩＩＩ） （式中％Ｌ、Ｂ、Ａ、Ｘ及びｎＦｉ上記式（１）におけ
ると同一の意義を有しｈ　Ｒ’　ｅ　Ｒ＠ｅ　Ｒ’　ｔ
　Ｒ・は各々独立して水素ま几は電子吸引性置換基であ
り、そして２は対イオンである）で表わされるアシル化
剤で処理することによ０展造できる。

Ｒ’　＊　Ｒ・ｅ　Ｒ’またはＲａ　　としての電子吸
引性置換基の例にはハロゲン、ニトロまたはスルホニル
が含まれる。

好適な対イオン２には塩素イオン、ｐ−トルエンスルホ
ン酸イオンまたはトリプルオル酢酸イオンが含まれる。

式（ｉｌｌ）で表わされるアシル化剤は新規であり。

それ自身で本発明の一部を成す〇 もしく線維素溶解性酵素１種のみを含有する「ホモ結合
体（ｈｏｍｏ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）　Ｊが必要なら
ば−その酵素は好適に・は１／ｎ〜１５／ｎ倍モル当量
の式（ＩＩＩ）で表わされ１式中ｎが王妃式（１）にお
けると同一の意義を有するアシル化剤で処理される。処
理は好ましくは好ましいｐＨ６，５〜８．５を有する水
性緩衝化媒体中で行なわれる。酵素は好適には高濃度で
１例えば１■／ｄより高濃度で、好ましくは５〜５０１
１１１７／ｄでなければならない。反応の温度及び時間
は好ましくは０〜４０℃及び３０分〜７日間の範囲にあ
る。酵素の丁シル化はカップリング中の好便な基質（例
えば色素産生性トリペプチドｐ−ニトロアニリド）に対
する活性の減少を測定することにより監視できる。カッ
プリング後、結合体は以下に述べる標単方法によシ精裂
できる。

２種以上の異なる酵素を含有するヘテロ結合体は好適に
は１種の酵素を上記条件下で１〜５０倍モル過剰の式（
ｆｆ［）で表わされるアシル化剤と反応させ、次いで、
少なくとも１種のアシル化性部分が酵素に結合せずに残
存する変性酵素中間体を単離することにより、ａ造でき
る。好適には、この単離は高性能ゲル透過クロマトグラ
フィーまたはアフイニテイクロマトグラフイーにより行
なわれる。

この中間体は次いで上述したものと同様の条件下で但し
、いかなるアシル−酵素成分の脱アシル化も最小限にす
るため一般によフ低温（好ましくは０〜２０℃）で反応
される。

所望ならば、遠心または圧力駆動限外濾過セル内で第二
工程を行ないそしてカップリング中に反応混合物の容積
を減少させることにより酵素の濃縮をカップリングと組
合せてもよい。

更に１本発明によれば、その活性中心が一緒に反応して
可逆性遮断基を形成できる基により遮断されている１種
以上の酵素を反応させることからなる上記した酵素結合
体の製造方法が提供される。

特に、式ＣＩ）で表わされ式中ｎ　＝　２である遮断基
を有する結合体を製造するとき、この方法はその活性中
心が構造（ｆＶ） Ｗ−Ｂ−Ａ−Ｘ−（ＩＶ） で表わされる基により遮断されている酵素をその活性中
心が構造（ｌＶＡ） Ｗｌ−Ｂ−Ａ−Ｘ−（ＩＶＡ） （上記式中、Ｂ、Ａ及びＸは式（１）におけると同一の
意義を有し、そしてＷ及びＷｌ　　は結節基りまたはそ
の前駆体を生成させるため一緒に反応させることができ
る基である）で表わされる基により遮断されている酵素
と反応させることからなる。

好適な基Ｗ及びＷｌ　並びにそれらにより生成される基
りの例は下記のようにまとめることができる。

Ｗ　　　　　　　　　　ＷＩ　　　　　　　　　　　　
　　Ｌチオ　　　　　　ピリジルチオ　　　　　　　　
ジチオチオ　　　　　　Ｎ−マレイミド　　　　　チオ
−スクシンイミドチオ　　　　　　ハロメチルケトン　
　　　チオ・メチルケトン（例えばクロルメチルケトン
） ヒドラジノ　　　　アルデヒド　　　　　　　　奮換ヒ
ドラゾン構造（ＩＶ）で表わされる基で遮断された酵素
は欧州特許第０．００９．８７９号（米国特許第４２８
５９３２号）中に記載され次ものと同様の方法により製
造できる。

酵素結合体を形成するカップリングは酵素成分を、取分
の一方または両者が結合している不溶性親和性母体と接
触させることにより行なうことができる。次いで、生氏
物は好適な配位子で溶離することにより単離できる。線
維素溶解性酵素のための好適な親和性母体はＬ−リジン
−アガロースである。

得られた酵素結合体は種々の技術によりいかなる未反応
出発物質も抽出してし筐うことにより精製できる。結合
体分子は出発酵素及び多官能性アシル化剤より著しく大
きな分子量を通常有するようになるため、ゲル透過（及
びその高性能変形法）のようなサイズ分別方法が特に有
用である。

アフィニテイクロマトグラフィ一方法、特に配位子とし
てのＬ−リジンの使用に基ずくものも使用できる。

式（ｌｌｌ）で表わされるアシル化剤は様々な標準的方
法により製造でた。それら方法のうち最後の工程は式（
Ｖ） Ｌ（−Ｂ−Ａ−Ｘ−ＯＨ）ｎ　　（Ｖ）、　（式中、Ｌ
、Ｂ％Ａ、Ｘ及びｎは上記式ＣＩ）におけると同一の意
義を有する）で表わされる化合物を式（■） （式中、　Ｒ’　＋　Ｒ’　＋　Ｆ３７＋　Ｒ８及びＺ
は式（ＩＩ）におけると同一の意義を有する）で表わさ
れる化合物と反応させることからなる。式（Ｖ）で表わ
される中間体は標準的方法により製造できる。

好ましい一般的合成手法は下肥の通シである。

（ａ）　　一般式Ｌ（−Ｂ−ＯＨ）ｎを’ｆｆ　ｆ　ル
化合物１側光ば二官能性または多官能性ポリマー（例え
ばポリエチレングリコール）をモル過剰の試薬１例えば
（ポリ−トルエンスルホン酸エステルを与えるための）
ｐ−トルエンスルホニルクロリ１％′″または（ポリー
クロル＠酸エステルを与えるための）ホスゲンと反応さ
せることにより活性化させる。このような活性化に先立
ち、二官能性ポリマーはホスホリルクロリドまたはベン
ゼン（２，４，６’）　）リカルボニルクロリドのよう
な二官能性結節基を過剰の（二官能性）ポリエチレング
リコールとピリジンのような無水塩基性媒体中で反応さ
せることによυ誘導できる。欠員で、生成物は過剰の未
反応ポリエチレングリコールから単離でき、上記のよう
に活性化できる。

０）　この反応性中間体は一般構造Ｔ（Ａ−Ｘ−ＯＨＣ
式中、人は式（１）におけると同一の意義を有する）で
表わされる親核性誘導体に塩基性条件下で（好ましくは
ピリジン、トリエチルアミンまたは炭酸ナトリウム水溶
液の存在下で）、２０〜１００℃で１〜２４時間カップ
リングされる。

（ｃ）　　（ｂ）からの中間体多會換酸は、単純な遮断
剤に関して欧州特許第０．００９．８７９号（米国特許
第４．２８５，９３２号）中に記載されたような弱塩基
性溶媒中でジシクロへキシルカルボジイミドのような縮
合剤を用いて４−アミジノフェノール（またはそのＪｉ
ＩｌＩｔ換誘導体）の塩でエステル化される。

充分なエステル化を確実にする友めＫわずかにモルｉ剰
のアミジノフェノール（１，５〜４倍）を用いるのが好
ましい。所望ならば、エステル化は酸性［１１してｐ−
トルエンスルホン酸の存在下で行なうことができる。

本発明の酵素結合体は好ましくは医薬組成物として投与
される。

従って１本発明はま九本発明の酵素結合体を医薬として
適当な担体と組合せて含有する医薬組成物も提供する。

本発明による組成物は人間に静脈内投与するのに適した
医薬組成物として通常の方法に従って処方できる。

典型的には、静脈内投与用Ｒ放物は滅菌等張水性緩衝液
に滅菌誘導体を溶解させた溶液である。

必要な場合、組成物はまた誘導体を溶液に保持する可溶
化剤及び注射部位の疼痛を和げるリグノカインのような
局所麻酔剤も含有できる。一般にこのような誘導体は単
位投与剤型１例えば活性単位で表わした酵素結合体の量
を示し、かつ遊離未変性蛋白質の放出期間を示したアン
プルや薬包のような気密容器内の乾燥粉末または水不含
濃縮物として供給される。誘導体が注入により投与され
るべき場合、誘導体は滅菌医薬品用「注射用水」を含有
する注入ビン゛と共に小口分配される。誘導体が注射に
より投与されるべき場合は％誘導体は滅菌注射用水のア
ンプルと共に小口分配される。注射または注入用組成物
は投与前に成分を混合することにより調製できる。

物質の投与量は線維素溶解の必要量及びそれが必要であ
る速度、血栓症状の程度及び凝塊の位置゛と大量さによ
りｎｆｘる。使用すべき正確な投与量及び投与形態は必
ずや症状の訴えの性質に照らし、治療を監督する医者に
より状況に応じて決定されなければならない。しかしな
がら、一般に、確立された血栓を治療中の患者は５回以
下の投与量に分けた注射によりまたは注入により体重１
　ｋｇ当り０．１０〜２．０−ｌｌ４ｇの８宛の投与量
を受ける。冠動脈血栓の治療の場合、同様な投与量が単
一静脈内大量投与量として与えら勲うる。

上＃ｃ’Ｌｆｃ投与′ｊｌｉｐ囲において何ら毒性作用
は観察されておらず、また示されてもいない。

従って１本発明の別の観点において、患者に効果的な非
毒性量の本発明の結合体を投与することからなる血栓症
疾病の治療方法が・提供される。

本発明はまた活性治療物質として使用するための、特に
血栓症障害の治療に使用するための酵素結合体も提供す
る。

実施例 以下、方法及び実施例により本発明を例示する。

方法 （ａ）　　色素産生性基質分析 ｔ−ＰＡを色素産生性基質（ｋａｂｉｖｌｔｒｕｍ、　
スウェーデン）Ｓ−２２８８に対して、各々０．１　Ｍ
　）リエタノールアミンーＨＣｌ中１ｍＭの基質濃度で
聞＆Ｏで２５℃にて分析した。ＳＵは光路長さ１ｃｍの
セル中ニーの基質中で０．００１　／分の０．Ｄ、増加
を持たらす活性の量として定義される。

（ｂ）　　速度定数決定 偽−次速度定数は生理条件下で、すなわち等張水性媒体
中［）Ｈ７，４かつ３７℃にてアシル−酵素を加水分解
することにより決定される。一定間隔でアリコートを抜
出し、色素産生性基質で培養し。

上δｅしたように基質の転換速度を測定する。

加水分解は基質の転換速度が最大に達するまでのような
時間桁なわれる。次いで速度定数にはプロットすること
により計算できる。

ｌｏｇ＠（１”　Ａ　ｔ／Ａｍｇｘ　）　（ｔに対して
）（式中、　Ａｍａｘは了りコートが基質を転換する最
大速度であり、そしてＡｔはアリコートが時ｔにおいて
基質を転換する速度である） 実施例１ α９ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（４−カルボキシフェニル）
ポリエチレングリコール４００　、　ｌ＝’スー４−ア
ミジノフェニルエステル・ｐ−トルエンスルホン酸塩 ポリエチレングリコール４００　（ａ、　７０　ｇ）を
１ｉＷＩｋ　ｋ”　ＩＪ　シン（５，Ｏｄ）中ｐ−）ル
エンスルホニルクロリド（４，１９！９）と混合し、４
℃で７０時間冷却し、砕氷（〜５０ｄ）中に注加した。

水性層を塩化メチレン（１００ｄ）で抽出し、有機層を
ＮａＣ６で飽和した６ＮＨＣ６で２回洗浄し、次いで乾
燥させた。有機層を３５〜４０°Ｃで蒸発乾固させ、固
体全量を水酸化カリウム（１，４５１％ｐ−ヒドロキシ
安息香酸メチルエステル（３，０４９）及び水（１，Ｏ
ｇ）を含有するテトラヒドロ７ラン（５０ｍｇ）中に溶
解した。混合物を９５時間加熱しく７０℃）、冷却し、
水（４ｏｙ）、水酸化ナトリウム（０，２ｇ）、メタノ
ール（１６ｓｔ（）及び塩化メチレン（５０ｄ）を添加
した。ｖ後層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
す）　１７ウムで乾燥させ比。生成物をＫＯＨ（０，１
５？　）含有メタノール（５０ｍ）中で４時間還流し、
水（３００ａｄ）に注加し、！ＨＣＪでｐＨ１，０まで
酸性化シ、クロロホルム（１００ｓｔ）で抽出すること
により酸まで加水分解した。乾燥及び蒸発後。

３．０６ｐ（５０１）の油状物質を得、これは固体の酸
を与えた。この物質の”　Ｈｎｍｒスペクトルは中間体
酸の構造と一致していた。この中間体（０，ｆｌｌ＆）
を塩化チオニル（５ｍｌ　）に周囲温度で３０分間溶解
し、過剰の塩化チオニルを２容積のベンゼンから蒸発さ
せることにより共沸的に除去した。中間体酸クロリドは
真空中１５分間乾燥させ１次いでピリジン（５−）及び
ｐ−アミジノフェノール塩酸塩（１，７３ｇ）に添加し
た。混合物を周囲温度で７０時間攪拌した。溶媒のピリ
ジンを真空蒸発により除去し、残渣をジエチルエーテル
（１ｏ　ｎｉ）で粉末化した。インプロパツール（２ｓ
ｙ）を添加し、生成物を加熱して溶解し。

再冷却すると油状物質が分離した。この油状物質ｆ　ｐ
　−）ルエンスルホン酸（０，６９’！　）　ト混合シ
。

イソプロパツールから再結晶することにより少量（約１
００ｒｎ９）の白色固体、融点１４７〜１４８℃を得友
。この物質は”　Ｈｎｍｒ　　で特定決定したところこ
れはジエステルと共にいくらかのモノエステルを含有し
ていることが分つ九。それ以上の精製［−４＝７７デツ
クス（５ｅｐｈａｄｅ−ｉり）　Ｌ　Ｈ２０のカラムを
用いて純メタノールで溶離することにより行なうことが
できた。

橋中に約３０個のエチレンオキシ単位を有する同族体を
ポリエチレングリコール１５００を出発物質として同様
な方法で製造した。

実施例２ α、ω〒Ｏ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−２−カルボニル（４′
−ヒドラジノ安息香酸）〕ポリエチレングリコール６０
０．ビス−４−アミジノフェニルエステル塩酸塩 、２ＨＣ６ｎ〜１３ ポリエチレングリコールｆ３００（６，０ｇ）ｔｌλ５
％（ｗ／ｖ）ホスゲンのトルエン（８０ｍ）中溶液に溶
解し１周囲温度で３日間攪拌した。過剰のホスゲン及び
トルエンを蒸発により除去し、残渣油状物質を乾燥ピリ
ジン（４０ｍｇ）に溶解した。４−ヒドラジノ安息香酸
（３，０４ｇ’）を添加し、混合物を１６時間周囲温度
で攪拌した。生成物を２容積の乾燥ジエチルエーテルに
溶解し、ピリジン（５０ｍｇ）Ｋ溶解し、エーテルで再
沈殿させ九〇沈殿した油状物質を乾燥ピリジン（５０ｄ
）に溶解し、ｐ−アミジノフェノール塩酸塩（５，１８
９，３倍モル過剰）ジシクロへキシルカルホジイｒ　）
−（４，５３９）Ａび無水ｐ−）ルエンスルホン酸（Ｓ
　ＯＩ＃ｇ）を添加した。混合物を２日間周囲温度で攪
拌し、濾過し、Ｐ液を乾燥ジエチルエーテル（２容積）
で沈殿させた。得られたガム状物質を（１）２−プロパ
ツール（２００ｍ）及びジエチルエーテル（ｚｏ＊）、
（２）エタノール（５０ｍ）及びジエチルエーテル（３
０ｍｇ）から再結晶した。

４℃で冷却すると生成物はガム状物質として生成され、
ジエチルエーテルで洗浄し、次いでＰｘ　Ｏｓで真空下
で乾燥させ友。薄橙色無定形固体が得られた（２１９．
２１％）、融点４６〜４８℃。

”　Ｈｎｍｒ　（ＤＭＳＯｄ＠　）　δ、９．２５／９
．４５　（広いｄ、８Ｔ（Ｄ鵞Ｏと交換可能、アミジン
Ｈ）　、　７．９５／７．５０（ｄｄ。

８Ｈ，アミジノフェニルＨ）　、　　７．９５／６．７
８（ｄｄ、８Ｈ。

ヒドラジノベンゾイルＨ）、４．１ｆｌ（流込５ｅ４Ｈ
メチレンオキシカルボニルＨ）　、　３．６５−３．３
５（エンベロープ、５６Ｈ，アルコキシ骨格Ｈ）実施例
３ α、ω−ｏ　、　ｏ’−ビス−ＣＮ　−６−〔Ｎ′−カ
ルボニルアミノ）ヘキシルアントラニル酸〕ポリエチレ
ングリコール６００．ビス−４−アミジノフェニルエス
テル塩酸塩 、２ＨＣｅ　　　　　　　ｎ　〜１３ ポリエチレングリコール６００　（３，ｏ　！　）　ヲ
１２、５　％　（ｗ／ｖ）ホスゲｙｆ）トルｘ：ｙ　（
８０ｍ）中溶液に溶解し１周囲温度にて１６時間攪拌し
九過剰のホスゲン及びトルエンを蒸発により除去し。

ｓｍｉ状物質をＮ−６−（アミノヘキシル）アントラニ
ル酸の１．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液（２０ｍ）中懸濁液
に添加した。油状物質が生成され、混合物を周囲温度で
６時間攪拌した。生成物を蒸発乾固し％　４０℃でメタ
ノール（７０ｎＩｔ）で抽出した。

メタノール抽出物を蒸発させ、二酸中間体をＰ！０１１
で真空乾燥させた。得られたガラス状固体全ｔを。

ジシクロへキシルカルボジイミド（４，１２９）。

ｐ−アミジノフェノール塩酸塩（６，９ｇ）及びｐ−ト
ルエンスルホンｅ−水利物（１，９ｇ）ｆ含有している
乾燥ピリジン（４０ｍ）に溶解した。混合物を周囲温度
で２日間攪拌し、濾過し％Ｆ液をＥ燥ジエチルエーテル
（２００ｄ）に４℃で注加した。４℃にで３日間後、ガ
ム状固体が析出し、上澄液をデカンテーションにより除
去し、残渣を熱インプロパツール（ｉ　ｏ　ｏｇ）に溶
解した。ジエチルエーテルを曇り点まで（２０ｄ）添加
し、黄色油状物質を４℃で７日間分離させた。この方法
を２回繰返し、最終生成物を真空下で乾燥させることに
よりガム状物質（全回収電ｆｉ１．７４ｇ）を得た。

１晩攪拌後、固体を戸数し、これをジクロルメタン（５
０ｄ）で洗浄した。固体を１０％炭酸水素ナトリウム溶
液（５ｏｉ）に懸濁し、粉末化し九〇これをデカンテー
ションにより除去し、炭酸水素ナトリウム溶液の新たな
了りコート（ｓｏｙ）を導入し次。懸濁液を１時間攪拌
し、混合物を分離ロートに移し、ジクロルメタン（３Ｘ
１５０ｍ）で抽出し友。有機層を乾燥させ（硫酸す）　
Ｕラム）濾過し、蒸発させることにより黄色固体（ｓ、
　ａ　ｉ９）を得た。

’　Ｈｎｍｒ　（ＣＤＣｇｓ）δ、　７．８０（ｄ　、
２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）　、　７．３０＜ｍ＋ｓＨ＋アリー
ル−Ｈ）＃６．４５（ｄ、２）１．Ｊ＝９Ｈ２，了り−
ルーＨ）　、　５．２５　（Ｓ　、　２［−（、アリー
ル−（？Ｅ（、）、及び４．０（Ｓ、２Ｔ（、ＮＨ雪）
。

ＩＲ分析：（ヌジョール）　３４５０，３３５０．３２
５０゜１６８０．１６３０，１８００．１５１０．１２
７５，１１７０，１１１０゜８４０．７７０．及び６９
０Ｔｍ−” ４−アミノ安息香酸ベンジル（２，９２ｇ）及び２−ブ
ロムエチルフタルイミドを窒素雰囲気中でＩ００℃に加
熱することにより橙色油状物質を虫取させ次。３６時間
後ＴＬＣ分析（Ｓ七〇雪／　ＣＨｚＣ６ｚ　）は生成物
スポットの出現を示し、また多量のポリマー物質も現わ
れた。クロロホルム可溶性物質を粉末化及びｐ過により
単離し、クロロホルム抽出物を蒸発させた。カラムクロ
マトグラフィー（シリカ５０ｙ、ジクロルメタン）によ
シ油状物質の単離を行ない、これを更に再結晶（クロロ
ホルム７４０〜６０’石油エーテル）により薄黄色結晶
物質（４１０ｍ９）を得た。

１　Ｈｎｍｒ　（ＣＤ（Ｊｓ）　　δ、８．０ＣＭ、６
Ｈ，アリール　Ｈ）。

７．２５（Ｓ、５Ｈ，アリ−Ａ−−Ｈ）、６．５０（ｄ
７２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）。

５．２５（Ｓ、２Ｈ，アリール−ＣＨ，）ｔ４．５（Ｉ
ｒｒ、５ｔＸＨｔＮ一旦）、３．９０（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝
６Ｈｚ、ＣＨ，ＨＣＯ）　、及び３．４０（ｔ。

２Ｈ＃　Ｊ＝６Ｈｚ　＊　ＣＨ，？電）。

ＩＲ分析：（ヌジョール）　３４８０，１７７５，１７
０５゜１６１０．１５３０．１２８０．１１７５．及び
７１５０−１゜ｍ　ｅ　ｐ　−１１８−９℃ 突験値：　Ｃ，８８，３７，Ｈ，４，９８，及びＮ、６
．４４％。

Ｃ５ＩＨｚＮｚＯａ　、）１２０の 理論値：　Ｃ、６８，８５、Ｈ，５，３０、及びＮ、６
．６９チ。

３．４−Ｎ−（２−丁ミノエチル）アミノ安息香酸ベン
ジル フタルイミド（４１Ｏｍｇ）ｔ−エタノール（１０ｄ）
に溶解し、１００％ヒドラジン水和物（６０μｇ）に添
加し友。このものを１８時間還流加熱し、濃塩酸（１，
Ｏｍ）を熱溶液に添加した。還流を更に０．５時間続け
、溶液を冷却した。沈殿を濾過により単離し、固体を水
洗した（５．Ｏｍ）。エタノールを減圧下で蒸発させる
ことにより主として水溶液を得、これを再濾過した。水
性層を２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で垣基性化し、酢酸エ
チル（３ＸＺＳ−）で抽出した。有機層を乾燥させ（硫
酸ナトリウム）、濾過し、蒸発させることにより油状物
質（２２９Ｉｎｇ、８３％）を得た。

’　Ｈｎｍｒ　（ＣＤ（Ｊ３　’）δニア、８（ｄ、２
ＨｔＪ＝８ＨｚｍアリールーＨ）　、　７．２（Ｓ、５
Ｈ，ｐｈ−Ｈ）、６．４５（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ。

アリール−Ｍ）、５．２０（Ｓ、２Ｈ，γリールーｃＨ
り、４．５（ｂｒ（Ｓ−２Ｈｔｂｒ　　ｓ、ＮＨ，）。

ＩＲ分析：（薄膜）　３３７０，１６９０，１６００，
１５２０゜１１７０．１１００，９１０．−８４０，７
７０及び６９０ｃｙ＋＋−”０ポリエチレングリコール
８００（８２１Ｖ）’ｔ）ルエン（５ｄ）に溶解した。

１２．５％のホスゲンのトルエン（２６０μｌ）中溶液
を水冷混合物に添加した。１時間攪拌後、全揮発性物質
を除去し。

トルエン（５ｄ）を油状物質に添加した。Ｎ−（２−ア
ミ／エチル）−４−アミノ安息香酸ヘンシル（７−３１
ｆｉ９）とトリエチルアミン（５０μｅ）のトルエン（
５ｄ）中溶液を添加した。混合物を１晩攪拌り、　　）
ルエン層を硫酸ナトリウムの飽和溶液（２−）で洗浄し
友。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、−過し、蒸
発させることＫより油状物質（１２０■、７２係）を得
た。

ＩＨｎｍｒ　　（ＣＤ（Ｊ’ｓ）　　δニア、７５（ｄ
ｔ４’ＨｅＪ＝９Ｈｚ、アリール一旦）、７．３０（Ｓ
、ＩＯＨ，アリール−Ｈ）、６．５０（ｄ。

４Ｈ，γリール一旦Ｌ５．５（ｂｒ　　Ｓ、２゛Ｈ，Ｎ
ＨＣＯ）、５．２５（Ｓ、４Ｈ，ＣＨｌｐｈ　）　、　
４．９０（ｂｒ　　Ｓ、２）Ｌ、Ｎ’ＨＡｒ）、４．２
０ＣＭ、４Ｈ，０＝Ｃ−０−ＣＨり、３．５５（Ｓ、５
０）１．ＰＥＧ）、及び３．３（ｂｒ　　Ｓ、８Ｈ，Ｎ
Ｔ（ＣＨ２）。

ＩＲ分、析：（純粋）　３３５０，１７１０，１６０５
．１４９５゜１２８０．１１００．１０２０．７３０及
び６９５ｍ−”。

ベンジルエステル（１２０ｍ９）を）〕／−ル（ｌ　ｏ
ｒｎｌ）に溶解し、１０％パラジウム担体木炭「触媒」
を添加した。混合物を水素吸収が停止するまで水添した
。混合物をセライト床中を通過させ、溶液を蒸発させる
ことにより油状物質（７０Ｉｎ９）を得友。

’　）ｌ　ｎｍｒ　（ＣＤ（Ｊ３　／ｄ’−アセトン）
　δニア、８（ｄ、４Ｈ。

Ｊ＝８Ｈｚｓアリール−Ｈ’ｒ　、ｓ、３−６．８（ｄ
、ｘｏＨ，広いこぶ上に７’Ｊ　　Ｌ−Ｈ及び酸性−Ｈ
）−４，２（ｂｒ　　Ｓ、４Ｈ，０ＣＨ２）−３，６（
Ｓ　、　５０Ｈ，ＰＥＧ一旦）、３．４（ｂｒ　Ｓ−５
Ｈ−ＮＨＣＨ＊）。

ＩＲ分析：（純粋）　２４００−３６００．１７１０，
１６０５゜１５３０＃１２６０−１０１０−７７５及び
１３７０ｃｍ−”０６、表題化合物 ＰＥＧ−二酸（７０１ｎ？　、　６７　悶ｏ１ｅ　）　
ＩヒｌＪ　シ：／（ｌｄ）に溶解し％４−アミジノフェ
ノール（４６１１ｋｇ、２７０μｍｏｌｅ　）を添加し
た。更にジシクロへキシルカルボジイミド（２８１７１
ｆ、１３５μｍｏｌｅ）　及ヒｐ　−）ルエンスルホン
酸（２■）全添加した。この混合物を５日間攪拌し、生
成した固体をグラスウール栓中を濾過することにより除
去した。溶液を蒸発させることにより油状物質（１３８
■）を得た。

冥施例５ α、ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（Ｎ−（２−〔Ｎ′−カルボ
ニルアミノエチル）　−４／−アミノ〕安息香酸）ポリ
エチレングリコール６００．ビス−２−クロル−４−ア
ミジノフェニルエステル塩酸塩Ｘ４−アオ、７７エ＝、
エユｆ、塩。塩　　　ノ、２Ｈ（Ｊ　　　　　　　　　
　　　ｎ　〜ｔ３実施例４．工程５から）ＰＥＧ二酸（
３８１ｎｇ。

３６．３μｍｏｌｅ）及び２−クロル−４−アミジノフ
ェノール（１５Ｒｇｍ　７８μｍｏｌｅ　）をピリジン
（０，５−）Ｋ溶解した。ジシクロへキシルカルボシイ
εド（１５〜、７６μｍｏｌｅ　）を添加し、次いで乾
燥４−トルエンスルホン酸（１ｒｎｇ）を添加した０混
合物を６日間攪拌したところ、白色沈殿が生成した。溶
液をグラスウール床中を濾過し蒸発乾固させることによ
りガム状油状物質（５０■）を得た。

実施例６ α、ω−〇、０′−ビス−（４−カルボキシフェニル）
　ボ＋ｌエチレンクリコール４００．ビス−〔〔ヒト１
７ｓ７７−　（ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕エス
テル ヒトプラスミンをヒトｌｙｓ７７プラスミノゲン（ｋａ
ｂｉｖｉｔｒｕｍ、　スウェーデン）のウロキナーゼ活
性化により得、０．１Ｍ）リスヒドロキシメチルアミノ
メタン・ＨＣＩＩ　、　０．９　憾ｗ／ｖ　）４ａ（Ｊ
　、　２０　％ｖ／ｖグリセロー　Ａ−（ＴＧＳ緩衝液
〕中８３７μＭの濃度（活性点滴定−Ｃｈａｓｅ　Ｊ、
ａｎｄ　Ｓｈａｗ　Ｅ、Ｂｉｏｐｈｙａ。

Ｒｅａ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１９６７　２９：５０８−５
１４　１ｃよシ決定）で使用した。この溶液２００μｇ
を実施例１の官能性エステル（１０ｍＭジメチルスルホ
キシド中溶液８μｇ）と混合し％θ℃で１晩培養した。

この混合物１００μｇを０．０８　Ｍ燐酸ナトリウム、
　０．３２Ｍ　ＮａＣ６ｈ２０　Ｓｖ／ｖ　ｘタノール
緩衝液、ｐＨ７，０（ＰＳＥ緩衝液、１００μｊ〕と混
合し、下記の条件下の高性能ゲル透過クロマトグラフィ
ーにより精製した。

カラム：　ＴＳＫ変性シリカゲル透過カラムＧ３０００
ＳＷ（６ｏ　ｏ　ｘ　７．ｓｍＭ　）、蛋白質分子量標
準目盛付き（Ｂｉｏｒａｄ、英国）。

緩衝液：　ＰＳＥ 流　速：０．５ｄ／分 ２８０における流出物吸光度を監視し、分子量約１６０
及び８０キロダルトン（各々二量体及び単量体プラスミ
ン）に対応する１３．１及び１７．７−の流出容積にお
いて２本のピークが検出された。

より高級なオリゴマーは有意量で観察されなかったので
、このことは特異的二量体化を示している。第一ビーク
を含有する両分をプールしく３．Ｏｄ）％飽和Ｎ酸アン
モニウム溶液（６，０ｄ　）を添加し友。混合物を氷上
で１時間保持し％４℃で３０分間１５０（ｌで遠心分離
し友。沈殿した蛋白質ペレット状物を一４０℃で保存し
１次いで０、０１１ｗ／ｖＴｗｅｅｎ　８０洗剤を含有
する上記ＴＧＳ緩衝剤（１，０ｍ）に溶解した。この溶
液を３７°Ｃで培養し、プラスミン特異性基質Ｓ−２２
５１を用いて分析した（前掲方法参照）。初期アミド分
解活性は６時間の培養後達成されたものの１．３％でち
ゃ、このことは生成物が初期は不活性だが再生可能な形
態で単離されたことを示してｈる。脱アシル化速度論の
分析（前掲方法参照）により見掛の偽−次脱アシル化速
度定数はｐＨ７，４，３７℃で１．２　Ｘ　ｉ　Ｏ−４
秒−１となった。

実施例７ α−〔ヒト（８ｅｒ　４７８−イル）ｍ織プラスミノゲ
ン活性化因子〕１ ω−〔ヒトｌｙｓ　７７　（ｓｅｒ　＝　７４０−イル
〕プラスミン〕。

０．０′−ビス−（Ｎ−２−カルボニル〔４′−ヒドラ
ジノ安息香酸〕）ポリエチレングリコ−Ａ−６００この
化合物は２工程で裏道した。

（１）　α−〔４−アミジノフェニル〕、α−〔ヒトｌ
ｙｓ　７７−　（ｇｅｔ　７４０−イル）プラスミン〕
ビス−Ｎ−２（カルバミル（４′−ヒドラジノ安息香酸
）〕ポリエチレングリコール６００ヒトｌｙｓ　７７−
プラスミン（４３０μＭ溶液１．６−）を実施例２の二
官能性エステル溶液（２０ｍＭ服ＳＯ中溶液０．４ａｔ
　％　プラスミンに対し１１倍モル過剰）と混合し１周
囲温度で１時間１次いで０℃で１時間培養した。生成物
を、３００Ｘ２２．５ｍＭの調製用規模のカラム及び１
．０ｍ／分の流速を使用した以外は実施例６で使用した
ものと同様な条件下の高性能ゲル透過クロマトグラフィ
ーにより分別した。実施例６の二量体プラスミン同族体
に相当する小さなピークが、より低分子量のアシル化剤
から光分離れた約８０キロダルトンの格段に大きなピー
クと共に観察され比。５９〜６９Ｇ　−２５Ｍ　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　、　ｘウェーテン）ノ小カラムを用い
てｌａｗ／ｖＤ−マンニトール、２０ｍＭ炭酸水素アン
モニウム、１．０ｍＭ６−丁ミノヘキサン＆ｐＨ７，４
（ＭＡＥ緩衝液）中にイオン交換した〇カラム溶離液を
プールし、親液化することにより白色粉末を得た（　１
９９．７■）。

０）　表題化合物 ヒト組織プラスミノゲン活性化因子をＢＯｗｅｓｓ黒腫
細胞の培養上澄液から精製しく　Ｒｉｊｌｃｅｎ　Ｄ、
Ｌ−・Ｃｏ１１ｅｎ　Ｄ、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、　
１９８１　２５６　ニア０３５−７０４１）、Ｎａｌ’
Ｉ／ｇつ素発生源で放射能標識した（　Ｆｒａｋｅｒ　
Ｐ、Ｊ、　、５ｐｅａｋ＊Ｊ、ｃ、　ｅＢｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、　１９７８
　８０　：８４９〜８５７）。０．０５Ｍ燐酸ナトリウ
ム。

０、１４５　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ’ｙ、　４　（ＰＢＳ
緩衝液＊　１．０−）中の活性因子を上記プラスミンモ
ノエステル（ＳＳ、ＺＷＩｇ）及び生柿プロテアーゼ阻
害剤′（アブ（Ａｍ１００１ｓ英国＆１Ｏ，Ｏ００ダル
トン分子、量カットオフ腹）内に入れ、５０００９７４
℃で３時間濃縮し友。この期間終了時、反応混合物の容
積は０、１９　ｍであり％　ｔ−ＰＡの全アミド分解活
性は最初の値の１３．３％に低下した。カップリングさ
れた生成物は一１９６℃の凍結溶液として保存し。

了りコート（８０μｅ）を１８μＭアプロチニン含有Ｔ
ＧＳ緩衝液（４２０μｇ　）で希釈した。この溶液を３
７℃で脱アシル化し、γミド分解活性をアプロチニン（
４，５μＭ）の存在下、　　ｔ−ＦＡ特異性基質Ｓ−２
２８８（前掲方法参照）ｔ−用すで測定し友。

ｔ−ＰＡアミド分解活性は２．９１　Ｘ　１０−’秒４
の偽−次速度定数で再生された。未加水分解生成物を上
記（１）部分に記載した条件下で高性能ゲルクロマトグ
ラフィーを用いてクロマトグラフィーにかけたところ、
放射能の主要ピークは約６０及び７３　ｍｌの溶離液容
積にて見出された。これらは各々約１４５及び６０キロ
ダルトンの分子量に相当する。

高分子量ピークからの物質をドデシルスルホン酸ナトリ
ウム中のポリアク１１ルアミドゲル電気泳動にかけ、次
いで線維素オーバーレイツアイモグラフイー（Ｇｒａｎ
ｅｌｌｉ−ＰｉｐｅｒｎｏＡ、５ＲｅｉｃｈＥ、１９７
８　。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍ
ｅｄｉａｉｎｅｓ　　１　４８　　：２２３〜２３４）
にかけた。結果を第１図に示す。

結合体は約１５０キロダルトンにて帯を示してい九が、
これはＴＧＳ緩衝液中３７℃で４時間加水分解後消失し
た０遊離組織プラスミノゲン活性化因子（６３キロダル
トン）及びプラスミン（〜９゜キロダルトン）に相当す
る帯が加水分解時に現われたＯ ＊施例８ α−〔ヒト（ｓｅｒ　４７８−イル）組織プラスミノゲ
ン活性化因子〕、 α−〔ヒトｌｙｅ　７７−　（ｓｅｒ　７４０−イル）
プラスミン〕。

０、Ｏ′−ビス−（Ｎ　−（２−〔Ｎ′−カルボニルア
ミノエチル）−４′−アミノ】安息香酸）ポリエチレン
グリコール６００ この化合物は２工程で製造した。

（１）　α−〔４−７ミジノフエニル〕、ω−〔ヒトチ
レングリコール６００ ヒ）　ｌｙｅ　７７−プラスミン（４３０μＭ溶液１．
８ＩＩｄ）を実施例４の二官能性エステル溶液（２０ｍ
Ｍジメチルスルホキシド中溶液２００μｅ）と混合し。

３７℃で１時間培養した。この時間後、プラスミンの最
初のアミド分解活性の５．７係が残存し友。

生成物を実施例７（１）の中間体について記載したよう
にｓ−ｉし、二量体アシルプラスミン（溶離容積５７Ｗ
ｄりに相当する副生放物及び６３〜６８ｒｎｔにて溶離
する主生成物を得た。後者は水で１＝１に希釈しｆｃＭ
ＡＥ緩衝液中にイオン交換し％親液化した。白色粉末（
６０，２〜）が得られた。０．０１係ｗ／ｖＴｗｅｅｎ
　８０含有ＴＧＳ緩衝液に再溶解し％３７℃で培養した
ところ、このアシル−酵素は１．２Ｘ１０−４秒−１の
偽−次速度定数で脱アシル化した。

（２）表題化合物 上記プラスミンモノエステル（３２，４ｇ）全２２μ で放射能標識ヒト組織プラスミノゲン活性化剤（約８ナ
ノモル、０．８６μＣｉ　）と混合した。混合物を３　
０，　Ｏ　（：）　０ダルトン分子量カットオフを有す
るセントリコン（　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　　）バイアル
に入れ。

１０℃で３．５時間５ｏｏｏｙで遠心分離した。溶液を
約５０μｇまで濃縮した。生成物を％０．　７　５　ｄ
／分の流速を用いた以外実施例７（１）に記載したよう
に高性能ゲル透過クロマトグラフィーに！！７精展した
。放射能の２本のピークか観察され，第一のものは約６
０〜８５ｍに，そして第二のものは７０〜８０ｍのとこ
ろであった。高分子量画分をＳＤＳ　−　ＰＡＧＥ　／
線維素オーバーレイツアイモグラフイーにかけたところ
これは高分子量のところに線維素溶解性成分を示し，こ
れは加水分解時に遊離ｔ−ＰＡに転換可能であった（第
２図）。

実施例９ α，ωーＯ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−２−カルボニル−（４
′−ヒドラジノ安息香酸）〕ポリエチレングリコール１
５００，１：’クー４−アミジノフエニルエモ Ｈ２ 、２ＨＣｇ　　　　　　ｎ　〜３０ この物質はポリエチレングリコール１５００を用いかつ
エステル化工程にて４倍モル過剰のｐ−アミジノフェノ
ールを使用した以外は実施例２に記載した方法で製造し
た。生成物をエタノール／ジエチルエーテルから３回再
結晶によシ精製し。

橙色ガム状物質とし，で単離し友。この物質のＩＨ蘭ス
ペクトルは実施例２の化合物のものと非常に類似してい
たが，相違点はポリエチレングリコール骨格（δ：３．
３〜３．７）に相当する高磁場信号対芳香族領域（δニ
ア、４〜８．０）に相当するものとの比がより高かった
ことであり，このことはヨリ長いポリエチレングリコー
ル橋を反映しているＯ 実施例１Ｏ α．ωービスー（ヒト（　ａｅｒ　４　７　８−イル〕
組織プラスミノゲン活性化因子）、０．０’−ビス−（
Ｎ−２−カルボニル−〔４′−ヒドラジノ安息香酸〕）
ボηテングリコールａＯＯ 組換型組織型プラスミノゲン活性化因子（１３１．２ｎ
ｍｏｌ　　）を、０．５ＭＬ−アルギニン、０．　５　
Ｍ　Ｎａ（４２０ｍＭ）リスヒドロキシメチルアミノメ
タン、ＨＣＩ　、　０．０　１　１ｗ／ｖＴｗｅｅｎ　
８　０　ｐＨ７．４　（　ＡＮＴ緩衝液）中４３．７μ
Ｍの原溶液から飽和硫酸アンモニウム溶液を用い，そし
て３　５０　０９で４℃で３０分間遠心分離することに
より沈殿させ九〇沈殿を０、　３　ｄの．υ江緩衝液（
最終容積０．　５　ｄ　）忙溶解し、２４３μｍで分析
した。実施例２の化合物（　ｍ。

中ｘｃ１Ｍ溶液９．　Ｌｔｔｌ　、　０．　７　５　当
ｋ　）　ヲ添加Ｌａ混合物を０℃で培養した。０”Ｃで
合せて６時間後。

混合物はＳ−２２８８基質に対して最初の７ミド分解活
性の７優を含有しており、これを前緩衝′液（１，５ｄ
）で希釈した。生成物を、ＡＮＴ緩衝液を２．０　ｍ　
／分の流速で使用しかり調製剤プレカラムを用いた以外
は実施例７（１）Ｋ記載した条件下でクロマトグラフィ
ーにで、けた。１３０キロダルトンの分子量に相当する
９２−におけるピークを集め（１８ｓ＋ｇ）、飽和硫酸
アンモニウム（３６ｍ）でｘ７，５ｏＯｇで４℃で６０
分間沈殿させた。

生成物をに汀緩衝液（１，５０ｍ　）に溶解し、−７０
℃で保存した。ＴＧＳ緩衝液中３７℃にて、生成物は４
．４８　Ｘ　１０”秒″″１の見掛の一次速度定数で脱
アシル化した。

実施例１１ ビス−α、ω−（ヒト（ｓｅｒ　４７８−イル〕組織プ
ラスミノゲン活性化因子）　−ｏ　、　ｏ’−ビス−（
Ｎ−２−カルボニル−〔４１−ヒドラジノ安息香９１）
ポリエチレングリコール１５００ヒト組換型組織型プラ
スミノゲン活性化因子（８０，２ｎｍｏｌ　）を０．０
５Ｍ燐酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム％０．０
１　％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ　８０（ＰＳＴ緩衝液１２．６
ｄ中に透析し％８μｌの実施例９の化合物ＣＤＭＳＯ中
５ｍＭ）（０，５当量）を添加した。０℃で２時間後、
更に８μｇ　のアシル化剤を添加し、培養を０℃で１６
時間続けた。飽和ｉ酸アンモニウム溶液ｃ　５．２　ｒ
ａｔ　）を生成物に添加し、沈殿を３０００１４℃で１
５分間遠心分離することにより単離した。沈殿物を２静
ぼ緩衝液（０，５４）及び０．１　Ｍ　８−アミノヘキ
サン酸含有ＰＳＥ緩衝液（ＰＳＥＥ）（０，５ｄ）に溶
解し、濾過した。これを実施例６に記載したようにクロ
マトグラフィーにかけたが、但しＰＳＥＥ緩衝液及び０
、２　ｍ　／分の流速を用いて行なった。１９及び２２
．２−で溶離する２本のピークが観察された〇前者をゲ
ルミル過（５ｅｐｈｔｈｄｅｘ　Ｇ−２５）によシ単離
して工８〜２０ｍにおけるプールした溶離物の廣緩衝液
（＆Ｏａｇ）に入れた。生成物を一７０℃を溶液として
保存したところ、２−３ｘｘ０７４秒のＰＳＴ緩衝液中
３７℃における見掛の一次脱γシル化速度定数を有して
ｈた。実施例７に記載したようにゲル電気泳動及び線維
素オーバーレインイモグラフィーにかけ九ところ、生成
物は加水分解に敏感な１３０キロダルトンの帯を示した
。

実施何重２ α−〔ヒト（ｓｅｒ　４７８−イル）組織プラスミノゲ
ン活性化因子〕、ω−〔ヒトｌｙｉ　７７−　（５ｅｒ
７４０−イル〕プラスミン）、０．０’−ビス−（Ｎ−
２−カルボニル〔４′−ヒドラジノ安息香ｅ３）ポリエ
チレングリコール１５００ この化合物は中間体アシル−プラスミンを単離すること
なく製造した。

ヒトプラスミン（ＴＧＳ緩衝液中２８６μｍ溶液１、５
　ｍｌ　）を実施例９の化合物ＣＤＭＳＯ中５ｍ中筬ｍ
溶液１０３μ ラスミンのアミド分解活性は９７チ減少した。生成物ヲ
アブロチニン（　２２２ｍｍｏｌ　　）と混合し，上記
したように小さな３ｅｐｈａｄｅＸ　Ｇ−　２　５カラ
ムを用いて４℃テ１　０ｍＭ　６−アミノヘキサン酸及
び２０μＭ７ブロチニン（３．ＯｍＡ）を含有するＰＳ
Ｔ緩衝液中ヘゲルｐ過した。前緩衝液（　４．　Ｏ　ｄ
　、　２３３ｎｍｏｌ　）中の組換型組織型プラスミノ
ゲン活性化剤を飽和硫酸アンモニウム溶液（１２−）で
１０、０００ｇで１４℃で１時間沈殿させた。ベレット
ｔ−上記アシル−プラスミン溶液に溶解し，追加の２２
２ｎｍｏｉのアプロチニンを添加した。生成物を一施例
７に記載したように４℃で４一時間遠心分離することに
より％２．３ｄまで減少させ，−７０℃で凍結した。こ
の温度で７２時間保存し。

解凍し友後、混合物は基質Ｓ−２２８８に対して最初の
ｔ−ＦＡ活性の３　７．　５　１を保持していた。生成
物は実施例１０に記載した条件下で但し１．５ｄ／分の
流速で調製用高性能ゲル濾過を用いて分別した。７５な
いし９６ｍ間で溶出する生成物をプールシ、飽和硫酸ア
ンモニウム（２４ｍ）で１０、０００１４℃で１時間沈
殿させた。沈殿物をに任緩衝液（１．Ｏｄ）に溶解し％
ー７０℃で保存した。

生成物はＰＳＴ緩衝液中３７℃でλ０　６　Ｘ　ＩＱ−
４秒−息の見掛の一次脱アシル化速度定数で脱アシル化
し九〇（実施例７に記載したように）ゲル電気泳動及び
線維素オーバーレイツアイモグラ７来イーは加水分解を
受けやすい線維素溶解性の帯を１４３キロダルトンに示
した。

実施例１３ α−〔ヒト（ｓｅｒ４７８−イル）組織プラスミノゲン
活性化因子】、α−〔ヒトｌｙｓ　７７−　（ｓｅｒ７
４０−イル・）プラスミン〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−Ｎ−６
・〔Ｎ′−力ルボニルアミノ〕ヘキシルγントラニル酸
ポリエチレングリコール６００この化合物は２工穆で製
造した。

（１）　　α−〔４−丁ミジノフェニル〕、α−〔ヒト
ｌｙｓ　７７−　Ｌ　ｇｅｒ　７４０−イル）プラスミ
ン〕０．０′−ビス−Ｎ　−６−〔Ｎ′−カルボニルア
ミノコヘキシルアントラニル酸ポリエチレングリコール
６００ ヒトｌｙｅ　７７−ブラスミ７　（４３０μｍ溶液１．
９約９４１のプラスミンの死活化が起きた。得られたプ
ラスミンをアプロチニン（８０ｎｍｏｌ　）の添加によ
フ中和し、実施例７（１）に記載したように但し、１、
５　ｄ　／分の流速を用いてクロマトグラフィーにかけ
た０６２〜７２ｄ間で溶離する蛋白質を集め、実施例７
　（１）に記載したようにＭＡＲ緩衝液中に濾過した。

カラム溶離液を親液化することにより白色粉末（１４９
，５＋１１１７）を得た。生成物は約ｌＯ重置部の蛋白
質でありＴＧＳ緩衝液中で３７℃で５．４６Ｘ　１０″
Ｓ秒−１の見掛の一次速度定数で脱アシル化した口 ■）　α−〔ヒト（ｅａｒ　４７８−イル）組織プラス
ミノゲン活性化因子〕、ω−〔ヒ）　ｌｙａ　７７−　
（ｓｅｒ　７４０−イル）プラスキン〕、０゜０′−ビ
ス−Ｎ　−６−［Ｎ’−カルボニルアミノ］ヘキシルア
ン゛トラニル酸ポリエチレングリコール６００− 上記化合物（６４，３１ｕｊ）をＰＢＳ緩衝液（０，９
ｓｌりアプロチニン　（８０ｎｍｏＬ　０．１　ｔｄ　
）及びヒトを−Ｐ　Ａ　（８０ｎｍｏ１．上記実権例７
Ｃ２）に記載したようにｌｕ　ｉ標識ｔ−ＰＡを含有）
と混合し、実施例７ね）に記載したように遠心分離によ
り濃縮し友。最終容積は０．３ｄで６り、ｔ−ＰＡは約
７０ｔｓ死活化された。生成物を実施例７Ｃ２）に記載
し次ように高性能ゲルクロマトグラフィーにより精製し
た。

５６〜６４ｄで溶離する放射性蛋白質をプールし。

上記したようにＸＷ／ｄヒト血清γルプミン含有壓緩衝
液中にゲルー過し、Ｒ液化することにより１２３１１Ｉ
ｇの白色固体を得た。この物質はＴＧＳ緩衝液中で１．
　ＯＸ　１０４秒−１の見掛の一次速度定数で３７℃で
脱アシル化した。

実施例１４ Ｎ、Ｎ−（６，８−〔（３，３−ジチオビスプロピオニ
ル）−Ｎ−（８−アミノヘキシル）−アントラニル酸〕
−ビス−（２−クロル−４−アミジノ）フェニルエステ
ル塩酸塩 、２ＨＣ１ （１）　　Ｎ、Ｎ−（６，６）　−〔（３，３−ジチオ
ビスプロピオエル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）アン
トラニル酸〕 ３．３ニジチオプロピオン酸ビス−Ｎ−オキシスクシン
イミドエステル（・１．０ｇ）をＮ−６−アミノヘキシ
ルアントラニルＷＲ（１，２５９、０，５ｍｏ１当量）
の乾燥ピリジン（Ｉ　Ｏｄ）中懸濁液に添加した。混合
物を周囲温度で２日間攪拌し、蒸発させて油状物質とし
、これを２　Ｎ　ＨＣＩ　（４０ｄ　）に溶解し１次イ
テ５　Ｎ　ＮａＯＨテｐＨ２Ｋ調整Ｌ７’ｊ０４０℃で
放置したところ、白色固体が沈殿し、エタノール／水１
：１ｖ／ｖ（５０ｇ）及びエタノール／水／γセトン１
　：　２　ａ　２　ｖ／ｖ　（４０ｇｄ　）から再結晶
した。帯黄白色固体が得られ、これを真空下で乾燥させ
ることにより０．９９の生成物を得た。融点１３３〜１
３５℃ ＩＨＮｍｒ　（ＤＭＳＯｄ’）δ：　７．８　（不規則
なｄ、ＩＨ，Ｈｓ）７．３５（ｔ、ＩＨ，Ｈ５）：６．
５−６．８（Ｑｔ、２Ｈ，Ｈ３＋Ｈ４）：２．９−３．
１　（Ｉｓ　６Ｈｓ　−ＣＨｚ−）　ａ　２．５　（ｍ
　ｓ　２Ｈｓ　−ＣＨｔ　−）　：１．３−１．７　（
ｍ　ｅ　８Ｈ−−ＣＨ宜−）元素分析：ＣゎＨ，、Ｎ４
Ｓ雪０６の理論値：Ｃ’：５９．４１゜）１ニア、１７
．Ｎ：８．６８．Ｓ：１０．０９゜実験値：　Ｃ：６０
．２４．Ｈニア、１５．Ｎ：８．４４＊Ｓ：８．６７゜
（２）　　Ｎ、Ｎ−（ｆｌ、６　）　−〔（３，３−ジ
チオビスプロピオニル）−Ｎ−（６−アミツヘキシルア
ントラニル酸〕−ビス−（２−クロル−４−アミジノ）
フェニルエステル堪酸塩 上記化合物（９７ｇ）を乾燥ピリジン（２，０ｍ）中で
無水ｐ−）ルエンスルホンｌ！１２（１０■）及び２−
クロル−４−アミジノフェノールＨＣＪ　（９３’Ｑ　
ｔ　３．　Ｏｍｏｌ当量）と混合し＆　Ｎ、Ｎ−ジシク
ロへキシルカルボジイミド（７７■＃２．５ｍ０１当量
）を添加した。周囲温度で４８時間攪拌後、溶液を濾過
し、蒸発乾固させた。黄色油状物質をＥｔＯＨ／　Ｈｓ
０１．５　ｖ／ｖ　（５，Ｏｍｌ　）から飽和食塩水（
２，、Ｏｄ）の添加により再結晶し１次いで同じ溶媒か
ら食塩水を用いずに再結晶した。析出し友固体を真空下
で乾燥させた。収量７６．７■、ガラス状固体。融点１
４５℃ ’ＨＮｍｒ　（ＤＭＳＯｄすδ：９．４５（広いＳ、４
ＨＤ！Ｏで交換、アミジンＨ）：８．１５（ｄ、ＩＨ，
アミジノフェニルＨ３）；８．０５（ｄｄ、ＩＨ，アミ
ジノフェニル５Ｈ）ニア、９６（不規則な三重項、ＩＨ
，ＤＩＯ中でシフトするＮＨ）ニア、８９（不規則なｄ
。

ＩＨ，アミジノフェニルＨ６）：　７．７２（ｄｄ、Ｉ
ＨチアンラニルオイルＨｆ３　）　：　７．５０　（不
規則なＩＨ，アントラニルオイルＨ５）ニア、４０（不
規則なｔ　ｅ　Ｉ　Ｈｅ　Ｄ２０で交換、ＮＨ）：６．
８５（ｄ。

ＩＨ，アントラニルオイルＨ３）：６．７１（ｔ、ＩＨ
−アント５二ｔｂオイルＨ４）　：　３．２０　（広い
ｄ　、２Ｈ，−ＣＨ，ＮＨＣＯ−）二３．００　（不規
則なｄ　、２Ｈ，−ＣＨ，ＮＨチアンラニルオイル）；
２．８ｆｌ（ｔ　、２Ｈ，−ＣＯＣＨ，−）：２．４（
ｔ　、２Ｈ。

−■ＣＨ＠　ＣＥＩＢ　Ｓ　−）　：　１．５０　（ｍ
　＃　２　Ｈｅ　−ＣＨ２−）　：　１．２−１．４　
（ｍｓ　６Ｈ＊　−Ｃｆｂ−）。

同様な方法により化合物（１）のビス−（４−アミジノ
フェニル）エステルを製造し友。両化合物はいずれも上
記実施例Ｂに記載した条件下におけるＨＰＬＣにより測
定してプラスミンの二量体を形成した。

【図面の簡単な説明】

図面中。 、＠　１　図ハ実ｍ例７　ノＪｉｉ１体（７）　ＳＤＳ
　ＰＡＧＥ　／ｍ維素ツアイモグラフイーによる特定決
定を示す゛ものであ０゜ 第２図は実施例８の結合体のＳＤＳ　ＰＡＧＥ　／線維
素ツアイモグラフイーによる特性決定を示すものである
。 いずれの図においても 条件：８係Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｅ、、線維素オーバーレイッγ
イモグラフィー。 活性はＳ　Ｕ／、ｄで表わした。 Ｈ：ＴＧＳ緩衝液中で３７℃で２時間加水分解したもの
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）除去可能な遮断基によりその活性中心を介して互
   いに結合された複数個の線維素溶解性酵素からなること
   を特徴とする結合体。 （２）定義されたように互いに結合された２個の線維素
   溶解性酵素からなる特許請求の範囲第（１）項記載の結
   合体。 （３）各酵素が独立してヒトプラズミンまたはヒト組織
   プラスミノゲン活性化因子である特許請求の範囲第（２
   ）項記載の結合体。 ４）除去可能な遮断基は式（ I ） Ｌ（−Ｂ−Ａ−Ｘ−）＿ｎ（ I ） 〔式中、ｎは２〜６の整数であり、 Ｌは原子価の価の結節基であり、 各Ｂは独立して線状親水性結合基であり、 各Ａは独立して酸素、硫黄及び窒素から選択された少な
   くとも１個のヘテロ原子を含有し、窒素がＣ＿１〜＿６
   アルキルにより置換されていてもよい橋かけ基であり、
   そして 各Ｘは独立して式 ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒは芳香族
   または不飽和非芳香族官能である）で表わされるアシル
   基である〕で表わされる特許請求の範囲第（１）〜（３
   ）項のいずれか一つの項に記載の結合体。 （５）ｎは２であり、そして部分Ｌ（−Ｂ−）＿２は線
   状親水性重合体である特許請求の範囲第（４）項記載の
   結合体。 （６）部分Ａは式（II） −（Ｃ）＿ｍ−Ｄ−Ｅ−（II） （式中、ＣはＢに結合するのに適した官能基であり、 Ｄは化合結合または炭化水素鎖であり、 Ｅは電子放出基であり、 ｍは１であるか、またはＥがＢに結合するのに適してい
   るときはｍは代りに０であつてもよい）で表わされる特
   許請求の範囲第（４）または（５）項に記載の結合体。 （７）部分Ｘは置換されていてもよいベンゾイルまたは
   アシルオキシであり、更に基Ａにより置換されている特
   許請求の範囲第（４）〜（６）のいずれか一つの項記載
   の結合体。 （８）遮断基はα，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（４−カルボ
   キシフェニル）ポリエチレングリコールから誘導される
   特許請求の範囲第（１）項記載の結合体。 （９）遮断基はα，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−２−カ
   ルボニル（４′−ヒドラジノ安息香酸）〕ポリエチレン
   グリコールから誘導される特許請求の範囲第（１）項記
   載の結合体。 （１０）遮断基はα，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−６−
   （Ｎ′−カルボニルアミノ）ヘキシルアントラニル酸〕
   ポリエチレングリコールから誘導される特許請求の範囲
   第（１）項記載の結合体。 （１１）遮断基はα，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（Ｎ−〔２
   −（Ｎ′−カルボニルアミノエチル）−４′−アミノ〕
   安息香酸）ポリエチレングリコールから誘導される特許
   請求の範囲第（１）項記載の結合体。 （１２）遮断基はＮ，Ｎ−（６，６）−〔（３，３−ジ
   チオビスプロピオニル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）
   −アントラニル酸〕から誘導される特許請求の範囲第（
   １）項記載の結合体。 （１３）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（４−カルボキシフ
   ェニル）ポリエチレングリコール４００，ビス−〔ヒト
   ｌｙｓ＿７＿７−（ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕
   エステル。 （１４）α−〔ヒト（ｓｅｒ４７８−イル）組織プラス
   ミノゲン活性化因子〕、ω−〔ヒトｌｙｓ＿７＿７−（
   ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−
   （Ｎ−２−カルボニル−〔４′−ヒドラジノ安息香酸）
   〕ポリエチレングリコール６００。 （１５）α−〔ヒト（ｓｅｒ４７８−イル）組織プラス
   ミノゲン活性化因子〕，ω−〔ヒトｌｙｓ＿７＿７−（
   ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−
   （Ｎ−〔２−（Ｎ′−カルボニルアミノエチル）−４′
   −アミノ〕安息香酸）ポリエチレングリコール６００。 （１６）α，ω−ビス−（ヒト〔ｓｅｒ４７８−イル〕
   組織プラスミノゲン活性化因子〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−（
   Ｎ−２−カルボニル−〔４′−ヒドラジノ安息香酸）〕
   ポリエチレングリコール６００。 （１７）ビス−α，ω−（ヒト〔ｓｅｒ４７８−イル〕
   組織プラスミノゲン活性化因子〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−（
   Ｎ−２−カルボニル−〔４′−ヒドラジノ安息香酸〕）
   ポリエチレングリコール１５００。 （１８）α−〔ヒト（ｓｅｒ４７８−イル）組織プラス
   ミノゲン活性化因子〕，ω−〔ヒトｌｙｓ＿７＿７−（
   ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕、Ｏ，Ｏ′−ビス−
   （Ｎ−２−カルボニル−〔４′−ヒドラジノ安息香酸〕
   ）ポリエチレングリコール１５００。 （１９）α−〔ヒト（ｓｅｒ４７８−イル）組織プラス
   ミノゲン活性化因子〕，ω−〔ヒトｌｙｓ＿７＿７−（
   ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕，Ｏ，Ｏ′−ビス−
   （Ｎ−６−〔Ｎ′−カルボニルアミノ〕ヘキシルアント
   ラニル酸）ポリエチレングリコール６００。 （２０）α，ω−Ｎ，Ｎ−（６，６）−〔（３，３−ジ
   チオビスプロピオニル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）
   −アントラニル酸〕−ビス−〔ヒトｌｙｓ＿７＿７−（
   ｓｅｒ７４０−イル）プラスミン〕エステル。 （２１）１種以上の線維素溶解性酵素を同時にまたは順
   次多官能性アシル化剤と反応させることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）項記載の酵素結合体の製造方法。 （２２）その活性中心が、一緒に反応して可逆性遮断基
   を形成できる基により遮断されている１種以上の酵素を
   反応させることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   記載の酵素結合体の製造方法。 （２３）特許請求の範囲第（１）〜（２０）項のいずれ
   か一つの項に記載の酵素結合体を医薬として適当な担体
   と共に含む医薬組成物。 （２４）式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｌ、Ｂ、Ａ、Ｘ及びｎは特許請求の範囲第（４
   ）項におけると同一の意義を有し、Ｒ＾５、Ｒ＾６、Ｒ
   ＾７及びＲ＾８は各々独立して水素または電子吸引性基
   でありそしてＺは対イオンである）で表わされる化合物
   。 （２５）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（４−カルボキシフ
   ェニル）ポリエチレングリコール４００、ビス−４−ア
   ミジノフェニルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩。 （２６）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（４−カルボキシフ
   ェニル）ポリエチレングリコール１５００、ビス−４−
   アミジノフェニルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩。 （２７）α，ω−Ｏ，Ｏ′−〔Ｎ−２−カルボニル（４
   ′−ヒドラジノ安息香酸）〕ポリエチレングリコール６
   ００、ビス−４−アミジノフェニルエステル塩酸塩。 （２８）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−６−（Ｎ′−
   カルボニルアミノ）ヘキシルアントラニル酸〕ポリエチ
   レングリコール６００、ビス−４−アミジノフェニルエ
   ステル塩酸塩。 （２９）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（Ｎ−〔２−（Ｎ′
   −カルボニルアミノエチル）−４′−アミノ〕安息香酸
   ）ポリエチレングリコール６００、ビス−４−アミジノ
   フェニルエステル塩酸塩。 （３０）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−（Ｎ−〔２−（Ｎ′
   −カルボニルアミノエチル）−４′−アミノ〕安息香酸
   ）ポリエチレングリコール６００、ビス−２−クロル−
   ４−アミジノフェニルエステル塩酸塩。 （３１）α，ω−Ｏ，Ｏ′−ビス−〔Ｎ−２カルボニル
   −（４′−ヒドラジノ安息香酸）〕ポリエチレングリコ
   ール１５００、ビス−４−アミジノフェニルエステル塩
   酸塩。 （３２）Ｎ，Ｎ−（６，６）−〔（３，３−ジチオビス
   プロピオニル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）−アント
   ラニル酸〕−ビス−（２−クロル−４−アミジノ）−フ
   ェニルエステル塩酸塩。